《动物细胞培养》课程提纲
1. 动物细胞培养技术概述
1.1 动物细胞培养基本概念
p? 动物细胞培养技术
p? 体外培养（culture in vitro）
p? 体内外培养细胞的差异和原因：
n? 失去体内神经系统和内分泌系统对功能细胞的调节作用
n? 丧失支持细胞与功能细胞的相互作用
n? 缺少支持物（细胞外基质）对功能细胞的作用
n? 改变功能细胞生长繁殖的三维几何空间环境
n? 缺乏功能细胞生长繁殖所需的应力等物理因素
p? 体内细胞所处微环境：由细胞本身、支持细胞、胞外基质、可溶性分子、应力、毛细血管以及神经等要素构成，调控细胞在体内的命运。
1.2 动物细胞培养技术的发展历史
1.2.1 动物细胞培养的萌芽
1.2.2 现代动物细胞培养技术的建立
1.2.3 动物细胞培养技术的发展
1.3 动物细胞培养的产品
p? 基于动物细胞培养技术生物医药产品
n? 生产细胞因子、生长因子、酶、抗体等蛋白制品
n? 生产病毒疫苗、病毒载体等
n? 生产细胞制品（干细胞、成体细胞或组织构建）
p? 细胞培养之基础研究
2. 细胞生物学基础
2.1 细胞成分和化学环境
p? 人体的细胞组成、细胞大小、细胞成分
p? 细胞的化学环境
p? 小结：
n? 体外培养时大多数细胞直径在12～18 μm
n? 细胞中水占近80％，其次是蛋白质，碳水化合物、脂、核酸含有较大的量
n? 钾离子浓度胞内远高于胞外，而钠离子浓度胞外远高于胞内，在细胞膜两侧有10倍以上的浓度差；胞内钙离子浓度极低
n? 细胞液的总渗透压大约280 mOsm/L
2.2 细胞结构和功能
2.2.1 细胞膜
p? 脂双分子层由磷脂、糖脂、胆固醇和蛋白构成
p? 磷脂具四种类型结构，以甘油或丝氨酸为骨架
p? 脂双分子层是流动的，其流动性受温度、脂肪酸和胆固醇等因素影响
p? 蛋白分子以不同方式镶嵌在脂双层分子中或结合在其表面，并赋予生物膜功能
p? 细胞膜处于动态变化之中
2.2.2 细胞质
p? 含有各种细胞器和可溶性蛋白、蛋白聚集体、酶的复合体、细胞骨架蛋白的高粘稠的胞质液p? 细胞质功能
2.2.3 细胞核
p? 细胞核是真核细胞内最大、最重要的细胞器，是细胞遗传和代谢的调控信息中心
p? 表观遗传修饰：指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。
n? 基因转录过程的调控
n? 基因转录后的调控
2.2.4 线粒体
p? 线粒体是由两套单位膜组成的封闭的囊状结构
p? 通过氧化磷酸化合成ATP，为细胞的生命活动提供能量
2.2.5 内质网
p? 结构：由单位膜围成的形状大小不同小管、小泡、扁囊结构；
p? 功能：细胞内蛋白质与脂类合成的场所；
p? 蛋白质合成：起始于细胞质中游离核糖体→形成肽80→信号肽与信号识别颗粒SRP结合→肽
链延伸终止→SRP与ER上受体结合→SRP脱离信号肽→肽链在内质网上继续合成，同时信80
号肽引导新生肽链进入内质网腔→信号肽切除→肽链延伸至终止→翻译体系解散
p? 糖基化（注意合成场所）：
n? N-连接：N-乙酰葡糖胺由Asn的氨基与蛋白质相连，Asn是在Asn-X-Ser/Thr的识别序列中，X为任意氨基酸；
O-连接：N-乙酰半乳糖胺由Ser、Thr、Hy-Lys或Hy-Pro的羟基和多肽相连n? 核苷酸糖的合成与运输：
u◆ 所有前体糖均在胞浆中合成，包括九碳唾液酸
u◆ 所有核苷酸糖在胞浆中形成，除了磷酸胞苷唾液酸
u◆ 唾液酸活化形成磷酸胞苷唾液酸发生在细胞核中
u◆ 核苷酸糖通过转运子运输至内质网，所有转运子都是逆向转运载体n? N-聚糖形成过程：在内质网外表面膜上形成七糖（5个甘露糖Man以及2个N酰葡萄糖胺GlcNAc）骨架结构→翻转至内质网内部→Glc3Man9GlcNAc2成熟核心形成→成熟核心转
移至初生蛋白分子上的结合位点（Asn-X-Thr/Ser）→蛋白折叠→切除3Glc和1Man→转移至高尔基体
p? 新生肽的折叠与组装：Glc3Man9GlcNAc2连接到新生肽链上后开始折叠→3Glc信号调节蛋白折叠→分子伴侣在蛋白折叠中起重要作用→一些未正确折叠的蛋白被送到蛋白酶体中降解2.2.6 高尔基体
p? 结构：由扁平膜囊和大小不等的囊泡构成
p? 功能：蛋白的加工（糖基化和水解）和运输
2.2.7 其他细胞器
p? 溶酶体：
p? 过氧化物酶体：
p? 核内体
2.2.8 细胞骨架
p? 微管
p? 肌动蛋白纤维（微丝）
p? 中间纤维
2.3 运输机制
2.3.1 物质的跨膜运输
2.3.2 跨膜运输途径
p? 运输机制
n? 简单扩散：顺浓度梯度
n? 协助扩散（载体蛋白、通道蛋白）：顺浓度梯度
n? 主动运输：逆浓度梯度，需ATP或离子梯度（H+、Na+）作为驱动运输的能量u◆ ATP驱动的主动运输
u◆ 协同转运载体蛋白
n? 胞吞与胞吐作用：大分子（蛋白质、多糖、核酸等）与颗粒性物质以膜泡形式进行的跨膜运输
p? 转运子类型
n? 单向转运载体：顺浓度梯度转移一个分子（如葡萄糖、果糖），通常不带电荷
n? 协同转运载体：两种物质以同一方向转运
n? 逆向转运载体：两种物质以相反方向转运
p? 举例
n? 葡萄糖转运蛋白（GLUT1：单向转运载体，协助扩散）；Na+依赖的葡萄糖主动运输（SGLT1）n? 单羧酸转运蛋白：MCT和H+一起转运乳酸、丙酮酸等，基于同向协同转运蛋白协助扩散n? 氨基酸转运蛋白：氨基酸转运蛋白对运载的氨基酸种类有重叠；一些氨基酸竞争同一个转运蛋白，许多氨基酸存在两种以上的转运蛋白
n? 离子转运：
u◆ 其他主要离子（H+、Na+、K+、PO43-、Cl-）的浓度在膜两侧相差很大；Na+和K+在细胞膜两侧有约10倍的相反浓度梯度；细胞内的钙离子浓度非常低，浓度差很大。
u◆ Na+-K+ATPase在维持Na+和K+浓度梯度中起很大的作用，ATP酶利用水解ATP作为能量来源
2.4 蛋白合成与运输（略）
2.5 蛋白质糖基化
p? 蛋白质糖基化不均一性
n? 微观不均一性：在同一蛋白结合位点上连接的O型、N型多聚糖分子结构不同
n? 宏观不均一性：蛋白分子上常呈现多个糖基化位点，不是所有蛋白质上的多糖结合位点都会被占据。蛋白分子上不同结合位点的占有情况不同
p? N-连接多糖结构：高甘露糖型、复合型、杂合型，它们共享三甘露糖中心域结构（Man3GlcNAc2）n? 高甘露型：多聚糖由五到九分子甘露糖组成（Man5-9GlcNAc2）
n? 复合型：两分子GlcNAc结合到三甘露糖中心域
n? 杂合型：高甘露糖与复合型聚糖的联合体，至少有三分子的甘露糖且不止一分子GlcNAc位于非还原甘露糖上。
p? 物种间聚糖多样性
2.6 细胞胞外基质
p? 细胞外基质成分组成
n? 胶原：动物体内含量最丰富的蛋白，具有Gly-x-y重复序列
n? 氨基聚糖和蛋白聚糖：由氨基聚糖和核心蛋白组成
n? 层粘连蛋白：含有与Ⅳ型胶原的结合部位、与整合素结合的Arg-Gly-Asp(RGD)序列
n? 纤粘连蛋白：由不同的亚单位构成，含有RGD序列是为细胞识别的最小结构单位
n? 弹性蛋白：高度疏水的非糖基化蛋白，与胶原纤维共同存在，赋予组织以弹性及抗张性
p? 细胞外基质特性
n? 细胞外基质含有丰富的电荷，能使生长因子、细胞因子等储存其中
n? 细胞外基质是许多类型的细胞附着的基质，并且可以提供细胞生长、分化和发育的信号2.7 细胞生长与死亡
p? 细胞周期
n? 用于蛋白质生产的细胞包括CHO、BHK、HEK293和小鼠骨髓瘤细胞如NS0和Sp2/0等失去其正常生长控制，其细胞周期检查点的控制已被破坏
p? 细胞凋亡及信号途径
n? 细胞培养过程中如营养枯竭、生长因子缺乏、病毒感染或代谢产物积累等导致细胞凋亡n? 启动细胞凋亡的信号通路：死亡受体途径、线粒体途径
p? 衰老和端粒
3. 过程工程中细胞代谢
3.1 细胞培养过程代谢概述
p? 葡萄糖和谷氨酰胺作为主要碳源，其大量消耗以供应生物量增长所需，当其他的糖类如半乳糖或果糖成为唯一碳源时，仍需进入葡萄糖的代谢途径（糖酵解）进行分解代谢
p? 绝大多数葡萄糖消耗转化为乳酸，过量的谷氨酰胺消耗导致了氨的分泌
3.2 葡萄糖和能量代谢
3.2.1 葡萄糖氧化
p? 糖酵解途径
p? 三羧酸循环
p? 氧化磷酸化
p? 线粒体外的氧化磷酸化
n? 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统（NADH）
n? 甘油磷酸穿梭系统（FADH2）
3.2.2 磷酸戊糖途径
p? 氧化阶段：从6-磷酸葡萄糖脱去一分子CO2
n? 产生磷酸化的五碳糖用于合成核苷酸和其他组分
n? 产生2分子NADPH
p? 分子转化
n? 磷酸化的五碳糖转化形成三碳和六碳糖等
n? 允许NADPH和五碳糖以不同比例产生
n? NADPH在生物合成以及中和ROS过程中具有重要作用
3.2.3 乳酸形成
p? 有氧糖酵解
n? 即便在高氧浓度下细胞利用葡萄糖大多经糖酵解产生乳酸，生成乳酸并不是因为缺氧n? 在高的糖酵解通量中，不是所有的NADH在线粒体中由电子传递而氧化
n? 乳酸生成是为了再生NAD+，连续的NAD+补充对于糖酵解是至关重要的
3.2.4 碳代谢流和反应中间物
p? 丙酮酸是控制节点
n? 丙酮酸生成速率由进入线粒体和生成乳酸的过程平衡
n? 通过丙酮酸生成乳酸，使NAD+再生，糖酵解得以持续进行
n? 乳酸脱氢酶是可逆的
n? 单羧酸转运蛋白与质子梯度偶联后转运乳酸
p? 糖代谢还提供构建细胞组成成分的前体物质
p? 培养的细胞需要消耗大量氨基酸，尤其是谷氨酰胺；摄入过量的氨基酸通过两种途径排出3.2.5 NADH平衡
p? 葡萄糖在糖酵解和TCA循环中被氧化，其碳原子不直接和氧反应
p? 能量传递给NADH/FADH2，然后在线粒体氧化磷酸化的过程中与氧反应，生成ATP
p? 总共12分子还原当量（NADH/FADH2）形成后与6个氧气分子反应，生成6分子水
p? 其中2分子还原当量在细胞质中生成（由糖酵解产生），另10分子还原当量在线粒体中生成3.3 代谢中转运作用和转运子
3.3.1 葡萄糖转运（略）
3.3.2 乳酸转运（略）
3.3.3 跨线粒体转运
p? 从糖酵解或者乳酸消耗生成丙酮酸，同时生成NADH，NADH还原当量通过苹果酸-天冬氨酸穿梭载体转移入线粒体
p? 细胞培养过程中大量消耗谷氨酰胺，近一半谷氨酰胺通过α-酮戊二酸进入三羧酸循环
p? 对于脂肪酸和胆固醇合成的前体，乙酰辅酶A在线粒体中合成，同时脂肪酸和胆固醇在线粒体外合成，乙酰辅酶A通过柠檬酸穿梭机制转运到线粒体膜外
3.4 葡萄糖代谢的调控
3.4.1 同工酶和变构调节
p? 细胞在不同组织、在不同条件下表达不同的同工酶，不同的同工酶有不同的动力学和调节作用p? 糖酵解中关键调节酶
n? 己糖激酶（HK）
n? 磷酸果糖激酶（PFK）
n? 丙酮酸激酶（PK）
p? 癌细胞（快速生长细胞）和休眠细胞有不同的同功酶
3.4.2 信号途径和生长控制的调节
p? 细胞生长速率调节信号在葡萄糖代谢中起关键调节作用
n? p53（肿瘤抑制剂）抑制葡萄糖摄取和糖酵解
n? 通过AKT调节葡萄糖、氨基酸的代谢
n? C-myc（原癌基因）刺激糖酵解
p? 快速生长（肿瘤）细胞有快速的糖酵解（和乳酸产生）
3.5 代谢平衡
p? 代谢是许多限制反应节点的一种平衡行为
p? 影响糖酵解通量因素
n? 调节（反馈和细胞生长）
n? 丙酮酸/NADH还原力进入线粒体
n? LDH（NAD+循环速率）
n? 乳酸输出胞外
n? 葡萄糖摄入胞内
3.6 氨基酸代谢
p? 氨基酸的降解
n? 当生产细胞和产物时氨基酸以3-5倍的速率被消耗，额外消耗的氨基酸必须被分泌；
n? 通过转氨、氧化（谷氨酸脱氢酶），氮（氨基）从碳骨架上去除，多余的氮以铵离子或氨基酸形式分泌（如丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺）
n? 碳骨架大部分进入TCA循环，转化并分泌出的非必需氨基酸或转化成丙酮酸和乳酸，或通过柠檬酸转化成胞质中乙酰辅酶A
n? 在培养过程中由细胞大量消耗的谷氨酰胺在细胞质中转化成谷氨酸，或进入线粒体转化成谷氨酸，谷氨酸再转化成α-酮戊二酸，进入碳代谢途径
n? 谷氨酰胺作为腺苷、鸟苷和胞嘧啶合成中的氨基供体，天冬氨酸和甘氨酸也用于合成核酸，Met作为甲基供体，Trp用于NAD合成
3.7 脂代谢
3.7.1 脂代谢概述
p? 动物细胞中脂类代谢的亚细胞定位
n? 细胞质：NADPH合成、类异戊二烯和早期胆固醇合成、脂肪酸合成
n? 线粒体：脂肪酸氧化、乙酰辅酶A合成、酮体合成、脂肪酸延长
n? 内质网：磷脂合成、胆固醇合成（后期阶段）、脂肪酸延长、脂肪酸脱饱和
n? 过氧化物酶体：胆固醇前体合成、胆固醇合成最后一步也在过氧化物酶体中进行
3.7.2 脂转运
p? 脂类转运：
n? 与白蛋白、LDL等形成复合物
n? 形成脂质体复合物
n? 形成可溶性结合物，像山梨糖醇酐脂肪酸酯
p? 脂肪酸摄取：被动运输，过程中不需要依靠能量；被细胞吸收后脂肪酸很快成为酯
p? 胆固醇摄取：与机体LDL结合通过LDL受体被细胞吸收；在细胞培养中胆固醇通过与血清白蛋白结合或与环糊精形成混合物的方式提供。
3.7.3 脂肪酸代谢
p? 饥饿条件下，细胞在线粒体或过氧化物酶体中进行β氧化，分解脂肪酸为乙酰辅酶A，线粒体中，乙酰辅酶A进入TCA循环产生能量
p? 细胞质中，从乙酰辅酶A合成脂肪酸，需要NADPH、HCO3-、ATP及Mn2+，通过脂肪酸合成酶复合体催化完成
p? 胞浆中的酶复合体只能催化合成软脂酸（16C），更长碳链的脂肪酸则需在线粒体或内质网中由脂肪酸碳链延长酶系催化合成
p? 在饱和脂肪酸形成之后通过不饱和反应合成双键，生成不饱和脂肪酸
3.7.4 乙酰辅酶A穿梭
p? 脂肪酸在细胞质中合成，乙酰辅酶A不能通过双分子层膜，需要由柠檬酸穿梭机制进入胞浆3.7.5 胆固醇及生物合成
p? 胆固醇合成的主要原料是乙酰辅酶A，由于乙酰辅酶A也可用于脂肪酸的合成，因此它是胆固醇和脂肪酸这两种脂类物质合成途径的分支点
p? 胆固醇合成需要NADPH+H+供氢和ATP提供能量，每合成1个胆固醇，需18个乙酰辅酶A、16个NADPH+H+和36个ATP，胆固醇合成有18个关键酶，5个存在于过氧化物酶体，13个存在于内质网上，HMGCS于细胞质中
3.8 聚糖合成和蛋白糖基化（略）
4. 细胞系建立和开发
4.1 原代细胞系建立
4.1.1 细胞来源
p? 用于生物制品生产细胞大多是上皮细胞、成纤维细胞、淋巴细胞
p? 培养中的细胞在生理和形态上表现出更接近于其来源的组织特征，而不是物种的特征
4.1.2 原代培养的建立
p? 原代培养建立
n? 组织块外迁
n? 胰酶消化
n? 机械方法
p? 原代培养细胞特点
n? 原代培养的细胞是异质的
n? 原代培养的细胞之间相互依存性强
4.1.3 细胞传代
p? 细胞系（cell line）：经初代培养后，第一次传代培养的细胞
p? 细胞株（cell strain）：从一个经过细胞生物学鉴定的细胞系，用单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群
p? 有限细胞系（finite cell line）：细胞系的生存期有限
p? 在体外培养的正常细胞有两个主要特征：具有两倍体核型和增殖能力是有限的
p? 无限细胞系（也称：连续细胞系）：已获无限繁殖能力、能持续生存的细胞系
4.1.4 细胞转化
p? 细胞转化：细胞发生遗传性改变的一种变化，即涉及DNA的改变，通过细胞转化，细胞获得永生性，即持久的增殖能力
4.2 融合细胞建立
4.2.1 骨髓瘤细胞系
p? 骨髓瘤细胞株的要求
n? 能在体内外传代培养繁殖，并能保存
n? 要求融合率高，瘤细胞不要产生抗体
n? 瘤细胞具有HGPRTˉ或TK ˉ
n? 要求抗8-AG或6-TG，并在HAT中死亡
4.2.2 致敏淋巴细胞
4.2.3 融合方法
p? 生物方法：病毒
p? 化学方法：聚乙二醇
p? 物理方法：电融合
4.2.4 融合细胞选择培养
p? HAT培养选择系统原理
n? 未融合的骨髓瘤细胞因缺乏HGPRT，不能利用补救途径合成DNA而死亡
n? 未融合的淋巴细胞虽具有HGPRT，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡
n? 融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
4.2.5 饲养细胞：人为加入能促进动物细胞和杂交瘤细胞生长繁殖的辅助细胞
4.2.6 杂交瘤细胞克隆化
p? 克隆化培养方法
n? 软琼脂平板法
n? 有限稀释法
n? 单细胞显微镜操作法
4.3 重组细胞构建
4.3.1 瞬时表达：将携带目的基因的载体导入哺乳动物细胞内，但载体并不与宿主细胞的基因进行整合，而是以游离的状态存在并表达目的基因
p? 常用的细胞株：HEK-293、COS
4.3.2 稳定表达：质粒转染进入细胞以后，外源基因可以整合到宿主细胞的基因组上，通过实施选择压力和筛选大量的克隆获得细胞状态良好、能高效表达外源蛋白的稳定细胞株
p? 细胞株
n? CHO
n? 骨髓瘤细胞（浆细胞）
p? 产生重组细胞系的基本步骤
n? 重组表达载体转染
n? 选择标记筛选：DHFR、TK、抗生素抗性选择、多药抗性
n? 选择压力下扩增：DHFR（二氢叶酸还原酶）-氨甲喋呤（MTX），GS（谷氨酰胺合成酶）-甲硫氨酸亚砜（MSX）
n? 细胞克隆
n? 细胞扩增并放大
n? 筛选出高产细胞系
n? 细胞适应无血清悬浮培养
n? 长期稳定性评价
4.4 用于生产的动物细胞
4.4.1 原代细胞
p? 生产上常用的原代细胞：鸡胚细胞、原代兔肾、鼠肾细胞、血液淋巴细胞等
p? 无特定病原体（Specific Pathogen Free, SPF）动物；无传染病的健康动物，即机体内无特定微生物和寄生虫存在，但非特定的微生物和寄生虫容许存在
4.4.2 二倍体细胞
p? 原代细胞经过传代、筛选、克隆，从多种细胞成分的组织中选择出的具有某种特性的细胞株p? 生产上常用的二倍体细胞系（株）：WI-38、MRC-5、2BS等
4.4.3 连续细胞系
p? 用于生产的连续细胞系：CHO、
Vero、Namalwa、BHK-21等
4.4.4 融合细胞
4.4.5 重组细胞
4.5 生产用动物细胞库的建立
p? 建立细胞库：为三级管理
n? 原始细胞库
n? 主细胞库
n? 工作细胞库
5. 细胞培养基本操作技术
5.1 器材清洗与消毒
5.2 培养方法
5.2.1 贴壁培养：必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养
5.2.2 悬浮培养：细胞在培养液中自由悬浮生长的过程
5.2.3 微载体培养：能适用于贴壁细胞生长的微珠或片状载体
p? 优良微载体须具备的特性
n? 微载体不得含有毒害细胞的成分
n? 微载体需与细胞相容性好，使细胞容易贴壁生长
n? 微载体比重略大于培养基
n? 微载体珠径在40-120μm，经生理盐水溶胀后，珠径增大到60-280 μm，粒度分布要均匀
n? 微载体须有良好的光学性质和透明的外表，便于用显微镜观察细胞生长情况
n? 能在磷酸盐缓冲液中耐120-125°C、20-30min高压灭菌
n? 基质须是非刚性材料，避免在培养过程中相互碰撞而损伤细胞
n? 不吸附培养基中营养成分，特别是血清
n? 表面须有一定亲水性，使细胞容易贴壁
n? 收获细胞或细胞制品容易
n? 价廉、或能重复使用，不变性
5.2.4 固定化培养
p? 吸附培养
p? 微囊化培养
p? 包埋培养
5.3 细胞生长检测
5.4 细胞冷冻复苏
p? 细胞冷冻保存：将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般<-70℃），并在此温度下对其长期保存的过程
p? 细胞复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程
p? 溶质损伤（或溶液损伤）：细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使未结冰的溶液中电解质的浓度升高，细胞暴露在此溶液中时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，使细胞发生渗漏，在复苏时，大量水分会渗入细胞内造成细胞死亡，这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤称为溶质损伤
p? 细胞内冰晶的损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏，并引起细胞死亡，这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤称作冰晶损伤
p? 冷冻保护剂：保护细胞免受冷冻损伤的物质
n? 渗透性保护剂（可以渗透到细胞内）：小分子物质（如甘油、DMSO）
n? 非渗透性保护剂：大分子物质（如：PVP-聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、白蛋白、羟乙基淀粉）
5.5 培养物的污染
6. 细胞培养过程的培养基设计
6.1 细胞培养环境优化
p? 培养基设计目标：服务于细胞生长和产品生产两个阶段，使细胞发挥最大的生产能力
p? 培养基设计指导思想：通过理解细胞生存的天然化学环境，满足细胞增殖、分化/生产所需6.2 培养基类型
6.2.1 天然培养基
p? 血清在细胞培养中的作用
n? 为细胞的生存、生长和增殖提供所需的生长因子和激素
n? 补充合成培养基中所缺的营养成分
n? 提供载体蛋白以结合维生素、脂质、金属离子等，起运输功能
n? 为贴壁依赖型细胞贴附和铺展提供贴壁因子及基质成分
n? 为细胞培养提供良好的缓冲系统
n? 提供蛋白酶抑制剂
p? 血清在细胞培养中存在的问题
n? 血清中成分复杂，存在许多未确定的成分，对进一步深入研究带来困难
n? 血清批次间差异很大，保存期短，给批次生产的标准化和连续化带来限制
n? 血清中可能携带动物源性病毒、支原体、衣原体等，使产品的质量和安全性受到质疑n? 血清蛋白含量极高，给后续目的蛋白的分离纯化带来极大困扰
n? 血清价格昂贵，特别是胎牛血清，增加了细胞培养过程的成本
6.2.2 合成培养基
p? 合成培养基是在研究细胞生存、生长所需的各种营养成分和环境条件的基础上，设计并开发的适宜细胞体外培养的培养基
p? 大部分动物细胞体外生长和增殖还是需要依赖于血清（10%～20%）
6.2.3 无血清培养基
p? 在合成培养基的基础上添加血清替代物（包括各种动物蛋白）形成的培养基
p? 血清替代物种类
n? 植物蛋白或动物蛋白水解物
n? 动物来源的蛋白、细胞因子和生长因子
n? 动物血清分离组分、血小板浓缩液等
n? ITES
6.2.4 无蛋白培养基
p? 不含有大分子蛋白添加剂，但含有来源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物6.2.5 无动物源性培养基
p? 去除了传统无血清培养基中的动物来源成分，但仍允许含有重组蛋白和植物蛋白水解物的无血清培养基
6.2.6 化学组份确定的无血清培养基
p? 不添加任何蛋白水解物和动物来源的成分，培养基的成分和性质明确的无血清培养基
6.3 基础培养基成分
6.3.1 水
6.3.2 糖和能量来源
6.3.3 氨基酸
6.3.4 维生素
6.3.5 核苷
6.3.6 脂肪酸
6.3.7 盐和微量元素
6.4 培养基中非营养成分
6.4.1 碳酸氢钠
6.4.2 其他缓冲液
6.4.3 抗氧化剂
6.4.4 剪切保护剂
6.4.5 抗生素
6.5 大分子物质及复杂的添加剂
6.5.1 胰岛素和类胰岛素生长因子（IGF-1）6.5.2 转铁蛋白
6.5.3 白蛋白和其他载体蛋白
6.5.4 细胞黏附分子
6.5.5 蛋白水解物
6.5.6 混合脂
6.6 工业化产品生产的培养基
p? 工业化生产用培养基开发难点
n? 细胞对营养物需求的个性化差异大
n? 营养物种类多、浓度变化范围大
n? 营养物交互作用
p? 开发设计核心
p? 开发思路和方法
7. 细胞培养工艺
7.1 细胞培养过程中的反应动力学
7.1.1 细胞生长物质平衡
p? 细胞培养目的
n? 细胞增殖
n? 产物生产（蛋白、细胞、病毒等）7.1.2 反应过程计量学
p? 动物细胞生长曲线
p? 动物细胞生长和产物形成的定量描述
细胞培养过程参数
n? 浓度（密度）
n? 比速率
n? 化学计量比率（得率）
p? 细胞过程的模型建立
7.1.3 反应动力学
7.2 细胞培养工艺
7.2.1 批培养
p? 批培养：将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经过一段时间反应后，将整个反应系取出。
p? 换液培养：批培养过程中在出现营养物限制或代谢副产物抑制之前，取出部分培养液，再补充等体积新鲜培养基继续培养。
7.2.2 流加培养
p? 流加培养：先将一定量培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，在此过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又不断补充至反应器，使细胞更进一步生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。
p? 流加方式
n? 无反馈控制流加
n? 有反馈控制流加
7.2.3 连续培养
p? 连续培养：将细胞种子和培养基一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器内，另一方面又将培养液（包括细胞）连续不断取出，使反应条件处于一种恒定状态。7.2.4 灌注培养
p? 灌注培养：在细胞培养过程中，不断流加新鲜培养基，同时等速排出细胞培养上清，而细胞（活细胞）截留在反应器中的培养过程。
p? 细胞截留装置
n? 重力沉降
n? 过滤
n? 离心
p? 灌注培养基的设计和灌注控制策略
8. 细胞培养的生物反应器
8.1 细胞培养生物反应器工程
8.1.1 温度
8.1.2 pH
8.1.3 溶氧和气体环境（气泡）
p? 溶氧影响细胞的生长和繁殖
n? 氧气参与三羧酸循环，产生能量供细胞生长、增殖和合成各种细胞成分之所需
n? 溶氧过低会影响细胞的能量代谢，从而影响细胞的生长
n? 溶氧过高时也会对细胞产生毒性，抑制细胞生长
p? CO2对细胞培养的影响
n? CO2改变细胞内的pH微环境，影响了细胞内酶反应速率，进而影响细胞的生理功能（细胞生长与产物表达）
n? CO2累积导致培养基的渗透压升高，进而影响了细胞的生长与产物表达
n? CO2为维持pH所必须
n? CO2参与脂肪酸的合成等生物反应
p? 氧和二氧化碳传质特性的差异
p? 生物反应器中气泡作用及气泡所致的细胞损伤
p? 细胞损伤的控制
n? 优化反应器设计
n? 优化工艺参数
n? 优化培养基组成
8.1.4 搅拌（剪切力）
p? 由混合导致的细胞损伤：流体主体的湍流剪切力只有当Kolmogorov漩涡长度≤细胞大小时才对细胞产生破坏作用
p? 由碰撞导致的细胞损伤：基于漩涡的碰撞、基于剪切场的碰撞
8.1.5 渗透压
p? 多数传代细胞对渗透压有较强耐受性，而原代细胞和正常二倍体细胞对渗透压波动则较敏感p? 人血浆渗透压约290mOsm/kg，细胞培养基理想渗透压为：260～320mOsm/kg
p? 渗透压的增加扰乱了细胞正常的离子跨膜梯度，细胞维持能量需求相应增加，需要消耗更多的能源物质
8.2 生物细胞培养反应器
8.2.1 搅拌式生物反应器
8.2.2 气升式生物反应器
8.2.3 填充床生物反应器
8.2.4 中空纤维生物反应器
8.2.5 模拟微重力生物反应器
8.2.6 一次性（抛弃型）生物反应器
9. 干细胞工程
9.1 干细胞生物学概论
p? 干细胞工程是利用干细胞的特性，通过体外对干细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横
向分化、基因修饰和组织成形等，使干细胞为人类服务。
9.1.1 干细胞研究的起源与进展
9.1.2 干细胞定义
p? 干细胞是一类具有自我更新（Self-renewing）和分化潜能细胞。
p? 干细胞分裂
n? 对称分裂（symmetry division）：形成两个相同的干细胞或分化细胞；
n? 不对称分裂（asymmetry division）：由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端，成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来
p? 细胞分化（cell differentiation）
n? 细胞分化是同一来源的细胞，通过细胞分裂，在细胞间产生形态结构、生化特征和生理功能有稳定性差异的过程
u◆ 时间上的分化：一个细胞在不同的发育阶段有不同的形态结构、生化特征和生理功能，如骨髓内血细胞的发生过程
u◆ 空间上的分化：同一种细胞的子代细胞所处的环境位置不同，其形态结构、生化特征和生理功能也不一样，如外胚层来源的细胞可发育成表皮细胞、神经细胞等n? 定向诱导分化：在体外把胚胎干细胞或其它干细胞诱导成特定的分化成熟的功能细胞。
u◆ 祖细胞（progenitor cell）：干细胞发育过程存在的中间类型的细胞，其具有有限增殖和分化的能力，但没有自我更新的能力。
n? 横向分化或转分化（Transdifferentiation）或干细胞可塑性（Plasticity）：指把一种组织的成体干细胞诱导分化成另一种组织的“干细胞”或功能细胞，即跨谱系、跨胚层分化。
n? 去分化（dedifferentiation）：分化细胞失去特有的结构和功能变为具有原谱系未分化细胞特性的过程。
n? 重编程（reprogramming）：成熟的细胞由分化状态逆转到一种未分化状态的过程，且未分化状态的细胞具有多能性（具有进一步分化其他任何一种细胞的潜能）。
9.1.3 干细胞分类
p? 按照发生学来源
n? 胚胎干细胞：是指源自囊胚内细胞团（ICM）的胚胎干细胞（ES cell），通常还包括：畸胎瘤细胞（EC cell：由机体内幼稚生殖细胞发生变异而形成的肿瘤，畸胎瘤内既含有各种分
化成熟的组织，还含有一些未分化的、能不断增殖的干细胞）和胚胎生殖细胞（embryonic germ cell，EG cell：指来自于5-10周龄的胚胎性腺区的原始生殖细胞）。
n? 成体干细胞：其在一生中一直保持持续分裂的能力并可产生特异类型的细胞，主要用于维持细胞功能的稳态。
p? 按照增殖能力和分化潜能
n? 多能干细胞（pluripotent stem cells），包括：胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、胚胎肿瘤细胞、诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells）
n? 组织干细胞或成体干细胞（tissue stem cells or adult stem cells）
p? 按照分化潜能
n? 全能干细胞（Totipotent stem cell）具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能。
n? 多能干细胞（Pluripotent stem cell）具有分化出多种组织细胞的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。
n? 专能干细胞（Unipotent stem cell）只能向一种类型或密切相关的几种类型的细胞分化。p? 根据干细胞组织发生部位
造血干细胞、神经干细胞、脂肪干细胞、间充质干细胞、表皮干细胞、肌肉干细胞、肝脏干细胞、胰腺干细胞、小肠粘膜干细胞……
9.1.4 干细胞生物学特点
p? 具有自我更新与自我维持的能力；
p? 具有多向分化的潜能；
p? 干细胞的分裂能力可维持相当长时间，有的可持续终生；
p? 既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力；
p? 干细胞的自我更新与分化需要特定的微环境，即niches。
n? 干细胞小生境（ stem cell niche ）是指干细胞在机体组织中生存的微环境。
9.1.5 干细胞增殖与分化调控
p? 外源性调控（niches）
n? 分泌因子/信号分子
n? 膜蛋白介导的细胞间相互作用
n? 细胞外基质对干细胞的调控
n? 环境的理化性质
p? 内源性调控
n? 转录因子调控网络
n? 表观遗传学的调控
u◆ 基因转录过程的调控：DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因沉默和RNA 编辑；
组蛋白修饰是发生在染色体组成成分——组蛋白上的修饰，主要有乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等，在调控基因转录中发挥着复杂的作用。
DNA CpG岛的甲基化是指胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸经DNA甲基化酶（DNA methyltransferase，Dnmt）催化，将胞嘧啶第5位碳原子甲基化，是一种DNA复制后的酶促反应过程。
u◆ 基因转录后的调控两部分：基因组中的非编码RNA、微小RNA（miRNA）、反义RNA （antisence RNA）、核糖开关（riboswitch）等。
miRNAs是一类20~25nt的具有调控功能的非编码RNA，以碱基互补的方式与靶mRNA的3‘UTR结合，引起mRNA翻译抑制或者裂解，参与基因转录后水平的调控。9.1.5 干细胞分类阐述
p? 胚胎干细胞：取自胚胎或胎儿中的多能性细胞群，细胞的核型应正常；细胞可在体外无限增殖，并保持未分化状态，单个细胞可形成基因型相同的细胞群体，并能分化为各种细胞类型
n? 胚胎干细胞来源：胚胎干细胞（ES）、胚胎生殖细胞（EG）、胚胎肿瘤细胞（EC）
n? 胚胎干细胞生物学特征：具多向分化潜能（亚全能性）、自我更新能力、端粒酶表达、正常的染色体结构
p? 肿瘤干细胞（tumor stem cells）：具有自我更新和分化潜能的肿瘤细胞亚群
n? 肿瘤干细胞生物学特征：具有肿瘤细胞再生能力并促成肿瘤的异质性，具有多重耐药性和对射线抵抗性，具有恶性肿瘤早期微转移能力，拥有与肿瘤和干细胞相关的信号传导通路，表达与正常细胞、肿瘤细胞和干细胞相关的分子标记。
p? 诱导多潜能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）：通过在分化的体细胞中表达特定的转录因子，以诱导体细胞重编程而获得的可不断自我更新且具有多向分化潜能的细胞。
n? 体细胞重编程方法：转录因子导入、体细胞核移植、将成熟的体细胞与多潜能细胞融合、用胚胎干细胞提取物来处理体细胞。
p? 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）：中胚层来源的具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞
n? 来源：骨髓、肌肉、脂肪、脐带、胎盘、骨、软骨、韧带、血管等。
9.2 干细胞工程原理与技术
9.2.1 干细胞的来源：胚胎、胎儿与新生儿脐带血、成体
9.2.2 干细胞的分离：
p? 细胞分离（cell isolation）：将组织材料分散制成细胞悬液后，从中获取目的细胞的过程。
p? 细胞纯化（cell purification）：从成分混杂的异质性细胞悬液中或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。
p? 细胞富集（cell enrichment）：使培养物中达到以某种细胞为主（占绝大多数）的操作过程。
p? 方法：
n? 解离（散）组织制备细胞悬液：机械分离、酶消化
n? 基于细胞体积和密度：密度梯度离心技术
n? 基于细胞黏附特性
n? 基于细胞表面标志：流式细胞分选术、免疫磁珠分选术、亲和板结合分离法
9.2.3 干细胞的鉴定
p? 依据：形态学标准、标志分子的表达、发育潜能、其他
9.2.4 干细胞体外扩增
p? 胚胎干细胞体外培养
n? 培养目的：维持细胞的未分化状态；维持细胞正常的分化能力和分化范围；维持种系传承（germ-line transmission）所需要的正常核型。
n? 培养方法：饲养层细胞培养体系；无饲养层、无血清培养体系：用细胞外基质包被的培养皿、条件培养基（condition medium，CM）、细胞因子。
p? 间充质干细胞体外培养
p? 造血干细胞体外培养
9.2.5 干细胞定向诱导分化
p? 自发分化（spontaneous differentiation）：在体外培养中胚胎干细胞在去除抑制细胞分化因子后能形成各胚层的细胞，或成体干细胞在体外培养中不定向地向一种或多种成熟的功能细胞分化。
n? 拟胚体（embryoid body，EB）是指在体外培养环境中，若撤除抑制细胞分化的因子（如饲养细胞或白血病抑制因子LIF等），胚胎干细胞就会自发形成多细胞结构，即拟胚体。
拟胚体中含有3个胚层的细胞。
p? 定向诱导分化（directed differentiation）
n? 细胞因子调控
n? 与特定分化细胞（饲养细胞）共培养
n? 干细胞遗传改造（转染外源性转录因子）
n? 其他（化学诱导剂等）
9.3 干细胞治疗及临床应用
9.3.1 细胞治疗基本概念
p? 细胞治疗是将正常的干细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位，代偿病变细胞丧失的功能
p? 细胞治疗需解决四个问题：细胞的来源和数目、如何把干细胞转化成病人所需的功能细胞、如何克服免疫排斥、如何诱导干细胞形成一个具有一定解剖结构的脏器。
p? 细胞治疗的特点：一次性介入，永久性治疗；不需要完全了解疾病发病的确切机理；还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应；可以用来治疗各种疾病，特别是那些对于传统治疗方法无能为力的组织坏死性疾病。
p? 细胞治疗发展
9.3.2 造血干细胞移植
p? 造血干细胞来源：骨髓、动员的外周血、脐带血等
p? 动员（mobilization）：通过对供者注射重组造血生长因子（如G-CSF等），使骨髓中造血干细胞进入外周血中。
p? 归巢（homing）：造血干细胞经外周血静脉会输后再次定位于骨髓或其他器官如脾、肠粘膜等的过程。
p? 造血干细胞移植的适应症及机制
n? 替代治疗
n? 大剂量放化疗后的支持治疗
n? 免疫治疗
n? 基因治疗
p? 移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease, GVHD)：是由于移植物中的免疫活性细胞与免疫受抑制的、组织不相容性抗原受者的组织之间反应所致的一种致命性输血并发症。
9.3.3 干细胞与糖尿病治疗
9.3.4 干细胞与心脏病治疗
9.3.5 干细胞与神经系统疾病
9.4 干细胞研究前沿
9.4.1 核移植技术（nuclear transplantation，NT）
p? 将动物早期胚胎卵裂球或体细胞的细胞核移殖到去核的（同种或异种）受精卵或卵母细胞中，构建新合子，并使其发育为与供体细胞基因型完全相同的后代。
n? 生殖性克隆：通过代孕母亲产生与供体在遗传上完全一致的新生个体
n? 治疗性克隆：是指把克隆出来的组织或者器官用于治疗疾病
9.4.2 孤雌胚胎干细胞
p? 孤雌生殖（parthenogenesis，单性生殖）：卵不经过受精发育成正常的新个体。
n? 卵母细胞孤雌激活：物理刺激（机械刺激、温度刺激、电刺激等）；化学刺激（渗透压刺激、酶刺激、离子处理、麻醉剂处理、蛋白合成抑制剂处理等）
n? 孤雌激活时，由于不同激活因子、刺激强度以及实验条件的影响，有些卵母细胞的第二极体不能排出，因而孤雌激活卵的核型会不一致
n? 孤雄单倍体胚胎干细胞：采用核移植技术，卵母细胞去核后注入精子，形成携带来自父本基因组的单倍体重构胚胎。
9.4.3 基因治疗
p? 基因治疗：将具有治疗价值的基因，即“治疗基因”，装配于具有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，然后导入人体内的靶细胞，它们或与宿主细胞染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中表达，起到治疗疾病的作用。
p? 干细胞作为基因治疗的靶细胞的优势：干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导入体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；干细胞是人体细胞，作为载体毒性最小。
组织研磨管的使用方法 1.作用：只适用于蛋白提取、RNA提取、基因组DNA提取时的组 织裂解，不做他用； 2.组织研磨管：容量为1.5ml, 里面已经提前放置了研磨珠（有时也 不放置），研磨液（Trizol或RIPA裂解液，有时也不放置）一般在取回后才加入，如果已经加入了研磨液，请离心后才拧开管盖，以免研磨液溢出，对皮肤造成伤害，所以操作时，要小心注意！ 3.组织：把收取的组织分切，用生理盐水或PBS缓冲液把分切的组 织上的血液漂洗干净，然后用医用纱布或滤纸把组织表面的水分吸干，然后放入研磨管（组织体积大小为1颗绿豆至2颗黄豆，根据实际情况决定）中，然后把放入的组织尽量剪碎； 4.存放：上述过程应尽量在最短的时间内操作完毕，立即用液氮冻 结，然后置于液氮或-80℃保存； 5.操作事项：操作时间尽可能短，做好一个，立马放置一个；
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (2) 2、研究肿瘤细胞转移 (3) 2.1. 体外(浸润模型) (3) 2.2. 体内(转移模型) (3) 3、研究肿瘤细胞耐药 (5) 3.1. 耐药细胞株的建立 (5) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (6) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
动物细胞培养和核移植技术 备课日期2014年 3 月 4 日课型新授课 教学目标 知识与技能 1\简述动物细胞养的含义。 2\说出动物细胞养的所需条件。 3\简述动物细胞培养的基本程序。 4\简述动物细胞核移植的概念。 过程与方法 情感态度 与价值观 1\通过学习基因工程的概念，使学生认识到科学研究需要的严谨，激 发为祖国而奋斗的精神。 2\通过学习基因操作的工具，使学生树立结构与功能相统一的辩证唯 物主义观念。 教学重点 1\动物细胞培养的过程及条件； 2\用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和应用前景 教学难点用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程 教学方法以探究法、谈话法、材料教学法相结合。 教学用具多媒体课件 课时安排1课时 教学内容设计与反思 板书设计:
教学内容设计与反思一、复习导入: 教师活动：投影幻灯片，引导学生思考、分析讨论。 （1）植物细胞工程常用的技术手段有哪些？ 植物组织培养 植物体细胞杂交 （2）植物体细胞杂交的结果是产生了？ （3）植物体细胞杂交过程中涉及的原理是？ 二、讲授新课: （一）动物细胞工程 动物细胞工程常用的技术手段 动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体、动物细胞培养 动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 （二）动物细胞培养 1.发展历史: 单20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形 成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问 题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的 脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神 经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验 不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后， 在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物 细胞培养。 2、动物细胞培养的应用和概念： 动物细胞培养就是从动物有机体中取出相关 的组织,将它分散成个细胞,然后,放在适宜的 培养基中,让这些细胞生长和增殖. 3、动物细胞培养过程： 引导学生阅读课文44--46面相关内容。
实验四动物细胞的传代培养 1. 实验目的 （1）了解动物细胞培养的基本知识。 （2）了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。 （3）掌握动物细胞的传代培养法。 2.实验背景与原理 2.1 动物细胞培养的基本概念 （1）组织培养：把来自机体内的细胞、组织或器官放在类似于体内的外环境中，使之成活、生长和繁殖。严格又分为细胞培养、组织培养和器官培养。值得注意的是和植物组织培养不同，目前动物组织培养在一般培养条件下难以维持组织的结构和功能，常最终转变成为细胞培养，所以动物细胞与组织培养并无严格区别。（2）原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 （3）传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。 （4）细胞系：原代培养后的细胞经传代即可成为细胞系。若其形态均一，生长增殖稳定，生物性状明确，即可称之为已鉴定的细胞（Certified Cells）。不同种类的细胞成系的难易程度也不同，一般胚胎、更新组织的细胞如造血、上皮等以及
癌细胞较容易成系，而神经等细胞则较难成系。按照其生存期可分为有限细胞系（生存期有限的正常二倍体细胞）和无限细胞系（生存期无限的癌细胞、转化细胞等，大多异倍体） 2.2 动物细胞培养的基本条件 体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。 （1）营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。 培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使用的胰蛋白酶的毒性。第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不可少的。所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清要预先进行血清的筛选实验。一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰胺（Gln）。 （2）胞外环境条件：主要是温度、气体和pH条件。这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。哺乳动物适宜的培养温度是37℃，鸟类是39℃，爬行类是22~25℃等；大多动物细胞适宜的pH条件都是7.2~7.4，以不超过pH6.8~7.6为宜。在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多，
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
一、实验目的 1、学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2、学习并掌握细胞传代培养的方法。 3、学习并掌握用倒置荧光显微镜观察细胞细胞形态。 二、实验原理 细胞培养（cell culture）：细胞在体外条件下生长，细胞不再形成组织。 动物细胞培养（animal cell culture）就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用胰蛋白酶或胶原蛋白酶）然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。由于细胞具有生长和自我复制的能力，为细胞体外培养和研究提供可能。 动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。 原代培养（primary culture）即直接从动物机体分离、获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法。 传代培养（subculture）当细胞生长增值达到一定密度，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，将细胞转移到新的培养皿中扩大培养的方法。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的，但如果把或细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则方便简单的多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类探索防治各种疾病途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，因此，动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 三、细胞培养相关设施及材料 1、细胞培养室 无菌操作区：只限于细胞培养及其它无菌操作，与外界隔离。 孵育区：培养箱设定的条件为37℃，5%CO2。 制备区：培养液及有关培养用液体的制备，液体制备后应该在净化工作台进行过滤除菌。 储藏区：包括冰箱、干燥箱、液氮罐等。 清洗区和消毒灭菌区：清洗区为相对污染区，消毒灭菌区与清洗区分开。 2、细胞培养常用基本设施： 荧光显微镜、超净工作台、孵箱、电热鼓风干燥箱、冰箱、液氮罐、消毒器、恒温水浴槽、滤器等。 细胞培养常用器皿：培养瓶、培养板、培养皿，玻璃瓶、吸管，离心管、冻存管，注射器，烧杯、量筒等。 3、细胞培养用品的清洗、消毒 新玻璃器皿要用5%稀盐酸浸泡，以中和其表面碱性物质：刷洗： 硫酸清洁液浸泡：浓硫酸+重铬酸钾+蒸馏水； 冲洗：流水冲洗15-20次，蒸馏水冲洗3次，三蒸水漂洗1-3次。 所有需灭菌的器械、物品灭菌前均需包装，防止灭菌后污染。使用时放入超净工
动物细胞培养及无血清培养研究进展 摘要：细胞培养是生物学中一项重要技术，应用较为广泛，目前已渗透到细胞生物学、生物化学、临床检验学等多个领域。其中动物细胞培养是动物细胞工程中最常用的技术手段，而且动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。本文主要介绍了动物细胞培养和其中发展较快的无血清培养技术的研究应用进展。为未来实际的研究和生产作一些总结和展望。 关键词：动物细胞；细胞培养；无血清培养基 1 引言 组织培养技术创建于18世纪末，之后于1907 年美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋巴液为培养基在试管中培养蛙胚神经组织宣告成功后，才逐渐发展成为一种从机体获取细胞，模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的实验技术。这种技术为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。近年来生命科学迅速发展，各种在分子水平的实验如核移植、细胞杂交、DNA 介导的基因转移等，都是借助细胞培养技术而得以实现的。然而各领域的动物细胞培养技术发展并不平衡，存在许多的局限性，使用范围有限，还未出现适合整个生命科学研究领域的培养体系。因此本文对细胞培养及大规模培养、无血清培养做一些总结。 2动物细胞培养 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。 2.1动物细胞培养的基本概念 细胞培养指的是从体内组织取出细胞，并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境，给予充分营养，使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段，也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后，由于受群体环境影响，需要转移到另一个容器，这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话，则表示传代成功，这些细胞称为细胞系或细胞株。 2.2动物细胞培养技术的内容
《动物细胞培养技术》复习思考题 1.动物细胞培养的实验器皿清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？如果 器皿中有杂质，会对细胞培养产生什么样的影响？ 答：①离体细胞对各种毒物都很敏感，若所用器材清洗效果未达到要求，各种毒物会损坏细胞影响实验。②器皿使用高压灭菌锅，121.3℃，20~30分钟，在取拿的时候用经过高压灭菌后的镊子取拿，避免造成污染。③ 2.叙述超净工作台的工作原理？ 答：超净工作台最主要的是空气循环过滤的过程，在这个过程中风机起到了心脏的作用。鼓风机驱动空气通过高效过滤器得以净化，净化的空气被徐徐吹过台面空间而将其中的尘埃、细菌甚至病毒颗粒带走，使工作区构成无菌环境。 3.正压过滤器为何会除菌？ 答：正压式过滤器没有内置灭菌灯，正压式过滤器利用的是两层0.22um孔的过滤膜，这层膜可以将细菌阻挡在膜上，过滤的液体流下去就基本上完成了灭菌过程 4.各种细胞培养用液的配制需要很精确吗？如果不精确，会导致什么后果？请举例说明。 你认为精确配制各种溶液？ 答： 5.配制后平衡盐溶液呈黄色意味着液体的pH发生了什么变化？ 答：配制后的液体应呈桃红色，PH值为7.4左右。苯酚红的变色域：1.2（橙）~3.0（黄），6.5（棕色）~8.0（紫色），若为黄色，则液体呈酸性，不利于细胞的生存。 6.用于分离细胞的消化液为什么宜用无Ca、Mg离子的D-Hanks液或PBS液配制 答：Ca＋2、Mg＋2是细胞膜的重要组分，具有使细胞凝聚的作用。因此，用于分离细胞的消化液宜用无Ca＋2、Mg＋2离子的D-Hanks液或PBS液。 7.L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？ 答： L－谷氨酰胺是细胞的能量来源；是一种必须氨基酸，是使物体合成核酸、蛋白质、嘌呤、嘧啶的重要前体，也是蛋白质合成分解的调节物；是细胞内氨的清除剂，氨对一些细胞有毒性。 8.HEPES溶液的作用机理？ 答：它是一种氢离子缓冲剂。主要作用是防止培养基pH迅速变动 9.平衡盐溶液的组成与基本作用？小牛血清在细胞培养中有哪些作用？ 答：①平衡盐溶液主要是由无机盐、葡萄糖组成,它的作用是维持细胞渗透压平衡,保持pH 稳定及提供简单的营养.主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。②作用：a提供能促使细胞指数生长的激素、基础培养基中没有或含量微小的营养物，以及某些低分子营养物质；b提供结合蛋白，识别维生素、脂类、金属离子，并与有毒金属和热源物质结合，起解毒作用；c是细胞贴壁、铺展生长所需因子的来源；d起酸碱度缓冲液作用； e提供蛋白酶抑制剂，细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受损伤。 10.营养液制备后为什么要小剂量分装？ 答：避免营养液被污染后，全部的营养液都被污染。 营养液一次用完过后，下一次的实验就不能用，会引起污染，影响实验，若冷冻营养液，则营养液的营养成分会有所损失，影响细胞的生长 11.10万U/mL单位青霉素、链霉素的配制方法？ 答：用注射器吸10毫升双蒸水溶解100万单位的链霉素，弃去2ml，用剩余的8ml链霉素溶解80万单位的青霉素，配制成每毫升青霉素、链霉素各10万单位的母液。
一. 背景： 本次动物实验相关疾病介绍、国内外相关治疗及研究的现状及结果（含临床、基础）、相关引文摘要等。 二、实验所用器械简介： 三、实验目的 1、使用猪或其他适宜动物为实验模型, 按照临床要求对产品进行模拟 使用，对* *器械的* *性能、* *效应进行测试。 2、通过动物实验取得数据和经验, 以便为产品的临床使用撰写详尽的使 用指南。 3、确定* * 器械置入猪后的最长可回收天数, 以便为临床使用的最长 可回收时间提供参考。 4、研究* *器械置入* *天后的可回收性, 以回答以往实验中未能解决 的* * 器械在置入* * 天后是否可取出的问题。 四、实验模型和材料 1、实验模型 （1）.动物模型：猪，体重：25?35KG （2）.体外模型：拟采用透明塑料软管作成的20mm 25mm两 种直径的下腔静脉模型。 2、材料： （1）* *器械采用XX公司研发生产的器械。 （2）其他手术配套器械采用临床通用器械。 3.过程要求：
本实验开始前必须取得动物道德委员会的许可（注：国外 有此要求，国内仅少数几家大医院有动物伦理委员会） 五.实验设计 动物数量及分组方法：实验动物共22头，在置入器械后分为A和B两组.A组动物采用介入方法取出滤器，B组动物采用外科方法经腹切开方法取出滤器.下腔静 脉滤器置入后饲养观察时间为7、10、12、14、16、20、30、60和90天，具体分组方法见下表。 分组（头） 时间（天）- A B 7 1 1 10 1 1 12 3 1 14 3 1 16 1 1 20 3 1 30 0 2 60 0 1 90 0 1 六、实验方法： 1、随机选取实验动物以1:1的比例进行* *实验，并记录* * 总结出的操作要求。7?20天实验用以观察器械置入后的可回收期，30、60、90天实验用以观察器械置入后的长期通畅情况。 2、所有动物器械取出前应造影复查，并与器械置入时的资料进行对比，判断器
动物细胞培养总结 一．实验准备 1.实验器械、器皿的清洗和消毒 （1）清洗和包装 离心管，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。 蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。 取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。 过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。 过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。 玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用
蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。 （2）消毒灭菌 1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。 2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。 玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。 2.无菌间消毒及设备检查 用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。 用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。
细胞培养技术
细胞培养发展史及其应用 （一）前言 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harriso n)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 所谓动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同。所谓动物细胞培养是指离散的动物活细胞在体外人工条件下的生长、增殖过程，在此过程中细胞不再形成组织。 由于动物细胞培养是在人工条件下进行的，便于调控和观察，因而成为现今研究动物的物质代谢过程、染色体的形态变化、以及遗传物质的表达调控等高难领域的既便利而又有效的新方法。同时，随着现代生物化学、分子生物学、分子遗传学、以及现代医学的发展，细胞培养也在许多应用领域充分展示了其巨大的发展潜力，并已为世人所关注。尽管如此，动物细胞培养仍是一门年轻的新学科，在发展之初被混淆于动物组织培养之中。 （二）细胞培养技术及其历史 细胞培养的历史最早可追溯到19 世纪末，据可考证的资料记载W ilhelm Roux是第一个进行动物组织培养实验的人。 1885年Wilhelm Roux 将鸡胚髓板放置于温热盐水中使之维持存活了数天，是有记录的第一个体外移植成功的例子。 1887年Arnold把恺木的木髓碎片接种到蛙的身上。当白细胞侵入这些木髓碎片后，他把这些白细胞收集在盛将盐水的小碟中，接下来观察到这些白细胞在运动，并存活了一个短的时间。
实验十五动物细胞培养技术及其应用 一．实验目的 通过本实验使学生掌握细胞培养、细胞检测和细胞表达等成套技术的原理和方法。 二. 实验内容 1.培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏等基本技术； 2.细胞生长曲线测定、细胞活性检测等常用技术； 3.细胞污染检测方法与技术； 4.病毒在细胞中的感染与增殖、重组病毒异源蛋白的细胞表达等实用技术。 三．实验用品 1. 材料：Sf 细胞、Hi5 细胞等 2. 器材：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、培养基抽滤装置、电泳仪、离心机、pH 计、液氮罐（含液氮）、水浴锅、温度计、培养瓶、血清瓶、5 ml和10 ml 移液 管、不锈钢移液管筒、大小不锈钢饭盒、酒精灯、吸耳球、血球计数板、96孔板、 24孔板、无菌冻存管、离心管、记号笔、一次性过滤器、微量加样器、精密pH 试纸、酒精棉球等 3. 试剂与药品：Grace培养基、胎牛血清、甘油、DMSO、双抗（青霉素、链霉素）100 u/ml、 Hank’s液、胰蛋白酶、台盼蓝、液氮、分析纯无水酒精、95%医用酒精、Tris 碱、硼酸、EDTA、琼脂糖粉（电泳用）、dNTPs、Taq酶、支原体检测试剂盒、 DNA提取试剂盒DNeasy Blood & Tissue kit （Qiagen）等。 四．实验方法与步骤 （一）培养基配制、细胞培养、细胞冻存与复苏 1. 缓冲液及培养基配制 Hank’s液：KH2PO4 0.06g，NaCl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加H2O至 1000ml，高压灭菌。4℃下保存。 胰蛋白酶液： 称取0.25克胰酶蛋白酶（活力为1：250），加入100ml无Ca2+、Mg2+的Hank’s 液溶解，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。 4%台盼蓝染液：称取台盼蓝4克，加双蒸水至100 ml。 MTT溶液：MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的Hank’s液中。4℃下保存。Grace培养基：取一份GIBCO公司的Grace培养基粉剂，按说明用量加入1000ml三蒸水100单位／毫升青、链霉素，充分混匀使溶解，调节pH值至6.8左右。 0.22 μm 滤膜抽滤除菌，4℃下保存。此为基础培养基。使用前加入10%胎牛 血清。 细胞冻存液：基础培养基加入10%DSMO，20%胎牛血清，用前配制。 PBS缓冲液：137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.1 mmol/L Na2HPO4, 1.5 mmol/L KH2PO4,
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
第章实验动物模型 第一节实验动物选择的原则 第二节生物科学研究中的动物模型
实验动物模型 选择什么样的实验动物作实验是生物医学研究工作中一个重要环节，不能随便选用一种实验动物来作科学研究，因为在不适当的动物身上进行实验，常可导致实验结果的不可靠，甚至使整个实验徒劳无功，直接关系到科学研究的成败和质量。事实上，每一项科学实验都有其最适宜的实验动物。
第一节实验动物选择的原则 ?科学研究工作中实验动物的选择，首先应根据实验目的和要求来选择，其次再参考是否容易获得、是否经济，是否容易饲养和管理等情况。 ?在实验动物选择上必须注意三点，即实验动物的种类（Species）；品种（Breed）或品系（Strain）；质量和实验动物的健康状态。
尽量选择与研究对象的机能、代谢、结构及疾病特点相似的实验动物； ?生物医学研究的根本目的是要解决人类疾病的预防和治疗问题。因此，在选择实验动物时应优先考虑的问题是动物的种系发展阶段。在可能的条件下，尽量选择那些机能、代谢、结构和人类相似的实验动物作实验。一般来说，实验动物愈高等，进化愈高，其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类，猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类的理想动物。
第二节生物科学研究中的动物模型 一、动物模型的意义和优越性 ?生物科学研究的进展常常依赖于使用动物模型作为实验假说和临床假说二者的试验基础。人类各种疾病的发生发展是十分复杂的，要深入探讨其疾病的发病机理及疗效机理不能也不应该在病人身上进行。可以通过对动物各种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类，探索人类生命的奥秘，以控制人类的疾病的衰老，延长人类的寿命。
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞增殖周期的各时期应循着G1-S-G2-M的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞
增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度等有关。接种细胞数量大，细胞基数大。相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）；连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增值快；；培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。以上情况都会缩短传代时间。 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离培养时的一段时间，这已成
动物细胞培养在药物领域的应用 摘要：动物细胞培养开始于本世纪初 1962 年, 其规模开始扩大, 发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法, 利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单克隆抗体等, 已成为医药生物高技术产业的重要部分。本论文主要介绍动物细胞培养在药物领域的应用。 关键词：现代生物技术、动物细胞工程、动物细胞培养、药物领域、单克隆抗体 现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程，这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切的关系，特别是在生物医药领域，细胞培养更具有特殊的作用。比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多都是通过细胞培养来实现的，基因工程乙肝疫苗大多是以CHO细胞作为载体；基因工程抗体药物的制备也离不开细胞培养。细胞工程领域更离不开细胞培养技术，杂交瘤单克隆抗体的研究制备完全是通过细胞培养来实现的，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。 一、首先介绍下动物细胞特点及其培养的基本要求和技术 1、动物细胞特点 动物细胞没有细胞壁，只有细胞膜，细胞质，细胞核，而且大多数哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 体外培养的动物细胞可分为原代细胞和传代细胞。原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。适应在体外培养条件下持续传代培养的细胞称为传代细胞。通常体外大量培养的动物细胞有哺乳动物细胞、昆虫细胞、禽类细胞和鱼类细胞等。 2、动物细胞培养的要求 动物细胞培养的条件：无菌、无毒的环境；营养物质（合成培养基）；温度和pH （36.5±0.5℃，7.2~7.4）；气体环境（氧气和二氧化碳）等。 其中动物细胞对营养要求更加苛刻，包括有氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或者半乳糖，除此之外还要有血清，因为由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，此外动物血清中也包含了一些动物的激素和酶，可以促进细胞的发育。这些都是组成培养基的重要成分。 动物细胞培养还需要防止污染问题，细菌、真菌、病毒均可以导致动物细胞在培养过程中受到感染而死亡。而生物的组织材料、操作者自身、培养基、各种器皿以及环境均会引起污染。显著的污染标志是培养基的pH迅速改变，细胞外形模糊，甚至出现漂浮的集落。 3、动物细胞培养的步骤 ①无菌操作取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净； ②以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块； ③将小组织块置解离液离散细胞（解离液含有蛋白酶类）； ④低速离心洗涤细胞后，讲目的细胞吸移至培养瓶内培养。注意，哺乳动物细胞的大量培养需要提供较大的支持界面，原因前面已经说过，那是因为哺乳动物细胞只有附着在固体或者半固体的表面才能生长。 4、动物细胞培养的方法
动物细胞培养在药物上的应用 摘要我国药物市场正迅速发展，药物生产技术不断地进行技术革新。动物细胞培养技术不仅提高我国药物生产工艺水平和药物质量，更推动了动物细胞培养技术在我国药物行业中的研发应用和技术发展。本文从动物细胞培养技术的发展、趋势、应用及前景等方面进行了综述，分析并探讨了动物细胞培养技术在我国药物生产中的应用前景。 关键词：动物细胞培养药物应用前景 1.动物细胞培养技术的发展及趋势 20世纪初，人们不知道神经纤维是由神经细胞的细胞质向外突出形成的，还是由神经细胞周围的其他细胞融合而成的。生物学家们就这个问题展开了激烈的争论。1907年，美国生物学家哈里森(Harrison)从蝌蚪的脊索中分离出神经组织，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培养。蝌蚪的神经组织存活了好几周，并且从神经细胞中长出了神经纤维。哈里森的实验不仅解决了神经纤维的起源问题，而且开创了动物组织培养的先河。此后，在许多科学家的不懈努力下，动物组织培养不断改进并逐渐发展成为动物细胞培养。 50年代末，随着生物科学和技术科学的相互渗透，遗传学和生物化学的相互结合，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学，这些新科学的形成和发展都与细胞培养有密切关系。当前细胞培养技术已广泛用于生物学和医学研究的各个领域，出现了用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物质、癌基因转染和细胞转化等。动物细胞培养将在药物上有着广泛的应用。 2.动物细胞培养技术的应用 2.1.动物细胞培养技术在临床医学上的应用 动物细胞培养技术可用于遗传疾病和先天畸型的产前诊断。目前，人们已经能够用羊膜穿刺技术获得脱落于羊水中的胎儿细胞，经培养后进行染色体分析或甲胎蛋白检测即可诊断出胎儿是否患有遗传性疾病或先天畸型。以此可避免先天残疾儿的诞生。现在用这种方法已能检测出几十种代谢性遗传缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，现在的一些科学研究已能通过染色体对比分析检测出易患癌症的病人，以便进行及早的预防和治疗。在这方面，我国的科学工作者有较突出的研究成果，他们改进了淋巴细胞的培养方法，从而使带有癌基因的人的染色体表现出明显高于常人的畸变率，这就从细胞分子水平揭示了癌症的病理、病因，并为癌症的早期诊断和预防提供了科学依据。再次，细胞培养还可用于临床治疗。目前已有将正常骨髓细胞经大量培养后植入患造血障碍症患者体内进行治疗的报道。另外，动物细胞培养生产