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蛋白激酶对_蛋白阿尔茨海默样磷酸化的调节作用

蛋白激酶对_蛋白阿尔茨海默样磷酸化的调节作用
蛋白激酶对_蛋白阿尔茨海默样磷酸化的调节作用

Abstract The cDNAs of chain and Fd fragment of ant-i gastric cancer mAb3H11w ere am plified by RT-PCR using degenerate primers for framework region1 (FR1)and cloned into an Fab expression vector. Ex pression of Fab could be detected but w ith no ant-i gen binding activity.Then the V and Fd g enes were corrected to its genuine sequence by PCR mediated mutagenesis.T he reconstructed Fab containing either corrected chain or Fd or both were expressed in E.coli at sim ilar level.Correction of any one of the V reg ion genes could partially resume the antigen binding activity.This result indicated that PCR primers introduced V and Fd N term inal changes may seriously affect the antig en binding activ ity. Key words ant-i human g astric cancer mAb,Ig variable gene,Fab

蛋白激酶对 蛋白阿尔茨海默样磷酸化的调节作用*

王建枝 王 群 吴琼莉 I.GRUNDKE-IQBAL K.IQBAL

(同济医科大学病理生理教研室,武汉430030)

摘要 微管相关蛋白 的异常磷酸化是阿尔茨海默病(AD)神经原纤维退变的重要机制之一.研究发现:酪蛋白激酶-1(CK-1),cAM P依赖性蛋白激酶(PKA)和糖原合成酶激酶-3(GSK-3)均可不同程度催化重组 蛋白发生磷酸化,从而不同程度抑制 蛋白促微管组装的生物学功能.如果先将 蛋白与P KA预温2h后再和GSK-3温育,则发现 蛋白磷酸化程度比单纯用GSK-3处理显著增高,生物学活性则显著降低,电镜检测几乎看不见微管形成.结果提示:PKA和GSK-3在 蛋白的A D样磷酸化及其功能抑制中具有正性协同作用.

关键词 蛋白激酶,阿尔茨海默病, 蛋白,异常磷酸化

学科分类号 R745 7,Q513

阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是由慢性进行性脑退变引起的最常见的成人痴呆症,其发病率随年龄增长而急剧上升.研究证明:神经细胞内的神经原纤维缠结的形成是AD患者微管结构崩溃,神经原纤维退化,神经元死亡的基础[1].神经原纤维缠结的主要组成成分是异常过度磷酸化和异常糖基化的 蛋白[2,3].

AD脑中 蛋白的异常磷酸化与蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶调节失衡有关.对蛋白磷酸酯酶在 蛋白异常磷酸化中的作用已有深入研究[1],而对蛋白激酶的有关作用却知之甚少,其主要原因是蛋白激酶在体外催化 磷酸化的反应具有非常缓慢的动力学[4].根据丝氨酰/苏氨酰蛋白激酶的催化序列是否依赖脯氨酸,可将其分为脯氨酸指导的蛋白激酶(PDPK)和非脯氨酸指导的蛋白激酶(non-PDPK).在AD 蛋白已经发现的21个异常磷酸化位点中,有10个PDPK和11个non-PDPK位点.可见,PDPK和non-PDPK可能均参与了AD 的发病过程.因此,本研究分别选用GSK-3 (PDPK)和CK-1及PKA(non-PDPK),探讨PDPK 和non-PDPK对 蛋白磷酸化的调节作用,以期部分阐明蛋白激酶与AD神经原纤维退化的联系.

1 材料与方法

1 1 蛋白质样品的制备

含C端四个串联重复序列和N端一个插入子的重组人类 ( 3L,图1)cDNA由Goedert博士提供.大肠杆菌中表达的 3L的制备根据Goedert 法[5]进行如下改良:将收获的含重组 3L的细胞于80mmol/L M es(pH6 8)含5mmol/L DTT的溶液中进行超声破碎,120000g离心后,取上清液用磷酸纤维素柱层析分离,用免疫印迹法确定 的洗脱峰,收集富含 的级分于沸水浴中煮沸5min后用过氯酸进行抽提.所纯化的 蛋白达凝胶电泳蛋白染色单点纯,其得率平均为5mg/L培养菌.CK-1和GSK-3由Sing h[6]提供.GSK-3制剂含 和 同工异构体的比例为1 3.1单位CK-1或GSK-3分别定义为在30 每分钟催化1nmol

*国家自然科学基金资助项目(39770175).

收稿日期:1998-06-19,修回日期:1998-12-29

32

P 掺入去磷酸化的酪蛋白(4g/L)或鞘脂碱性蛋白(1g/L )所需的酶量.PKA 催化亚基从

Sig ma 公司购买.蛋白质含量测定用改良Low ry 法

.

图1 蛋白异构体结构示意图

1 2 蛋白的磷酸化反应

将 3L (1g/L)分别与CK -1(400U/L ),PKA (6mg/L)和GSK -3(350U/L)在磷酸化缓冲液(7mmol/L MgCl 2,12m mol/L -ME,0 5mmol/L ATP,20mmol/L H epes pH 7 5)中30 保温4h.在研究蛋白激酶的协同效应时,先加入CK -1或PKA 和非标记ATP 保温2h,于95 加热5min,10000g 离心10m in 后,于上清液中加入GSK -3和32P -ATP 再保温4h.1 3 蛋白磷酸化的定量分析

将一定量磷酸化样品加在Waterman 一号滤纸,用24%三氯醋酸(TCA)变性固定后,在含1%T CA 和0 1mol/L NaCl 的水溶液中层析约20min,使磷酸化的 蛋白与游离磷酸分离,再用Cherekov 计数法测 3L 的标记率.1 4 蛋白促微管组装实验

将上述不同处理的 (20mg/L)与新鲜纯化的微管蛋白(2g/L)以及组装缓冲液(100mmol/L Mes,1mmol/L EGTA 和1mmol/L GTP)在冰浴中混匀,迅速加至1cm 石英比色皿后在37 连续记录350nm 时光吸收的变化.

1 5 负染电子显微镜技术检测微管结构

在微管组装实验进行到15min 时,迅速取出10 l 反应液加在300mesh 碳素包被的铜网上,经5%戊二醛(glutaraldehyde)固定并用2%磷钨酸(phosphotungtic acid,PTA)染色后,电镜观察微管结构.

2 结 果

2 1 PKA 和GSK -3对 磷酸化的协同作用

将 蛋白分别与GSK -3,PKA 及CK -1保温4h,测得32P 的掺入量分别为(1 7 0 3),(2 1 0 5)和(4 0 0 2)mol/mol;若将 蛋白先与CK -1或PKA 及非标记ATP 保温2h,再与GSK -3及32P -ATP 反应4h,其32P 的掺入量分别为(1 2 0 4)和(3 2 0 3)mol/mol (表1).

表1 不同蛋白激酶对 的磷酸化作用

蛋白激酶32

P 掺入量/mol mol -1

GSK -31 7 0 3PKA 2 1 0 5CK -14 0 0 2CK -1+GSK -31 2 0 41)PKA+GS K -33 2 0 31)

x s,n =12,1)

仅显示GS K -3催化的32P 掺入量.

2 2 蛋白激酶对 功能抑制的协同作用

CK -1,GSK -3和PKA 的磷酸化对 蛋白促微管组装的生物学功能具有强度递增的抑制效应;CK -1及PKA 与GSK -3的联合使用进一步增强对 蛋白活性的抑制,在本文所检测的蛋白激酶中,PKA 与GSK -3联合应用的抑制作用最强(图2).

图2 蛋白的促微管组装曲线

a:重组 3L,b~f:分别依次为CK-1,GSK-3,PKA, CK-1+GSK-3和P KA+GSK-3处理的 3L,g:微管蛋白.

2 3 负染电子显微镜检测生成的微管

CK-1,GSK-3和PKA磷酸化的 蛋白与管蛋白反应生成大量微管(图3b~d),其电镜结构与未经处理的重组 蛋白(图3a)无差异;CK-1加

图3 负染电子显微镜显示微管结构

(a)重组 3L,(b)~(f)分别依次为CK-1,GSK-3,

PKA,CK-1+GSK-3和P KA+GSK-3处理的 3L.GSK-3或PKA加GSK-3处理的 蛋白与管蛋白的反应液在电镜下几乎不见微管生成(图3e,f).

3 讨 论

3 1 蛋白激酶CK-1,PKA和GSK-3可在体外催化重组 蛋白磷酸化,将CK-1,PKA和GSK-3单独与 蛋白保温4h, 蛋白的32P掺入量分别为

4 0,2 1和1 7mol/mol.PKA预处理可明显增强GSK-3对 蛋白的磷酸化作用,其32P掺入量比单纯用GSK-3增高约1倍,而CK-1的预处理则不促进GSK-3对 的磷酸化作用.CK-1和PKA是non-PDPK,而GSK-3是PDPK,可见,non-PDPK 的预处理可对PDPK促 蛋白磷酸化起不同的调节作用.

3 2 微管组装实验证明:CK-1,PKA和GSK-3单独处理的 蛋白的促微管组装生物学活性比未经处理的 蛋白明显降低,但在电镜下仍可见大量微管生成,电镜检测属定性观察,尚不能准确反应 蛋白功能抑制的程度.CK-1或PKA和GSK-3联合处理的 蛋白微管组装活性显著降低(图2),且在电镜下几乎不见微管生成(图3).根据32P的掺入量,当分别使用上述蛋白激酶时,CK-1使 蛋白磷酸化的作用最强(表1),但是,与PKA和GSK-3相比,CK-1的磷酸化对 生物学活性抑制作用最弱(图2);此外,GSK-3虽然在CK-1的基础上只加上少量磷酸,但确明显增强对 蛋白生物学活性的抑制.可见, 蛋白生物学活性的抑制除与其分子的磷酸化程度有关外,其分子特定位点的磷酸化可能起更重要的作用.根据本文研究结果,我们得出如下初步结论: 蛋白的AD-样异常磷酸化与CK-1,PKA和GSK-3等多种蛋白激酶有关,且这些蛋白激酶在 蛋白的AD样转变反应中起不同的调节作用.这一研究结果为AD的发病机制提供了新理论,为其防治途径的探讨提供了新线索.

参 考 文 献

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(下转第402页,Continued on page402)

参 考 文 献

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Sequencing Partial Fragment of Cecropin A cDNA in the Silkworm Bombyx mori From C hina.LI Jian-M in,ZHOU Ka-i Ya,ZHANG Shuang-Quan,DAI Zhu-Ying(Dep ar tment of Biology,Nanj ing Nor mal Univer sity,Nanjing210097,China); ZH U Chang-Liang,YE Xin-Hai(Dep ar tment o f Biology,Nanj ing Medical University,Nanj ing 210029,China).

Abstract Total RNA w as prepared from fat body of the silkw orm,Bombyx mor i,9hours after injected by E.coli K12D31.Single-strand cDNA was synthesized by reverse transcription(RT).Partial fragments of cecropin A cDNA w ere obtained,cloned and sequenced,by PCR technique with a pair of degenerate primers designed according to the amino acid sequence of CM4in Bom byx mori and cecropin A in Hy alop hora.These laid a foundation for further research on preparation of the probes of cecropin A for screening the silkworm cDNA library.

Key words cecropin A g ene,Bombyx Mori,cDNA sequence

(上接第375页,Continued from page375)

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Modulation of Protein Kinases on an Alzheimer-like Phosphorylation of .WANG Jian-Zhi,WANG Qun,WU Qiong-Li,I.GRUNDKE-IQBAL,K. IQBAL(Dep ar tment o f Pathop hysiology,Tongj i Medical Univer sity,Wuhan430030,China). Abstract Abnormal phosphorylation of microtubule associated protein is one of the major mechanism in Alzheimer neurofibrillary degeneration.It w as found that casein kinase-1(CK-1),cyclic AM P-dependent protein kinase(PKA)and glycogen synthase kinase-3 (GSK-3)differentially phosphorylate human ( 3L) and thus inhibit its biological activ ity.Morever,the phosphorylation and inhibition of this activity of by GSK-3is significantly increased if is prephospho-rylated by PKA.U nder this condition,only neglectable microtubles could be seen by electron microscopy.The data suggest that a sy nergistic role of PKA and GSK-3m ight be involved in abnormal phosphorlation and functional inhibition of in Alzheimer disease.

Key words protein kinase,Alzheimer disease, protein,abnormal phosphorylation

磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一, 白质磷酸化和去磷酸化为...

摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展,尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用,磷酸化修饰数据不断积累,从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中,将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息,从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说,除了给出较为准确的预测结果外,还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验,而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点,采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性;提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练,形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos,该算法在特异性高于已有预测算法(约2个百分点)的基础上,大大提高了预测的灵敏度(约10个百分点)。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法,可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律,并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围,既可以用于提供充分信息的位点预测,又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction),无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质(包括磷酸化蛋白质)的鉴定,提高鉴定效率。 关键词:磷酸化,位点预测,规则抽取,SVM,AdaBoost

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点预测详 解 公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]

蛋白质修饰位点分析目录

(特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接,可以跟踪标题;ctrl+单击标题后的图标 可以返回目录) 实验目的 找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点,并说明为什么(注释) 找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点,注释结果 实验平台 uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) 预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus:

预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测: O型糖基化位点预测: 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列: 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接: 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (1)DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接: 开始预测 结果

DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点,总共有37个丝氨酸修饰位点,13个苏氨酸修饰位点,16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分,只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 (2)PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接: 开始预测 结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点,丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致,“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多,且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质,与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白,是主要的细胞缝隙连接蛋白,其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为:

磷酸化蛋白的富集

TiO2法磷酸化富集 试验:pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响 共5个样品,各400ug蛋白(酶解之前),每个样品用1mg TiO2,共用5mg。流程: 1.TiO2 Beads 活化 ①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2,震荡20min,8200×g,2min,离心,弃上清; ②更换wash buffer 1 1000ul,第一遍摇晃两次,弃上清;第二遍,震荡20min,弃上清; ③更换Loading buffer 1000ul,2遍震荡30min,最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。 2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化,使TFA终浓度为0.1%—0.5%,离心浓缩抽干,之后重新用Loading buffer溶解(体积控制在400ul左右)。 3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集,将1mg TiO2 加入到一个样品中,室温旋转30min,转速1100转/分。 4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中,8200×g,2min,收集为Flow Through。 5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1,8200×g,2min,,重复3次,收集600ul。 6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2,8200×g,2min,,重复3次,收集600ul。 4、5、6合并到一起,为Flow Through。 7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1,8200×g,2min,,重复2次,收集400ul,为elute1;再加入200ul Elute buffer 2,8200×g,2min,收集200ul,为elute 2;合并elute 1和elute 2,总共600ul磷酸化多肽。

酪蛋白磷酸肽的药理作用

酪蛋白磷酸肽的药理作用 【摘要】酪蛋白磷酸肽具有促进钙、铁、锌的吸收、利用,增强精卵的结合等作用。近年来对其进行了深入研究发现它在增强机体免疫力,促肿瘤细胞凋亡方面有潜在的药理作用,通过对其作用机制的研究,将为其用于临床提供理论依据。 【Abstract】Casein protein phosphorylation peptide with the promotion of calcium,iron,zinc absorption,utilization and enhance the integration of sperm,In recent years their has conducted in-depth study found that it enhanced immunity,and promote apoptosis of tumor cells have the potential pharmacological effects,through the mechanism of its role will be to provide a theoretical basis for clinical. 【Key words】Casein Phospho peptides; Pharmacological effects 英文:Casein Phospho Peptides(CPP) 别名:酪蛋白磷肽 化学结构:CPP的活性中心是成串的磷酸丝氨酸和谷氨酸族,其基本结构可表示为-serp-serp-serp-glu-glu-,相对分子质量约2000~4000。 性状:乳白色或淡黄色粉末,有轻微的芳香气味。易溶于水,水溶液呈中性,在酸性条件下不易沉淀。有良好的热稳定性。 来源与结构:Nato[1]最早用酪蛋白喂养大鼠,在肠内容物中发现CPP。Nicholas等[ 2-3]用胰酶或胰蛋白酶水解酪蛋白,精制、纯化制备CCP。CPPs有α和β两种构型[4],其主要功能区是αSI-(59-79)5P和β(1-25)4P,不同条件下制备的CPP 都含有相同的核心构:-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-(Ser:丝氨酸,Glu:谷氨酸,P:磷酸基)。此结构中磷酸丝氨酸残基[-Ser(P)-]成簇存在,在肠道pH弱碱性环境下带负电荷,可阻止消化酶的进一步作用,使CPP不会被进一步水解而在肠道中稳定存在。同时,-Ser(P)-对CPP 的功能发挥起重要作用。冯凤琴等[5]研究了CPP的纯度、CPP 中氮与磷摩尔比值(N∶P)与其功能的关系,发现N∶P 越小,CPP的肽链越短,磷酸基密度越大,CPP 纯度越高,促进钙吸收和利用的作用越强。 1 酪蛋白磷酸肽的药理功能 1.1 促进小肠对钙的吸收25-(OH)2VitD3可促进钙吸收,其吸收率取决于小肠内游离的钙离子浓度。人日常膳食中,谷类等植物性食物中含有大量的植酸、肌醇六磷酸等高磷成分,它们在小肠下端pH 7~8 的环境下与钙结合成磷酸钙沉淀,因此影响钙离子的被动吸收。CPP[1] 能抑制磷酸钙沉淀的形成,使游离钙保持较高的浓度,促进钙离子的被动吸收,从另一个途径提高钙离子的吸收率。冯凤琴等[3]用pH-stat法观察实验室制得的CPP抑制磷酸钙沉淀的效果。结果发现0.11~0.12 g/L的CPP使磷酸钙沉淀的形成延缓5~40 min。相同条件下,不加

蛋白质磷酸化概述

蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制,是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用,而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外,在所以有核生物中,细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育,如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后,新陈代谢受磷酸化作用的调节控制,尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而,形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能,他们常常不约而同,有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐(32Pi)进行生物合成标记。这种方法非常简单,而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化,而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在

酸性PH条件下化学性质稳定,酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合,它们可以是以磷酸-酶的中间体或稳定修饰物的形式存在,这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定,不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究,它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围,读者可以参考《酶学方法》(Methods in Enzymolcgy)第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸,因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出,尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理,使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸,可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率,在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化,无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如,蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测,其特异性和敏感性相当高。更普遍的是,蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化,而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后,从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用,如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情

生物质谱分析蛋白质磷酸化位点

磷酸化蛋白的高效富集 在线酶解与快速鉴定 项目申请人:袁敏婷黄懿 指导教师:杨芃原 摘要:蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义,对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一,但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低,在质谱分析前,依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附,结合在线酶解技术的快速,高序列覆盖度特性构建一个快速,高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。 关键词:蛋白质磷酸化;Fe3O4磁性材料富集;在线酶解 1.引言 蛋白质的翻译后修饰(PTMs)是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式,它几乎调节着生命活动的整个过程,包括细胞的增殖、发育和分化,神经活动,肌肉收缩,新陈代谢,肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计,在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的,而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用,是一种普遍的调控机制。 蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸,其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点,并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要,用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步,但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集,可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。 在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来,包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等,而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具,串联质谱更是可以高通量,快速的给出详细的磷酸

酪蛋白磷酸肽编制说明

中华人民共和国粮食行业标准《酪蛋白磷酸肽》编制说明 前言 酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料,通过生物技术制得的具有生物活性的多肽,是一种功能性食品添加剂,可用于各种营养、保健食品中,能有效促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用。 酪蛋白磷酸肽是使用蛋白酶水解后的酪蛋白,经过精制、纯化制成,其核心结构为:—Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-(Ser:丝氨酸,Glu:谷氨酸,P:磷酸基)。这一结构中的磷酸丝氨酸残基(-Ser(P)-)成簇存在,在肠道PH弱碱性环境下带负电荷,可阻止消化酶的进一步作用,使CPP不会被进一步水解而在肠中稳定存在。国内研究发现,CPP中氮与磷的摩尔比值越小,CPP的肽链越短,磷酸基的密度越大,则CPP纯度越高,促进钙的吸收和利用作用也就越强。 从我国民众的钙营养状况看,我国民众膳食组成以植物性食物为主,其中含有大量的影响钙、铁、锌吸收因子,如植酸、草酸、等,因此,中国人缺钙尤为严重。目前,我国从儿童到中老年人各年龄组的人群,普遍存在缺钙问题。这就使得国内补钙多年以来保持长盛不衰的现象,消费者的补钙意识已由“接受”转变为“自发”。除了钙以外,中国人最易缺乏的矿物质是铁和锌。CPP不仅可促进钙的吸收,对铁、锌的吸收利用也有良好的促进效果,这更使得CPP在营养强化食品和保健食品中的应用备受瞩目。因此开发添加CPP的营养食品和保健品,能真正达到有效补充人体缺乏的矿物质的目的,满足人们的营养需求,必能产生巨大的经济效益和社会效益。 在我国,酪蛋白磷酸肽的规模化生产技术已经成熟,产业规模也在逐步扩大,与之相配套的国家标准才刚刚发布。由于国家标准规定的指标比较宽泛,为了能把握行业规模化发展方向,有效规范和监管酪蛋白磷酸肽产品市场,切实提升该类产品质量水平,推动酪蛋白磷酸肽进入健康发展的轨道,制定能反映本行业整体水平,又符合行业发展规律的酪蛋白磷酸肽行业标准势在必行。 1.工作简况(包括任务来源、协作单位、主要工作过程、行业标准主要起草人及其所做工作等) 任务来源、协作单位 酪蛋白磷酸肽在我国属于食品营养强化剂,它是牛乳或酪蛋白经过进一步加工的产物。目前该行业已经初步形成规模,但不可避免的存在行业管理机制不健全、市场准入政策法规

蛋白质磷酸化1

浅谈蛋白质磷酸化 摘要:蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生,被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识,主要类型与功能,以及研究蛋白质磷酸化的主要目的,最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词:蛋白质修饰;蛋白质磷酸化;磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成,生命科学研究已进入后基因时代,主要研究对象是功能基因组学,包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质,而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境(分子)的关系。它的研究内容包括:(1)蛋白质鉴定;(2)蛋白质翻译后修饰的研究;(3)蛋白质结构研究;(4)蛋白质细胞内定位及功能确定;(5)发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式,随着学科的发展,蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应,使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程,其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的,称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷

磷酸化蛋白质组学

磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义,探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰,可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化,这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充,同时提供了一个全新的研究视角,并由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注,各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前,仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质,然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法,从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小,所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍,特异性较差。因此,目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 图片来源:https://www.doczj.com/doc/6d902688.html,/wiki/Phosphoproteomics

酪蛋白磷酸肽

酪蛋白磷酸肽 1 范围 本标准规定了酪蛋白磷酸肽的相关术语和定义、质量要求、检验方法、判定规则、标签标识以及包装、储存和运输的要求。 本标准适用于以牛乳或酪蛋白制品为原料,用酶解法生产制得的商品酪蛋白磷酸肽。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 191 包装储运图示标志 GB 2761 食品安全国家标准食品中真菌毒素限量 GB 2762 食品安全国家标准食品中污染物限量 GB 5009.3 食品安全国家标准食品中水分的测定 GB 5009.4 食品安全国家标准食品中灰分的测定 GB 5009.5 食品安全国家标准食品中蛋白质的测定 GB/T 5491 粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T 5492 粮油检验粮食、油料的色泽、气味、口味鉴定 GB 7718 食品安全国家标准预包装食品标签通则 GB 28050 食品安全国家标准预包装食品营养标签通则 GB 31617 食品安全国家标准食品营养强化剂酪蛋白磷酸肽 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酪蛋白磷酸肽 casein phosphopeptides 以牛乳或酪蛋白制品为原料,用酶解法生产制得的,主要有效成分为含有1—6个磷酸丝氨酸残基的多肽。 3.2 酪蛋白磷酸肽含量 the content of casein phosphopeptides 酪蛋白磷酸肽占试样的质量分数。 4 质量要求 4.1 感官要求

酪蛋白磷酸肽感官指标见表1。 表1 感官要求 4.2 质量指标 酪蛋白磷酸肽感官指标见表2。 4.3 微生物要求 应符合GB 31617和国家有关的规定。 4.4 食品安全要求 4.4.1 真菌毒素限量应符合GB 2761的规定。 4.4.2 污染物限量应符合GB 2762的规定。 5 检验方法 5.1 扦样:按GB/T 5491执行。 5.2 感官检验:按GB/T 5492执行。 5.3 水分含量检验:按GB 5009.3直接干燥法执行。 5.4 灰分含量检验:按GB 5009.4执行。 5.5 总氮检验:按GB 5009.5凯氏定氮法执行。 5.6 酪蛋白磷酸肽含量检验:按GB 31617-2014附录A执行。 6 判定规则 有一项不符合本标准质量要求的,判定为不合格产品。 7 标签标识

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展

论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否,信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性,一般情况下被磷酸化的酶有活性,脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性,使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中,有许多是相当持久的,如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短,但蛋白激酶一旦激活,其活性却可以通过某些方式(如自身磷酸化)维持较长时间;更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类,其效应可以维持更长时间,直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用,由于是酶促反应,一个酶分子可以催化成百上千个底物分子,即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶,其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性,将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的,并认为它们有共同的祖先。因此,它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是,这些序列表现为一组组高度保守的,甚至是完全保守的氨基酸模体,这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名,从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析,发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为,亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用;而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说,在亚域VIII中,紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异,它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-,看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶,选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链,使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员:PPl,PP2A,PP2B,PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)

酪蛋白磷酸肽的概况

酪蛋白磷酸肽的概况 第一节:酪蛋白磷酸肽的基本概况 中文名称:酪蛋白磷酸肽 英文名称:Casein Phosphopeptides 钙是人体内含量最丰富的元素之一,对人体健康起着十分重要的作用,然而它也是最易缺乏的矿物质元素之一。当今世界上缺钙已成为一大营养问题,即使经济很发达的国家也未能幸免,在我国表现得尤为突出。据报道,我国老年人因缺钙引起的骨质疏松发病率高达30%-50%,儿童因缺钙引起的佝偻病高达40%,妊娠妇女缺钙比例也非常高,严重威胁着人们的健康。因此,补钙是众所需求。 现代研究已证实钙缺乏的主要原因并不是食物不足,而是由于吸收率低下。如何提高钙的吸收率,是人们长期以来一直在进行的研究。而今从牛奶中分离的一种生物活性肽——酪蛋白磷酸肽(CPP),由于具有很强的促钙吸收活性,正成为功能性食品添加剂的开发和研究热点。 酪蛋白磷酸肽(Casein Phosphopeptides),简称CPP,是以牛奶酪蛋白为原料,经单一酶或复合酶水解,再对水解产物进行分离纯化而得到的含有簇磷酸丝氨酚的多肽。专家们认为,将钙和CPP应用于各类食品中,作为一种食品基料,可提高食品的附加值,使人们长期存在的钙摄取量不足的问题得以解决,有效地预防骨质疏松症和儿童缺钙症。 CPP具有促进成长期儿童骨骼和牙齿发育的作用,并能预防和改善骨质疏松症,促进骨折患者的康复,预防和改善缺铁性贫血;还具有抗龋齿作用。 CPP可添加于各类食品。包括饮料、烘烤食品、冷饮、乳制品、发酵食品、快餐食品、糖果、果酱、儿童咖喱饭、口香糖及保健品和调料中,可满足各种年龄段人群的需要。CPP还可用于动物饲料中,促进动物体外受精。纯CPP和高纯CPP可应用于制药工业,能进一步促进钙质吸收,防止矿物质流失。

磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法

蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义,探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰,可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化,这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充,同时提供了一个全新的研究视角,并由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注,各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前,仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质,然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法,鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小,所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍,特异性较差。因此,目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱(IMAC) 固相金属亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中,并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽,不管其长度如何,都有富集作用,而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析,但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外,那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力,也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题,可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外,自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发,使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行,为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年,Pinkse等人将二氧化钛(TiO2)技术引进磷酸化蛋白质组学领域,利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集,并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术,但仍然存在非特异性吸附等问题。后来,人们又利用纳米材料比表面积大的特点,对TiO2纳米级材料进行了开发

蛋白质修饰位点预测详解

蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)

(1)DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) (2)PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) (1)哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) (2)真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) (特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接,可以跟踪标题;ctrl+单击标题后的图标可以返回目录) 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点, 并说明为什么(注释) ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点,注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.doczj.com/doc/6d902688.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.doczj.com/doc/6d902688.html,/disphos/

PhosphoSitePlus:https://www.doczj.com/doc/6d902688.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测:http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列:fasta.txt

分子生物学---11蛋白质磷酸化和信号转导

蛋白质磷酸化和信号转导 一、蛋白质磷酸化过程和功能 1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n (1)过程: P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶) P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n A T P A D P P h o s p h a t a s e(磷酸酶) P i (2)主要磷酸化位点(对有-O H的氨基酸进行磷酸化) 丝氨酸(S e r)/苏氨酸(T h r):磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变 酪氨酸(T y r):磷酸化之后通常招募其他蛋白因子,使下游蛋白质活性改变 (3)蛋白质磷酸化的功能 生物热力学;蛋白质降解;酶活性的调控(激活o r抑制);蛋白质相互作用 2、重要的蛋白激酶 (1)C D K s:c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶,属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶,和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性,作用于细胞周期的不同阶段 (2)R T K s:R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶,是具有酪氨酸激酶活性的受体,如E G F R(表皮生长因子受体) (3)C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s:非受体酪氨酸激酶,存在于细胞质中,大部分结构中存在S H2、S H3结构域,是磷酸化的结合位点。如S r c、J A K、 F A K等 二、信号转导 1、信号转导的种类 E n d o c r i n e(内分泌):激素 P a r a c r i n e(旁分泌):神经递质 A u t o c r i n e(自分泌):生长因子 2、信号转导的步骤 (1)信号分子的合成 (2)信号分子释放 (3)信号分子传导 (4)信号分子与受体结合 (5)激活细胞内信号通路 (6)细胞内信号传导

酪蛋白磷酸肽

酪蛋白磷酸肽 酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白为原料,通过生物技术制得的具有生物活性的多肽,可用于各种营养、保健食品中,能有效促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用。 目录 概述 结构和功能 生产工艺及产品 特性 作用及作用机理 应用 概述 结构和功能 生产工艺及产品 特性 作用及作用机理 应用 酪蛋白磷酸肽是用胰酶或胰蛋白酶水解的酪蛋白,经过精制、纯化制成,其核心结构为:—Se r(P)-Se r(P)-Se r(P)-G lu-G lu-(Se r:丝氨酸,G lu:谷氨酸,P:磷酸基)。这一结构中的磷酸丝氨酸残基(-Se r(P)-)成簇存在,在肠道PH弱碱性环境下带负电荷,可阻止消化酶的进一步作用,使CPP不会被进一步水解而在肠中稳定存在。国内研究发现,CPP中氮与磷的摩尔比值越小,CPP的肽链越短,磷酸基的密度越大,则CPP纯度越高,促进钙的吸收和利用作用也就越强。 钙只有以离子形态存在时才易被吸收,而且在中性和弱碱性环境中又容易与酸根离子形成不溶性盐而流失。CPP对钙的吸收作用主要表现为,在中性和弱碱性环境下能与钙结合,抑制不溶性沉淀的生成,避免钙的流失,最终因游离钙浓度的提高而被动吸收。目前研究表明, CPP促钙吸收的作用主要表现在以下几个方面: 促进小肠对钙的吸收 人的饮食中的谷类食物含有大量的植酸、肌醇六磷酸等高磷成分,在小肠下端PH7~8环境下与钙结合而生成磷酸钙沉淀。而CPP能抑制磷酸钙沉淀的形成,使游离钙保持较高的浓度,促进钙的被动吸收,成为维生素D作为钙吸收促进剂的又一途径。

促进骨骼对钙的利用 动物实验表明,CPP能促进钙的吸收和利用,减弱破骨细胞作用及抑制骨的再吸收。 促进牙齿对钙的利用 过去认为,餐后咀嚼乳酪能刺激唾液分泌,使碱性的唾液缓冲牙斑上的酸性物质对牙釉质的腐蚀,有助于防止龋齿的发生。近年研究发现,乳酪中含有的CPP能将食物中的钙离子结合在龋齿处,减轻釉质的去矿物化,从而达到抗龋目的。 研究发现,在含有CPP的培养液中的精子,明显具有更高的穿透卵细胞的能力,还能减少精子的变异程度而使胚胎发育更加稳定。CPP还能提高铁、锌、镁等金属离子的生物利用度,因而被称为具有金属载体功能的肽类物质。目前,国外已将CPP应用于儿童咖喱饭、饮料、口香糖等食品和保健品中。对儿童缺钙、老年人骨质疏松、不育症的治疗和牙齿保健方面的研究和应用也在进行之中。因为CPP是从天然蛋白质中提取的多肽,具有不良反应小、安全可靠的优点,因而将会得到更广泛的应用。国外研究了酪蛋白、脱脂乳蛋白和CPP的致敏反应,发现CPP的致敏性很小,表明它能够适用于对牛奶过敏的体质。但也应注意到,影响CPP作用的因素非常复杂,在钙代谢过程中的作用还须进行深入的研究。 结构和功能 酪蛋白磷酸肽(CaseinPhosphopeptides,简称CPP)是以牛乳酪蛋白为原料,通过生物技术制得的具生物活性的多肽。CPP分子由二十到三十几个氨基酸残基组成,其中包括4~7个成簇存在的磷酸丝酰基。大量试验证明,CPP能有效地促进人体对钙、铁、锌等二价矿物营养素的吸收和利用。 生产工艺及产品 CPP生产的基本工艺为: 酪蛋白→酶解反应→酶失活→干燥→CPP成品由上述工艺所得产品CPP 含量为12%~20%,若经分离纯化可得到含量更高的产品。高含量的产品(含量达80%左右)主要用于含钙量较高的液态产品,固态产品和一般液态营养、保健食品中则大多使用含量为12%以上的CPP产品。除了工艺较简单,成本较低外,低CPP含量的产品中还含有类啡肽、免疫调节肽、抗高血压肽等多种生物活性肽,除了促进钙、铁、锌吸收功能外,还能向人体提供其他保健功能,其综合营养保健效果更好。因此国内外市场上以低含量CPP产品的使用和贸易量最大。 CPP主要应用于强化钙、铁、锌的营养保健食品

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍

磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起,而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰;在脊椎动物基因组中,有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸(酯)酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性,使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义,探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰,可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化,这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充,同时提供了一个全新的研究视角,并由此派生出磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注,各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀,从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前,仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性,可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质,然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法,鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小,所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍,特异性较差。因此,目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱(IMAC) 固相金属亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography, IMAC)是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中,并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽,不管其长度如何,都有富集作用,而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析,但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外,那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力,也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题,可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外,自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发,使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行,为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。

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