酚氯仿法提取DNA的原理
作者: 渭水凡夫(站内联系TA)发布: 2013-04-06
最近在博客上看到的一篇可以作为入门级《分子生物学十万个为什么》
和大家分享一下
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？
使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA
联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而D NA溶于水相。
使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。
缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase
的活性。
氯仿的作用？
氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。
最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）
用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？
异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？
用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DN A分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。
原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。
将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。
溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至
界面不出现蛋白凝胶为止；
沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀；
溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。
溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH ＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2m o1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除R NA时）受到干扰。
溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS －蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA
在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即
可。
在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在p H为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和D NA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成D NA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pK a＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA 的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳
苯酚、氯仿、异戊醇在DNA提取时的作用
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？
酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？
在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气
泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
苯酚：氯仿：异戊醇为什么要25:24:1？
抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为2 4：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
异丙醇沉淀的优点在于所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大的DNA样品沉淀。
0.54-1.0倍的异丙醇可选择性地沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；其缺点在于易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀，在DNA沉淀中的异丙醇难以挥发除去，所以常规需要
用70％乙醇漂洗DNA沉淀数次。
异丙醇沉淀DNA后，其沉淀产物中含盐分及杂质比较多一些，因此一般推荐使用无水乙醇为好。
乙醇主要是沉淀较大的DNA片段的，而异丙醇则没有什么选择性，多大的片断它都能沉。
作者: 渭水凡夫(站内联系TA)发布: 2013-04-06 最近在博客上看到的一篇可以作为入门级《分子生物学十万个为什么》 和大家分享一下 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10 分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分
[方案]酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理酚氯仿法提取DNA主要步骤: 1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。每个梯度脱水时间为5-10min 2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液(300μl)，研磨后再加入 300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。 3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K， 用封口带将离心管封口，放入摇床(56?,5h)。 4.加入等体积的Tris饱和酚(500μl)，摇匀(10min)。 5.离心:12000R， 7min，4?。离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。 6.吸取上层液体加入新的离心管。 7.配制Tris饱和酚:氯仿:异戊醇=25:24:1。 8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl， 摇匀10min。 9.离心:12000R，7min，4?。 10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl(氯仿:异戊醇=24:1)。 11.离心:12000R，7min，4?。 12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20?冷冻的100%的酒精。-20?过夜。 13.将样品取出，12000R，7min，4?离心。 14.弃上清，留白色沉淀(DNA)，加400μl的75%的经过-20?冷冻的酒精，反复吹打溶解。
15.重复第14步骤2次(用75%酒精洗三次)。 16.提取DNA完成。 溴氯仿法提取DNA的原理: 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用, 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的优点:1. 有效变性蛋白质;2. 抑制了DNase的降解作用。缺点:1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用, 氯仿:克服酚的缺点;加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的迹量酚。(酚易溶于氯仿中) 用酚,氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么, 异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子, 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理:动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白(DNP)可溶于水或浓盐溶液(如1mol/L 氯化钠)，但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白(RNP)则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。
异硫氰酸胍 强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。 盐酸胍、尿素 盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，它并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA 从富含RNase的组织中提取出来。 4-8M可断裂氢键，有两种可能机制：1变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变性；2盐酸胍、尿素对氨基酸的增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，结果盐酸胍、尿素就称为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的变性往往是不可逆的。 高浓度尿素使蛋白质变性并抑制Rnase活性 十二烷基肌氨酸钠 使蛋白质解体变性 巯基试剂
1防止蛋白质或酶等（如辅酶A）分子中SH基团氧化成二硫键，2在某些酶反应过程中维持体系的还原环境。DTT，DDTE、巯基乙醇应用最广，谷胱甘肽也常应用，由于他是生物体内的还原剂，同时氧化后能被谷胱甘肽还原酶原位释放。DNA提取中，常使用巯基乙醇，维持缓冲液的还原环境，防止多酚类氧化，由于具有一定的毒性，浓度不应高于2%。 巯基乙醇 β-巯基乙醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键（肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键）。 1 还原蛋白质二硫键，使Rna酶变性 2 抑制酚类氧化，若氧化，核酸会变成灰黑色，苯酚的氧化产物苯醌等氧化物引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联 3 保护蛋白质的巯基蛋白质提取中需要 巯基乙醇还原二硫键，使RNA酶失活 化学变性剂SDS、尿素、盐酸胍能破坏疏水键、盐键、氢键、范德华力使蛋白质变性但不影响肽键和二硫键，不能使蛋白质彻底变性 加上还原剂巯基乙醇或DTT，能还原二硫键，使RNA彻底变性 DTT二硫苏糖醇 刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但
荧光原位杂交（FISH）探针的制备及其应用 概述 1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征 2、染色体异常常见的类型 3、染色体异常的检测方法 二、荧光原位杂交及其探针 1、荧光原位杂交的原理 2、荧光原位杂交的探针 三、荧光原位杂交探针的制备和荧光原位杂交（按试验流程介绍） 一、概述 1、克隆性染色体异常是肿瘤的特征 1914年德国遗传学家Boveri就提出染色体畸变与肿瘤起源相关，然而这还仅仅只是一个假说；1960年Nowell和Hungerford在7例慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia，CML）的患者中发现后来被称为费城染色体（Philadelphia chromosome）的微小染色体；1973年Rowley证实了Ph染色体是9号和22号染色体易位所致，这是人们在肿瘤中认识到的第一个染色体易位；目前，已经有11,500篇文献报道了55,600多种克隆性细胞遗传学异常。这些染色体畸变，尤其是染色体易位及其相应的融合基因在肿瘤致病的起始阶段有着重要的作用，无不说明克隆性细胞遗传学异常是肿瘤的特征，在肿瘤起源中起重要作用。
下图是各种疾病报告的克隆性染色体异常病例数
2、染色体异常的常见类型 染色体异常指数目异常和结构异常两类：前者包括整条染色体数目的扩增和缺失；后者包括染色体易位、插入、倒置、区带的缺失或扩增等。 下图是染色体数目异常
染色体结构异常 3、染色体异常的检测方法 染色体异常的识别得益于二十世纪六十年代后发展起来的胰蛋白酶－姬姆萨染色和常规显带技术，使得常规筛查全基因组染色体异常和检测染色体核型改变成为可能。染色体显带是细胞遗传学分析技术中标准和常用的方法，但耗时且依赖于获得良好的分裂相，还难于分析复杂和隐匿的异常。
酚氯仿法和试剂盒法提取DNA实验报告 一、实验目的 实验原理：酚氯仿法：先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K 消化，通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白 质成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化 DNA。 蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA乙二胺四乙酸二钠存在 下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体 系中晶SDS可破坏细胞膜、核膜晶并使组织蛋白 与DNA分离晶EDTA则抑制细胞中Dnase的活性 而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸 晶使DNA分子完整地分离出来。氯仿-异戊醇溶 液可以使核蛋白变性沉淀晶将核酸物质萃取出 来再向萃取液中加入适量乙醇晶可使DNA析 出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在DNA纯化 研究中非常常用晶氯仿-异戊醇抽提的原理是晶 氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相分层 异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。而 DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙 醇沉淀来纯化和浓缩DNA 二、实验用品 试剂：
1mol/L(M)Tris-Cl(pH8.0), 0.5M EDTA（pH8.0），5M NaCl TES（15mM Tris, 15mM EDTA，15mM NaCl） Tris饱和酚（PH8.0） 氯仿/异戊醇（V/V=24/1） 10％SDS 5mg/ml Protease K 70％乙醇、无水乙醇 TE缓冲液（pH8.0）：10mM T ris-Cl（PH8.0） 1mM E DTA(PH8.0) 10mg/mL 溴化乙锭（EB） 耗材： 仪器：低温离心机、移液枪一套，低温冰箱，恒温水浴锅、紫外分光光度计（Eppendorf）。 三、实验步骤 4.1取血样：实验人员相互取血样5ml.（用品：采血管、采 血针、无水乙醇、棉签、橡皮管、废液缸） 4.2血液样品的预处理：分取2ml 血样加入到离心管A中 用于酚氯仿法提取DNA。 1) 破除RBC：
酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理 酚氯仿法提取DNA主要步骤： 1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。每个梯度脱水时间为5-10min 2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液（300μl），研磨后再加入300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。 3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。 4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。 5.离心：12000R，7min，4℃。离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。 6.吸取上层液体加入新的离心管。 7.配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。 8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10min。 9.离心：12000R，7min，4℃。 10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：异戊醇=24:1）。 11.离心：12000R，7min，4℃。 12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。-20℃过夜。 13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。 14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。 15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。 16.提取DNA完成。 溴氯仿法提取DNA的原理：
用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase 的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在 0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；
1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法） TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 RNA降解 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。 2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。 3. 冷冻样品：样品取材后应立即臵于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。 4. 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。 5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。 Q：OD260/OD280比值偏低 A： 1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。 2.苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。 3.多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4.设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 Q：RNA提取得率低 A： 1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。 2. 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。
Chapter 1 DNA extraction 说明：本原理及方法是个人整理，用来给研究生教学用的，用本方法可以提取到理想的DNA。各实验室提供的细胞裂解液浓度各有不同，只要经过实验证实的，都可以用来提取到理想的DNA. 1.Experimental Principles 1)Cell lysis (lysis buffer, containing SDS, EDTA, Tris-HCl, and RNase) SDS, a detergent is added to the buffer to break open the cell membranes; it also helps remove proteins and lipids in the cell. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), a chelator to remove metal ions in solution to preven DNase from cutting up the DNA. RNase is also present in the buffer at this step, to break up the RNA present in the cells. 2)Remove protein Proteinase K, it remains active at elevated temperatures, so the solution can be heated to about 55 °C to aid protein inactivation and removal by the detergent. 3)Extract DNA from buffer Once the cells are broken open and the RNA, proteins, and lipids have been dissolved in the buffer, the DNA must be separated from these materials. Phenol: remove the proteins, leaving DNA and other water-soluble materials behind by centrifugation. The DNA is then extracted from the water phase using chloroform and precipitated from the chloroform using ethyl alcohol mixed with sodium acetate salt. 4)DNA precipitation The ethanol can precipitate DNA from water phase 2.Materials and Solutions All reagents are precooled or kept at 4°C before use. 1)Proteinase K 2)Phenol saturated with TE (pH 8.0) 3)Chloroform 4)Isoamyl alcohol 5)RNase stock (30 mg/ml, Catalog No.R4642-10MG, Sigma ) 6)10% SDS 7)0.5 mol/L EDTA, PH=8.0 8) 1 mol/L Tris-HCl, PH=8.0 9) 1 mol/L NaCl 10)Extraction solution (ES) (100 mM EDTA, 200 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI (pH 8.0), 0.5% SDS, 50 μg/ml RNase)
酚氯仿法提取DNA的原理 作者: 渭水凡夫(站内联系TA)发布: 2013-04-06 最近在博客上看到的一篇可以作为入门级《分子生物学十万个为什么》 和大家分享一下 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而D NA溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase 的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DN A分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟；除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至
求助】PBS-酚/氯仿抽提法提取的DNA方法 大家能介绍一下PBS-酚/氯仿抽提法提取DNA的方法吗, 我们实验室没有钱买试剂盒, 还 得自己配试剂, 谢谢!! 你是提取细胞的还是血液的？ PBS是洗涤样品的作用吧，我用酚/氯仿抽提法提过DNA，与试剂盒比较起来，总体感觉是浓度大但是纯度不是很纯，但是做PCR的话是能购满足条件得，如果说要做酶切等操作 的话，最好还是用试剂盒抽提 以下方法可供你参考，祝你好运 细胞DNA的提取 PBS洗涤离心2次，弃上清，加入400 μL裂解液（100mg· L－1蛋白酶K，10mmol·L-1 Tris-HCI，15 mmol·L-1 NaCl，10mmol·L－1 EDTA，4g·L－1SDS pH8.0），重悬细胞，37℃保温12～24h。加450μL平衡酚，混匀，5000 g离心10min．转移上层水相，重复酚抽提1次．转移上层水相，加入450μL氯仿：异戊醇（24：1），混匀，5000g 离心10min。转移上层水相，加入1／10体积3mol·L－1乙酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积无水乙醇，混匀．置—20℃1h后，IO000g离心15min。以700mL·L－1乙醇洗涤2次，晾干后，加入50μLTE，－20℃保存备用． 血液提DNA ①300ul抗凝全血加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。 ②去上清液，加1000ul PBS，充分混匀，8000rpm离心5min。 ③去上清液，加500ul消化Buffer（100mg· L－1蛋白酶K，10mmol·L-1 Tris-HCI， 15 mmol·L-1 NaCl，10mmol·L－1 EDTA，4g·L－1SDS pH8.0），充分混匀，56℃ 水浴5h以上。 ④加500ul 25:24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。 ⑤取上清液，加等量的25:24的酚氯仿，混匀，13000rpm离心10min。 ⑥取上清液，加2倍体积的无水乙醇，轻摇混匀，直到出现絮状沉淀。（未见沉淀提示 DNA量不多） ⑦15000rpm离心3min。 ⑧去上清液，加500ul 70%的乙醇，充分混匀，15000rpm离心3min。 ⑨去上清液，晾干，加50ul TE完全溶解备用。 我觉得酚/氯仿抽提法提取DNA还是可以的，除了开始做的少数几个标本，我一般提取的纯度没有低于1.8，甚至一些超过了2.0。不过，我们也不要完全相信仪器的数值，它只能 提供一个参考。 我做的方法是： 1 DNA提取（血液） （1）加入等体积的PBS磷酸盐缓冲液，充分混匀后12000rpm离心5min，弃上清；加400μlSTE，10%SDS 40μl，蛋白酶-K 10μl（10mg/ml）
酚氯仿法提取DNA主要步骤： 1.将动物组织放在1.5ml的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。每个梯度脱水时间为5-10min 2.将组织放入研钵中，加入适量DNA裂解液（300μl），研磨后再加入300μlDNA裂解液冲洗研磨棒。 3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml离心管，在管中加10μl蛋白酶K，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h）。 4.加入等体积的Tris饱和酚（500μl），摇匀（10min）。 5.离心：12000R，7min，4℃。离心后分成上中下三层，上层为DNA，中层为蛋白质，下层为有机质。 6.吸取上层液体加入新的离心管。 7.配制Tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。 8.在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl，摇匀10min。 9.离心：12000R，7min，4℃。 10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl（氯仿：异戊醇=24:1）。 11.离心：12000R，7min，4℃。 12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。-20℃过夜。 13.将样品取出，12000R，7min，4℃离心。 14.弃上清，留白色沉淀（DNA），加400μl的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。 15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。 16.提取DNA完成。 溴氯仿法提取DNA的原理： 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase 的活性。
各种DNA提取方法 一，基因组DNA提取方法 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等 试验步骤： 1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。 2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。 3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/%SDS)混匀。 4、加入25ul 蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml 混匀，50℃水浴3h 5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相 6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL 混匀，冰浴，10min.。 7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。2500rpm离心10min。弃上清。 8、加入倍体积3mol/L乙酸钠与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。 9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。二，外周血DNA提取技术分离外周血白细胞提取方法： 试验步骤： 1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。 2、小心吸取上层血浆，分装到3个离心管中。 3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。 4、2500rpm离心10min，弃上清。 5、加入10ml 溶血液，摇匀，冰浴15min。 6、3000rpm离心10min，弃上清。 7、倒置离心管，去掉残液。 8、得白细胞，－80℃冻存。 试验要求： 血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。 三，氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA： 试验试剂： Ligsisbuffer： 7.12g30.071g；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。ACD 抗凝剂：__________柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。 提取缓冲液（Extractionbuffer）： 10mMTrisCl(PH=(PH=(PH=(PH=%SDS10%；最后加灭去离子水至100ml， 高压灭菌 试验步骤： 1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。 2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。 3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。 4、加入8μl 的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。 5、每管加入450μl 饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。 6、取上清，每管加入250μl 饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 7、取上清，每管加入500μl 氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。 8、取上清，每管加50μl 的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。 9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。 10、加入50μl 灭菌去离子水，转弹，混匀。 四，NaI提取法提取外周血白细胞基因组： 实验步骤： 1、取外周抗凝血（全血）100ul 于eppendorf管中，12000rpm离心12min。 2、弃上清，加双蒸水200ul 溶解，摇匀20s。 3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。 4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm 离心12min。 5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心 12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。 6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。 7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE 溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。五，常用的外周血白细胞基因提取方法： 试验原理： 苯酚/氯仿提取DNA是利用岘_Q______酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机
苯酚-氯仿法小提DNA 试剂配制： 1：细胞裂解液：0.32 M 的蔗糖；5 mM 的MgCl2 2：DNA稀释缓冲液：0.375 M的NaCl；12 mM的Tris-HCl [PH 7.5] 3：10%的SDS [PH 7.2] 4：5 M的NaCl 5：苯酚-氯仿混合液V/V = 1:1 6：无水乙醇和70%的乙醇 DNA 抽提： 1、收集白细胞:500 μl新鲜/冻存全血(EDTA-2Na抗凝),加入1 ml的细胞裂解液 充分混匀后孵育10分钟，,13000 rpm离心15 sec/3min； 2、洗涤白细胞:离心后弃去上清液,加入1ml双蒸水重悬沉淀,将沉淀充分吹打使 起完全溶解后, 13000 rpm离心1 /5min； 3、稀释DNA，去除蛋白:弃离心后上清液，加入80 μl DNA 稀释缓冲液,重悬 沉淀，完全溶解后，加入10 μl 10% SDS 和5 M NaCl 100μl，用手摇匀,再加双蒸水240 μl稀释DNA； 4、加入300 μl苯酚-氯仿-异戊醇溶液(V/V=25:24:1,PH=7.5).盖紧试管,彻底混合 均匀后, 13000 rpm离心12 min; 5、取上清相转至另一1.5 ml EP管中，加入上清液体积比的1.5-2倍体积的预冷 无水乙醇。反复颠倒数次后,可见有絮状DNA沉淀析出； 6、13000 rpm离心5 min,去上清水相。加入和无水乙醇等量的70%预冷乙醇洗去DNA中的盐后,离心5 min。用100 μl ddH2O或50 μl TE保存DNA备用。 为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
酚氯仿法提取DNA的一些试剂的作用 酚氯仿法提取DNA的原理 用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？ 使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚－氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。 用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？ 用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。 将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：将离心后除去RNA的沉淀，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10％SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1％左右，边加边搅拌，放置60 ℃水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟； 除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟，8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面不出现蛋白凝胶为止； 沉淀：准确量取上清液体积，加2倍体积95％冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀； 溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解,得DNA溶液。 溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
酚氯仿法提取DNA 主要步骤： 1.将动物组织放在1.5ml 的离心管中，分别用75%、50%酒精和纯水梯度脱酒精。每个梯度脱水时间为5-10min 2.将组织放入研钵中，加入适量DNA 裂解液（300μl ），研磨后再加入300μlDNA 裂解液冲洗研磨棒。 3.将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml 离心管，在管中加10μl 蛋白酶K ，用封口带将离心管封口，放入摇床（56℃,5h ）。 4.加入等体积的Tris 饱和酚（500μl ），摇匀（10min ）。 5.离心：12000R ，7min ，4℃。离心后分成上中下三层，上层为DNA ，中层为蛋白质，下层为有机质。 6.吸取上层液体加入新的离心管。 7.配制Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1。 8.在含有上清液的离心管中加入Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇混合液450μl ，摇匀10min 。 9.离心：12000R ，7min ，4℃。10.吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400μl （氯仿：异戊醇=24:1）。11.离心：12000R ，7min ，4℃。12.吸取上清液加入新的离心管，加入2.5倍经过-20℃冷冻的100%的酒精。-20℃过夜。13.将样品取出，12000R ，7min ，4℃离心。14.弃上清，留白色沉淀（DNA ），加400μl 的75%的经过-20℃冷冻的酒精，反复吹打溶解。15.重复第14步骤2次（用75%酒精洗三次）。16.提取DNA 完成。溴氯仿法提取DNA 的原理：用酚抽提细胞DNA 时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase 的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。 使用酚的优点：1. 有效变性蛋白质；2. 抑制了DNase 的降解作用。缺点：1. 能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly （A ）RNA 。2. 不能完全抑制RNase 、管路敷设技术通过管线敷设技术，不仅可以解决吊顶层配置不规范问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标高等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内，强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。