Progress in Veterinary Medicine
哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术研究进展
(1.石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000 ;
2.新疆生产建设兵团农垦科学院绵羊繁育生物技术重点实验室,新疆石河子832000)
中图分类号: S852. 2文献标识码:A
菌肽对疱疹病毒、感病毒、滋病病毒等有囊膜病
毒有明显的杀伤力。③不易产生耐药性。相对传统
的抗生素而言,细菌对抗菌肽更难产生耐药性。
④抗肿瘤活性。使肿瘤细胞不能贴壁和正常生长。
⑤无残留、毒副作用。
机制独特等特点。文章主要综述了几种哺乳
动物上皮细胞抗菌肽的分离纯化技术研究概
哺乳动物抗菌肽研究起步较杀菌肽(cecropin)、况。
fensin)晚,但是发展速度较快,至今已经分离纯化或
克隆得到数百种哺乳动物上皮细胞抗菌肽。
哺乳动物的皮肤和黏膜直接与外界接触,是病
原体入侵的门户,为了抵御病原体的入侵,当机体受
病原微生物刺激后在上皮细胞(气管、和小肠等黏
抗菌肽( t racheal antimicro bial peptide , TA P)、舌抗生物入侵的第一道分子屏障,也是生物体先天性免
疫的重要组成部分[ 3 ]。抗菌肽具有抗细菌、菌、
虫和一些有被膜病毒的作用,作用机制独特,不易产
pep tidoglycan ( P GN ) reco gnitio n p roteins ,
阔的应用前景[ 4 ] ,故从不同的哺乳动物上皮细胞中
分离纯化具有抗菌活性的多肽是研究的重点。
它是从哺乳动物上皮细胞分离纯化得到的第一个抗1. 1抗菌肽的理化特点菌肽, TA P的发现为其他的哺乳动物上皮细胞抗菌
抗菌肽的理化性质主要有以下几点:①分子质
量小,氨基酸组成少于100个。②热稳定性高,
100℃加热10 min～15 mim ,仍能保持一定的活力。
③水溶性好。④等电点(p I)一般大于7 ,具有较强的
阳离子特征。
1. 2抗菌肽的生物功能特点提。纯化采用3步色谱技术,第一步凝胶过滤色谱
抗菌肽的生物功能特点主要有:①广谱高效的
抗菌活性。抗菌肽对革兰氏阳性菌、兰氏阴性菌、
真菌及原虫均有高效广谱的杀伤作用,并且它的抗的柱子,用50 mmol/ L的乙酸铵( p H 4. 1 )平衡、
菌浓度小,一般在微摩尔水平。②抗病毒活性。抗 2. 5 mL/ min流速洗脱,收集、冷冻干燥并做抑菌试基金项目:兵团科技局基础研究项目(2006J C01)
动物医学进展 ,2006 ,27 (11) :29233
3
陈 琛1 ,2 ,王新华2 ,薄新文2 3 ,王运宏1
文章编号 :100725038 (2006) 1120029205
摘 要 :抗菌肽是在动植物体内发现的氨基 酸数目少于 100个的一类多肽 ,是哺乳动物 防御体系的一个重要组成部分 ,具有分子质 量小、对热稳定、水溶性好、广谱抗菌和作用
2 哺乳类动物上皮细胞抗菌肽的分离纯化
关键词 :上皮细胞抗菌肽 ;分离纯化 ;层析 ;哺 乳动物
2. 1 牛上皮细胞抗菌肽的分离纯化
膜)产生抗菌肽 [ 122 ]。这些小分子抗菌肽构成病原微
菌肽 ( bovine lingual antimicro bial pep tide , L A P)、
al peptide) ,即肠肽素及牛肽聚糖识别蛋白 [ bovine
生耐药性 ,在医药卫生和食品防腐等方面显示有广
B P GRPs ]。
Diamo nd G 等 [ 7 ]从牛气管黏膜分离得到 TA P ,
1 抗菌肽的特点
肽的发现奠定了坚实的基础。Tarver A P 等 [ 8 ]从牛
小肠分离纯化得到牛肠肽素 ,其方法为采集牛小肠 , 液氮冻存 , - 70℃保存备用。粗提制备 :剪碎 ,研 磨 ,匀浆 ,用 100 mL/ L 乙酸过夜搅拌浸提 ,过滤 ,液 体用 1 mol/ L 硫酸铵沉淀 ,离心 ,上清液浓缩即得粗
流艾
无
舌
真原
革
作者简介 :陈 琛 (1978 - ) ,男 ,陕西宝鸡人 ,硕士研究生 ,主要从事动物传染病诊断与防制研究。3通讯作者
30 动物医学进展2006年第27卷第11期(总第158期)
验。有活性部分进行阳离子交换色谱,用330 g/ L KH 2 PO 4溶液平衡,0 mol/ L～1 mol/ L的NaCl线
性梯度洗脱,收集冷冻干燥。将有抗菌活性的部分
H PL C) ,0. 46 cm×22 cm C18反相柱,平衡1 mL/ L
三氟乙酸( TFA )水溶液,洗脱 1 g/ L TFA/乙腈,乙腈梯度0 mL/ L～850 mL/ L ,洗脱速度 1 mL/ min , 收集进行活性检测、子量鉴定及序列测定。
[9 ]
行质谱分析,氨基酸测序。B P GRPs的纯化则先将
粗提产物采用10 cm× 25 cm C18 cat ridge进行浓
溶液,洗脱 1 mL/ L TFA/乙腈,乙腈梯度0 mL/ L～[ 10 ]
2. 2绵羊上皮细胞抗菌肽分离纯化
绵羊抗菌肽包括3类共11种。这3类分别是
防御素( defensin) Cat helicidins、羊肺部表面活性
peptides , SAA Ps)。截止目前,这11种绵羊抗菌肽
中Cat helicidins类的SMA P29和SMA P34已能人
工化学合成; OaBac5从绵羊中性粒细胞中分离纯化,SAA Ps从绵羊肺部分离纯化,其他7种均为克
隆得到的cDNA序列,还没有从蛋白质水平分离纯
化得到。
SAA Ps分离纯化方法如下[ 11 ] :用蒸馏水冲洗绵羊肺脏,收集冲洗液,在4℃以30 000 r/ min离心
1 h。清液用高压液相色谱纯化,0. 39 cm×30 cm
C18柱,0. 1 % TFA、10 %～100 %乙腈,梯度洗脱, 洗脱速度 1 mL/ min。213 nm～217 nm波长测定吸
光度,收集洗脱液进行抑菌活性检测,氨基酸序列测定,最后得到仅含7个氨基酸的SAA Ps。
2. 3猪上皮细胞抗菌肽分离纯化
已经从猪体内发现至少13种以上不同的抗菌肽,中性粒细胞中存在10种,上皮细胞中存在3种,
[ 12 ]
猪Cecropin P1分离纯化采用3步层析技术[ 13 ]。猪小肠上皮细胞抗菌肽粗提物制备方法为: 950 mL/ L的乙醇室温浸提猪小肠上皮细胞24 h ,过滤除去沉淀,冷冻干燥得到粗提物。第一步离子交换层析,将冷冻干燥粗提产物溶解在0. 1 mol/ L甲
色谱,用上述缓冲液平衡,先用0. 1 mol/ L甲酸铵(p H 6. 4)洗脱,再继续用0. 1 mol/ L～0. 85 mol/ L 的乙酸铵(p H 5. 2)梯度洗脱,280 nm波长测定吸光度,收集,冷冻干燥。将冷冻干燥产物溶解在水中, 做抑菌活性检测。第二步用Sep haro se进行纯化, 平衡0. 3 mmol/ L乙酸铵(p H 5. 2) ,先用此平衡液
洗脱230 mL至基线出现,再用0. 3 mol/ L～
0. 5 mol/ L的乙酸铵梯度洗脱。检测波长同上,收集,冷冻干燥溶解在 1 mL/ L TFA中进行第三步纯化,上样于反相FPL C ,平衡 1 mL/ L TFA水溶液, 洗脱 1 mL/ L TFA/乙腈,0 mL/ L～48 mL/ L的乙
腈梯度洗脱,收集进行抗菌活性检测,重复进行3次FPL C纯化。氨基酸序列测定、子质量大小鉴定, 最终分离得到含31个氨基酸,分子质量为 3. 326 ku 的Cecropin P1。Agerbert h B等[ 14 ]从猪小肠上皮
抗菌蛋白,将粗提物分别进行Medium和Fine
经过3步纯化后,得到氨基酸数目为39个,分子质此外,马卫明等[ 15 ]采用两步凝胶过滤层析,
希菌、黄色葡萄球菌、脓杆菌的猪小肠抗菌肽类
似物。
2. 4鼠上皮细胞抗菌肽分离纯化
Ouellet te A J等[ 16 ]从鼠小肠上皮细胞分离纯
化到小肠防御素。方法是将鼠小肠匀浆,300 mL/ L 乙酸浸提。在4℃以15 000 r/ min离心30 min ,取上清冷冻干燥。冷冻干燥产物溶解在300 mL/ L乙酸中,进行凝胶过滤层析。第一步凝胶过滤层析,
子,300 mL/ L乙酸平衡、洗脱,流速 1. 67 mL/ min , 收集冷冻干燥。第二步将凝胶过滤冷冻干燥产物溶
H PL C纯化用1 cm×25 cm C18柱,平衡1. 3 mL/ L 七氟乙酸,0 mL/ L～400 mL/ L的乙腈梯度洗脱,流速 3 mL/ min ,收集冷冻干燥,活性检测。重复进行
进行第三步分离纯化 ,反相高压液相色谱 ( RP 2
Ao no S 等从牛乳腺上皮
的牛β防御素 ,并进行树脂进行纯化 ,纯化抗菌肽进
。
420 mL/ L
在于猪小肠上皮细胞。
酸铵 (p H 6. 4)中 ,进行 CM 2Sep haro se 阳离子交换
分
、绵
上
分
金绿
1次 RP 2H PL C 纯化 ,平衡 1 mL/ L TFA 水溶液 ,洗
小肠上皮细胞即得粗提。纯化采用 RP 2H PL C ,
平衡 陈正望等从狗小肠中分
化得到 ,恒河猴肠肽素 4 ( R ED 24)用生物化学方法从 Gel00030层析纯化 ,用h50收mL/上的乙酸清进。收集 ( MALD I 2TO F 2MS)测定分子质量并进行抑菌活性
再进行下一步分离纯化。第二步 RP 2H PL C 纯化 , 活 检
1. 陈 琛等 :哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术研究进展
31
脱 160 mL/ L ～210 mL/ L 的乙腈梯度洗脱 ,流速同 上。
Ayabe T 等 [ 17 ]也从鼠小肠上皮潘氏细胞中分 离纯化得到肠肽素 ,方法是 300 mL/ L 乙酸浸提鼠
1 mL/ L TFA 水溶液 ,100 mL/ L ～450 mL/ L 的乙 腈梯度洗脱。收集、性检测 ,质谱分析及氨基酸测 序。
2. 5 狗上皮细胞抗菌肽分离纯化
[ 18 ]
量约为 4 ku 的生物活性肽。方法如下 :将新鲜狗小 肠去脂 ,加入 0. 5 mol/ L 乙酸 ,匀浆 ,4℃搅拌浸提 24 h ,离心 ( 4℃,7 000 r/ min ,25 min) ,收集上清 液。上清液用 2 mol/ L HCl 调 p H 至 2. 7 ,加入海藻 酸 ,缓慢搅拌 30 min 后静置 10 min ,倾去液体 ,用布 氏漏斗收集海藻酸 ,用 0. 002 mol/ L HCl ( 100 mL ) 清洗海藻酸 ,抽滤并去滤液 ,再向海藻酸中加入 0. 2 mol/ L HCl ( 100 mL )洗脱 ,收集洗脱液 ,用乙 酸钠调 p H 至 3. 5 ,加入 NaCl ( 320 g/ L ) 35 g 搅拌 15 min 后于 4℃静置过夜 ,次日用布氏漏斗收集盐 析物 , - 20℃保存。乙醇沉淀分离。将上述盐析物 溶于 50 mL 的 0. 2 mol/ L 乙酸 ,抽滤 ,滤液调 p H 至 7. 2 ,加入乙醇 200 mL , - 20℃冰箱静置 48 h ,去上 清 ,将浊液离心收集沉淀物。
离。用 0. 2 mol/ L 乙酸平衡凝胶柱。取上述沉淀物 溶于乙酸中 ,离心 ( 10 000 r/ min ,12 min) ,取上清 上凝胶柱 ,用 0. 2 mol/ L 乙酸洗脱 ,流速 1. 8 mL/ min ,220 nm 波长测定吸光度 ,按峰收集 , 洗脱液冷冻干燥。
(含 0. 1 % TFA 的乙腈)平衡反相柱 ( ODS2C18 )。 将样品溶于 A 液 (含体积分数为 0. 1 % TFA 的超纯 水) ,每次的上样量为 20μg ( 1μg/μL ) ,用体积分 数为 20 %～ 50 %的 B 液梯度洗脱 30 min ,流速 1 mL/ min ,214 nm 波长测定吸光度 ,按峰收集后冻 干 ,检测活性。
2. 6 恒河猴上皮细胞抗菌肽分离纯化 从恒河猴体内发现 13种抗菌肽 ,可分为两类 ,
R EDs)。7个 RMAD 从恒河猴骨髓细胞中分离纯
小肠上皮细胞分离纯化得到 ,其方法如下 [ 19 ] :恒河 猴小肠粗提制备产物用 300 mL/ L 乙酸浸提 ,4℃以
各峰利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 检测 ,若有抗菌活性并且分子质量≤10 ku 的收集峰
用硅胶 C18柱 ,缓冲液为 0. 1 % TFA 水溶液 ,15 % ～45 %的乙腈梯度洗脱 150 min 。收集、测活性、 2. 7 人上皮细胞抗菌肽的分离纯化
β
已发现的 HN P 共有 6种 ,主要产生于中性粒细
细胞 (如消化道、呼吸道、泌尿生殖道、角膜等 ) ,
肺
表达常局限于附睾。人的上皮细胞 Cat helicidins 类
Howell S J 等 [ 20 ]从人结肠上皮细胞分离纯化
得到 4个抗菌肽。方法是剥取人结肠上皮黏膜 ,按 1 g 上皮黏膜加 10 mL 200 mL/ L 乙酸 ,再分别加入 1. 5 mmol/ L E64、1 mmol/ L 胃蛋白酶抑制剂、 2 mmol/ L 亮抑酶肽、 5 mmol/ L 抑亮氨酸氨肽酶、 80 mmol/ L 抑肽酶 ,然后超声波细胞破碎仪破碎细 胞 ,4℃过夜浸提 ,离心收集上清 ,调 p H 至 7. 0 ,即 得粗提物。第一步纯化采用离子交换层析 ,利用
10 mmol/ L 磷酸钠缓冲液 (p H 7. 4)洗脱。第二步阳 离子交换高压液相层析 ,柱子 0. 46 cm ×20 cm ,洗 脱缓冲液 A 为 20 mmol/ L ,p H 6. 0的乙酸铵 ;缓冲 液 B 10 mL/ L ～100 0 mol/ L 乙酸梯度洗脱 ,洗脱速 度1 mL/ min ,收集检测生物活性和测定蛋白含量。
0. 21 cm × 25 cm C18反相柱。洗脱缓冲液 0. 1 %
TFA / 50 mol/ L ～100 0 mol/ L 乙腈 ,梯度洗脱 ,洗 脱速度 0. 35 mL/ min ,214 nm 波长测定吸光度 ,收
32 动物医学进展2006年第27卷第11期(总第158期)
到5种较纯的组分,其中4种具有抗菌活性。
李明等[ 21 ]分离、鉴定了人子宫黏液抗菌多肽。
方法如下:收集健康女性子宫黏液,50 mL/ L乙酸浸
PA GE电泳分析,活性检测,切割抗菌条带,进行制
TFA/ 0 mL/ L～600 mL/ L乙腈线性梯度洗脱,流速
1 mL/ min。收集洗脱液,冷冻干燥后溶于
0. 1 mL/ L乙酸,检测抗菌活性。
3展望
哺乳动物上皮细胞抗菌肽分离纯化技术主要有
凝胶过滤层析、子交换层析和高压液相层析等,在
具体的分离过程中根据不同的组织材料将这3种技
术结合运用,最终达到高效的分离纯化目的。不断
改进的抗菌肽活性检测技术(琼脂糖孔穴扩散法、
量肉汤稀释法)和质谱技术为分离纯化提供了强有
力的技术支撑,解决了分离纯化产物鉴定中技术难
点。仍存在的问题是从动物上皮细胞分离纯化抗菌
肽含量较低,成本高,无法满足临床应用。相信在基
因工程技术快速发展的今天,将会有一批抗菌活性
高的抗菌肽新产品实现批量生产。
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提 ,离心去沉淀、上清透析、冷冻干燥。进行尿素2 备电泳 ,电洗脱。进行 RP 2H PL C 纯化 , 1 mL/ L
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动物医学进展 ,2006 ,27 (11) :33237
臧 丽 ,李英俊 ,张乃生 3 ,王兴龙 ,周 虚
文章编号 :100725038 (2006) 1120033205
摘 要 :乳头管的结构和内衬的角质蛋白是 乳腺抵御微生物侵入的物理性屏障 ,角蛋白 中的低级脂肪酸、阳离子蛋白质对侵入的病 原微生物具有抗性 ;环境性致病菌是引起机 组成了自然的免疫系统 ,它们通过分泌细胞 因子、体和吞噬作用等活动来灭杀、除侵
床型乳腺炎的监控具有参考性。 关键词 :乳腺 ;防御机制 ;乳腺炎病理学
从 20世纪 80年代初 ,乳制品的生产量在西欧、 北美、洋洲和亚洲都有了快速的增长 ,奶牛养殖业
酸 ,这样的物质构成极大地提高了角蛋白对病原微
炎 中 Progress in Veterinary Medicine
奶牛乳腺的防御机制与乳腺炎病理学
(吉林大学畜牧兽医学院 ,吉林长春 130062)
中图分类号 : S857. 26 ; S858. 23文献标识码 :A
主也在试图增加原料奶的产量以提高经济效益。但 多项研究表明 ,高产奶牛总是处于感染各种疾病的 危险之中 [ 1 ]。在奶牛的疾病中 ,临床型乳腺炎是引 起奶牛业经济损失的最主要原因 ,该病所造成的经 济损失包括降低牛奶的产量和质量、增加奶牛的淘 体免疫应答的主要因子 ,巨噬细胞、单核细
汰率、症的治疗费以及额外的劳动支出。乳腺对 胞、性粒细胞和淋巴细胞之间的相互协调 侵入的微生物所产生的免疫反应 ,对维持奶牛机体 的健康极为重要 ,了解乳腺免疫反应这一基本的要 素 ,对于指导疾病的防治有着重要的意义。本文旨
入机体的病原体 ;乳中的可溶性因子具有免在阐明奶牛乳腺受感染后机体的免疫机制和乳腺炎 疫调节作用 ,对细菌的结构具有破坏性 ;妊娠的病理学 ,以提高临床型乳腺炎的防治效果。 期及围产期奶牛由于内分泌的变化而导致免 1 乳头管的屏障作用
疫抑制 ,结果造成临床型和亚临床型乳腺炎乳头管是乳腺预防病原微生物感染的第一道有
的发病率相对较高 ;牛奶体细胞计数对亚临效屏障 ,乳头管壁呈条纹状 ,内衬角质蛋白 ,它来自 于乳头管的上皮细胞 ,这种角质蛋白是一种硬质蛋 白 ,呈网状结构 ,充塞在开放的乳头管处 ,阻碍病原 菌由此进入乳池。在角蛋白中 ,含有高浓度的脂肪 大 基金项目 :国家自然科学基金项目 (30471276)
Progress on Isolation and Purif ication of Epithelial
Antibacterial Peptides in Mammals
( 1. A nimal Science and Technology College , S hihezi University , S hihezi , X inj iang , 832003 , China; 2. The B reed and B iotechnology Key L aboratory of S heep , Xinjiang Production and Constrution Group ,
X injiang A cademy of A griculture and Reclamation Science , S hihezi , Xinjiang , 832000 , China)
Abstract :Antibacterial peptides are polypeptides of fewer t han 100 amino acids t hat are fo und in animal s
and plant s and t hey are key co mpo nent s of mammalian defense system. These active polypeptides have
cular antibacterial mechanism. This review summarized t he p resent knowledge abo ut epit helial antibacterial peptides isolated and p urified in mammal s.
Key words :epit helial antibacterial peptides ;isolatio n and p urificatio n ;chro matograp hy ; mammal s
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从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案
精品资料 仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除谢谢2 生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。
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鱼类抗菌肽的研究进展 作者：江丽娜， 赵瑞利， 雷连成， 王教玉， 韩文瑜 作者单位：江丽娜,赵瑞利,雷连成,韩文瑜(吉林大学畜牧兽医学院)， 王教玉(吉林省水产技术推广总站) 刊名： 中国水产 英文刊名：CHINA FISHERIES 年，卷(期)：2008(5) 本文读者也读过(8条) 1.张书剑.Zhang Shujian几种鱼类抗菌肽的研究进展[期刊论文]-饲料研究2007(12) 2.李华.杨桂文.温武军鱼类抗菌肽研究概况[期刊论文]-科技信息2010(2) 3.黄平.章怀云.HUANG Ping.ZHANG Huai-yun鱼类抗菌肽研究进展[期刊论文]-中南林业科技大学学报2009,29(2) 4.杨学明.江林源.蒋和生.YANG Xue-ming.JIANG Lin-yuan.JIANG He-sheng水生动物抗菌肽及其基因工程研究[期刊论文]-生物技术通讯2006,17(1) 5.王克坚.林志勇.杨明.任洪林.黄文树.周红玲.邓尚龙.陈君慧.蔡灵.蔡晶晶海水养殖鱼类抗菌肽hepcidin基因的研究进展[会议论文]-2005 6.王小玲.尹建文.Wang Xiaolin.Yin Jianwen鱼类的先天性抗菌和抗病毒机制[期刊论文]-现代渔业信息2006,21(7) 7.叶星.白俊杰抗菌肽的研究及其在水产上的应用前景[期刊论文]-大连水产学院学报2000,15(4) 8.单晓枫.郭伟生.张洪波.钱爱东鱼类体液中的几种抗菌因子研究进展[期刊论文]-河南农业科学2010(5) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/601693523.html,/Periodical_zhongguosc200805040.aspx
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
抗菌肽的研究进展 青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素,对保护人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用,不断产生出诸多新问题。如β-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。于是人们开始寻找新一代抗菌剂。近期的研究发现,某些阳离子型多肽具有广谱的抗菌活性,同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性:不会诱导抗药菌株的产生,有希望成为新一代抗菌剂[1]。抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。研究的内容包括:抗菌肽的分离与纯化,氨基酸序列的分析,蛋白质构型与功能的关系,抗菌肽的作用机理[3,4],应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视[5,6]。目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界,包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用,更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物,尤其对耐药性细菌有杀灭作用,并能选择杀伤肿瘤细胞,抑制乙型肝炎病毒的复制。 1. 抗菌肽的分类迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种,仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据抗菌肽的结构,可将其分为5类:(1)单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由无规则卷曲连接的两段а-螺旋组成的肽。该类包括天蚕素Cecropins, Magainins等。Magainins最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的,它是爪蟾的皮肤在一定的环境压力下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分,由两个紧密相连的肽链组成,每一个肽链有23个氨基酸,低浓度便可抑制许多细菌和真菌生长[7]。(2)富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽。如从猪肠内分离的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。(3)含一个二硫键的抗菌肽,该二硫键的位置通常在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins[9]。(4)有两个或两个以上二硫键,具有β 折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素(Phormindefensin),分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键,肽链C末段是带有拟β 转角的反向平行的β片层[10]。实验证明,分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。(5)由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。 2. 抗菌肽的作用及机理 2.1抗菌肽的抗菌作用及其机理抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,造成细菌细胞膜结构破坏,引起胞内水溶性物质大量渗出,而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上,接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中,最终通过膜内分子间的相互位移,抗菌肽分子聚集形成离子性通道,使细菌失去了膜势而死亡[10-14]。但是,Gazit[15]等得出
抗菌肽的研究进展 摘要：由于细菌对抗生素耐药性不断出现, 研发新型抗菌物质已迫在眉睫。而抗菌肽是广泛存在于自然界生物中的具有广谱抗菌、抗病毒、抑制杀伤肿瘤细胞等作用的多肽。本文介绍了抗菌肽的结构，抗菌肽的生物学活性，抗菌肽的作用机理和作用机制，以及抗菌肽的应用和前景。 关键词：耐药性，抗菌肽；作用机理；前景 抗菌肽，简称ABP,是由宿主产生的一类能够抵抗外界病原体感染的小分子多肽。广泛存在于各种生物体内。1980 年，瑞典科学家Boman 等从天蚕蛹的血淋巴中分离得到天蚕素( cecropin ) 抗菌肽，使人们对抗菌肽的作用机理和应用有了一个崭新的认识。目前世界上已知的抗菌肽共有1 700余种。由于热稳定性强，且对较高离子强度环境有较强的适应性，不仅有广谱抗细菌能力, 而且有的对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用，最重要的是可以杀伤动物体内的肿瘤细胞，却又极少破坏动物体内的正常细胞，因此，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外昆虫学、生理学、药理学研究热点，在动植物转基因工程及药物开发领域及农业、食品等领域具有广阔的应用前景。 1 .抗菌肽的结构 1 .1 一级结构 据报道，已分离并测定其氨基酸序列一级结构的抗菌肽达几十种，且一级结构都比较相似，具有以下典型的特征：由20~70多个氨基酸残基组成的肽链，其N 端富含赖氨酸和精氨酸等阳离子型氨基酸，C 端富含丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸等非极性氨基酸，中间部分则富含脯氨酸，且在许多特定位置都有一些较保守的氨基酸残基，这些高度保守的氨基酸残基是一些抗菌肽分子具有抗菌活性所不可缺少的， 1. 2 二级结构 通过圆二色性分析、二维核磁共振谱法及脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，结果表明，抗菌肽在一定条件下形成a-螺旋和β-折叠结构。a-螺旋是一个近乎完美的水脂两亲结构,即圆柱形分子的纵轴一边为带正电-的亲水区，而对称面为疏水区。这种两亲性结构是抗菌肽杀菌的关键，改变a-螺 旋的螺旋度会影响抗菌肽的活性。抗菌肽有许多保守序列,在N端易形成a-螺旋,中间部分易形成β-折叠或铰链。a-螺旋肽主要包括天蚕素、爪蟾抗菌肽ma g a i n i n 、c a t h e l i n d i a 等，β-折叠肽主要包括哺乳动物防御素、植物防御素、昆虫防御素和富含脯氨酸的抗菌肽等。 2 抗菌肽的来源 2.1微生物抗菌肽
生物分离与纯化技术模拟试卷九答案 装 订 线 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．离心分离技术：是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。 2．物理萃取：即溶质根据相似相溶的原理在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 3．有机聚合物沉析：利用生物分子与某些有机聚合物形成沉淀而析出的分离技术称为有机聚合物沉析。 4．平衡离子：离子交换树脂中与功能基团以离子键联结的可移动的平衡离子，亦称活性离子。 5．离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．葡聚糖凝胶可使用那种溶剂溶胀（C ） A.甲醇 B 乙醇 C.缓冲液 D.乙酸乙酯 2．不能用于固液分离的手段为（C ） A.离心 B 过滤 C.超滤 D.双水相萃取 3．最常用的干燥方法有（ D ） A 、常压干燥 B 、 减压干燥 C 、喷雾干燥 D 、以上都是 4．物理萃取即溶质根据（ B ）的原理进行分离的 A.吸附 B.相似相溶 C 分子筛 D 亲和 5．适合小量细胞破碎的方法是（ B ） A.高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 6．关于分配柱层析的基本操作错误(D )。 A 装柱分干法和湿法两种 B 分配柱层析法使用两种溶剂，事先必须先使这两个相互相饱和 C 用硅藻土为载体，需分批小量地倒入柱中，用一端是平盘的棒把硅藻压紧压平 D 分配柱层析适用于分离极性比较小、在有机溶剂中溶解度大的成分，或极性很相似的成分。 7．颗粒与流体的密度差越小，颗粒的沉降速度（ A ） A.越小 B.越大 C.不变 D.无法确定 8．“类似物容易吸附类似物”的原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质（ B ） A ．极性溶剂 B ．非极性溶剂 C ．水 D ．溶剂 9．关于大孔树脂洗脱条件的说法，错误的是： （ A ） A 、最常用的是以高级醇、酮或其水溶液解吸。 B 、对弱酸性物质可用碱来解吸。 C 、对弱碱性物质可用酸来解吸。 D 、如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时，则常常仅用水洗就能解吸下来。 10．亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作 （ D ） A 、 阴性洗脱 B 、剧烈洗脱 C 、正洗脱 D 、负洗脱 11．下列哪一项不是常用的滤布材料 （ C ） A. 法兰绒 B. 帆布C. 滤纸 D.斜纹布 12．阴树脂易受有机物污染，污染后，可用（ B ）处理 A 柠檬酸 B 10%NaCl+2%～5%NaOH 混合溶液 C 氨基三乙酸 D EDTA 13．HPLC 是哪种色谱的简称（ C ）。 A ．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 14．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A ．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 15．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用 （ A ） A 、分离量大分辨率低的方法 B 、分离量小分辨率低的方法 C 、分离量小分辨率高的方法 D 、各种方法都试验一下，根据试验结果确定 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．有机溶剂被细胞壁吸收后，会使细胞壁膨胀或溶解，导致破裂，把细胞内产物释放到水相中去。（√ ） 2．向含有生化物质的水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，能使生化物质沉淀析出。（√ ） 3．等电点沉淀在实际操作中应避免溶液pH 上升至5以上。（√ ） 4．在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS ），影响凝胶的形成。（× ） 5．当气体的温度超过其临界温度，压力超过临界压力之后，物质的聚集状态就介于气态和液态之间，成为超临界流体。（√ ） 6．冻结-融化法冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性来破坏细胞的。（√ ） 7．盐析作用也能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。可以促使生化物质转入有机相从而提高萃取率。（√ ） 8．氨基酸、蛋白质、多肽、酶、核酸等两性物质可用等电点沉析。（√ ） 9．甲醇沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇、丙酮都小，所以应用广泛。（×） 10．若两性物质结合了较多阳离子（如Ca2+、Mg2+、Zn2+等），则等电点pH 升高。（√ ）
我国制药分离纯化技术现状和发展方向 引言：制药工业关系国计民生。一种好的药品，不仅能治疗疾病，而且能够提高国民的身体素质。大千世界，形形色色的动植物，不计其数的化合物，想要从里面找到能够制成药物的有效成分是一件困难的工作。由于药物的纯度和杂质含量与其药效、毒副作用、价格等息息相关，使得分离过程在制药行业中的地位和作用非常重要。因此，制药分离纯化技术在制药工业中具有举足轻重的地位。 一、现状 制药分离过程主要利用待分离的物质中的有效活性成分与共存杂志之间在物理、化学及生物学性质上的差异进行分离，是一个复杂的过程。 近年来，我国的医药产业虽然得了比较大的发展，但是在制药过程上并没有取得重大突破，与发达国家仍有很大的差距。其原因是多方面的，但最主要的原因来自于生产过程中的工艺技术和装备问题，药品提取分离纯化过程作为医药生产过程中最关键的环节，自然而然的成为了首要原因。 目前，在我国制药领域，很多先进的提取分离纯化技术已经得到了发展和应用，但是仍然没有成为制药过程中的主导工艺，依然是以传统落后的提取技术为主导，在制药过程中存在着提取分离技术装备简单，工艺流程单一等缺陷。我国目前的分离提取技术还存在很多不足。设计和开发出一个新的生产系统和设备，显得尤为迫切。 制药提取分离技术及其装备关系到三个问题：(1)能否最大限度
地从药材中提取有效成分，但是保证无用的物质不能被同时转移。(2)能否尽量使所提取物质的量相对平均；(3)能否在尽量满足最大产能的情况下，把成本降到最低。简单来说是产率、工艺条件稳定和效率三个问题。这些问题如果能得到有效的解决，就能为后续生产环节制提供良好的生产环境，实现提高生产质量的最终目的，目前，我国大部分所使用的传统提取工艺和装备都难以解决以上的几个问题，生产中仍然以传统落后的工艺技术和装备为主导，提取生产过程中的装备陈旧、工艺流程单一，集成优化和高效节能的成套装备虽然已经开发出来，但是并没有得到广泛应用，因此，充分利用各种先进的提取分离纯化技术，先进的装备的优势以及自动化控制与在线检测系统的优势，开发出先进、适用的中药提取分离技术流程，并使其得到推广和广泛的应用。 传统的分离纯化方法主要有水提醇沉法(水醇法)、醇提水沉法(醇水法)、酸碱法、盐析法、离子交换法和结晶法等。新的分离纯化方法主要有絮凝沉淀法、大孔树脂吸附法、超滤法、高速离心法等。这些新技术的推广应用，降低了生产成本、提高了产品质量，推动了医药的现代化进程，为我国的医药行业走向国际市场奠定了基础。 二、发展方向 我国的医药生产水平与世界先进的药物提取水平差距甚大，影响了我国医药产品在世界药品市场的地位。中国已经加入WTO，国内医药生产企业要想在竞争中赢得主动，必须采用先进的提取分离技术，才可能使我国医药产品生产和销售在国际市场占有更多的份额，
抗菌肽的研究进展 04002424 赵谦一 青霉素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此发展了大量的β-内酰胺类抗生素,对保护人类健康作出了巨大贡献。但随着上述“传统抗生素”的广泛使用,不断产生出诸多新问题。如β-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。于是人们开始寻找新一代抗菌剂。近期的研究发现,某些阳离子型多肽具有广谱的抗菌活性,同时具有“传统抗生素”无法比拟的优越性:不会诱导抗药菌株的产生,有希望成为新一代抗菌剂。 抗菌肽是具有抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人从惜古比天蚕蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。研究的内容包括:抗菌肽的分离与纯化,氨基酸序列的分析,蛋白质构型与功能的关系,抗菌肽的作用机理,应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因以及动植物的转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视。目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生
物界,包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用,更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用,大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用,有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物,尤其对耐药性细菌有杀灭作用,并能选择杀伤肿瘤细胞,抑制乙型肝炎病毒的复制。 1.抗菌肽的分类 迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种,仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据抗菌肽的结构,可将其分为5类:(1)单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽,或由无规则卷曲连接的两段а-螺旋组成的肽。该类包括天蚕素Cecropins, Magainins等。Magainins最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的,它是爪蟾的皮肤在一定的环境压力下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分,由两个紧密相连的肽链组成,每一个肽链有23个氨基酸,低浓度便可抑制许多细菌和真菌生长。(2)富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽。如从猪肠内分离的抗菌肽PR39中Pro含量占49%。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly。(3)含一个二硫键的抗菌肽,该二硫键的位置通常在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins。(4)有两个或两个以上二硫键,具有β折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素,分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键,肽链C末段是带有拟β转角的反向平行的β片层。实验证明,分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。(5)由其他已知功
抗菌肽的研究进展 王亮赵协常维山 山东农业大学动物科技学院 摘要：具有广谱高效杀菌活性的小分子多肽类物质———抗菌肽,是机体非特异性免疫系统的重要组成部分。在动植物体内分布广泛, 是天然免疫防御系统的一部分。据研究表明,抗菌肽对细菌、部分真菌、原虫、病毒、肿瘤细胞都具有杀伤作用。从目前国内外在抗菌肽研究热点着手,分析阐述了抗菌肽的分类、作用机理、抗菌肽基因工程,及抗菌肽在农业、畜牧业中的应用,并对微生物针对杭菌肤的耐药性进行了简单讨论。关键词：抗菌肽;基因工程;耐受性；作用机理；阳离子抗菌肽。 抗菌肽(Antibacterial pep tide)是生物细胞特定基因编码、经特定外界条件诱导产生的一类多肽, 具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等特点,不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体、螺旋体及一些活性细胞有杀伤活性, 还在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面有重要作用。随着抗生素的大量使用，耐药性的问题越来越严重，寻找合适的活性物质来替代抗生素是解决这一问题最有效的途径。抗菌肽具有水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生耐药性等优点,是理想的抗生素替代品。笔者就目前国内外对抗菌肽的研究及抗菌肽在农业中的应用综述如下。 1 发展历程 1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽,并将其命名为cecropin。此后,许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点。2007年3月,中国科学院昆明动物研究所在动物来源的抗菌肽研究方面取得重要进展。研究小组在单个两栖动物个体中发现了107种新型的抗菌肽类似多肽，占全世界已知抗菌肽总数的10%左右,并克隆了372条抗菌肽基因，分属于30个不同的多肽家族,是目前世界上发现的最丰富的抗菌肽资源。抗菌肽是一类很难导致微生物耐药性的新型抗感染药物多肽，目前世界上已知的抗菌肽共有1200多种。 2 抗菌肽的分类 根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。 3 抗菌肽的作用及机理 抗菌肽作用机理的研究主要集中在抗菌肽与质膜的相互作用的问题上。抗菌肽与细胞膜的作用大致分
（生物科技行业）生物分离与纯化技术复习重点
生化分离技术复习重点 1.生化分离，生化分离技术的基本步骤 生物分离与纯化的目的是从微生物发酵液，酶反应产物，动植物细胞培养和生物体本身分离并纯化对人类有用的，符合质量要求的各种生物药物和生物制品。 来源：（1）动物脏器（2）血液，分泌物和其它代谢物（3）海洋生物（4）植物（5）微生物 特点：（1）目的产物浓度低，纯化难度大（2）活性物质性质不稳定，操作过程容易失活（3）生物材料中生化组分数量大，分离困难（4）生物材料易变质，保存困难（5）生物产品的质量标准高 基本步骤：原料的选取和预处理，分离提取，精制和成品的制作 2.吸附技术 概念：是指在一定条件下，将待分离的料液（或气体）通入适当的吸附剂中，利用吸附剂对料液（或气体）中某一组分具有选择吸附的能力，使该祖坟富集在吸附剂表面，然后再用适当的洗脱机将吸附的组分从吸附剂上解吸下来的一种分离技术 吸附剂类型：（1）物理吸附（范德华力）（2）化学吸附（电子转移）（3）交换吸附（离子交换） 常用的吸附剂：一类有机吸附剂，如活性炭、纤维素、大孔吸附树脂、聚酰胺等；另一类是无机吸附剂，如氧化铝、硅胶、人造沸石、磷酸钙‘氢氧化铝等。 活性炭吸附规律：对具有极性基团的化合物吸附力较大；对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物；对相对分子质量大的化合物的吸
附力大于相对分子质量小的化合物。 影响吸附的因素：吸附剂的性质；吸附物的性质；吸附条件（温度、PH、盐的浓度）、溶剂的影响。 3.膜分离技术 概念：指物质在推动力作用下由于传递速度不同而得到分离的过程。特点：易于操作；成本低、寿命长；高效；常温下操作无相态的变化，分离精度高，没有二次污染；膜材质的价格高；操作过程中膜面容易被污染；膜的耐药性，耐溶性，耐热性能有限。 类型：渗析；电渗析；微滤；超滤；反渗透；纳滤；气体分离 微孔滤膜清洗和再生方法：将滤膜平放于清洁盛器内，用60℃左右的蒸馏水浸泡，使全部湿润，数小时候（约4小时以）倾去水，再用上法浸泡12小时，使用前再用适量温蒸馏水清洗一次。 微孔滤过膜截留粒子的范围：0.1—10μm的粒子。 4.液膜分离技术 概念：是一种以液膜为分离介质，以浓度差为推动力的分离操作，是属于液—液系统的传质分离过程。 组成：膜溶剂；表面活性剂；流动载体；膜增强剂。 分类：乳状液膜；支撑液膜。 液膜分离步骤：制备液膜；液膜萃取；澄清分离；破乳。 影响因素：液膜乳液成分的影响；乳水比；连续的PH；搅拌速度的影响；料液的浓度和酸度的影响；操作温度的影响；接触时间。应用：分离氨基酸；提取抗生素；提取生物碱；提取蛋白质；分离
·综述与专论 ·生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第3期 海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展及其在 食品保鲜中的应用 宫晓静 1，2 吴燕燕 1 （1中国水产科学研究院南海水产研究所，广州510300；2上海海洋大学，上海201306） 摘 要： 海洋无脊椎动物抗菌肽抑菌广谱，稳定性高，且对生物体本身无害，其应用日益引起大量研究者的关注。综述了抗菌肽的几种类型、抑菌机理，介绍了海洋无脊椎动物抗菌肽研究进展、存在的问题并分析其在食品保鲜中的应用前景。 关键词： 海洋无脊椎动物抗菌肽 抑菌机理 结构 活性 食品保鲜 Review on Research Progresses and Application in the Food Preservation of Antimicrobial Peptides from Marine Invertebrates Gong Xiaojing 1， 2 Wu Yanyan 1 （1South China Sea Fisheries Research Institute ，Chinese Academy of Fishery Sciences ，Guangzhou 510300； 2 Shanghai Ocean University ，Shanghai ，201306） Abstract ：Antimicrobial peptides from marine invertebrates are wide bacteriostatic ，high stability and harmless to organism．So their applications have attracted large researchers ’attention day by day．Reviews on the several types ， mechanism of antimicrobial ，the updated research progress ，actual problems and the application in the food of antimicrobial peptides from marine invertebrates were elu-cidated． Key words ： Antimicrobial peptides from marine invertebrates Bacteriostatic mechanism Structure Activity Food preservation 收稿日期：2010-09-14基金项目：海南省重点科技项目计划项目（070121， ZDXM20100005）作者简介：宫晓静，女，硕士研究生，研究方向：海洋生物资源利用；E-mail ：xiaojinggong@163．com 通讯作者：吴燕燕，女，研究员，研究方向：水产品加工与质量安全；E- mail ：wyy1028@tom．com 抗菌肽（antimicrobial peptides ， AMPs ）是一类抗菌活性肽的总称。自1980年瑞典科学家Boman 等 ［1］ 首次在美国天蚕蛹中分离出第一种特殊抗菌活性肽天蚕素（cecropin ）以来，到目前为止，已经鉴定的抗菌肽达1000种以上，并且数量还在持续迅猛增长，最新数据可到国际上最权威的抗菌肽数据库（http ：//www．bbcm．univ．trieste．it / tossi ）查询。 从天然产物中获得抗菌肽并应用于工业，特别是食品保鲜防腐方面的研究是目前国内外的研究热 点。海洋生物种类高达300－500?106［2］ ，其中海洋 大型动物种类有0.5－10?106［3］ 。海洋无脊椎动物，由于其单独依靠体内免疫机制抵抗入侵细菌或病原体，因此內源性抗菌肽丰富，成为开发天然抗菌 肽的重要资源。 1抗菌肽的分类 大多数抗菌肽是小分子短肽（≤10kD ），其三 维结构可用普通的二维核磁共振法获得。根据抗菌肽的核磁共振结构及其氨基酸序列，可将抗菌肽分为5类。1.1α-螺旋抗菌肽在海洋无脊椎动物抗菌肽中，这类分子的典型 代表是Clavanins ， 是1997年Lee 等［4］ 从柄海鞘（Styela clava ）的血细胞中分离得到的，含有一或两个α-螺旋结构，无半胱氨酸残基，具有高效的抗菌活性，但对哺乳动物无细胞毒性。1.2富含半胱氨酸的抗菌肽 大多数海洋无脊椎动物防御素都富含半胱氨酸，形成一个或多个分子内二硫桥。例如，从贻贝Mytilus
生物分离与纯化技术模拟试卷三答案 一、名词解释（每小题3分，共15分） 1．CM-Sephadex C-50：羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂，吸水量为每克干胶吸水五克。 2．絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程 3．离心过滤：使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高 4．膜分离：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。 5．层析分离：是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。 二、单选题（每小题1分，共15分） 1．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（ B ）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 2．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（ B ） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．凝胶色谱分离的依据是（B）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 5．如果要将复杂原料中分子量大于5000的物质与5000分子量以下的物质分开选用（D）。 A、Sephadex G-200 B、Sephadex G-150 C、Sephadex G-100 D、Sephadex G-50 6．工业上强酸型和强碱型离子交换树脂在使用时为了减少酸碱用量且避免设备腐蚀，一般先将其转变为（B）。 A、钠型和磺酸型 B、钠型和氯型 C、铵型和磺酸型 D、铵型和氯型 7．下面哪一种是根据酶分子专一性结合的纯化方法（ A ）。 A. 亲和层析 B. 凝胶层析 C. 离子交换层析 D. 盐析 8．以下哪项不是在重力场中，颗粒在静止的流体中降落时受到的力（ B ） A.重力 B. 压力 C.浮力 D. 阻力 9．关于用氢键形成来判断各类溶剂互溶规律，下列（A）项是正确的叙述。 A、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 B、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则有利于互溶。 C、氢键形成是能量释放的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 D、氢键形成是能量吸收的过程，若两种溶剂混合后形成的氢键增加或强度更大，则不利于互溶。 10．关于萃取下列说法正确的是（C） A. 酸性物质在酸性条件下萃取 B碱性物质在碱性条件下萃取 C. 两性电解质在等电点时进行提取 D. 两性电解质偏离等电点时进行提取 11．下列关于固相析出说法正确的是（B） A.沉淀和晶体会同时生成 B析出速度慢产生的是结晶 C.和析出速度无关 D.析出速度慢产生的是沉淀 12．那一种膜孔径最小（C） A.微滤 B超滤 C.反渗透 D. 纳米过滤 13．酚型离子交换树脂则应在（B ）的溶液中才能进行反应 A. pH＞7 B pH＞9 C. pH﹤9 D. pH﹤7 14．一般来说，可使用正相色谱分离（B） A. 酚 B带电离子 C. 醇 D. 有机酸 15．离子交换层析的上样时，上样量一般为柱床体积的（C）为宜。 A. 2％-5％ B1％-2％ C. 1％-5％ D. 3％-7％ 三、判断题（每小题1分，共10分） 1．珠磨法中适当地增加研磨剂的装量可提高细胞破碎率。（×） 2．进料的温度和pH会影响膜的寿命。（√） 3．应用有机溶剂提取生化成分时，一般在较高温度下进行。（×） 4．溶剂的极性从小到大为丙醇＞乙醇＞水＞乙酸。（√） 5．蛋白质为两性电解质，改变pH可改变其荷电性质，pH﹤pI蛋白质带正电。（√） 6．进行水的超净化处理、汽油超净、电子工业超净、注射液的无菌检查、饮用水的细菌检查使用孔径为0.2μm的膜。（×） 7．只有树脂对被交换离子比原结合在树脂上的离子具有更高的选择性时，静态离子交换操作才有可能获得较好的效果。（√） 8．制备型HPLC对仪器的要求不像分析型HPLC那样苛刻。（√） 9．Sephadex LH-20的分离原理主要是分子筛和正相分配色谱。（√） 10．水蒸气蒸馏法是提取挥发油最常用的方法。（√） 四、填空题（每小题1分，共15分） 1．常用的蛋白质沉析方法有（等电点沉淀），（盐析）和（有机溶剂沉淀）。 2．蛋白质分离常用的色谱法有（凝胶色谱法），（多糖基离子交换色谱法），（高效液相色谱法）和（亲和色谱法）。 3．离子交换树脂由（载体），（活性基团）和（可交换离子）组成。 4．膜分离过程中所使用的膜，依据其膜特性（孔径）不同可分为（微滤膜），（超滤膜），（纳滤膜）和（反渗透膜）。 五、简答题（每小题7分，共35分） 1．在色谱操作过程中为什么要进行平衡？ 答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。 2、液体环境：为了保持被分离物质运动的均一性，以及好的吸附和解析效果，因此要保持孔隙内部和外部液体环境的一致，所以进行液体环境的平衡。