吉林大学远程教育本科生毕业论文
（药学）
中文题目残留溶剂检查方法的选择和验证要点
学生姓名XXX 专业药学
层次年级专升本学号201004706293
指导教师XXX 职称副教授
学习中心成绩
20120315
摘要
溶剂残留系指活性药物成分、辅料和药品生产中产生，而又未能完全去除的有机溶剂。残留溶剂无治疗作用并可能对人身健康和环境造成危害。
残留溶剂的分析属于杂质分析范畴。但由于残留溶剂的含量通常在0.1％-0.0001％，属于微量至痕量分析范畴，直至20世纪90年代，伴随着对残留溶剂的毒性及致癌作用的逐渐认识，加之分析化学手段的不断进步，才逐渐引起国际医药界和管理部门的关注和重视。目前各国药典均收载有残留溶剂检查法：各国药典也已经逐步接受了ICH的指导原则。由此，使得药品残留溶剂分析成为当今药物分析的热点之一。
为保障药物的质量和用药安全，以及保护环境，需要对残留溶剂进行检查和控制。残留溶剂是药品质量控制中一个重要的内容。残留溶剂检查方法选择是否合理直接关系到结果的准确性，对测定结果有着重要的影响，因此需对有机溶剂的残留量的检测选择合理检查方法，通过验证确保检测方法的可行性。
关键词：中药溶剂残留方法选择验证要点
目录
一、概述 (1)
二、各国药典对残留溶剂控制标准 (2)
三、残留溶剂检查方法的选择 (3)
1、检查法的确定 (4)
2、评价进样方法的合理性 (4)
2.1 直接进样法 (4)
2.2 顶空进样法 (5)
2.3 固相微萃取法 (7)
3. 残留溶剂分析方法新进展 (8)
3.1 快速分离 (8)
3.2 快速定性 (9)
3.3 进样方法 (10)
4、供试品溶解 (11)
5、测定残留溶剂应考虑方面 (11)
5.1 确定被测的有机溶剂 (11)
5.2 选择合适的色谱柱 (12)
5.3 供试品和对照品的制备 (12)
5.4 供试品和对照品的制备及浓度的确定 (13)
5.5 检测器的选择 (13)
5.6 顶空温度和顶空时间的选择 (14)
5.7 顶空瓶中样品体积 (15)
5.8 进样方式 (16)
5.9 提高灵敏度 (17)
四、残留溶剂检查方法的验证 (18)
1、系统适用性试验 (18)
2、准确度 (18)
3、专属性 (19)
4、精密度 (19)
5、中间精密度 (19)
6、线性 (19)
7、检测限和定量限 (19)
8、多种有机溶剂综合影响 (20)
9. 耐用性 (20)
参考文献 (21)
致谢 (25)
一、概述
药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中、以及在制剂制备过程中使用或产生而又未能完全去除的有机溶剂。根据国际化学品安全性纲要，以及美国环境保护机构、世界卫生组织等公布的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体都有一定的危害，因此，为保障药物的质量和用药安全，以及保护环境，需要对残留溶剂进行检查和控制。残留溶剂是药品质量控制中一个重要的内容。残留溶剂检查方法选择是否合理直接关系到结果的准确性。
按有机溶剂的毒性和对环境的危害，ICH将有机溶剂分为避免使用、限制使用、低毒和毒性依据尚不足四种情况。
有机溶剂残留的引入，在原辅料制备、制剂制备过程中所使用的有机溶剂均有残留的可能，而进行残留量的检测和控制。通过对药品制备工艺、有机溶剂的性质等进行分析，提出科学合理的依据，有选择性地对某些溶剂进行残留量研究。因此，药品在进行有机溶剂残留量研究之前，需要首先对药品中可能存在的残留溶剂进行分析，以确定何种溶剂是需要进行残留量的检测和控制。
在药品制剂工艺中应尽量避免一、二类溶剂的使用，维护中药“绿色、环保、健康”的形象。但由于制剂工艺的发展，残留溶剂问题难以避免。对于残留溶剂问题，逐步予以重视，并相应开展研究工作，制定相应的检查项目，以保证制剂的质量。
有机溶剂的残留量一般要求控制在几个至几千个ppm之间，属于微量或痕量测定，与常量测定有着不同的特点。残留溶剂检查方法的选择对测定结果有着重要的影响。通常发现在残留溶剂的检查方法尚不合理的情况下，若样品的色谱图中未出现溶剂峰，也未经其它系统验证，就简单地作出样品无该溶剂残留的结论，进而不将其残留定入质量标准，因此需对有机溶剂的残留量的检测选择合理检查方法，通过验证确保检测方法的可行性。
二、各国药典对残留溶剂控制标准
1990年,美国药典(USP)第22 版第三补充本首次收载了<467>有机挥发性杂质的检查,并在USP第23版(1995年)将有机挥发性杂质检测列入附录中；中国药典(ChP) 1995年版、英国药典(BP)于1993年版增补本( 1996年)及欧洲药典(EP)第三版(1997年)陆续收载了残留溶剂检查法，但所控制的残留溶剂种类均在6～
8种，其中包括苯、氯仿、二氧六环、环氧乙烷、二氯甲烷、三氯乙烯、乙腈、吡啶和甲苯。
由于药典中所控制的残留溶剂种类与制药工业中实际应用的溶剂相差甚远, 1994年医用药品注册技术要求国际协调会(ICH)着手编撰关于残留溶剂的指导原则。该指导原则于1997年12月24日起正式生效。
ICH制定的“Q3C杂质: 残留溶剂的指导原则”[1]将药品生产和纯化过程中常用的69种有机溶剂按照其对人体和环境的危害程度分类,并给出了相应的限度要求。各国药典陆续参照此原则修订了残留溶剂的控制标准。
EP第三版补充本(1999年)接受了ICH的指导原则: 采用毛细管顶空GC法、FID检测器进行测定；残留溶剂的种类和限度都与ICH的规定一致。
日本药典(JnP)第14版(2001年)完全采用了ICH的指导原则。
ChP2000年版对残留溶剂的限量调整至ICH规定的限度,并在2005版对残留溶剂检查做出了重大调整:残留溶剂的控制种类和限度与ICH一致；根据具体品种的生产工艺确定控制对象；检测方法推荐采用顶空毛细管气相色谱法。测定方法分为3种:毛细管柱顶空进样等温法；毛细管柱顶空进样系统程序升温法；溶液直接进样法。
USP28版采用了ICH的指导原则,但USP29版对残留溶剂的控制要求发生了较大改变:首次在所有的原料和制剂各论中增加了残留溶剂检查项；要求其均应符合附录(对象和限度与ICH要求相同)的规定,但未规定具体的检测方法；按照此规定,可参照附录要求,采用任何经过验证的检验方法,对ICH规定的69种残留溶剂进行检测，结果均应符合规定。
三、残留溶剂检查方法的选择
早期用来测定药品中残留溶剂的方法是干燥失重法。其缺点是非专属性,只能得到所有残留溶剂的总量,而且药品中的水分也会干扰测定。干燥失重法需要几克样品才能达到011%的检测限[2～4],而热重测定法( TGA) ,使用数毫克的样品就能达到100ppm的检测限[5]。
分光光度法通常利用特定溶剂与特定化学试剂的反应测定药品中的残留溶剂,但通常检测灵敏度较低。采用紫外可见分光光度法测定氯仿,对检验为阴性的产品,本实验室应用气相色谱2红外光谱联用技术在甲型肝炎减毒活疫苗中仍能定量检测到氯仿。
Osawa和Aiba[6]用红外光谱法通过图谱中的溶剂特征峰测定聚合物样品中
四氢呋喃、二氯苯和二氯甲烷的残留量。
Avdovich等[7]用核磁共振光谱测定可卡因样品中残留的苯、甲苯、丙酮和乙醚,在测定中还发现了以前在可卡因样品中未检测到的两种有机溶剂二氯甲烷和乙酸乙酯,但发现苯的定量限大约为100ppm,检测灵敏度达不到ICH规定的要求。
Jones等[8]应用核磁共振光谱建立了ICH规定的所有溶剂的氢谱和碳谱化学位移数据库,这个数据库有助快速鉴别和定量。
目前多采用气相色谱法。气相色谱法具有良好的分离能力和高灵敏度,适合于药品中残留溶剂的分析。随着气相色谱技术的发展,毛细管色谱柱已逐步代替分离效率较低的填充柱；FID检测器是应用广泛、检测灵敏度高、线性范围宽、耐用、操作简单、重现性好,尤其适用于残留溶剂等微量有机化合物的分析[9]。 Witschi和Doelker[10]统计发现80%引用的文献使用FID检测器测定残留溶剂。根据样品前处理和进入气相色谱的方式,可以将气相色谱分为3类:直接进样气相色谱、顶空气相色谱和固相微萃取气相色谱。
1.检查法确定
有机残留溶剂检查一般采用气相色谱法，GC法具有检测灵敏度较高，选择性较好的特点，采用此法所需的样品用量较少，基本可以满足所有残留溶剂测定的要求。采用GC法时，需要结合药物和所要检测的溶剂的性质，通过方法学研究确定合适的检测条件。由于通常要同时检测多种溶剂，为操作的可行性和简便性，尽量采用同样的检测条件控制尽量多种类的残留溶剂。评价色谱系统的适用性和方法学验证资料遵循与液相色谱方法评价相同的原则。与液相方法不同的是，气相色谱有多种进样方式，残留溶剂检查常用直接进样法或顶空进样法。通常情况下，沸点低的溶剂建议采用顶空进样法，沸点高的溶剂可以采用溶液直接进样法，当样品本身对测定有影响时，也建议采用顶空进样法。对不宜采用气相色谱法测定的含氮碱性化合物，可采用其它方法，如离子色谱法等。
2.评价进样方法合理性的要点
针对进样方法不同的特点，评价方法合理性的要点应有所不同。
2.1直接进样法：
直接进样方法是最早应用于气相色谱分析的进样技术, 仅需要使用自动进样器。其最大缺点是样品本身及样品中含有的不挥发性组分也会被注入到气相色谱中污染进样口、色谱柱。另一个缺点是在下一次进样前必须使用高柱温把这些物质从色谱柱中分离出去,延长了整个分析过程的时间。Witschi和Doelker[10]以及B’Hymer[11]认为,近年来直接进样法在残留溶剂测定中的使用明显减少。
对于直接进样法，着重评价方法的灵敏度和重复性。目前已普遍用毛细管柱取代填充柱，因为毛细管柱的柱效高，其灵敏度也较填充柱大为提高。但由于毛细管柱直接进样的体积小，一般仅几微升，即使提高供试溶液的浓度，对于测定限量极低的溶剂（如：苯、四氯化碳、1，2-二氯乙烷等）及对FID检测器响应低的溶剂（如：含氯的溶剂），其检测限一般接近或高于限量，灵敏度难以满足测定的需要。测定此类溶剂最好采用顶空进样法，对含卤素的溶剂可
改用电子捕获检测器（ECD）。进样量小也易造成进样重复性差，采用内标法较外标法的结果更为准确。
水、合适的有机溶媒或混合液。对于非极性色谱柱，水对柱有影响，会缩短柱的使用寿命。
2.2 顶空进样法：
根据取样和进样方式的不同,顶空分析可以分为静态顶空和动态顶空两种。静态顶空分析是用气体对液体或固体样品中的挥发性组分进行萃取的一种预处理方法,与其他预处理方法相比,顶空分析更加简便、干净、快速,不需要使用大量的有机溶剂且易于实现仪器自动化。顶空气相色谱法的原理基于Dalton定律、Raoult定律和Henry定律[12]。
目前各国药典推荐使用静态顶空气相色谱法。静态顶空法可以克服直接进样法的主要缺点[9],药品不直接进入气相色谱,只有易挥发的残留溶剂等杂质进入气相色谱进行分析,是药品残留溶剂测定中应用最为广泛的技术[13～17]。静态顶空气相色谱法常用于水溶性药物的残留溶剂的测定,而对微溶于水或不溶于水的药物具有一定的局限性。目前通常用N ,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N ,N-二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)作为HS2GC测定水不溶性药物的溶剂。
Camarasu[12]考察了上述3种溶剂单独使用及与水以1∶1混合使用时测定甲醇、乙醇、乙酸乙酯和DMF的差异: 除乙酸乙酯外,甲醇、乙醇和DMF在不同的溶剂体系内的检出量有极大的差异,这也说明不同的溶剂体系对残留溶剂的测定存在较大的影响。用Rtx624柱和DB2624柱静态顶空气相色谱法测定13种有机溶剂( ICH一类、二类和三类)在两种不同极性且不溶于水的药物中的残留量,考察样品体积及作为溶剂介质的高沸点有机溶剂中的水分含量对方法灵敏度的影响。结果表明,在溶剂介质允许的情况下,增大样品的浓度使得样品体积减小(011～013mL),方法的灵敏度明显提高;高沸点有机溶剂中的水分含量高于7%时将显著提高方法灵敏度；但可使得某些残留溶剂的方法回收率偏高至115%,造成这些溶剂的检测结果偏高[12]。
Qin等[18]考察了顶空气相色谱法测定药品中残留溶剂的影响因素,提出了减少共出峰干扰和热降解干扰的对策。
静态顶空法相对动态顶空法的主要缺点是灵敏度稍低。分配系数(K)是影响顶空灵敏度的主要因素之一,其表征平衡状态下组分在气液两相的浓度比。分配系数小(K<10～100)的组分更易于分配到气相中,更适合顶空分析。
研究[19～25]表明降低分配系数的方法, 如盐析效应、调节pH值或者提高平衡温度,尤其是在以水为溶剂的系统中,可提高静态顶空的灵敏度。静态顶空法测定时,由于对照品溶液和供试品溶液的组成不同, 使待测挥发性组分在气液两相间的分配系数不同而引起定量误差[18]。由顶空分析的原理知道,在给定的平衡体系中,待测组分在顶空气体中的浓度除了与其自身的性质有关外, 还与样品中其他组分的性质有关。当待测组分与样品基质间存在强烈的相互作用时,会因为待测组分在对照品溶液和供试品溶液中具有不同的分配系数而导致定量结果的不准确。因此配制对照品溶液时应使用与供试品相同或相似的基质,也可以用标准加入法定量。在供试品中加入饱和浓度的无机盐溶液也是常用的减少基质效应的方法, 无机盐离子在溶液中分散包围在待测挥发性组分周围, 减少了挥发性组分与基质分子间的相互作用, 通过影响组分的活度系数, 影响其分配系数, 进而减少基质效应对定量准确性的影响。
动态顶空分析是用流动的惰性气体将样品中的挥发性成分“吹扫”出来,再用一个捕集器吸附吹扫出来的物质,然后经热解析将样品送入气相色谱仪进行分析。动态顶空分析的最大优点是灵敏度高,检测限达到pg级[26],比静态顶空分析高1000倍,因此,动态顶空分析更适合低浓度残留溶剂和高沸点的残留溶剂的分析。动态顶空分析另外一个优点是分析过程中不需要等待气体与样品基质之间的平衡。动态顶空分析的缺点包括:仪器较复杂,样品管较难清洗,仪器自动化程度较低,而且重现性往往比静态顶空分析低。
顶空进样法是将大量样品中的残留溶剂富集在顶空瓶上层的气体中，对绝大多数有机溶剂而言，灵敏度较直接进样法大为提高，但顶空进样系统中存在气液两相的平衡问题，对结果准确性的影响因素增多。评价方法是否合理，应着重关注以下三个方面：
（1）顶空条件：顶空瓶的平衡温度和时间是最重要的参数，根据溶解样品的溶剂和待测溶剂的不同性质，达到气液平衡所需的温度和时间可能不同，应
有试验数据作为选择的依据。判断顶空条件是否适用，一般的规律是：顶空瓶的平衡温度应低于溶解样品所用溶剂的沸点10℃以下，能满足检测灵敏度即可；对于沸点过高的溶剂，如DMF、DMSO、聚乙二醇等，用顶空进样测定的灵敏度不如直接进样，不适宜采用顶空法；顶空瓶的平衡时间一般应为30至60分钟，才能保证气液两相达到稳态平衡。
（2）供试品和对照品是否平行：由于供试品和对照品的液体部分状态不完全一致而造成的基质效应会直接影响到结果的准确性。采用标准加入法可以消除基质效应，但目前在国内的申报资料中较少见到，其原因可能是方法较为繁琐，且需要消耗大量的样品，对新药研发初期样品量较少的情况或一些贵重的药品不太适用。如果申报资料中提供了回收率数据，就容易判断基质效应的大小，但由于目前对此没有强制要求，大多数资料都未对回收率进行研究。因此在评价方法时，至少应要求对照品和供试品采用相同的溶剂溶解，且液体部分的体积应完全一致。
（3）重复性：由于顶空进样法存在气液平衡和气体进样的问题，粗放度较大，中国药典要求内标法连续五次进样的相对标准偏差小于5％，外标法的相对标准偏差小于10％；欧洲药典则要求相对标准偏差小于15％，因此重复性应密切关注。
2.3 固相微萃取技术(SPME)[12]
固相微萃取的优点包括: 灵敏度高，溶剂用量少，操作简单，易于实现自动化。固相微萃取主要针对有机物进行分析，根据有机物与溶剂之间“相似者相溶”的原则,利用石英纤维表面的色谱固定相对分析组分的吸附作用,将组分从试样基质中萃取出来,并逐渐富集,完成试样前处理过程。在进样过程中,利用气相色谱进样器的高温将吸附的组分从固定相中解吸下来进行分析。用SPME萃取样品有两种方法:
①直接法: 将纤维头直接插入到样品中, 当待测物与固定相充分接触至平衡时将SPME装置取出, 进样分析。该法仅适用于气体样品或干净水样品的测定。
②顶空法: 不将纤维头与样品直接接触, 而是将纤维头停留在样品顶部空间, 对气相中的待测物吸附、富集, 而后进行分析。其优点是避免了基体的干
扰, 该法适用于任何基体的样品测定。顶空固相微萃取方法能够使纤维涂层不被样品中的高分子量物质和其他的不挥发性干扰物质污染[27]。
研究表明,对极性残留溶剂的分析,顶空固相微萃取要比直接固相微萃取的灵敏度高[28]。近年来,顶空固相微萃取技术已经成为残留溶剂分析中除了顶空分析外的另一种选择[28]。
Camarasu等[26]深入地比较了两种固相微萃取进样技术和顶空分析技术。气密固相微萃取技术中只有很小体积的顶空气体从样品基质中移走,而顶空固相微萃取则有较大体积的顶空气体从样品基质中移走。研究发现在这些技术中气密固相微萃取技术的灵敏度最高。挥发性残留溶剂的检测限显示气密SPME分析比静态顶空分析低约两个数量级。
Coran等[29]采用HS2SPME2GC, 应用同位素稀释测定优布芬及其片剂中的残留溶剂。
Chiarotti等[30]应用HS2SPME通过鉴别可卡因中的残留溶剂来判断其来源。
Legrand等[31]使用Carboxen/PDMS纤维定性和定量测定药品中的残留溶剂,为了增加对三乙胺的提取,加入磷酸盐缓冲液调节溶液pH9.6,并对提取温度、离子强度和水溶液的体积进行优化。
3.残留溶剂分析方法的新进展
3.1 快速分离
残留溶剂检测的理想方法是能够在一次分析中对近70种残留溶剂逐一进行快速定性和定量。许多研究者应用不同的方法对此进行了研究。
Chen等[32]用DB2624毛细管色谱柱(10m311mm3014μm)，在一次分析中快速分离了38种常用的有机溶剂,分析时间不到419min。如果使用DB2624色谱柱(30m 3132mm3118μm)的分析时间将达到45min。
Wittrig等[33]采用流量2调节技术,即在串联色谱柱的接头处通过程序调节载气的压力:在色谱柱接头处插入一个死体积小的阀门,并将其与载气相连或者使其高于气相色谱的进样压力。当阀门打开,第1个色谱柱中的载气停止而第2个色谱柱的载气加速。所采用的串联柱系统包括一个固定相为聚乙二醇和一个固定相为三氟丙基/甲基聚硅氧烷的色谱柱,通过停止2流量模式来改善或者“调
节”分离。阀门在分离过程中间歇地打开2～8s,使难分离的物质得到分离。采用此方法在一次气相色谱分析中可实现对36种残留溶剂(ICH一类、二类)进行分离, 快速的升温程序使整个分析时间只有12min。
Rocheleau等[34]使用Flash GC技术快速分离残留溶剂,使用的EZ FlashTM毛细管柱RTX2624色谱柱(10m30118mm),在4min内分离了约20种残留溶剂。Flash GC技术利用金属的电阻值加热并调节毛细管色谱柱的柱温达到快速分离待测物的目的。如ThermoOrion的EZ FlashTM技术,就是将一根标准色谱柱插入到一个金属鞘中,通过金属鞘来控制色谱柱的柱温,由于减小了加热器的传质损耗,使得EZ FlashTM毛细管柱的升温和降温速度大大提高。尽管Flash GC方法的灵敏度低于传统的气相色谱方法,但当需要快速分析时仍为一种可选择的方法。
David等[35]通过低热质量(LTM)柱温箱来实现快速分离的目的。LTM柱温箱的升温速率能够达到1800℃2min-1,从240℃降到40℃仅需要30s。在DB2624 (20m 3180μm31μm)色谱柱上,20种残留溶剂可以得到较好的分离。
3.2 快速定性
ICH关于残留溶剂的指导原则指出,只有在药品生产或纯化过程中使用过的溶剂,才有必要作检查。据此确定残留溶剂的控制对象,可能会造成误检或漏检。USP和EP目前的残留溶剂检查法要求逐一筛查药品中是否含有一类/二类溶剂,方法十分繁琐。快速定性药品中的残留溶剂种类是残留溶剂测定中的另一热点。
Qin等[36]应用顶空毛细管气相色谱建立了对药品中残留溶剂进行初筛的知识库。以ICH规定的69种残留溶剂中适合顶空气相色谱分析的51种为研究对象,用两根极性相反的SPB21和HP2FFAP色谱柱,分别考察了51种有机溶剂在等温和程序升温条件下的出峰顺序,计算各有机溶剂相对于参比溶剂丁酮的相对保留时间,以相对保留时间作为定性参数建立了知识库。首先,将样品溶液分别在系统A( SPB21)和系统B (HP2FFAP)的程序升温条件下进行测定,记录所有色谱峰的保留时间,同时测定参比溶剂丁酮的保留时间。然后,计算样品溶液中各个色谱峰相对于丁酮的保留时间的相对保留时间(RRT)。将得到的RRT值与知识库中的数据进行比较,如果误差小于3% ,即是样品中可能存在的残留溶剂。分别得出两个柱系统中可能存在的残留溶剂,在两个柱系统中共同存在的溶剂即可初步判
定为药品中的残留溶剂。最后,根据初筛的结果,选择合适的色谱条件,通常在等温条件下,应用有机溶剂对照品对初筛的结果进行验证,可以快速地鉴别出药品中未知残留溶剂的种类。该策略已经在ChP2005版附录中被采用。在此基础上,采用双通道并联色谱系统,选择非极性的SPB21色谱柱和极性的HP2INNOWAX色谱柱,非极性色谱柱系统和极性色谱柱系统通过“Y”型管连接,以调整相对保留时间为定性指标,在统一的色谱条件下通过一次实验可完成对药品中残留溶剂的初步定性和定量测定,节省了实验时间[37]。
Liu和Hu[38]应用气相色谱2质谱联用(GC2MS)和气相色谱2红外光谱联用(GC2FTIR)建立了对药品中残留溶剂进行准确定性的知识库。以ICH规定的60种残留溶剂为研究对象,分别建立了这60种溶剂的标准质谱库、检测限浓度的质谱库、标准红外光谱库和检测限浓度的红外光谱库。这4个图谱库组成了残留溶剂定性知识库,应用这个知识库,不需使用有机溶剂对照品就可以解决残留溶剂定性的问题。质谱和红外光谱互为补充,相互验证,如果质谱和红外的定性结果相同,进一步增加了定性的准确性。
Perez Pavon等[39]应用顶空进样技术和快速气相色谱2质谱联用建立了20种残留溶剂的低分离度色谱图,应用低分离度色谱图的保留时间与相应溶剂的质荷比组成的模板,可以鉴别药品中的残留溶剂。在通过顶空2快速气相色谱质谱方法建立的20种残留溶剂的鉴别模板中,首先获得20种溶剂的低分离度色谱图,虽然20种溶剂没有被完全分离,但是以每种溶剂的保留时间为横坐标,质荷比为纵坐标组成的等高线图可以将这20种溶剂完全分开,形成鉴别残留溶剂的模板。在分析样品时,采用同样的方法,当待测样品在模板相应的位置出现信号,就说明样品中含有这种残留溶剂。
3.3 进样方法
Brault等[40]介绍了一种全挥发技术,可以直接用于固体样品残留溶剂的测定。这种方法可以用于不溶性样品的残留溶剂测定,并且可以克服基质效应。测定供试品时将数毫克固体样品密封在顶空瓶中,在高于样品熔点20℃的温度下加热;测定对照品时,将数微升对照品溶液加入到顶空瓶中,在相同的温度下加热。通过对ICH规定的9种溶剂的测定对方法进行了评价,结果表明线性、准确性、
精密度和灵敏度都能满足残留溶剂测定的要求。
4.供试品溶解性：无论是直接进样或顶空进样，都应尽量使供试液中的样品完全溶解，否则当残留溶剂被包裹在样品晶格中时就不能被检测出来，可能造成结果与实际情况完全不符。对溶解性差的样品，可采用不挥发性酸或碱的溶液、高沸点的有机溶剂、混合溶剂等来溶解样品，即使样品在加热的条件下可能被破坏，只要待测的残留溶剂不被破坏（如：测定酯类溶剂不能采用酸或碱溶液，以免发生分解）且样品的热分解产物不影响测定，那么方法也是可以认可的。如果确实有一些药物采用上述条件都不能达到溶解，则可考虑采用充分研磨或超声的方法破坏药物的结构，使其中的残留有机溶剂释放出来，当然，这种情况下一般应注意进行相应的方法学验证以确定方法的可行性。
在国外药典中，对残留溶剂检查的规定有所不同，其中以欧洲药典对残溶检查的要求最为严格，它建立了两个极性不同的色谱系统，对色谱系统的选择、色谱条件、溶液的配制方法、系统适用性试验、方法学验证等都作了详细的规定，以保证样品中所有的残留溶剂都能被逐一的、准确的检测出来，避免发生遗漏的情况；根据样品的具体情况选用其中一个系统测定后，还必须用另一系统加以验证，以保证结果的正确性。欧洲药典的残溶检查方法看似繁琐、呆板，但在其严谨、严格的框架下，结果的可信度、准确度、专属性、耐用性大大提高，值得我们借鉴。
5.测定残留溶剂应考虑方面：
确定被测的有机溶剂、选择合适的色谱柱、制备供试品溶液和对照品溶液、选择合适的进样方法和满足检测灵敏度要求的检测器，下面分别进行介绍：
5.1 确定被测的有机溶剂
根据制备工艺确定被测有机溶剂的范围。通常应对制备工艺过程中使用的二类以上溶剂和重结晶用溶剂，以及根据工艺特点要求的其它溶剂进行残留量的研究。建议对合成最后三步使用的三类溶剂也进行研究，这样能更好地对未知峰进行归属；对制剂过程中使用的有机溶剂建议考察其残留，残留溶剂的限度要求同ICH的规定。
溶剂的选择原则不仅要能溶解样品, 而且能溶解对照品, 并对色谱柱无
损坏(例如直接进样不能含GC不能分析的无机盐成分)。对于痕量残留溶剂的分析, 选择高沸点溶剂比低沸点溶剂有利。溶剂沸点与待测组分沸点差距大一些容易实现待测溶剂聚焦。检查残留溶剂最常用的溶剂为水、DMF和DMSO。
首选水，其次DMF、DMSO、不挥发酸碱溶液，不可使用盐酸溶液和氨水，可选择在80～90°C加热能溶解样品的试剂。温度太高爆瓶。
如待查成分为苯、甲苯、三氯甲烷等水溶性不好的溶剂，可采用混合液，即先用少量乙醇或甲醇溶解待查溶剂再用水稀释待测溶剂再用水稀释。为提高灵敏度, 应选择分配系数小的溶剂。
当待测溶剂在有机相中的分配系数明显大于水相（例如三氯甲烷），对顶空进样来说采用有机相如DMF为溶剂不是很好的选择（K大，灵敏度低）；如果样品也只能在有机相中溶解，建议采用混合液。
5.2 选择合适的色谱柱
按照相似相溶的原理选择色谱柱。毛细管柱有极性柱、非极性柱、弱极性柱和中等极性柱。填充柱有高分子多孔小球或涂渍适宜固定液的填充柱。
测定含氮的碱性有机溶剂时，由于普通气相色谱仪的不锈钢管路、进样器衬管等对有机胺等含氮的碱性化合物具有较强的吸附作用，致使其检出的灵敏度降低。通常采用弱极性色谱柱或经碱处理过的色谱柱分析含氮的碱性有机溶剂，如果采用胺分析专用柱进行分析，则效果更好。
残留溶剂检查大多需要较高的分离度和检测灵敏度，通常采用毛细管色谱柱。填充柱口径大，造成溶剂峰扩散，检测灵敏度低。
实践证明，使用非极性至中等极性色谱柱，配合适当柱温梯度可分离大部分有机溶剂。通常当待查溶剂数目仅两、三种时，可用极性较强的色谱柱，出峰快，分析时间短；当溶剂数目较多时，还是优选非极性至中等极性柱分离较好。
5.3 供试品和对照品的制备
顶空进样方法通常以水为溶剂，当药物不溶于水，但可溶于一定浓度的酸或碱液中时，可采用不挥发的酸或碱液为溶剂，但不能使用盐酸溶液或氨水；对于非水溶性的药物，可采用DMF、DMSO或其他适宜溶剂。溶液直接进样方法
用水或合适的溶剂溶解样品。
制备供试品的溶剂的选择应兼顾供试品和被测有机溶剂的溶解度，且所用溶剂应不干扰被测有机溶剂的测定。水是首选溶剂，特别是顶空进样系统。因为水中不含有机溶剂，故干扰较少，且在FID检测器上，以水为溶剂时，各残留溶剂的灵敏度最高。以DMSO等为溶剂时，可加入一定量的水以增加检测的灵敏度，或用盐析的方法增加灵敏度。测定含氮的碱性溶剂时，供试品溶液应不呈酸性，以免被测物与酸反应后不易汽化。
供试品溶液的配制不可超声或加热助溶，以免残留溶剂挥发；如果顶空进样，样品置顶空瓶封盖之后可以超声或加热溶解。
大颗粒样品不可以研磨取样，只能取原态样品（或冷冻粉碎）。
避免基质效应。顶空气体中各组分的含量既与其本身的挥发性有关, 又与样品的基质(溶剂)有关, 特别是那些在样品基质中溶解度大(分配系数大) 的组分,“基质效应”更为明显。这是顶空进样的特点, 即顶空气体的组成与原样品中的组成不同, 因此, 标准样品不能仅用待测溶剂的标准品配制, 还必须与原样品基质相同, 否则, 定量误差将会很大。
顶空进样方式要求对照品配制与供试品配制方法应绝对一致，否则顶空瓶中气液平衡状态有差异（基质效应）。
对照品的制备方法应与供试品的制备方法相同，否则也造成顶空瓶中气液平衡状态的差异。
对照品配制最好采用标准加入法。
5.4 供试品溶液和对照品溶液浓度的确定
配制供试品溶液的浓度应满足定量测定的需要，一般供试品取样量在0.1～1g之间。限度检查时对照品溶液的浓度可按规定的限度配制，定量测定时按实际残留量配制，浓度相差最好以不超过2倍为宜。
5.5 检测器的选择
氢火焰离子化检测器(FID,火焰电离)、电子捕获检测器(ECD, 化学电离) 和氮磷检测器(NPD, 热表面电离) , 应用范围分别为有机物、电负性物质(卤代烃)、氮?磷化合物。同时具备上述三种检测器的实验室不多, 多数情况下, 仅
有FID检测器。采用FID检测三氯甲烷、DMF等溶剂, 由于未采用专属性检测器, 灵敏度不够, 需采取一些措施提高检测灵敏度。
四氯化碳则必须用ECD检测器。
一般选用FID检测器，对含卤素的有机溶剂如氯仿等，采用ECD检测器可得到更高的灵敏度。
通常可根据药物溶剂的残留情况选择合适的检查方法。当需要检查的有机溶剂数量不多，且极性差异较小时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-等温法。当需要检查的有机溶剂数量较多，且极性、沸点差异较大时，可选择毛细管色谱柱-顶空进样-程序升温法；也可选择填充柱或适宜极性的毛细管柱直接进样法。
限度检查（一类、部分二类溶剂）时采用内标法或外标法；定量测定（含量超过0.1%的二类或需要定量控制的三类溶剂）时采用内标法或标准加入法。
与检测器相关的注意事项
FID检测器属于质量型检测器, 对有机物均有响应, 只是对难电离的卤代烃和氮?磷化合物灵敏度比ECD、NPD检测器低很多。
ECD为半选择性的检测器, 对多种类型化合物均有响应, 如果供试品含有其他非卤代烃溶剂, 应同时进行系统适用性试验考察分离度。
采用FID 检测器, 同时又采用填充柱测定三氯甲烷, 灵敏度不可能达到限度要求。
5.6 顶空温度和顶空时间选择。
顶空温度应根据溶解供试品溶剂的特性及供试品中残留溶剂的沸点选择。以水为溶剂及测定低沸点残留溶剂时，顶空温度不宜超过85℃；测定沸点较高的残留溶剂时，通常选择较高的顶空温度；但此时应兼顾供试品的热分解特性，尽量避免供试品产生的挥发性热分解产物干扰测定结果。以DMSO为溶剂时，顶空温度不宜超过115℃。例如，以水为溶剂，顶空温度为100℃，柱温60℃，结果高浓度的乙腈比低浓度的二氯甲烷的峰面积还小，原因是顶空温度太高，大量的水被蒸发（或浓度被稀释），随着水蒸汽的凝结，在水中溶解度大的乙腈的灵敏度下降，产生了与事实不符的实验结果。
顶空时间是要确保供试品溶液的气-液两相达到平衡，一般通过测定顶空时间与顶空气体浓度的浓度—时间曲线来确定。顶空时间不宜过长，一般为30～45分钟，如果超过60min，可能引起顶空瓶的气密性变差,导致定量的准确性降低。如果平衡时间选择10分钟，就不能保证气-液两相达到平衡。
色谱柱：初温应接近样品中最轻组分的沸点，而终温则取决于最重组分的沸点，升温速率则要依样品的复杂程度。例如采用SE230, 0132mm口径, 60米长, 分离含甲醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯等数个溶剂, 采用初温60℃, 保持1至3分钟, 以5至10℃速率升至180℃,保持1至3分钟, 能很好分离待测溶剂。初始柱温最好不低于50℃, 否则峰保留时间太长, 峰形不好, 并且峰检出灵敏度降低。
进样口：一般不影响检测灵敏度, 原则上讲, 温度高有利,一般接近沸点最高的组分，但要低于易分解组分的分解温度。常用的条件是200或250oC。
检测器：原则是避免流出色谱柱的组分冷凝。FID检测器通常设置为250或300oC。
顶空瓶平衡温度：温度越高，蒸汽压越高，顶空气体的浓度越高，分析灵敏度越高。待测组分的沸点越低，对温度越敏感。但温度的改变只影响分配系数K，并不影响相比β。
例如水溶液中的甲醇、甲乙酮、甲苯、正己烷和四氯乙烯，80oC平衡温度与40oC平衡温度相比，甲醇在顶空气体中的浓度增加5.15倍，甲乙酮浓度增加2.61倍，甲苯只增加25%，而正己烷和四氯乙烯，分别增加2.6%和10.4%。
实际工作中往往是在满足灵敏度的条件下，选择较低的平衡温度。过高的温度可能导致某些组分的分解和氧化。一般采用高沸点溶剂时，样品比较稳定的情况下，推荐80oC左右的平衡温度。因为残留溶剂检查通常需要尽可能增加灵敏度。
注意对照品溶液与供试品溶液必须使用相同的顶空条件。
甲酰胺、2－甲氧基乙醇、2－乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基吡咯烷酮等不适宜用顶空法测定。
5.7 顶空瓶中样品体积
顶空样品瓶中的样品体积（Vs）对分析结果影响很大，因为它直接决定了相比β。
Cg＝Co/（K＋β）其中β＝Vg/Vs，K＝Cs/Cg，其中Cg为一定温度下气液平衡时, 溶剂在气相中的浓度, Cs为在液相中的浓度,Co为原始浓度,Vg为气相体积,Vs为液相体积, K为平衡常数(分配系数) , 即一定温度下气液平衡时,溶剂在液相中的浓度与气相中浓度的比值。由公式可见,样品体积增大, B减小, Cg增大,灵敏度增加;同时要考虑K,当K>β时，样品体积改变对灵敏度影响很小。
当K<β时，影响很大。例如，分析水中的二氧六环和环己烷（三氯甲烷），60oC平衡，两者的K分别为642、0.04。当样品体积由1ml增加至5ml，二氧六环的峰面积只提高了1.3％，而环己烷却提高了452％。根据实际经验来说，20ml顶空瓶样品装量为5ml比较适当。
5.8 进样方式
作为残留溶剂检查，顶空进样有许多优越性，不需要对样品进行特殊处理，不用担心样品中不挥发组分对GC分析的影响。直接进样对仪器要求低，由于部分实验室不具备顶空进样器，该方法的应用也具普遍性。
进样方式选择需注意的几点：
对于待测溶剂在溶解样品的溶剂中溶解度小（分配系数小）的情况下，例如三氯甲烷在水溶液中，采用顶空进样方式测得的灵敏度将大于直接进样；反之，例如甲醇与水互溶性好，直接进样的灵敏度将大于顶空进样。
测定二氯甲烷、三氯甲烷等卤代烃时，如果溶剂为水，直接进样容易造成FID检测器灭火，此时优选顶空进样。
合理选择顶空进样与直接进样对于待测溶剂在溶解样品的溶剂中溶解度小(分配系数小) 的情况下, 例如三氯甲烷在水溶液中, 采用顶空进样方式测得的灵敏度将大于直接进样; 反之, 例如甲醇与而二甲基甲酰胺互溶性好, 直接进样的灵敏度将大
无论是采用细口径或粗口径, 均可选择不分流进样, 以利于提高检测灵敏度(分流进样是因为柱容量小, 样品浓度高而不得不采用的方法)。如果采用分
流进样, 常用分流比为5∶1 或2∶1。当然, 采用不分流进样也要考虑溶剂性质, 挥发性太大的溶剂对色谱柱污染较大; 如果直接进样也要考虑样品性质, 沸点太高或不挥发的样品滞留在玻璃衬管或色谱柱上也会造成污染。
无论是采用细口径或粗口径，均可选择不分流进样，提高灵敏度。当然，采用不分流进样也要考虑溶媒性质，挥发性太大的溶媒对色谱柱污染较大。
直接进样要考虑样品性质。
顶空进样体积可达到2ml气体，而直接进样只能1至3ul液体。
Brault等[40]介绍了一种全挥发技术,可以直接用于固体样品残留溶剂的测定。这种方法可以用于不溶性样品的残留溶剂测定,并且可以克服基质效应。测定供试品时将数毫克固体样品密封在顶空瓶中,在高于样品熔点20℃的温度下
加热；测定对照品时,将数微升对照品溶液加入到顶空瓶中,在相同的温度下加热。通过对ICH规定的9种溶剂的测定对方法进行了评价,结果表明线性、准确性、精密度和灵敏度都能满足残留溶剂测定的要求。
5.9 提高灵敏度
对于限度要求很严格的溶剂，或贵重样品取样量有限制时，或检测器对该溶剂灵敏度低的情况下，采取一些措施提高灵敏度是方法成败的关键。
溶剂、温度、不分流进样、顶空瓶体积、利用盐析作用（即在水溶液中加入无机盐（硫酸钠）来改变挥发性组分的分配系数。常用高浓度，甚至用饱和浓度），盐析作用对极性组分的影响远大于对非极性组分的影响。
例如在水溶液样品溶剂中加入0.01mol/L氯化钠溶液可使甲醇、乙醇灵敏度在有机溶液中加入水，可以减少有机物在有机相中的溶解度，增大其在顶空气体中的含量（常用）。
例如采用FID检测器测定三氯甲烷，DMF为溶媒，顶空进样1ml气体，分
流比5：1，限度浓度的对照品溶液检不出峰。
改为：水为溶媒，三氯甲烷用少量乙醇溶解，水稀释至刻度，顶空进样2ml 气体，不分流进样，结果限度浓度的对照品溶液可检出很明显的色谱峰，灵敏度可达到限度的五十分之一。提高5倍（这种方法不常用）。