万方数据
万方数据
万方数据
发酵工程与设备课程论文 题目木瓜蛋白酶 班别学号 姓名 成绩
木瓜蛋白酶 摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries 关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。 作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 一、木瓜蛋白酶的制备及保存 木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
跨膜丝氨酸蛋白酶研究进展 郭晓强 (解放军白求恩军医学院生物化学教研室,石家庄050081) 摘要 跨膜丝氨酸蛋白酶(T MPRSSs),又名II型跨膜丝氨酸蛋白酶(TTSPs)是一类定位于细胞膜上具有保守丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白家族,哺乳动物中已发现二十多个成员。T MPRSSs基本结构类似,C端蛋白酶结构域在胞外,N端位于胞内,还拥有单跨膜结构域,差异之处在于主干区。T MPRSSs具有多种重要生理功能,功能异常可造成耳聋、癌症、贫血和高血压等多种疾病。本文对T MPRSSs基本特征、结构、生理功能及相关疾病进行综述。 关键词 跨膜丝氨酸蛋白酶;耳聋;癌症;贫血;高血压 中图分类号 Q55 蛋白酶是一类水解蛋白质的酶类,最早于上世纪初在胃液中发现(胃蛋白酶),至今已鉴定多个成员。最早认为蛋白酶主要通过非特异性水解蛋白质参与食物消化,然而一系列研究表明哺乳动物体内还存在一些具有底物选择性的蛋白酶,它们参与更为多样的生理过程,如细胞周期、形态建成、细胞增殖和迁移、排卵、血管生成和细胞凋亡等,功能异常可造成代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病、关节炎和癌症等的发生(Puente等.2003)。相对于传统水溶性蛋白酶,新近发现一类特殊蛋白酶———具有单跨膜结构域的丝氨酸蛋白酶,并且C端位于胞外,因此被称为II型跨膜丝氨酸蛋白酶(type II trans me mbrane serine p r oteases,TTSPs)(Hooper等. 2001),又称跨膜丝氨酸蛋白酶(trans me mbrane p r o2 tease serines,T MPRSSs),这些新成员的发现和深入研究使人们对蛋白酶有了全新的认识[1]。 一、T M PRSS结构与基本特征 自1988年发现第一个跨膜丝氨酸蛋白酶T M2 PRSS1(hep sin)(Leytus等.1988)以来,至今已在人、小鼠和大鼠中发现二十多个成员,仅人类就有十几种(表1)。T MPRSS表达具有明显组织特异性,T M2 PRSS6主要在胎儿和成年肝脏中表达(Velasco等. 2002),而T MPRSS10主要存在于心脏(Yan等. 1999),这种表达模式说明不同T MPRSS参与不同生理过程。T MPRSS家族成员在分子量上差别巨大,如人T MPRSS1包含417个氨基酸残基,而T M2 PRSS10由1042个氨基酸构成,两者相差1倍以上,但基本结构却高度相似,均含四部分,从N端到C 端依次为短细胞质结构域、跨膜结构域、主干区和丝氨酸蛋白酶结构域,后两者位于胞外,不同成员区别主要集中于主干区。 根据主干区不同,T MPRSS可被进一步分为四个亚家族:HAT/DESC、hep sin/T MPRSS、matri p tase 和corin[1]。HAT/DESC亚家族包括T MPRSS11d (HAT)和T MPRSS11e(DESC1),它们结构最为简单,主干区仅由单一SE A(sea urchin s per m p r otein, enter opep tidase,agrin)结构域构成[2](图1)。hep2 sin/T MPRSS亚家族包括T MPRSS1～5和T MPRSS13等,是包含种类最多的一个亚家族,主干区包含清道夫受体富含半胱氨酸(scavenger recep t or cys2rich, SRCR)结构域和低密度脂蛋白A类受体(l ow densi2 ty li pop r otein recep t or class A,LDLa)结构域。matri p tase亚家族包括T MPRSS14(matri p tase21)、T MPRSS6(matri p tase22)和T MPRSS7(matri p tase23),其主干区除含有SEA结构域外,还包含2个CUB (comp le ment p r otein subcomponents C1r/C1s,urchin e mbryonic gr owth fact or and bone mor phogenetic p r o2 tein1)结构域及3到4个串联重复LDLa结构域。corin亚家族目前只发现一个成员T MPRSS10(cor2 in),其结构最为复杂,主干区包含8个LDLa结构域,2个frizzled结构域和1个SRCR结构域。 图1 几个典型T MPRSS结构特点[1]
关于影响土壤酶活性因素的研究 摘要：本文对国内外土壤酶活性影响因素的研究进行了综述,总结了土壤微生物、团聚体、农药、重金属和有机物料等对土壤酶活性的影响,并对土壤纳米粒子与土壤酶活性关系的研究发展前景进行了展望。 关键词：土壤酶活性;微生物;团聚体;重金属;有机物料 Study progress on factors affecting soil enzyme activity Abstracts:In this article,the study on factors affecting soil enzyme activity in recent years was reviewed. Several aspects such as microbial,aggregation,heavy metals,organic manure and so on were included.At the same time,the effects of the soil inorganic nanometer particle (SINP) on soil enzyme activity inthe future research was forecasted. Key words:soil enzyme activity;microbial;aggregation;heavy metals;organic manure 酶是土壤组分中最活跃的有机成分之一,土壤酶和土壤微生物一起共同推动土壤的代谢过程[1]。土壤酶来源于土壤中动物、植物和微生物细胞的分泌物及其残体的分解物,其中微生物细胞是其主要来源[1,2]。土壤中广泛存在的酶类是氧化还原酶类和水解酶类,其对土壤肥力起重要作用。土壤中各有机、无机营养物质的转化速度,主要取决于转化酶、蛋白酶磷酸酶、脲酶及其他水解酶类和多酚氧化酶、硫酸盐还原酶等氧化还原酶类的酶促作用[2]。土壤酶绝大多数为吸附态,极少数为游离态,主要以物理和化学的结合形式吸附在土壤有机质和矿质颗粒上,或与腐殖物质络合共存[3]。 土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向[4],其活性是土壤肥力评价的重要指标之一,同时也是土壤自净能力[1]评价的一个重要指标。土壤酶的活性与土壤理化特性、肥力状况和农业措施有着显著的相关性[5]。因此,研究土壤酶活性的影响因素,提高土壤酶活性,对改善土壤生态环境,提高土壤肥力有重要意义。本文对土壤酶活性影响因子的研究
木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文 得分
摘要 木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。 关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业
1.木瓜蛋白酶的概述 木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。 2.木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 3.木瓜蛋白酶的作用机制 作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。 木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用 （1）医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 （2）食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有
南宁东恒华道生物科技有限责任公司——专业酶制剂生产厂家 销售热线4000-0771-80 木瓜蛋白酶在美白护肤中的应用美白产品在行业中的现状 人体到了25岁以后，身体的新陈代谢功能减慢，黑色素无法正常排解，而在角质层沉积形成斑点，形成黄褐斑、黑斑和色斑等。统计资料显示，13亿人口的中国，祛斑美容产品每年的市场份额已超过100亿元,年利润在千万元以上。国内美白、祛斑类产品已成为护肤品中的主流产品之一，而美白护肤产品绝大多数属于化学试剂或植物提取物，效果有限而且副作用明显，严重影响了用户的持续使用和行业的发展。 美白产品在行业中存在的问题 美白是全世界的难题，有一些不良商家为了使护肤品达到良好的美白效果，在护肤品中添加一些金属元素如汞、铅等。添加汞后，汞化合物会破坏表皮层的酵素活动，使黑色素无法形成。铅的氧化物具有一定遮盖作用，也可用于美白。如果化妆品中添加了砷、汞、铅，长期使用对人体造成的损害最大。在SK—II 之后，又有4大著名化妆品品牌(迪奥、雅诗兰黛、兰蔻、倩碧)的6款粉饼产品被香港媒体披露含有重金属铬和钕。消费者不仅感到恐惧，也对化妆品的安全性产生怀疑。 木瓜蛋白酶在行业中的应用 木瓜酶是从番木瓜水果中提取而得含有多种生物酶的美白去斑生物产品，主要作用为嫩肤及美白去斑。其生物机理学： 第一，木瓜酶作用于人体皮肤老化角质层，促使其分解退化、去除，达到嫩肤效果及促进细胞生长的效果，且木瓜酶水解物在皮肤表层形成一层氨基酸衍生物薄膜，使肌肤保持润湿与光滑； 第二，木瓜酶易于与形成色斑的黑色素中的铜离子形成络合物，减少黑色素的形成和去除色斑的黑色素，且木瓜酶水解的三钛物质可直接抑制形成黑色素的络氨酸活性，消除自由基作用，从而达到美白去斑的效果。 归结起来，木瓜酶通过去除老化皮肤角质层及与色斑中铜离子快速反应，抑制形成黑色素的络氨酸活性和去除氧化自由基，达到嫩肤美白去斑的功效。 1
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。 [关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体的蛋白酶抑制剂在机体与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类 目前，典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂基于其序列、拓扑结构及功能的相似性，至少可分为18个家族[5]，如表1－1所示。不同家族抑制剂的空间结构也不同。通常这类抑制剂是β片层或混合了α螺旋和β片层的蛋白质，也可能是α螺旋或富含二硫键的不规则蛋白质。但它们都拥有规的反应活性位点环的构象，从而使这些非相关的蛋白质具有相似的生物学功能[6]。因此典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂最明确最广泛地代表了蛋白质的趋同进化。 1.2 Serpins Serpins是一类分子量较大的丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族，氨基酸残基数为
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展
丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究进展 梁化亮 （生物与食品工程学院，江苏常熟 215500） Progress on antimicrobial peptide [摘要]蛋白酶抑制剂（PIs）是一类能抑制蛋白酶水解酶的催化活性的蛋白或多肽，广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用。根据活性位点氨基酸种类不同可将蛋白酶抑制剂分为四大类型:丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶抑制剂。其中尤以丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用。其能对蛋白酶活性进行精确调控，包括分子间蛋白降解，转录，细胞周期，细胞侵入，血液凝固，细胞凋亡，纤维蛋白溶解作用，补体激活中所起的作用。[关键词]丝氨酸蛋白酶抑制剂分类临床应用防御
1 丝氨酸蛋白酶抑制剂 免疫系统是由组织，细胞，效应分子构成，并逐渐进化形成用于阻挠病原微生物的侵入攻击，限制它们扩散进入宿主内环境。这其中起到主要作用的是宿主产生的蛋白酶抑制剂，广泛存在于生物体内的蛋白酶抑制剂在机体内与相应的蛋白酶形成一个动态的系统，在生物体系以及一系列的生理过程中起着调控作用[1]，是生物体内免疫系统的重要组成部分。它不仅能使侵入体内的蛋白酶失活并且能将其清除，使附着在宿主表面的病原细菌无法附着生存。其中丝氨酸蛋白酶及其抑制剂在体内一些重要生理活动中起关键性的调控作用[2]。 丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor）泛指具有抑制丝氨酸蛋白酶水解活性的一类物质，广泛存在于动物、植物、微生物体中[3]。在动物体中，丝氨酸蛋白酶抑制剂是维持体内环境稳定的重要因素，一旦平衡失调即导致多种疾病，任何影响其活性的因素也会造成严重的病理性疾病。它们最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡。作为调控物，丝氨酸蛋白酶抑制剂参与机体免疫反应，对生物体内的血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成、激素转运、细胞内蛋白水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等许多重要的生化反应和生理功能有重要的影响[4]。鉴于其重要的生理功能，丝氨酸蛋白酶抑制剂一直倍受研究者的关注，目前已分离得到多种天然丝氨酸蛋白酶抑制剂，同时如何将其更好地应用于食品、医药领域也成为近来研究热点。 1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类
木瓜蛋白酶应用及研究进展 摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方 面的最新研究进展。 关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展 一、简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。 二、作用机理 木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观
为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）
木瓜蛋白酶的提取及应用研究进展 赵电波，陈茜，张丽尧 (郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002) 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶的组成，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Progress of Extraction and Application of Technology of PapainZHAO Dianbo, CHEN Xi, ZHANG Liyao（College of Food and Biotechnology Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, HenanZhengzhou 450002, P. R. China）Abstract: The composition of papain was described, and its extraction methods, research of extractiontechnology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing itwas further described, and its applicationsinpharmaceutical, chemical industry and the future prospects offood processing have been prospected in this article.Key words: papain;extractiontechnology; food processing; application 中图分类号：TS201.1文献标识码：A文章编号：1001-8123(2010)11-0019-05 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。1木瓜蛋白酶的提取工艺 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，取上清液放置于鼓风干燥箱中，在55～60℃烘干，粉碎后即得到粗酶制品。乙引等[2]用这种方法所获得的酶得率为23.1%，但此法不利于酶活的保持，其酶活力仅为0.16×105U/g，且产品的纯度较低。木瓜蛋白酶的提取也曾广泛采用单宁沉淀法，乙引等[2] 用单宁沉淀法提取了木瓜蛋白酶。先将番木瓜乳汁离心，于上清液中缓慢加入已溶解的单宁溶液，不断搅拌，使溶液中单宁达到一定浓度。静置，沉淀 单宁-酶复合物，调节pH值，沉淀后进行真空干燥，得到酶制品。结果表明，这种方法生产的酶得率较低，仅有7.3%，但酶活力较高，为3.53×105U/g。但是这种方法存在环境污染等问题。1.2目前较为常见的提取方法 目前生产中多采用超滤、絮凝、盐析等方法提取木瓜蛋白酶。 1.2.1超滤法提取木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶酶活力检测方法 南宁庞博生物工程有限公司企业标准 Q/NPB 01-2019 食品添加剂木瓜蛋白酶制剂 1、范围 本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。 2、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2019 包装储运图示标志 GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准 GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测 GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定 GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则 GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖 JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜
影响酶活性的因素 a.温度： 温度（temperature）对酶促反应速度的影响很大，表现为双重作用：（1）与非酶的化学反应相同，当温度升高，活化分子数增多，酶促反应速度加快，对许多酶来说，温度系数（temperature coefficient）Q10多为1～2，也就是说每增高反应温度10℃，酶反应速度增加1～2倍。（2）由于酶是蛋白质，随着温度升高而使酶逐步变性，即通过酶活力的减少而降低酶的反应速度。以温度（T）为横坐标，酶促反应速度（V）为纵坐标作图,所得曲线为稍有倾斜的钟罩形。曲线顶峰处对应的温度，称为最适温度（optimum temperature）。最适温度是上述温度对酶反应的双重影响的结果，在低于最适温度时，前一种效应为主，在高于最适温度时，后一种效应为主，因而酶活性迅速丧失，反应速度很快下降。动物体内的酶最适温度一般在35～45℃，植物体内的酶最适温度为40～55℃。大部分酶在60℃以上即变性失活，少数酶能耐受较高的温度，如细菌淀粉酶在93℃下活力最高，又如牛胰核糖核酸酶加热到100℃仍不失活。 最适温度不是酶的特征性常数，它不是一个固定值，与酶作用时间的长短有关，酶可以在短时间内耐受较高的温度，然而当酶反应时间较长时，最适温度向温度降低的方向移动。因此，严格地讲，仅仅在酶反应时间已经规定了的情况下，才有最适温度。在实际应用中，将根据酶促反应作用时间的长短，选定不同的最适温度。如果反应时间比较短暂，反应温度可选定的略高一些，这样，反应可迅速完成；若反应进行的时间很长，反应温度就要略低一点，低温下，酶可长时间发挥作用。 各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可以相应提高1～2倍。不同生物体内酶的最适温度不同。如，动物组织中各种酶的最适温度为37～40℃；微生物体内各种酶的最适温度为25～60℃，但也有例外，如黑曲糖化酶的最适温度为62～64℃；巨大芽孢杆菌、短乳酸杆菌、产气杆菌等体内的葡萄糖异构酶的最适温度为80℃；枯草杆菌的液化型淀粉酶的最适温度为85～94℃。可见，一些芽孢杆菌的酶的热稳定性较高。过高或过低的温度都会降低酶的催化效率，即降低酶促反应速度。 最适温度在60℃以下的酶，当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；当温度接近100℃时，酶的催化作用完全丧失。 一般而言，温度越高化学反应越快，但酶是蛋白质，若温度过高会发生变性而失去活性，因而酶促反应一般是随着温度升高反应加快，直至某一温度活性达到最大，超过这一最适温度，由于酶的变性，反应速度会迅速降低。 热对酶活性的影响对食品很重要，如，绿茶是通过把新鲜茶叶热蒸处理而得，经过热处理，使酚酶、脂氧化酶、抗坏血酸氧化酶等失活，以阻止儿茶酚的氧化来保持绿色。红茶的情况正相反，是利用这些酶进行发酵来制备的。
木瓜蛋白酶在食品工业中应用的研究进展 江甜 （武汉轻工大学，湖北武汉430023） 摘要：本文主要介绍木瓜蛋白酶，重点阐述提取方法、提取工艺的研究进展，进一步介绍木瓜蛋白酶在食品工业特别是在食品加工中的应用，并对其在医药、化工及未来食品加工方面的应用前景进行展望。 关键词：木瓜蛋白酶；提取工艺；食品加工；应用 Applications of papain in the food industry JIANG Tian （Wuhan Polytechnic University，Wuhan, 430023） Abstract: The papain was described, and its extraction methods, research of extraction technology had been highlighted. Applications of papain in food industry, particularly in food processing it was further described, and its applications in pharmaceutical, chemical industry and the future prospects of food processing have been prospected in this article. Key words: papain; extraction technology; food processing; application 木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛地存在于番木瓜(Carica papaya)的根、茎、叶和果实内，未成熟果实的乳汁中含量最丰富[1]。木瓜蛋白酶的作用范围很广，水解温度为10℃～80℃，在pH值3～9的范围内对底物均有作用，且稳定性好。在密封容器内，4℃的条件下或阴凉干燥处保存6个月酶活力仅下降0～10 或10 ～20 [2]。木瓜蛋白酶具有较强的蛋白酶水解和合成能力，还具有凝乳、解脂和溶菌活力，利用木瓜蛋白酶的酶促反应，可把大分子的蛋白质水解成容易消化吸收的小分子多肽或氨基酸[3-4]，不仅可以用来改善植物蛋白的营养价值或功能性质，而且也广泛应用于食品行业，如啤酒的澄清、肉的嫩化以及制革、纺织和日化用品等行业中，同时也受了医学界的极力关注和重视[5-6]。 1木瓜蛋白酶的制备 1.1过去的常规提取方法 木瓜蛋白酶最原始的提取方法是烘干法，就是在番木瓜浆液中加入保护剂，然后将浆液离心，
Papain Papain [9001-73-4] Papain is a purified proteolytic substance derived from Carica papaya Linné(Fam.caricaceae).papain,when assayed directed herein, contains not less than 6000 units per mg. Papain of a higher digestive power may be reduced to the official standard by admixture with papain of lower activity ,lactose,or other suitable diluents. One USP Unit of papain is the activity that releases the of 1μg of tyrosine from a specified casein substance under the conditions of the Assay， using the enzyme concentration that liberates 40μg of tyrosine per mL of test solution. Packaging and storage－Preserve in tight,light-resistant containers in a cool place. USP reference standards (11)—USP papain RS. pH<791>:between 4.8 and 6.2 in a solution (1 in 50). Loss on drying <731>—Dry it in a vacuum oven at 60℃ for 4 hours : it losses not more than 7.0% of its weight. Assay (casein digestive power)— Dibasic sodium phosphate.,0.05M—dissolve 7.1g of anhydrous dibasic sodium phosphate in water to make 1000mL.add 1 drop of toluene as a preservative. Citric acid,0.05M—dissolve 10.5g of citric acid monohydrate in water to make 1000mL. Add 1 drop on toluene as a preservative. Casein substrate—Disperse 1 g of Hammersten-type casein in 50 mL on 0.05M Dibasic sodium phosphate. Place in a boiling water bath for 30 minutes with occasional stirring.Cool to room temperature ,and add 0.05 M Citric acid to adjust to a pH of 6.0±0.1.stir the solution rapidly and continuously during the addition of the 0.05M Citric acid to prevent precipitation of the casein. Dilute with water to 100 mL .prepare fresh daily. Buffer solution (Phosphate-Cysteine Disodium ethylenediaminetetraacetate Buffer)
丝氨酸蛋白酶 摘要：丝氨酸蛋白酶是一种种类丰富的酶类【1】，之所以以此命名是因为在酶的催化活性位点上包含丝氨酸在内的丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸组成的催化三联体。有些丝氨酸蛋白酶类如凝血酶类蛋白酶，其中包括凝血酶，组织纤维蛋白溶酶原激活剂、血纤维蛋白溶酶，它们参与凝血的发生以及炎症应答反应；也有些如胰蛋白酶类的丝氨酸蛋白酶类的参与消化的酶类，包括胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶；还有一些表达在神经系统中的丝氨酸蛋白酶类，这些酶类与神经系统正常的维持或是介导病理情况的发生。其实丝氨酸蛋白酶类在执行功能的时候也受到许多因素的限制，如受一些抑制剂的影响等，这些物质对蛋白酶功能的执行起到重要的作用。 关键词：丝氨酸蛋白酶催化机制功能调节 酶的功能 已知所有的蛋白分解酶类丝氨酸蛋白酶占到了其中的三分之一，这些酶又可以细分成很多种类有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、组织纤溶酶原激活剂、神经源类的丝氨酸蛋白酶等。这些酶类具有消化凝血、纤溶、消化、受精、生长发育、凋亡、免疫等方面都有重要的作用。 酶的催化位点 由于丝氨酸蛋白酶的种类很多根据其催化的特点以及种树亲疏性可以分成不同的类别，不同的组织器官，不同的生物种系中酶的分布与种类是不同的(见表格)。但是其催化特点通常都是其反应的催化三联体，丝氨酸的亲核攻击，即丝氨酸的羟基攻击酰胺键的羰基碳，但是在生物进化的长时间了这种催化活性结构也发生了改变。如在有些酶中其催化三联体不在是固定的丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸，而是只有丝氨酸与天冬氨酸或是组氨酸的一种组成催化活性位点，也有的如组氨酸成对出现于丝氨酸组合形成新的催化结构，但是无论怎样其上的丝氨酸残基是固定保守的。 酶的活化 对于丝氨酸蛋白酶类的活化，一般来说是通过对酶前体【2】的加工使其形成具有催化活性的酶，或者是通过一些辅助因子的协同作用使其由闭合的非活化状态转成活性状态，也有通过信号的捕获诱发一系列的级联反应从而活化蛋白，或是通过一些关键因子的作用使得构想发生改变来实现活化等等。通常来说酶的状态一种是抑制非活化状态，另一种是活化的活性状态，但是在一些研究中酶具有新的状态，而这种状态与酶原或是缺少辅因子而显示无活性的酶的状态是不同的，虽然这种状态下的酶也没有活性，但是其结构上出现一些特有的变化，在对凝血酶的研究中发现，这种状态称为E*【3】，其伴有一些氨基酸链陷入酶的催化活性部位从而破坏其中的氧离子空穴，致使没得活性受阻，因此对于这种酶的活化一定有其他的方式，研究发现当E*状态下在远离活性部位连接一种配体时会将这种氨基酸陷入活性位点的状况扭转过来，从而恢复酶的活性位点，并在其他因子的作用下得到活化。 酶的催化机制 对于丝氨酸蛋白酶类的催化活性，有的是通过前体酶原的活化，比如胰蛋白酶类