动物细胞工程实验指导书
江青艳张守全高淑静
华南农业大学动物科学学院
2004年8月
前言
动物细胞工程是利用生物技术和工程思想对动物细胞进行特定的遗传操作、以及从动物组织中分离有特定功能的细胞并在离体条件下使之快速增殖并产生特定的生物产品的工艺。
动物细胞的遗传操作可以在不同层次上进行：在整体细胞水平上，可利用细胞培养的各种工艺对细胞进行改造，或用细胞融合的方法制备各种杂交细胞；在细胞器水平上，可以进行核移植、染色体注射或将微核、人工细胞等进行融合以制备各种胞质体，或改变染色体的组成或倍性；在基因水平上，有采用外源基因导入细胞的方法，赋予细胞以新的特征核新的功能；此外还可以通过制备全能性的胚胎干细胞，经过遗传操作进而把它植到假孕动物的子宫内孕育成动物以培育新品种。
动物细胞工程是一门新兴的具有产业性质的学科，它的建立与发展，不仅对动物学科的基础理论研究具有强大的推动力，而且势必改变以动物为材料的生产和加工产业、医药工业以及畜牧业的生产面貌。由于哺乳动物细胞是生产许多有着重要经济价值的医药产品的理想场所，它所产生的蛋白质能分泌到细胞外，具有完全正常的天然蛋白质的结构，因此，用动物细胞工程所产生的产品，其分离纯化的程序比工程菌所产生的产品更简单，功效也更可靠，所以动物细胞工程的研究和开发具有特别重要的理论意义和经济意义。
动物细胞工程的建立和发展是以细胞培养技术为前提的。自从1912年Carrel第一个培养出活的动物细胞以来，经历了九十多年的发展，动物细胞培养技术目前已经成为一门精细的实验科学，从取材、消毒、细胞的分离、接种、继代培养到诱变、筛选、克隆、鉴定、冻存等等均已建立了标准的操作程序。动物细胞培养的每一进步都推动了细胞工程的发展。
为了加强生物技术课程的教学与研究。广东省高教厅委托华南农业大学成立生物技术实验室，其中的动物细胞工程实验室由动物科学学院负责承担。为了做好这项工作，我们参照有关的文献资料，从动物细胞培养的基本要求出发，结合我们实验室的条件及平时在教学与科研工作中的实践体会，编写出这本实验指导书用于动物细胞工程的实验教学。由于我们的水平所限，错误之处在所难免，敬请读者批评指正。
编者
2004年8月
目录
前言 (1)
目录 (2)
实验一实验器材的清洗、包装和消毒 (3)
实验二实验室常用的仪器设备及无菌操作 (6)
实验三动物细胞培养用液的配制 (8)
实验四培养细胞的观察 (11)
实验五鸡胚成纤维细胞原代培养 (18)
实验六小鼠肝细胞培养 (21)
实验七小鼠骨骼肌细胞的培养 (24)
实验八微重力条件下大鼠肝细胞三维培养 (26)
实验九单克隆抗体制备技术
1、细胞融合、阳性株的筛选与克隆 (28)
实验十单克隆抗体制备技术
2、单克隆抗体的制备、细胞冻存与复苏........................3 4 实验十一小鼠早期胚胎体外培养 (37)
实验十二小鼠体外受精 (40)
实验十三家兔细胞核移植 (44)
实验一实验器材的清洗、包装和消毒
一、目的：了解动物细胞体外培养的概念，熟悉细胞培养的基本条件；掌握培养用品的清洗、包装、消毒方法，树立“无菌操作”观念；了解灭菌方法及高压湿热灭菌方法及操作注意事项。
二、原理：在动物细胞培养实验中最危险的是发生微生物（包括细菌、真菌、支原体和病毒）污染，因而导致实验失败。污染的来源主要由操作者的疏忽引起；操作表面或周围空气不洁净；培养器具消毒灭菌不彻底等等，因此，在实验中必须采用紫外线照射、60Co射线照射、湿热消毒及化学消毒剂等方法杀灭或除去培养室、培养用品的污染源。
三、仪器设备及用具
仪器：超净工作台、高压灭菌锅、干燥箱、酸缸、水槽
用具：手术器械：手术刀2把、手术剪（弯头）2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：注射器（100ml、50ml、10ml、5ml、1ml ）各2个
烧杯（3000、2000、1000、500、250、100、50ml）各2个
玻璃筒2个
吸管30支
载玻片、盖玻片各1盒
量筒（1000ml、500ml、100ml、50ml）各1个
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5）各2个
贮存瓶（500ml、250ml、100ml）各3个
培养瓶（20ml）20个
刻度离心管（10ml带盖）20个
白管20个
细胞计数板1个
塑料用品：加样器（5ml、1ml、200ul、50ul）各1把
吸头（5ml、50ul 各50个，1ml、200ul）各200个
一次性塑料细菌滤器（ф25mm）10个
Eppendorf管（1.5ml）100个
塑料注射器（50ml、20ml）各1个
洗瓶2个、吸头盒2个
培养板（96孔、24孔、6孔）
其它用品：清洁液、不锈钢滤器、不锈钢饭盒6个、试管架2个、滴管吸头10个、酒精灯1个、酒精棉球瓶1个、污物缸1个、清洁缸1个（1000ml水+5ml新洁尔灭）、反口胶塞20个、细胞筛、PH试
纸6～9、棉花、牛皮纸、线绳、微孔滤膜（0.45、0.22um）大小各1盒、记号笔（粗、细）各1
支、标签纸
四、常用物品的清洗
1、清洁液的配制：新配制的清洁液为棕红色，遇有机溶剂或水分增多时变成绿色，表明失效。配方：重铬酸钾63
克，浓硫酸1000ml、蒸馏水200ml；方法：先在搪瓷盘中加入蒸馏水，加热溶解重铬酸钾，待重铬酸钾冷却后，缓慢加入浓硫酸，边加边用玻棒搅动，以混合液温度不急剧上升、和不出现重铬酸钾结晶为度。配制完毕将清洁液置于特制的酸缸内备用。
2、玻璃器皿：自来水加洗洁精浸泡刷洗流水振荡冲洗20遍重铬酸钾清洁液浸泡过夜流水
冲洗蒸馏水浸泡24小时蒸馏水洗一次烘箱烘干备用。
3、新购置的橡胶制品（胶盖、吸头、反口胶塞等）的洗涤方法：0.5mol/L NaOH煮沸15分钟流水冲洗
mol/L HCl煮沸15分钟流水冲洗自来水煮沸2次蒸馏水煮沸20分钟50℃烘干备用。
用过的橡胶制品其清洗方法：除不用泡酸外，要求基本同玻璃器皿，因胶塞使用面常沾有洗涤剂，流水冲不净，故胶塞洗刷的重点部位是胶塞的使用面。用刷子刷洗，在使用过程中，胶塞尽量不要与培养液接触，以防未洗净的胶塞污染培养液和细胞。
4、不锈钢正压除菌滤器及手术器械的清洗：新的或使用后的滤器及手术器械经50℃水加洗涤剂刷洗流水冲洗
15分钟滤水去离子水浸泡24小时双蒸水浸泡24小时50℃烘干备用。（注意：保护不锈钢滤器内的橡胶塞密封圈）
5、塑料制品的清洗：塑料制品（细胞培养板、胚胎培养板等）质地软且耐腐蚀能力强，但不耐热、易出现划痕，
有条件可一次性使用。如重复使用其清洗程序为：器皿使用后立即用流水冲洗50℃稀洗涤剂用纱布或棉签刷洗流水冲洗20遍晾干浸于稀清洁液中15分钟流水冲洗20遍蒸馏水浸泡两次（每次24小时）晾干，用前紫外线照射两小时。如果量大可打包送辐照中心用钴60照射消毒。
五、包装
细胞培养用品在消毒处理前要进行严密包装，以便于消毒和贮存。包装材料常用牛皮纸、棉布、饭盒、特制玻璃消毒筒（比吸管长，一端封口，用纱布垫底，另一端加棉塞和双层牛皮纸封口），较大的培养瓶及各种瓶口用双层牛皮纸严密包扎，筛网（因属铁质，不能泡酸，应及时清洗、烘干）、小的培养瓶、离心管、注射器、手术器械等用牛皮纸包装后再装入饭盒内，吸管的手持端加棉花。（注意：包装时手指与器材接触面积要小，不能触及器具的使用端。）
六、常用的消毒方法
对不同物品，可分别采用以下的消毒方法。
1、紫外线照射：适用于对培养室、操作区及塑料培养皿、培养板进行消毒。使用紫外线照射消毒时，应禁止阳光
直射，同时避免物品的相互遮挡。
2、湿热消毒：即高压蒸气消毒（日本进口半自动高压灭菌锅），适用于布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿以及某些
培养用液的消毒。消毒前必须检查消毒锅内水位是否合适；消毒物品不能过满，以保证锅内气体流通。对一般的用品的消毒，设定120℃，30分钟的消毒程序即可。
3、60Co射线照射：适用于塑料培养板、培养瓶、培养皿的大批量消毒。培养器皿在洗净晾干后，用塑料袋根据每
次的用量密封包装，再用大塑料袋或纸箱装好，因射线的穿透力强，消毒时不必拆开包装。照射后放置在无菌室备用。
4、滤过除菌：采用微孔滤膜滤器，对培养用液进行滤过除菌，该项操作必须在超净工作台内进行。对大量液体需
采用100mm金属滤器，每次可滤3000ml；滤膜薄且光滑，容易移动，安装膜时位置一定要放好，并用双蒸水浸润，旋好锁栓并用棉布包好，湿热消毒。冷却后马上使用，用后打开滤器对光检查滤膜是否移动或破裂。500ml 以下的液体量可用一次性针头式滤器进行，孔径为0.22μm。
5、使用化学消毒剂：常用的化学消毒剂包括来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸和75％酒精等，其中来苏儿、0.5％过氧
乙酸多用于无菌室内的桌椅、墙壁和地面的消毒；0.1％新洁尔灭和75％酒精多用于实验材料、实验器械、操作者的皮肤及操作台表面的消毒。
6、酒精灯火焰消毒：实验过程中对金属器械的尖端、玻璃瓶口、瓶塞等进行一过性消毒，以确保实验的每一步都
做到无菌操作。
实验二实验室常用的仪器设备及无菌操作
一、目的：了解细胞培养中常用仪器设备的使用方法、注意事项和保养方法。
二、仪器设备：净化工作台、双重纯水蒸馏器、CO2培养箱、压力蒸气消毒器、电热干燥箱、天平、冰箱、不锈钢滤器、离心机、倒置显微镜、立体显微镜、恒温水浴摇床。
三、注意事项
1、净化工作台
（1）首先打开净化工作台的风机及照明灯；
（2）实验前后用清洁液擦拭台面；
（3）经常用酒精棉球擦拭紫外杀菌灯的表面。
2、双重纯水蒸馏器：
（1）使用前先开水源后通电源，使用完毕先关电源，后断水源；
（2）使用去离子水作蒸馏水水源；
（3）蒸馏时需有人看管，调节水位，以防烧坏仪器，每次蒸馏时间不超过3小时。
3、CO2培养箱：
（1）用螺旋口培养瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气，但瓶口过松易污染；
（2）保持CO2培养箱内空气干净，定期用紫外线消毒，或用酒精棉擦拭、酒精熏蒸；
（3）箱内水槽中加1/3体积的蒸馏水（1000ml水加5ml新洁尔灭）；
（4）取放培养物时，尽量缩短开箱时间，减少CO2消耗，手及器具用酒精棉擦拭，减少带入箱内的微生物。
4、压力蒸气消毒器：用前必须观察锅内水位，按要求加入适量的蒸馏水，消毒物品放入量不易过多。
5、电热干燥箱：
（1）烘干物品干燥箱调至50℃即可；
（2）物品不易放置过多，以利于空气对流；
（3）轻关箱门，以防震坏控制板；
（4）塑料、橡胶、纱布等物品烘干温度不宜超过50℃
6、天平：保持干燥，称取试剂时尽量不要撒在称量纸外，如有撒落一定要及时用软毛刷清除干净，防止腐蚀天平。
7、离心机：离心管用粗天平平衡，离心管摆放位置要正确，不能直接把水加入到转子孔内，低温离心后及时将离心机内的水擦干净。
8、倒置显微镜：调节时，动作要轻；用后切记关电源。
9、冰箱：普通冰箱是细胞培养的必备设施，经过除菌的用液必须放入冰箱保存。培养液、无Ca、Mg PBS等都要贮存在4℃冰箱中；血清、消化液、抗菌素、培养基干粉等应贮存于－20℃冰箱中。冰箱内禁止存放易挥发、易燃及有毒的药品。要定期做好冰箱的清洁工作，多人使用冰箱时，应分区摆放，便于使用。
四、无菌操作：
操作前首先将实验用液从冰箱取出，解冻至室温（不宜紫外线照射）；无菌室及超净工作台打开紫外灯照30分钟，关紫外灯10分钟后再进入无菌室；进无菌室前用洗手液洗手，穿工作服、换鞋；打开超净工作台的风机及照明灯，用清洁液擦拭台面，点燃酒精灯；所有已灭菌的实验器具都需在超净工作台内拆去包装取出，用酒精灯进行一过性消毒，并放置在工作台适当的位置；使用培养液时瓶口要及时用反口胶塞封盖；所有无菌器具不能用手直接触摸，需用弯头大号止血钳夹出使用；经常用酒精棉球擦手及台面，滴落在台面的培养液要及时用酒精棉球擦干净；丢弃废液时，滴管要高出污物缸10cm；一旦有不确定的污染因素出现，一定要更换新的无菌用具。
实验三动物细胞培养用液的配制
一、目的：了解动物细胞体外生存、生长所需要的基本用液，掌握细胞基础营养液（RPMI-1640，DMEM等）的配制方法和操作要求，掌握抗菌素、消化液、无Ca、Mg PBS液的配制方法、学习无菌操作，练习各种实验器材的使用方法，练习细胞用液的分装方法。
二、仪器设备及用具
CO2培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、普通冰箱、电子天平、磁力搅拌器、酸度计、PH试纸、不锈钢滤器（已灭菌）、移液器；灭菌后的贮存瓶（250ml、100ml）、离心管、滴管、反口胶塞、1.5ml塑料离心管、1ml吸头；洗干净的烧杯、量筒、玻棒
三、蒸馏水的制备
体外培养的细胞对水的质量十分敏感，必须使用三蒸水，买回来的去离子水要经过玻璃双重纯水蒸馏器蒸馏两次，注意瓶口封闭，减少污染机会，存放时间不超过两周，最好现制现用。
四、培养用液的配制
1、无Ca、Mg PBS液
NaCl 8.00g
KCl 0.30g
Na2HPO4·12H2O 1.83g 注意：在烧杯中加入900ml重蒸
KH2PO4 0.02g 水，然后逐项溶解各试剂，
葡萄糖 2.00g 最后定容至1000ml。
重蒸水1000ml
2、天然培养基
天然培养基有血清、组织提取液等。血清质量好坏是实验成败的关键，常用的血清有：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清等，其中以胎牛血清质量最好。
①血清：大瓶血清（100ml）－20℃保存，用时自然解冻。进行分装（无菌操作）。方法：将新购买的1.5ml塑料离心管放入烧杯，用两层牛皮纸封住烧杯口，高压灭菌、烘干，将血清分装成1ml/支（在超净工作台内无菌操作），
冻存于－15℃～－20℃冰箱，用时按用量提前自然解冻。
②胚胎浸液：胚胎浸液能促进细胞生长繁殖，将9～11天龄的鸡胚用匀浆器磨碎，加等量培养液，2000转/分离心20分钟后，收集上情液，即为鸡胚浸液。冻存于－20℃冰箱，用时自然解冻，离心用上清。
3、合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的，目前已设计除许多种培养基，如TCM199、RPMI-1640、DMEM、DMEM-F12等。
①DMEM基础培养液（不完全培养液）配制方法：
甲液：DMEM干粉10.5克（一包）
Hepes缓冲液 2.7～5.4克（如干粉中有Hepes不必再加）
三蒸水700ml
磁力搅拌至颗粒完全溶解3小时左右采用空气CO2助溶法。
乙液：NaHCO3 2.0~2.2克
三蒸水30ml
搅拌至颗粒完全溶解。
将甲、乙两液混合，加水至体积1000毫升，充分搅拌，PH7.1~7.2，在超净工作台内用不锈钢滤器滤过除菌、分装、贴标签、抽样做检菌试验，5℃～7℃冷藏保存。
②DMEM血清细胞培养液（完全培养液）配制方法：
DMEM基础培养液80ml～90ml
小牛血清10～20ml
青霉素、链霉素（双抗）100单位/毫升
PH 7.1~7.2
4、消化液
①胰蛋白酶液
购自中山大学中山医学院分子医学试剂部，2.5％胰蛋白酶液100ml/瓶，无菌分装于1.5ml离心管中（1ml/支），冻存于－15℃～－20℃备用。用时用无Ca、Mg PBS稀释。
②胶原蛋白酶液
方法：用无菌基础培养液将胶原酶粉稀释成1％的浓度，充分摇匀，溶解分装于1.5ml塑料离心管，冻存于－15℃～－20℃备用。用时加无菌基础培养液稀释。
5、PH调整液
①NaHCO3溶液
常用浓度5.6％，用37℃三蒸水溶解后，用一次性滤器过滤除菌50～100ml，4℃冰箱保存。无菌使用，使用时往培养液逐滴加入，并搅动培养液，用PH试纸检测。
②10％醋酸液
高压灭菌50～100ml，4℃冰箱保存，使用方法同NaHCO3液。
6、抗菌素液（青霉素、链霉素液）
购自中山大学中山医学院分子医学试剂部100ml/瓶、每毫升含青霉素、链霉素10000单位的母液，无菌分装标记于1.5ml塑料离心管（1ml/支），置－15℃～－20℃冻存备用，使用终浓度为每毫升100单位（100ml不完全培养液中加1ml双抗母液，用时才加）。
7、终止液（完全培养液）
血清细胞培养液（完全培养液）对倍稀释已消化好的细胞悬液，使之停止消化。
实验四培养细胞的观察
一、目的：了解体外培养细胞分型；通过原代细胞观察、换液，了解一代细胞生长增殖过程；掌握细胞贴壁和生长过程中几种细胞（刚接种细胞、放射延展细胞、成纤维细胞、上皮细胞、衰老细胞、S晚期细胞、G2晚期细胞、M 期细胞）的形态、结构特征和核大小；掌握培养细胞贴附器皿条件，并了解其贴附过程。
二、实验内容
1、培养细胞的分型
体外培养的动物细胞有两种类型，一类是非贴壁依赖性细胞，来源于血液、淋巴组织的细胞，杂交瘤细胞，一些肿瘤细胞核转化细胞属于这一类型。这类细胞可采用类似微生物的培养方法进行悬浮培养，细胞胞体呈圆球形。
另一类是贴壁依赖性细胞，包括大多数动物非淋巴组织细胞核许多异倍体肿瘤细胞。它们只能贴附在带适量电荷的固体或半固体表面上生长。培养细胞贴附在器皿上，细胞分化现象常变得不显著，易失去它们在体内的原有特征，在形态上常表现单一化的现象，并常反映其胚层起源，类似所谓“返祖”现象。如源于内、外胚层的细胞多呈上皮型，源于中胚层的细胞多呈成纤维细胞型。供体年龄越小，这种现象越明显。
体外培养细胞大致分为四型。
成纤维细胞型成纤维细胞胞质常向外伸出2～3个长短不同的突起，突起的数目不同，细胞形态有梭形、扇形或星形。细胞边缘不整齐、胞浆透明。细胞核呈椭圆形，核仁明显。细胞可以单独活动。组织块培养时，细胞呈放射状、火焰状或漩涡状走行。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间叶组织起源的细胞，如心肌细胞、平滑肌细胞、成骨细胞、胶质细胞等常类似成纤维细胞形态。凡培养细胞形态与成纤维细胞类似的，皆可归入成纤维细胞型。
上皮细胞型细胞呈扁平不规则多边形，角为钝角，大小相仿，中夹有圆形核。细胞外观透明，生长时呈薄膜状移动，细胞彼此紧密相连成单层膜，也可呈管状或囊状样生长。前者如肾脏培养细胞，后者如乳腺、内分泌腺培养细胞。上皮膜边缘的细胞总是与膜相连，很少脱离细胞群单独活动。起源于内、外胚层的细胞，如皮肤表皮及其衍生物，消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等细胞，皆呈上皮型。上皮细胞传代后形态特征逐渐典型。
游走细胞型起源于网状内皮系统的细胞皆属本型。细胞散在生长，常活跃地游走或做变形运动，速度快而且方向不规则，一般不连接成片。此型细胞不稳定，有时难与其它型细胞区别。若受培养基影响，它们也可能呈成纤维细胞形态。
多形细胞型神经细胞属于本型。
培养细胞形态结构特征受培养条件（基质、温度、PH值、营养污染状况和培养方式等）影响。角膜上皮细胞在胶原基质上的形态与体内天然状态相吻合，而在塑料基质上细胞单层生长，呈扁平形。气液界面培养的气管上皮细胞在光镜下呈复层生长，其转运功能较单层培养细胞更接近正常生理情况。上皮型Hela细胞在偏碱或偏酸的环境中停止生长，细胞形态变成梭形。不规则形，给予及时纠正，细胞又逐渐恢复原形。
2、细胞培养中常用术语
细胞培养（cell culture）单个细胞在体外条件下的生长，称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织。
组织或器官培养（tissue or organ culture）是指组织、器官原基，以至整个器官或其一部分在体外的维持或生长，它们可以分化并保持原来的结构或功能。
外植块（explant）用于开始体外培养而切下的一小块组织或器官。
细胞系（cell line）原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。如果细胞系不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系（finite cell line），它由原代培养中的许多细胞系组成。如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系（continuous cell line），即已建成的细胞系（establisted cell line）。
细胞株（cell strain）通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。这些特性包括具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。
汇合（confluent）指在瓶中培养的细胞彼此汇合，形成单层。
克隆（clone）单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。
体外转化（in vitro transformation）细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、抗原、增殖或其它特性的可遗传的变化。
体外恶性转化（in vitrojmalignant transformation）细胞在体外培养过程中获得了致瘤性，当把这种细胞接种于适当的动物，可以产生肿瘤。
集落形成率（plating efficiency）细胞接种到培养器皿内所形成的集落的百分率。接种细胞的总数、培养瓶的种类以及环境条件（培养基、温度、密闭系统还是开放系统等等）均须说明。如果能肯定每个集落均起源于单个细胞，则可使用另一专业术语——克隆形成率（cloning efficiency）。
细胞一代时间（cell generation time）单个细胞两次连续分裂的时间间隔。可借助显微电影照相术来精确确定。
群体倍增时间（population doubling time）在对数生长期（logarithmic phase of growth）计算细胞数增加一倍所需要的时间，例如在此期间细胞由1.0×106增殖到2.0×106个细胞。平均群体倍增时间可以通过计算培养结束时或收集培养物时的细胞数与接种时的细胞数的比值推算而得。
再培养（reculture）单层细胞不经任何丢失而转移到新鲜培养基的过程。
饱和密度（saruration density）在特定条件下，培养器皿内能达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞群体停止繁殖。在贴壁培养中以每平方厘米的细胞数表示，在悬浮培养中以每立方厘米的细胞数表示。
贴壁率（seeding efficiency, attachment efficiency）在一定时间内，接种细胞贴附于培养器皿表面的百分率，但应当说明测定贴壁率时的培养条件。
原代培养（primary culture）从机体取得材料（细胞、组织或器官）在培养瓶内培养到第一次传代前，即为原代培养或初代培养。
传代培养或传代（passage）指将细胞从一个培养容器移植到另一培养容器中培养。
3、原代培养
体外培养细胞从细胞接种到分离在培养，一般要经过以下几个阶段。
游离期细胞接种后，在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。
贴壁期细胞附着于支持物上，游离期结束。原代细胞大多数在24小时内贴壁，细胞株平均在5～30分钟贴壁。单个细胞贴壁快，细胞团和组织块贴壁慢。培养基偏酸偏碱，细胞机能不良或濒死细胞都不易贴壁。另外，培养基污染、胶塞有毒、培养器材不洁等都不利于细胞贴壁。
生长基质是带正电荷的糖蛋白，细胞表面唾液酸残基带有负电荷，因静电吸引作用使细胞容易贴附。血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIC）和纤粘素（FN）等，均属于糖蛋白。实验证实：CIG具有使细胞贴壁生长和促胞质分裂的作用。1～5微克/毫升的FN能促进细胞贴壁，含10％小牛血清的全培养基中有2～3微克/毫升的FN。FN与细胞表面FN受体结合，引起细胞骨架重组，促进细胞粘着、铺展、增殖。某些动物细胞如人的成纤维细胞，能合成大量纤粘素，因此即使在无血清的情况下也能贴壁。相反，某些细胞如许多分化程度高的细胞或转化细胞，合成这种糖蛋白量很少，只有在培养基中补加血清或外加带正电荷的糖蛋白，如鱼精蛋白或生长在多聚赖氨酸覆盖的培养皿中，才能改善细胞贴壁率和克隆生长率。CIG与多聚赖氨酸联用，也能使细胞迅速贴壁。
细胞贴壁后由圆形细胞变成放射延展细胞，进而过渡成极性细胞。放射延展细胞的中央为胞核，核周围胞质较稠密（即内质），含有较多的细胞器，主要是颗粒状或线状的线粒体。细胞质的外质部分无色透明，内含有较少的细胞器如微丝、微管，需特殊染色显色。放射延展细胞持续0.5～2小时，过渡为极性细胞（即细胞的分化形态）。极性细胞常见的有成纤维细胞型和上皮细胞型。极性细胞形态常随细胞运动发生改变，成纤维细胞的外质周边部可分为活跃与不活跃的两部分，不活跃部分比较稳定，活跃部分常伸出伪足，使细胞发生定向运动。有的细胞附着于支持物后，也可不经过放射延展阶段直接变为极性细胞。上皮细胞稍有不同，它们经过延展阶段进入极性细胞时，细胞相互接壤成片，似无极性，外质周边也无明显活跃与不活跃部分的区别。
潜伏期此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。原代培养细胞潜伏期长，一般为24～96小时或更长。细胞株潜伏期短，一般为6～24小时。潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。
指数生长期（又称对数生长期）此时期细胞增殖旺盛，细胞数成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。此阶段可以用细胞群体倍增时间、细胞分裂指数、3H-TdR渗入法等来判断。在细胞接种数量适宜的情况下，培养3～5天后，细胞数量增多。成纤维细胞膜呈现特征性的皱褶样活动，当两个细胞相互接触时，其中一个或两个停止移动，并相互远离。当一个细胞被其它细胞固定无处可去时就停止移动，接触区域的细胞膜皱褶样活动便会停止。这样保证了细胞不重叠生长，此现象称为接触抑制（contact inhibition）。转化细胞或癌细胞失去接触抑制特征，导致癌细胞相互重叠向三维空间发展，只要营养充分，细胞仍然能够进行分裂，细胞数量持续增多。正常细胞生长汇合成单层时，细胞达到一定密度，细胞停止分裂，这种现象叫密度抑制（density inhibition）。这时细胞可维持存活一段时间，但不发生分裂增殖细胞生长所能达到的饱和密度，因细胞的类型而不同，也因培养条件的改变而改变。特别是转化细胞和癌细胞的密度抑制调节下降，因此可以生长分裂至较高的细胞密度。
细胞从贴壁期、潜伏期进入增殖期，其表面亚微结构发生相应变化：细胞贴附后，伸长成其固定有分化形态，如上皮型细胞扁平，呈不规则多边形；成纤维型细胞伸长成梭形、不规则三角形等。部分细胞紧贴在培养瓶壁，从G0期进入G1期，从G1期进入S期，核内DNA合成，细胞表面微绒毛和小泡很少。细胞进入G2期，特别是G2期的中期，细胞渐渐从贴壁的摊平状态鼓起来，细胞表面的微绒毛增多。细胞进入有丝分裂期（M期），细胞进一步变成球状，微绒毛更多了。M期的末期，分裂成两个子细胞，细胞仍保持圆球状。子细胞进入G1期又从圆球状变得扁平，表面突起消失和微绒毛减少，表面铺开拉平，贴在培养皿的壁上。细胞表面的周期性变化，反映细胞内部剧烈的生命活动和环境物质交换的变化。
停止期（平顶期）细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂增殖，可继续存活一段时间。为保存细胞活力，通常在细胞长满瓶底80％时传代，即将细胞接种到2～3个新瓶皿中，继续培养繁殖。若不及时传代，由于营养物质的消耗和代谢物的积累，细胞发生中毒性改变，甚至脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）可影响下一代细胞的机能状态。要恢复至正常状态，还要再传一两代，待不健康的细胞被淘汰掉后，方可做实验。
小鼠和人成纤维细胞在培养条件合适情况下，细胞单层形成后，仍可继续增殖，呈重叠复层生长特征。
4、细胞周期
细胞每一次增殖所经历的全过程称为细胞的增殖周期，简称细胞周期（cell cycle）。从理论上说，细胞每经过一个增殖周期，在数量就增加一倍。根据细胞周期不同时期的生化特点，可以把一次细胞周期划分为四个连续的时期
或时相（phase），即G1期（DNA合成前期），S期（DNA合成期），G2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G1期为起点，那么细胞周期的各时相应循着G1-S-G2-M…G1的顺序进行，G1、S、G2三期合称为细胞间期，此期完成细胞生长过程，主要为遗传物质DNA的复制。有丝分裂期（M期）完成遗传物质（染色体）的分配。细胞群中多数细胞处于间期，少数细胞处于M期。在细胞周期各期都有蛋白质合成，S期的蛋白质合成速度最大，M期最小。DNA合成仅发生在S期。RNA合成在G1、S和G2期，以恒定速度进行。细胞周期各时期的生化变化，实际是一个连续的过程，上一期生物合成为过渡到下一期作物质准备。因此，在细胞周期的任何一个时期的生物合成被阻断，都可以使整个增殖周期被抑制。例如，细胞从G1期向S期过渡，需要合成某些特殊RNA和蛋白质，这时若G1期细胞接受蛋白质合成的抑制剂（如嘌呤霉素）的处理，或G1后期细胞经RNA合成抑制剂（如放线菌素D）处理后，均可阻止G1期细胞进入S期。同样，处于S期的细胞如用DNA合成抑制剂（如氨甲喋呤、阿糖胞苷）处理后，可阻碍其进入G2期。秋水仙碱能干扰纺锤体形成，细胞被阻断在M期。总之，任何一种可以中断细胞增殖的因素（药物或射线），都是通过干扰某一时相的生物合成而抑制细胞生长的。
细胞完成一次细胞周期所需要的时间称为细胞周期时间（time of cell cycle, TC），因此细胞生长的速度同TC的长短有关。正常细胞和肿瘤细胞相比较，TC大致是相接近的，如人的正常肠上皮细胞的TC一般为1～3天，结肠癌细胞TC约2.5天；急性白细胞的TC是2～4天，而正常白细胞的TC是1天。由此可见，肿瘤细胞的增殖速度并不比正常细胞快，所不同的是正常细胞的增殖达到一定的限度就停止了，而且增殖的细胞数基本上相当于丢失的细胞数，总数始终保持相对恒定；肿瘤细胞虽然增殖速度不比正常细胞快，也可能有少数的丢失，但是它们是以持续的无限制方式增殖，在培养条件合适时，瘤细胞数量的增加永不停止。细胞周期时间和细胞周期中各期的持续时间因不同细胞类型而异。一般说来，哺乳动物的细胞周期为10～30小时。其中S期、G2期及M期加在一起约为10小时，不同细胞的变异程度较小，而G1期持续时间差别则较明显。
M期细胞分裂全过程持续时间一般为30～60分钟，但因细胞种类不同和温度变动，分裂时间有一定差别。由于细胞长期传代、反复冻存等因素影响，培养细胞中有异常分裂相现象。
5、培养细胞的生命期
多数二倍体细胞在体外培养中维持有限的生存期，最多生存一年左右，人成纤维细胞可传30～50代，相当于150～300个细胞周期。不同组织来源、取自不同年龄个体的成纤维细胞平均寿命是不同的。取自年轻个体成纤维细胞的寿命比年老者长。同年龄的个体健康差异又影响培养细胞的寿命。不同种族的动物细胞寿命亦不同，如人胚成纤维细胞能传50代，恒河猴皮肤成纤维细胞寿命为8代左右。培养人皮肤成纤维细胞生命的全过程大致经历以下三个阶段。
第I阶段原代培养期（primary culture）。从体内取出组织细胞接种，进行原代培养，原代细胞一般持续1～4周，是二倍体核型。此期细胞常活跃地移动，极少见细胞分裂相。原代细胞与体内原组织相似性大，细胞是异质的（heterogeneou），细胞间相互依存性强，细胞软琼脂集落形成率和克隆形成率很低。细胞转化可能性极小，适宜进行疫苗制备、药物测试、移植等实验研究。
第II阶段传代期。原代培养传代后称为传代细胞（subcultured cell）。原代细胞传代后便成为一有限细胞系（finite cell line）。在适宜培养条件下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存，其与原代细胞有同样的形态和使用价值。目前，常用细胞系均在10代内冻存。如不冻存，反复传代有可能丢失二倍体性质。原代细胞一般传到10代左右就不易传下去，大部分细胞出现退化，甚至死亡。仅极少数细胞度过危机，这些存活细胞再传代40～50代后，增殖缓慢以至完全停止，细胞进入第III阶段。
第III阶段衰退期。细胞仍然生存，但不增殖或增殖很慢，细胞衰退死亡。
在细胞生命阶段少数情况下，由于不明原因的影响，任何一个阶段都可能发生自发转化（spontaneous transformation）。转化的标志之一是细胞获得不死性（immortality），即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系或连续细胞系（continuous cell line）。培养细胞转化成一个细胞系的可能性，很大程度取决于培养细胞的动物种属。小鸡是一个“稳定”的种，它的细胞培养物不能自发转化、小鼠细胞自发转化的可能性最高，几乎鼠胚成纤维细胞的每个大量培养，都能得到连续细胞系。大鼠、金黄地鼠成纤维细胞自发转化率也是相当高的。健康成人除淋巴细胞培养可获得淋巴样细胞系外，其它细胞培养成系株的可能性很小。无限细胞系的形成主要发生在II 期，III期比较少见。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（heteroploid）。转化后，细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性而无恶性，需做动物致瘤试验、软琼脂培养、凝集试验等来确定。目前实验中常用的无限细胞系有3T3-Swiss albino、NIH3T3、BHK-2等，属异倍体核型，它们易在基质上铺开，在低血清培养基内不生长（常用15％血清），在半固体培养基内形成很少集落，但细胞保持接触抑制，而且同源动物无致瘤性，它们是良性无限细胞系。但这类细胞在性质上已接近恶变细胞，有可能发生恶性转化。在无恶性转化前提下才可做进一步实验。各种癌细胞株能在软琼脂低血清中生长（常用10％血清），它们可使裸鼠或去胸腺动物致瘤，是恶性无限细胞株。
实验五鸡胚成纤维细胞原代培养
一、目的：鸡胚成纤维细胞的培养是动物细胞培养的基础实验之一，通过本实验了解鸡胚成纤维细胞的分离、培养技术及其体外生长的特点，掌握动物细胞体外培养的基本方法。
二、原理：应用胰蛋白酶处理鸡胚组织，使成纤维细胞呈单个、游离状态，在培养液中成纤维细胞呈现典型的贴附式生长。
三、材料：9～12天的鸡胚。
四、仪器设备及用具
仪器：CO2培养箱、超净工作台、CO2钢瓶、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机
用具：手术器械：手术剪2把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）10个
滴管套管10个
滴管一筒
塑料用品：20ml培养瓶2个、40ml培养瓶2个
6孔培养板1块（放置鸡胚）
移液器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各10个，1ml、200ul各50个）
吸头盒2个
其他用品：不锈钢饭盒
100目、200目细胞筛各1个
五、试剂和培养基
无Ca、Mg PBS、DMEM培养液、2.5％胰蛋白酶液、小牛血清、75％酒精、0.1％台盼蓝、双抗
六、实验步骤
1、实验前的准备：在本次试验前必须完成以下准备工作
（2）孵化至9～12天的鸡蛋（鸡胚）。
（3）各项实验用品的消毒。
（4）无菌室、超净工作台的清洁、消毒、
2、实验操作：
（1）在超净工作台内将鸡蛋置入6孔板上，令气室端（钝端）向上，用酒精棉球消毒蛋壳，待酒精挥发后，用弯剪刀环行剪除气室端卵壳，切开壳膜，暴露出鸡胚，用镊子将鸡胚取出置入培养皿中。
（2）剪去鸡胚的头、翅、爪，其躯体用不完全培养液洗三次，再用眼科剪剪成3mm3左右的组织块。
（3）切碎的组织块用不完全培养液洗三次，再用无Ca、Mg PBS洗两次。
（4）加入适量的0.25％胰蛋白酶（用无Ca Mg PBS稀释），每个鸡胚加20ml，置于37℃水浴箱中振荡消化30分钟，以悬液中组织块漂浮不易下沉为度。吹打、镜检，细胞已单个分散即可终止消化。
（5）悬液经100目细胞筛过滤，收集滤液于10ml离心管中，1000转离心10分钟，再用不完全培养液洗两次，用0.1％台盼蓝染色计算活细胞数。
（6）将细胞悬液用DMEM培养液（含15％小牛血清）稀释至5×105个/ml，接种至培养瓶或培养板中，置入37℃、5％CO2、饱和湿度的CO2培养箱内培养，每天观察细胞的生长情况，视情况隔天换液，待细胞长成单层后，可传代培养。
实验流程
将鸡胚置于平皿中，剪去头、翅、爪
不完全培养液洗三次
将鸡胚剪成3mm3左右的组织块
不完全培养液洗三次
无Ca、Mg PBS洗两次
将组织块移入培养瓶中
加入0.25％胰蛋白酶液20ml
37℃、30分钟；终止消化
吹打细胞悬液，经100目细胞筛过滤
1000×g、离心10分钟
不完全培养液洗三次，细胞计数
稀释至5×105个/ml
接种，置37℃的CO2培养箱内培养
每天观察
视细胞生长情况隔天换液
七、实验的关键和注意事项
1、所选用的鸡胚必须保证成活、无菌。
2、每次冲洗组织或细胞时，离心力不可过大。
3、由于钙、镁离子会影响胰蛋白酶的消化能力，在消化前宜改用无Ca、Mg PBS洗两次。
4、胰蛋白酶的消化时间不可过长，以免影响细胞活力。
5、接种时的细胞浓度过高或过低均会影响细胞生长，一般以5×105个/ml为宜。
八、实验结果与分析
本实验要求做到连续培养一周不发生污染、细胞在培养瓶内铺满单层。
实验六小鼠肝细胞培养
一、目的：上皮细胞培养是研究细胞结构与功能的主要材料，而肝细胞培养是上皮细胞培养实验的典型代表。通过本实验熟悉大鼠肝细胞的分离、培养方法，掌握哺乳动物上皮细胞的原代及传代培养技术。
二、原理：肝组织块在培养瓶中形成生长晕；用胰蛋白酶和胶原酶消化肝组织后游离出的肝细胞在培养瓶中形成单层；待原代细胞生长连接成片后，用胰蛋白酶和EDTA混合消化单层细胞，做传代培养。
三、材料：小鼠
四、仪器设备及用具：
仪器：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机
用具：手术器械：手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个）
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）10个
滴管套管10个
塑料用品：20ml、40ml培养瓶各2个
24孔培养板2块
加样器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个）
吸头盒2个
其他用品：不锈钢饭盒6个
100目、200目细胞筛各1个
五、试剂和培养基
无Ca、Mg PBS、DMEM-F12培养液、2.5％胰蛋白酶液、1％胶原酶液、小牛血清、75％酒精、0.1％台盼蓝
六、实验步骤
1、原代肝细胞培养：
（1）颈动脉脱臼处死小鼠，浸入75％酒精消毒3分钟；无菌手术取出小鼠肝脏置入平皿内，剥除被膜和血管等纤维成分，用不完全培养液洗两次。
（2）用手术剪把肝脏剪成2mm3左右的小块，用不完全培养液充分漂洗三次，尽量去除血细胞，将组织块置入培养瓶中。
（3）加入0.2％胶原酶液，20ml，37℃摇床消化15～20分钟，中间摇匀一次。
（4）细胞悬液吹打后，镜检，细胞单个分散后加入等量的终止液，吹打；100～250目细胞筛过滤，收集细胞悬液，1000转、离心10分钟，弃上清，用不完全培养液洗二次，每次600转，低速离心3分钟，去除酶和血细胞。（5）计数，用完全培养液将细胞浓度稀释为1×105个/ml，接种于培养瓶或培养板中，每天观察细胞的生长情况，隔天换液。
2、传代培养：
待细胞生长连接成片后，吸出培养液，加入0.25％胰蛋白酶液消化5～10分钟，待细胞回缩后，吹打加终止液停止消化，吹打，离心，弃掉消化液，用不完全培养液洗三次，加完全培养液吹打，制成适当浓度的细胞悬液，再接种培养。一瓶扩大培养成两瓶。
实验流程
取小鼠肝脏，剥除被膜及结缔组织
不完全培养液洗两次
把肝脏剪成2mm2左右的小块
用不完全培养液漂洗三次
将组织块移入培养瓶
加入0.2％胶原酶液
37℃摇床消化15～20分钟，终止消化
吹打细胞悬液，100目细胞筛过滤，
收集悬液，1000转离心10分钟，弃上清
不完全培养液洗二次（600转，离心3分钟）
计数，按5×105个/ml接种
待细胞生长连接成片后
加入0.25％胰蛋白酶液
消化5～10分钟
吹打，离心，弃掉消化液，用不完全培养液洗三次
用完全培养液制成适当浓度的细胞悬液，再接种扩大培养
七、实验的关键和注意事项
1、实验用小鼠以幼龄为好（断奶后）。
2、肝组织剪碎后的血污应漂洗干净，以免影响细胞生长与镜下观察。
3、做传代消化时，一旦单层细胞漂起立即终止消化，以免过分伤害细胞。
八、实验结果与分析
要求学员拍下细胞原代培养及传代培养的照片，并分析细胞的生长情况。
实验七小鼠骨骼肌细胞的培养
一、目的：由于骨骼肌在机体中的重要地位，多年来对于它的研究一直备受关注，离体培养骨骼肌卫星细胞是进行此项研究的重要手段之一。
二、原理：采用II型胶原酶24小时、37℃消化法及差速贴壁法获得高纯度的骨骼肌细胞。
三、材料：小鼠。
四、仪器设备及用具
仪器：CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机
用具：手术器械：手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个）
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）10个
滴管套管10个
塑料用品：20ml、40ml培养瓶各2个
24孔培养板2块
加样器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个）
吸头盒2个
其他用品：不锈钢饭盒6个
100目、200目细胞筛各1个
五、试剂和培养基
无Ca、Mg PBS、DMEM-F12培养液、2.5％胰蛋白酶液、1％胶原酶液、小牛血清、75％酒精。
六、实验步骤
1、颈动脉脱臼处死小鼠，浸入75％酒精消毒3分钟，无菌剥除四肢的皮毛，用大剪刀将四肢去爪，从肩关节和髋关节处剪断，移入装有培养液的培养皿中，去除骨、血管、脂肪及肌腱后清洗二次。
2、用眼科剪将肌肉组织剪成2mm3左右小块，用培养液清洗二次。
3、移入装有20ml消化液的中型培养瓶中（18ml不完全培养液加2ml 1％胶原酶液）混匀。
4、放入37℃、CO2培养液中消化24小时。
5、取出培养瓶加终止液10ml，用吸管充分吹打使组织分散，过200目筛，将悬液移入离心管，1000转离心10分钟，去上清。根据情况再低速离心二次去除浆液。
6、用完全培养液重悬细胞，计数，2×105个/ml接种在培养瓶中。
7、置入CO2培养箱中培养，90分钟后轻轻振荡培养瓶，将未贴壁的细胞移入另一个培养瓶中培养，利用这种差速贴壁分离法可获得纯度约为90％的骨骼肌细胞。
8、换液、培养、观察。
七、实验的关键和注意事项
1、实验用小鼠以幼龄为好（断奶后）。
2、肌肉组织剪碎后的血污应漂洗干净，以免影响细胞生长与镜下观察。
3、做传代消化时，一旦单层细胞漂起立即终止消化，以免过分伤害细胞。
八、实验结果与分析
要求学员拍下细胞原代培养及传代培养的照片，并分析细胞的生长情况。
实验八微重力条件下大鼠肝细胞三维培养
一、目的：建立哺乳动物肝细胞在微重力条件下的三维培养模型，比较肝细胞在三维培养与二维培养的形态、功能及基因表达的异同。为进一步研究提供动物模型。
二、原理：采用先进的低剪切力旋转容器式细胞培养系统，通过筛选不同的支架材料，优化细胞培养条件。
三、材料：大鼠、猪、血纤维蛋白膜。
四、仪器设备及用具
仪器：转壁式生物反应器、CO2培养箱、超净工作台、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机
用具：手术器械：手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个）
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）10个
滴管套管10个
塑料用品：20ml、40ml培养瓶各2个
24孔培养板2块
加样器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个）
吸头盒2个
其他用品：不锈钢饭盒6个
100目、200目细胞筛各1个
五、试剂和培养基
无Ca、Mg PBS、DMEM-F12培养液、2.5％胰蛋白酶液、1％胶原酶液、小牛血清、75％酒精。
六、实验步骤
1、血纤维蛋白膜制备：
①取成年大鼠，用75％酒精全身消毒后，无菌操作剪断头部，迅速用小培养皿接血，使其成均匀的薄层，换另一平皿直至无血滴出，待血液凝固；②漂洗血纤维蛋白膜：将凝固后的血膜用0.9％NaCl充分漂洗至膜呈灰白色；将漂洗后的血纤维蛋白膜剪成1mm3的小块用于旋转培养；或将血纤维蛋白膜冻干后用于平面培养。
2、肝细胞的分离
①胶原酶消化法分离：方法与实验五相同。
②肝脏原位灌流分离：从大鼠颈椎二枕骨大孔插针，破坏大脑。用75％酒精全身消毒，无菌操作，背位固定于鼠
板上；打开胸腹腔，暴露肝脏，从胸腔内找出下腔静脉胸段穿线备用。将肠向右拨开，暴露下腔静脉腹段和门静脉，穿线备用；将大号针头作下腔静脉胸段插管，用备用线固定针头，用备用线结扎下腔静脉腹段，从下腔静脉胸段插管处缓慢注入3ml浓度为0.2％的肝素钠溶液，此时肝脏略微发胀，剪断门静脉用预热（37℃）无Ca Mg PBS溶液，以4～5ml/min的流速灌流10min，此时肝脏由红色转为黄色。用预热（37℃）0.05％的胶原酶II灌流消化10min，流速2.5ml/min肝脏失去弹性，组织变得松软。将肝脏由动物体上分离下来，置于预冷（4℃）培养液中，用镊子撕开肝脏被膜，肝细胞释放出来，培养液变得浑浊。
③平皿培养：原位灌流分离出的肝细胞可做无支架和有支架的平皿培养（用培养瓶或培养板，方法同前），支架材
料有多种（胶原膜、血纤维蛋白膜、弹性甲壳素、GHG、PHB、PLGA500等）。
④旋转培养：将活率在90％以上的肝细胞，计数，4×105个/ml与适量支架材料（也可不加支架材料）移入转壁式
生物反应器中培养，转速可调整，15～30转/min。
分不同时期取样，显微镜下观察细胞的活力、增殖及其与支架材料的贴壁情况，需要注意是：防止污染，因为用旋转器进行培养操作繁杂培养器的清洁灭菌、安装、加样、取样、器具清洗、灭菌一次性注射器的可靠性、培养用液的安全性，实验人员的操作技术等都是决定实验成功与否的因素，如有丝毫的疏忽都将前功尽弃。
实验九单克隆抗体制备技术
1、细胞融合、阳性株的筛选与克隆
一、目的：熟悉建立杂交瘤细胞所用的瘤细胞系SP2/0的培养方法及其生长特点，了解细胞融合的基本原理，掌握PEG诱导细胞融合以及阳性株的筛选与克隆的方法。
二、原理：离体细胞的骨髓瘤细胞具有无限度生长的能力，但不能产生抗体；脾淋巴细胞能够分泌抗体，但在体外不能无限度生长。在聚乙二醇（PEG）的作用下，骨髓瘤细胞与脾淋巴细胞融合，形成的杂交瘤细胞经HAT选择性培养基筛选后既能分泌抗体，又可在体外无限度生长、繁殖，因此可在培养液中保持获得大量的特异性抗体。应用间接ELISA方法从融合后的杂交瘤细胞中筛选出强阳性细胞克隆，采用有限稀释法对阳性细胞进行三次以上的克隆化。
三、材料：SP2/0骨髓瘤细胞、BALB/c小鼠
四、仪器设备及用具
仪器：CO2培养箱、超净工作台、CO2钢瓶、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机、液氮罐、超低温冰箱
用具：手术器械：手术刀2把、手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个）
刻度吸管（10、5、2、1、0.5ml各2支）
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）5个
滴管、滴管套管
塑料用品：96孔培养板4块
培养瓶（100ml 4个、25ml 10个）
50ml尖头离心管5个
细胞冻存管（1.5ml）20个
移液器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个）
吸头盒2个
其他用品：不锈钢饭盒6个
100目、200目细胞筛各1个、定时器1个
五、试剂和培养基
1、试剂配制：
（1）PPMI-1640培养原液：RPMI-1640培养基干粉10.5g（一包），NaHCO32.0g，溶于1000ml重蒸水中，调pH 至7.0～7.2，加入青霉素、硫酸链霉素各105IU，过滤除菌后按每瓶200ml分装，4℃保存。
（2）HT100×储存液：称取次黄嘌呤136.1mg，溶于100ml重蒸水中，加温至70℃10分钟，待次黄嘌呤溶解后冷却至室温，再加入胸腺嘧啶核苷38.75mg，溶解后过滤除菌，按每管1ml分装，－20℃保存。
（3）氨基蝶呤100×储存液：称取氨基蝶呤1.78mg，置入90ml重蒸水中，缓慢滴加1M NaOH并不时摇动，直至氨基喋呤完全溶解，再滴加1M HCl使其pH在7.0左右，加重蒸水至100ml，过滤除菌后按每瓶1ml分装，－20℃保存。
（4）8-氮杂鸟嘌呤100×储存液：称取250mg 8-氮杂鸟嘌呤溶于100ml重蒸馏水中，过滤除菌后按每瓶1ml分装，－20℃保存。
（5）50％PEG（MW. 1000～4000）：称取聚乙二醇（PEG）5g，经8磅、15分钟高压灭菌后，冷却至50℃，取1ml液态PEG，加入等量预热至37℃的RPMI-1640培养原液，混匀待用（临用前配制）。
（6）L-谷氨酰胺（2mM）100×储存液：称取L-谷氨酰胺2.52g，溶于100ml重蒸馏水中，过滤除菌后按每瓶1ml 分装，－20℃保存。
（7）小牛血清处理：将小牛血清经56℃、30分钟灭活后，1 ml分装，－20℃保存。
（8）HEPES 100×储存液：称取N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸（HEPES）60g，溶于100ml重蒸馏水中，过滤除菌，按每瓶1ml分装，－20℃保存。
（9）RPMI1640培养液：取83ml RPMI-1640培养原液，加入L-谷氨酰胺储存液1ml、HEPES储存液1ml、小牛血清15ml混匀，经无菌检验合格后即可使用。
（10）无血清RPMI-1640培养液：取99ml RPMI-1640培养原液，加入L-谷氨酰胺储存液1ml，经无菌检验合格后即可使用。
（11）HA T选择性培养液：取81mlRPMI-1640培养原液，加入L-谷氨酰胺储存液1ml、HEPES储存液1ml、小牛血清15ml混匀、HT储存液1ml、氨基喋呤储存液1ml，经无菌检验合格后即可使用。
（12）HT培养液：取82ml RPMI-1640培养原液，加入L-谷氨酰胺储存液1ml、HEPES储存液1ml、小牛血清15ml 混匀、HT储存液1ml混匀，经无菌检验合格后即可使用。
（13）10％DMSO溶液：取二甲基亚砜（DMSO）1ml，加入9ml RPMI-1640培养液混匀，临用前配制。
（14）福氏佐剂的配制：不完全佐剂：无水羊毛脂1份、石蜡油5份研磨而成；完全佐剂：不完全佐剂1ml加卡介苗3～4mg。
六、实验步骤
1、建立杂交瘤细胞所用的瘤细胞系，SP2/0骨髓瘤细胞的培养方法：
（1）事先准备好细胞株、RPMI-1640完全培养液，及无菌的细胞培养用具；
（2）取无细菌、霉菌污染的，生长良好的细胞株，计数活细胞（台盼蓝排除法）；
（3）在严格的无菌条件下先加适量RPMI-1640培养液于培养瓶，此传代用培养瓶应较大，并至少两个以上；（4）若细胞株处于生长对数期，细胞密度在106/ml左右，将培养瓶置于5％CO2培养箱，37℃培养，每日或隔日在倒置显微镜下观察一次，以确定细胞生长良好，无污染表现为细胞饱满、透明、轮廓清晰无皱缩、无颗粒、有分裂相及3～5成群的增殖细胞团，一般5天左右可达最大密度，需要再次传代；
（5）浆细胞瘤株在体外培养过程中会发生突变回复，逐渐变成HGPRT阳性，为此应每隔3～6个月用含15ug/ml 的8-氮杂鸟嘌呤的DMEM或RPMI-1640培养液再培养筛选一次，清除突变回复了的细胞。
2、鼠免疫B1淋巴细胞的制备法：
在建立单克隆细胞系时，最常用BALB/c小鼠的免疫B淋巴细胞作为亲本细胞之一，带给杂交瘤细胞产生特异性抗体的基因，其制备方法如下：
（1）用纯化或较纯化抗原免疫动物，取BALB/c小鼠5～6只为一组，每只体重18～22g，根据抗原种类（如：蛋白质、细胞膜、病毒、多肽、激素等）及免疫原性将适量（一般为10～100ug蛋白/鼠）纯化抗原与等量的福氏佐剂一同使用。
福氏佐剂与抗原一同使用时要使佐剂与抗原充分混合，形成油质佐剂包裹液状抗原状态，制作时边研磨佐剂，边滴加适量抗原液，直至形成不散的油包水即可。经皮下或腹腔免疫注射一次，注射量约0.15～
0.2ml，此后隔周注射一次每次约0.2ml，总共12周。细胞表面抗原则用完整细胞不加佐剂，经腹腔注射2×107/
鼠，3周后经静脉注射等量细胞作为加强免疫，3～4天后取脾。大鼠免疫：可用Lou、BA ×Lou或Wistar 大鼠3～4只，福氏佐剂乳化的抗原0.6ml经脚底皮肉注射或后腿肌肉注射、或皮下多点注射，每隔两周左右注射一次，共约5～6次。
（2）检测抗体生成：从免疫小鼠的尾静脉取血1ml，分离血清按倍比稀释，用环状沉淀法：①试剂及仪器：抗血清及相应抗原；0.01M PBS,PH7.3～7.4或生理盐水；试管：内径0.3～0.4，长6cm；吸量管或注射器或0.1ml 微量移液器。②步骤：吸取不同浓度的稀释抗血清0.25ml，如：1:1、1:2、1:4、1:8……，分别加入PBS或生理盐水稀释于1、2、3、4……号试管内；分别在以上试管内缓慢加入适宜稀释度的相应抗原0.25ml，使之铺于血清表面；置于37℃培养箱内10～15分钟；观察：以出现沉淀环反应的抗体最高稀释度为其效价，此法操作时间短，比较简单，但不能保存，常用于粗试抗体效价。测出各稀释度血清中能出现沉淀线或沉淀环的最高稀释度血清来判断抗体生成程度。
（3）选用抗血清效价最高的动物进行加强免疫，将纯化抗原若干单位（106）或若干微克（5～100ug蛋白/鼠）静脉注射或肌肉注射进行强化免疫一次，强化注射第四天，即免疫B淋巴细胞处于最佳活化状态时处死动物取脾。
（4）脾细胞悬液的制备：将免疫小鼠颈动脉脱臼处死，酒精消毒皮毛，无菌开腹，摘取脾脏，置于细胞筛中用滴管拉碎，将组织块在挤压过100～200目筛网，反复冲洗，以取得单个细胞悬液；将此细胞悬液缓缓加入到已装有淋巴细胞分离液的10ml离心管内，细胞悬液与淋巴细胞分离液体积比为1:1（5ml淋巴细胞液加5ml细胞悬液）；2500rpm/min，离心20分钟；收集分离出的脾细胞，置于10ml离心管中加入不完全培养液吹打，1500rpm/min，离心10分钟；弃上清；再加入不完全培养液吹打，1500rpm/min，离心10分钟；弃上清；加入适量的完全培养液，重新悬浮细胞，调整细胞密度为1×107即可。
3、细胞融合步骤：
（1）将两种按一定比例混合于锥形离心管中，单克隆细胞:免疫鼠脾细胞与浆细胞:瘤细胞的比例一般为2:1～10:1，例如：5～10×107免疫鼠脾细胞与2.5×107SP2/0细胞；
（2）1500rpm/min，离心7分钟，弃上清，用不完全培养液清洗，重悬；
（3）用1000rpm/min低速离心10分钟，小心吸掉上清，轻弹和晃动离心管，令细胞分散，外观为乳白粘附状，37℃水浴；
（4）水浴过程中，边摇动边滴加50％PEG预温液（37℃，0.5～0.7ml），约一分钟内完成；
（5）1000rpm/min，离心5分钟；缓缓加入不完全培养液10ml来终止PEG作用，约在三分钟内滴完，注意滴加时尽量不搅散融合细胞；
（6）1000rpm/min，离心10分钟，吸弃上清；
（7）加20mlHA T完全培养液，用吸管轻轻悬起细胞，但尽量避免将刚融合的细胞吹打开；
（8）将融合细胞悬液分装在96孔培养板，每孔0.2ml，将细胞培养板置于5％CO2培养箱，37℃培养；
（9）仔细观察和记录融合细胞生长情况，每3天换HA T完全培养液一次，连续两周（7～14天）可见杂交瘤细胞克隆；
（10）两周后改用HT培养液培养，当进一步克隆纯化时，用间接ELISA法，预先检查出上清抗体阳性孔，收集好杂交瘤细胞。
4、阳性杂交瘤细胞的筛选克隆：采用有限稀释法。用适量的HA T培养液制成细胞悬液，计数，每毫升含50个杂交瘤细胞。
（1）取10ml混匀，用加样器在1～3行24个孔内各加0.2ml，每孔内有细胞10个；约用5ml，余下5ml再加入培养液5ml混匀，加在4～6行24个孔内，各加0.2ml，每孔内有细胞5个；，重复以上步骤7～9行，每孔
2.5个细胞，10～12行每孔1.25个细胞；
（2）静置于CO2培养箱中培养；
（3）根据生长情况，每隔3～5天换一次HA T培养液，换培养液应轻柔，不可冲散细胞集落；
（4）当集落长满2/3孔时，用间接ELISA法检测出上清抗体阳性孔；
（5）若10～12行中上清含特异抗体，挑出单个集落孔的细胞，将该集落细胞再次克隆纯化，形成单克隆细胞系，扩大培养。
5、杂交瘤细胞阳性孔的筛选：采用间接ELISA方法，其操作流程为：
抗原包被：用0.05M碳酸盐缓冲液稀释抗原，
每孔50ul包被酶标板
4℃过夜
洗板：用PBS－T洗涤四次，每次3分钟
加样品：加入待测的培养液，每孔50ul
37℃，2小时
洗板：用PBS－T洗涤四次，每次3分钟
加标记物：加入羊抗鼠IgG标记物（1:200），每孔50ul
37℃，2小时
洗板：用PBS－T洗涤四次，每次3分钟
加底物：加邻苯二胺底物溶液，每孔50ul
室温避光反应10分钟后，
用2M H2SO3终止
检测：用酶标仪测定490nm的吸收值
融合后的细胞克隆生长到覆盖2/3培养孔面积时，即可用间接ELISA对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，对检测为阳性的细胞孔迅速进行接种并进行克隆化，阴性孔两天后再检测一次，如仍为阴性则弃去。
七、实验的关键及注意事项
1、免疫小鼠血清抗体滴度在1:1000以上方可准备融合。
2、骨髓瘤细胞及杂交瘤细胞在培养板内轻微附着生长，传代时无需用酶消化，只需用玻璃吸管轻轻吹起。
3、用于融合的骨髓瘤细胞需选择生长良好、形态饱满、折光性强、有多数分裂相的细胞（处于对数生长期）。
4、因PEG的细胞毒性较大，操作时需严格控制时间，以免造成细胞的过度伤害。
5、细胞融合完毕时，各项操作应轻柔，以免使刚开是融合的细胞再度分开。
6、因杂交瘤细胞较脆弱，接种前最好制备饲养细胞，后者能提供多种细胞因子以改善培养环境，促进杂交瘤细胞
生长。
7、每次在显微镜下观察细胞的时间不宜过长，以免导致培养液中CO2挥发而使培养液的PH升高，影响细胞生长。
8、ELISA底物显色反应的时间不宜过长，一般以阳性对照孔有明显着色、阴性对照孔基本无色为最佳。
9、筛选阳性细胞时，应将培养板与酶标板一一对应标号，以免混淆，吸取培养液时每孔用一个吸头，以免造成孔
间污染。
10、阳性孔细胞的克隆化时间愈早愈好，以免阴性细胞掩盖。
11、用有限稀释法进行克隆化时，细胞计数必须准确。细胞数过多将导致孔内克隆数太多，难以选择单个克隆；过
少则会导致许多孔内无克隆生长。
八、实验结果与分析
要求学员掌握本实验每一步操作的原理与技巧，实验结果最终得到杂交瘤细胞克隆，并要求融合率在90％以上。
实验十单克隆抗体制备技术
2、单克隆抗体的制备、细胞冻存与复苏
一、目的：熟悉单克隆抗体制备的全过程，以及细胞冻存与复苏的基本方法。
二、原理：建立阳性杂交瘤细胞株，接种后小鼠诱生腹水，腹水中含有高浓度的单抗。在细胞液中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO）后，细胞可在液氮中长期冻存，解冻复苏后细胞仍保持较高活力。
三、材料：杂交瘤细胞、BALB/c小鼠
四、仪器设备及用具
仪器：CO2培养箱、超净工作台、CO2钢瓶、倒置显微镜、恒温水浴摇床、离心机、液氮罐酶标仪
用具：手术器械：手术刀2把、手术剪2把、止血钳2把、毛剪1把、大镊子1把、小镊子（尖头、钝头各2把）、眼科剪3把、眼科镊（弯头、直头各2把）
玻璃器皿：烧杯（250、100、50、25ml各2个）
刻度吸管（10、5、2、1、0.5ml各2支）
培养皿（ф7、ф8.5、ф9.5各3个）
细胞计数室1个
刻度离心管（10ml带盖）5个
滴管
塑料用品：一次性96孔酶标板20块
96孔培养板12块
培养瓶（100ml 4个、25ml 10个）
50ml尖头离心管5个
细胞冻存管（1.5ml）20个
加样器（5ml、1ml、200ul、50ul各1把）
吸头（5ml、50ul各20个，1ml、200ul各100个）
洗瓶1个、吸头盒2个、洗耳球1个
五、试剂和培养基
1、试剂配制：
（1）PBS-Tween20，PH7.4：称取NaCl 8.0g、KCl 2.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g，逐步溶解于100ml 蒸馏水中，调PH至7.4，加入0.5mlTween20。
（2）PBS-Tween20－BSA，PH7.4：取PH7.4 PBS-Tween20 100ml，加入1g牛血清白蛋白（BSA），溶解即成。（3）0.05M碳酸盐缓冲液，PH9.6：称取无水Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，逐步溶解于1000ml蒸馏水中，调PH至9.6。
（4）0.2M PBS，PH6.8：称取Na2HPO4·12H2O 7.16g溶解于100ml蒸馏水中（A液）；再称取NaH2PO4·2H2O 3.12g 溶解于100ml蒸馏水中（B液）；取A液49ml、B液51ml，混合即成。
（5）磷酸盐-柠檬酸缓冲液，PH5.0：称取柠檬酸0.96g溶解于50ml蒸馏水中（A液，0.1M）；再称取Na2HPO4·12H2O
1.42g溶解于50ml蒸馏水中（B液，0.2M）；取A液24.3ml、B液25.7ml，加蒸馏水至100ml，调PH至5.0。（6）邻苯二胺底物溶液：称取邻苯二胺（OPD）40mg，避光溶解于100ml PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液中，加入30％H2O2 15ul，临用前现配。
（7）羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶标记物：购买成品。
六、实验步骤
1、单克隆抗体的制备：在细胞培养过程中杂交瘤细胞能产生和分泌单克隆抗体，但是产生的抗体量很少，约10～100ug/ml，若将杂交瘤细胞接种于BALB/C小鼠体内，令细胞增殖，可获得高效价抗体，约大于1mg/ml接种杂交瘤细胞的方法如下：
（1）选择适当的小鼠，若杂交瘤的亲代免疫B细胞是取自BALB/C小鼠，则杂交瘤细胞种于BALB/C小鼠，若免疫B细胞取自其它品系小鼠或品种，则该杂交瘤需接种到裸鼠体内，或两个亲代杂交的第一代小鼠BALB/C小鼠应选8周龄以上，体重20g左右。
（2）先给小鼠腹腔注射0.5ml降植烷或福氏佐剂进行预免疫刺激1～2周，有些实验室则免去此步骤，直接接种细胞。
（3）制备杂交瘤细胞悬液，给上述小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，105～107/0.5ml只，精心饲养小鼠2周左右小鼠腹部明显隆起时，抽取腹水或处死小鼠取腹水。
（4）将腹水离心10分钟，2000rpm/min，分离上清和杂交瘤细胞，收集上清液进一步离心，12000rpm/min，离心20分钟，以去除杂质大分子，收集上清测定抗体效价后分装，－20℃保存。
（5）分离出的杂交瘤细胞用培养液离心清洗一次后，再制成105～107/ml，或接种动物保存细胞系，或进行低温冻存。
2、细胞的冻存与复苏：
（1）细胞冻存：
①选择处于对数生长期的细胞（在收集细胞前24小时换液一次），用吸管吹打细胞使之成为细胞悬液，计数。
②200×g离心10分钟，按5×106个/ml细胞的浓度缓慢滴加适量的细胞冻存液（10％DMSO），用吸管轻轻吹
打，令细胞重悬。
③将细胞悬液按1ml分装入细胞冻存管内，加盖封严，并注明细胞代号与冻存日期。装入纱布袋，放置于泡沫
盒中。
④将泡沫盒放入－70℃～－85℃超低温冰箱中，可保存半年以上，如长期保存移入液氮中。
（2）细胞复苏：
①从冰箱或液氮罐内取出冻存管，迅速置入37℃水浴，轻轻晃动令其尽快融化。
②用75％酒精擦拭冻存管，旋开管盖，用吸管吸出细胞悬液置入离心管中。
③往离心管内缓慢滴加10ml培养液，150×g离心5分钟，弃上清后再用培养液洗一次，计数并计算细胞活率。
④用适当培养液重悬细胞，接种于培养瓶内使其终浓度约为1×105/ml，置37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱内
培养，次日更换一次培养液，再按常规方法培养。
七、实验的关键及注意事项
1、抽取小鼠腹水时，一般每只小鼠可抽2～3次，腹水离心后的沉淀细胞仍可作为杂交瘤细胞用于再度接种或冻存。
2、细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。
八、实验结果与分析
要求学员掌握本实验各步骤的操作原理及方法，通过本实验最终获得腹水单抗。
动物细胞工程12月20日 动物细胞工程常用技术手段有动物细胞培养、动物细胞核移植、动物细胞融合、生产单克隆抗体等，其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。 一、动物细胞培养 1、定义：就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。 2、原理：细胞增殖 3、过程 分散成单个细胞， 制成细胞悬液 注意： ①10代以内细胞保持正常的二倍体核型，无突变发生，常用于实践或冷冻保存。 ②超过50代，极少数细胞突破自然寿命极限，突变成癌细胞，具有无限增殖能力；若超过50代，细胞不再增殖，全部死亡，则说明细胞没有发生癌变。 ③分瓶之前，称原代培养；出现接触抑制用胰蛋白酶处理，再分瓶培养为传代培养。 思考回答： ⑴、为什么选用幼龄动物组织或胚胎进行细胞培养? 答：其细胞的分化程度低，增殖能力强，有丝分裂旺盛，容易培养。 ⑵、动物细胞培养需要脱分化吗?为什么? 答：不需要。因为高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以没有类似植物组织培养的脱分化过程，要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。 ⑶、进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分?用胃蛋白酶行吗? 答：主要是蛋白质，不行，因为胃蛋白酶作用的适宜PH约为2，当ＰＨ大于6时就会失去活性，多数动物细胞培养适宜PH为7.2－7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。（胰蛋白酶作用的适宜PH为7.2－8.4，胰蛋白酶活性较高） ⑷、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗?为什么?
答：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质，长时间作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤，因此必须控制好消化时间。 ⑸、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？ 不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体 4、重要概念 ①细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。 产生原因：培养贴附性细胞时，细胞要能够贴附于底物上才能生长增殖。 培养要求：培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒，易于贴附。 ②细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 ③原代培养：动物组织消化后的初次培养 ④传代培养：原代培养的细胞由于接触抑制不再分裂，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶继续培养，让细胞继续增殖，这种培养叫传代培养。 5、培养条件： ⑴无菌无毒环境：无菌——对培养液和所有培养用具进行无菌处理；在细胞培养液中添加一定量的抗生素。；无毒——定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对自身造成危害。 ⑵营养： 成分：所需营养物质与体内基本相同，例如需要有糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等，还需加入血清、血浆等天然成分。 培养基类型：合成培养基（将细胞所需的营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基） ⑶温度和pH值：哺乳动物多以36.5±0.5℃为宜，多数细胞生存的适宜pH为7.2～7.4。 ⑷气体环境：通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95％空气加5％CO2的混合气体的培养箱中进行培养。O2：是细胞代谢所必需的CO2主要作用是维持培养液的pH。 6、应用：生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。基因工程中受体细胞的培养。用于检测有毒物质，判断某种物质的毒性。科学家培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于筛选抗癌药物等，为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依据。
动物细胞工程 1 一、单选题 1．下列关于细胞工程的叙述，正确的是（） A．骨髓瘤细胞经免疫处理，可以直接获得单克隆抗体 B．灭活的病毒为促细胞融合剂，可诱导原生质体的融合 C．用原生质体制备人工种子，要防止细胞破裂 D．核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体 2．下列关于动物的细胞融合技术及其应用的叙述，错误的是 A．细胞杂交时因染色体容易丢失，可用于基因定位 B．杂交瘤技术制备的单抗，可解决抗血清的异质性问题 C．细胞杂交时可采用电融合技术，合适的电场中质膜的脂双层被击穿 D．制备单抗时，经细胞融合、克隆可获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞3．用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是 A．都需用培养箱B．都须用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性4．植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术或方法与原理不相符的是A．植物组织培养和单克隆抗体——细胞的全能性 B．纤维素酶、果胶酶处理植物细胞壁——酶的专一性 C．原生质体融合和动物细胞融合——细胞膜的流动性 D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞增殖 5．图为科研人员培育克隆猴“中中”的流程图。下列有关叙述正确的是（）
A．e的性状表现不受于b中的基因控制 B．图中涉及的技术有动物细胞培养、核移植、胚胎移植等 C．d为胚胎发育提供遗传物质和其他适宜条件 D．e诞生实验体现了a细胞的全能性 二、多选题 6．下列有关细胞工程技术在生产实践中应用的叙述，正确的是 A．愈伤组织细胞分裂能力强，可作为体细胞诱变育种的材料 B．植物花粉粒细胞容易获取，可作为培养单倍体植株的理想材料 C．动物胚胎细胞分化程度低、易恢复全能性，可优先作为核移植的受体细胞 D．自体皮肤生发层细胞分裂能力强且不会排斥，可作为烧伤患者皮肤移植母细胞 7．动物细胞培养是动物细胞工程的基础，如右图所示，a、b、c 表示现代工程技术，①②③表示通过相应技术经胚胎移植得到的个体，请据图回答，下列说法错误的是 A．若a 是核移植技术，①中个体的获得反映了动物细胞具有全能性
生物专题细胞工程之动物细胞工程题库详解 一、单项选择题（共80小题；共160分） 1. 动物细胞融合的原理是 A. 动物细胞没有识别能力 B. 动物细胞易被病毒感染 C. 细胞膜具有流动性 D. 动物细胞膜易被击穿 2. 能使动物细胞融合的特有的诱导因子是 A. 离心 B. 灭活的病毒 C. 电刺激 D. 振动 3. 科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与 骨髓瘤细胞融合的是 A. 经过免疫的B淋巴细胞 B. 不经过免疫的T淋巴细胞 C. 经过免疫的T淋巴细胞 D. 不经过免疫的B淋巴细胞 4. 动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是 A. 动物细胞培养 B. 动物细胞融合 C. 生产单克隆抗体 D. 胚胎移植、核移植 5. 进行动物细胞培养时，选用的材料是 A. 衰老退化的动物细胞 B. 成熟动物个体的体细胞 C. 动物的受精卵 D. 动物胚胎或幼年个体的细胞 6. 动物细胞融合与植物原生质体融合的理论基础是 A. 细胞膜的流动性 B. 细胞膜的选择透过性 C. 细胞质的流动性 D. 细胞质中酶的活性 7. 用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因 是这样的组织细胞 A. 容易产生各种变异 B. 具有更强的全能性 C. 取材十分方便 D. 分裂增殖的能力强 8. 为了让用于培养的动物组织细胞分散开以便配制成一定浓度的细胞悬液，选取来的动物组织应选 用下列哪种物质处理 A. 胃蛋白酶 B. 胰蛋白酶 C. 盐酸 D. 胰脂肪酶 9. 动物细胞工程常用的技术手段中，最基础的是 A. 动物细胞培养 B. 动物细胞融合 C. 单克隆杭体 D. 胚胎、核移植 10. 动物细胞培养的细胞来自于 A. 任何个体的细胞 B. 只能取自动物胚胎细胞 C. 只能取自幼龄动物的组织细胞 D. 胚胎或幼龄动物的器官和组织细胞
细胞工程第一讲 一、概述 1、细胞工程（cell engineering ）定义 应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的原理方法与技术，按照人们的需要，在细胞水平上进行遗传操作，包括细胞融合、核质移植等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。 2、细胞工程的研究内容 （1）动植物细胞和组织培养 植物细胞培养主要用于育种和代谢产物制备，日本等国家用生物反应器培养人参细胞生产有效药用成分。 动物细胞培养用于制备单克隆抗体、疫苗、生长因子等。 （2）细胞融合 改良性状，培育新品种 （3）染色体工程 细胞工程 动植物细胞和组织培养 细胞融合 染色体工程 胚胎工程 细胞遗传工程 器官培养 组织培养 细胞培养 （快速繁育和产物大量制备） （改良性状，培育新品种） （培育新品种，单倍体和多倍体） （获得人们需要的成体） （无性繁殖，改变性状） 克隆 转基因技术
主要用于培育单倍体或多倍体新品种，如四倍体小麦，八倍体小黑麦 （4）胚胎工程 主要是获得人们需要的成体 如：胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术等最成功应用于畜牧业获得优良品种与胚胎保存 对人类来说主要用于不孕症获得试管婴儿 （5）细胞遗传工程 克隆：无性繁殖，动物克隆指经无性繁殖而产生遗传性状完全相同的后代个体。 转基因技术：将外源基因整合到生物体内，能够表达并稳定遗传给后代的实验技术。 3、细胞工程的优势 （1）避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作，只需将细胞遗传物质直接转移到受体细胞中就能够形成杂交细胞。 （2）不仅可以在植物与植物之间、动物与动物之间、微生物与微生物之间，甚至可以在三者之间形成前所未有的杂交物种。 4、细胞工程发展 （1）萌芽阶段---理论渊源和早期的尝试（20世纪初-30年代中期）德国植物生理学家Haberlandt在1902年提出植物细胞的全能性。认为植物细胞有再生出完整植株的潜在能力。 美国生物学家Harrison 是公认的动物组织培养的创始人，1907年，以淋巴液为培养基观察了蛙胚神经细胞突起的生长过程，
植物细胞工程和动物细胞工程默写 1、细胞工程是在或的操作 2、细胞工程按操作对象分为和 3、植物细胞工程通常采用的技术手段是：和 4、植物组织培养的理论基础是： 5、理论上每一个活细胞都应该具有。因为 6、受精卵的全能性最高，受精卵生殖细胞体细胞 7、为什么体内细胞没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织、器官？ 8、植物组织培养的外界条件：， 内在原理是： 9、植物组织培养的过程：经过形成 经由过程形成，最后移栽发育成。 10、是指已分化细胞经诱导，失去其特有的结构和功能而变为未分 化细胞的过程。 11、是指由外植体长出来高度液泡化、无定形状态薄壁细胞组成 的排列疏松无规则的组织。 12、植物体细胞杂交的意义（优势）：。 13、去除细胞壁的常用方法：（纤维素酶、果胶酶等） 14、人工诱导原生质体融合方法：物理法：等； 化学法： 15、融合完成的标志是： 16、植物体细胞杂交过程包括：和。 17、植物体细胞杂交的原理是：和 18、人工种子的特点是： 19、作物脱毒(1)材料: (2)脱毒苗: 20、单倍体育种：(1)方法: (2)优 点: ; 21、动物细胞工程常用的技术手段： (基础)、、 、
22、动物细胞培养的原理是：。 23、用处理，一段时 间后获得单个细胞。 24、细胞贴壁： 25、细胞的接触抑制： 26、原代培养：，培养的第1代细胞与传10代以 内的细胞称为原代细胞培养。 将原代细胞从培养瓶中取出，用处理后配制成，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为 27、目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为 28、细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡， 少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代 细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失 去接触抑制，容易传代培养。 29、动物细胞培养的条件：1. 2. 3. （培养 液的Ph为7.2-7.4）4. 30、细胞所需营养：等， 按种类和所需数量严格配制而成的合成培养基。培养基内还需加入、等天然成分 31、动物细胞培养所需的气体环境：95%的空气和5%的二氧化碳的混合气体。氧 气：；二氧化碳： 32、植物组织培养和动物细胞培养的比较：
第2章细胞工程 第2节动物细胞工程（第1课时） 【学习目标】 1.认同动物细胞培养是模拟体内生理条件在体外进行的培养，由此分析、推出培养动物细胞需要满足的基本条件。 2.尝试建构动物细胞培养基本流程。 3.认同动物细胞培养是动物细胞工程的基础。 4.简述干细胞的应用；通过探讨干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险，理性看待生物技术的应用，增强社会责任感。 【重点难点】 1.动物细胞培养的过程及条件。 2.干细胞在生物医学工程中的应用。 【学习新知】 学习任务一动物细胞培养 阅读教材43-45页，完成以下内容： 活动1：通过“人造皮肤”事例，概述动物细胞培养的概念。 活动2：认同动物细胞培养是模拟体内生理条件在体外进行的培养，由此分析、推出培养动物细胞需要满足的基本条件。 （1）分析机体给体内的细胞提供了哪些适宜的条件使其能够维持正常的生命活动？ （2）动细胞培养实际上是在体外模拟体内的生理条件进行的培养，你认为体外培养动物细胞需要满足哪些条件？ 活动3：尝试建构动物细胞培养基本流程。 （1）依据动物细胞培养的概念，初步建构动物细胞培养的流程。 （2）根据教材中“动物细胞培养的过程”的内容，并结合图2-12，思考、回答下列问题： ①培养前为什么要将组织分散成单个细胞？ ②怎样将组织分散成单个细胞细胞？ ③培养一段时间分裂会受阻,这是为什么？怎样解决这一问题？ ④什么是细胞贴壁、接触抑制、原代培养、传代培养？ （3）在分析、回答问题的基础上完善动物细胞培养的基本流程。 活动4：比较动物细胞培养与植物组织培养有什么相同和不同之处？
活动5:完成[自学检测1] [自学检测1] 1.判断下列有关动物细胞培养的表述是否正确。 (1)培养环境中需要O2，不需要CO2。（） (2)动物细胞培养要经过脱分化形成愈伤组织。（） (3)培养液中通常含有糖类、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清。（） (4)培养瓶中的细胞均需要定期用胰蛋白酶处理，分瓶后才能继续增殖。（） (5)培养过程除需要无菌、无毒的环境外，还要定期更换培养液。（） 2.回答下列有关动物细胞培养的问题： (1) 细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物的细胞增殖能力，有丝分裂，老龄动物的细胞则相反，所以一般来说，细胞比动物的细胞易于培养。同样，分化程度越低的细胞增殖能力越强，所以更（“容易”或“难以”）培养。 (2) 在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面______________时，细胞通常会停止，这种现象称为细胞的______________现象。这时要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，常用的酶是______________。 学习任务二干细胞培养及其应用 活动1：阅读教材46-47页，思考、回答下列问题： （1）什么是干细胞？它有哪些类型？这些类型各有怎样的特点和哪些方面的应用？ （2）科学家是怎样获得诱导多能干细胞（iPS细胞）的？这种细胞与胚胎干细胞相比，有哪些应用优势？ （3）干细胞用于临床治疗，可能存在什么问题？ （4）你如何看待干细胞在临床上的应用所产生的效益与风险？ 活动2：完成[自学检测2] [自学检测2] 3.干细胞有着广泛的应用前景，判断下列相关叙述是否正确。 (1)干细胞就是从胚胎中分离提取的细胞。（） (2)造血干细胞主要存在于成体的骨髓、外周血和脐带血中，可以分化为各种血细胞。（） (3)不同类型的干细胞，它们的分化潜能是有差别的。（）
专题2细胞工程单元检测 一、选择题 1.下图为植物组织培养得基本过程,则制作人工种子,及生产治疗烫伤、割伤得药物——紫草素,应分别选用编号就是得 ( ) A.④② B．③② C.③④ D.④③ ２．某同学在学习“细胞工程”时,列表比较了动植物细胞工程得有关内容， ?A 3.试管婴儿、试管苗、克隆羊三者均属于生物工程技术得杰出成果，下面对其 生物学原理及技术得叙述正确得就是() ?A.都属于无性生殖，能保持母本性状B．都就是细胞工程得技术范围 ?Ｃ.都充分体现了体细胞得全能性 D.都不会发生基因重组与变异 4.两个亲本得基因型分别为AＡｂb与ａaBB,这两对基因按自由组合定律遗传,要培育出基因型为aabb得新品种,最简捷得方法就是?( ） A.单倍体育种B．杂交育种Ｃ.人工诱变育种 D.细胞工程育种5．下列关于细胞工程得叙述中，错误得就是（） A、植物细胞融合必须先制备原生质体 B、试管婴儿技术包括人工授精与胚胎移植两方面 C、经细胞核移植培育出得新个体只具有一个亲本得遗传性状 D、用于培养得植物器官或组织属于外植体 6.下面关于植物细胞工程得叙述,正确得就是 () ?A、叶肉细胞脱分化后可形成无定形状态得薄壁细胞 B.叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织 C、融合植物叶肉细胞时,应先去掉细胞膜 D.叶肉细胞离体培养时,可以表现出全能性 7.关于单克隆抗体得不正确叙述就是( ）?A、化学性质单一 B.用有性繁殖获得 C．特异性强 D.可用于治病、防病 ８．下列关于细胞工程得有关叙述,不正确得就是( ） ?A.利用花药离体培养得到单倍体植株,从紫草得愈伤组织中提取紫草素,利用细胞工程培育“番茄-马铃薯”杂种植株,都利用了植物组织培养技术,而利
第三节动物细胞工程 动物细胞与组织培养、细胞核移植与动物体细胞克隆 学习目标： 1.简述动物细胞培养的过程、条件及其应用； 2.简述克隆动物的概念含义和基本原理； 3.简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景； 课前导学： 一、动物细胞工程包括的主要技术 动物细胞工程的主要技术包括____ 、_____ 、___ ___、_______________、________________等技术。其中_________________________是其他动物细胞工程技术的基础。 二、动物细胞与组织培养 1．概念：动物细胞与组织培养是指在体模拟____ _ __，将动物细胞或组织在无菌、温度适宜和营养充足的条件下培养，使其、并维持原有和的技术。 2. 材料：动物或出生不久的的器官或组织。 3. 过程： （1）动物细胞培养： （2）动物组织培养： （3）动物细胞培养和动物组织培养的区别：动物细胞培养过程中需要用 __________________等使________________________________________________。 4.培养条件： （1）温度：最适温度是°C左右。 （2）PH：最适PH范围是_______。 （3）气体：主要是和，气体的含量不仅影响培养环境的，还直接影响。 （4）营养物质：如、无机盐、氨基酸、维生素、核酸、嘌呤、嘧啶、和生长因子等。 5.培养基的种类： 天然培养基：主要取自动物血清、动物组织提取液和鸡胚汁等，具有营养价值高、成分复杂的特点。 合成培养基：人工配制的，具有成分明确、便于控制实验条件的特点。缺点是缺乏天然培养
专题2 细胞工程 2.3 动物细胞工程知识点汇总 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。 （4）动物细胞培养需要满足以下条件 ①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 ②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。 ③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃+0.5℃；pH：7.2～7.4。 ④气体环境：95%空气+5%CO 2。O 2 是细胞代谢所必需的，CO 2 的主要作用是 维持培养液的pH。 （5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。 2.动物体细胞核移植技术和克隆动物 （1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。 （2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。 （3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）（注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达）；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛。 （4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；②保护濒危物种，增大存活数量； ③生产珍贵的医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等。 （5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。
专题2细胞工程 2.2动物细胞工程 班级：姓名： 一、单选题 1．用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是() A．都需用CO2培养箱B．都须用液体培养基 C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性 2．下列有关体细胞核移植过程的叙述，错误的是() A．在体外将从卵巢采集到的卵母细胞培养到减数第一次分裂中期 B．供体细胞不一定要来自珍稀动物 C．通过显微操作技术去除卵母细胞的细胞核和第一极体 D．使用电脉冲等方法激活重组细胞使其完成细胞分裂和发育 3．绵羊的乳腺细胞是高度特化的细胞，但用乳腺的细胞核与卵细胞的细胞质融合成一个细胞后，这个细胞核仍然保持着全能性，这主要是因为() A．细胞核内含有保持物种发育所需要的全套遗传物质 B．卵细胞的细胞质内含有物种发育所需要的全套遗传物质 C．卵细胞细胞质为细胞核提供营养物质D．细胞核与细胞质是相互依存的关系4．下列关于动物细胞培奍的叙述，正确的是（） A．恶性细胞系的细胞可进行传代培养 B．培养保留接触抑制的细胞在培奍瓶壁上可形成多层细胞 C．克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变 D．二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的 5．用于动物细胞培养的组织和细胞，大都来自胚胎和出生不久的幼龄动物，其主要原因是这样的组织细胞() A．容易产生各种变异B．具有更强的分裂能力 C．取材十分方便D．具有更强的全能性 6．下列不属于克隆的是（） A．矮牵牛花的扦插繁殖B．PCR扩增人SRY基因 C．受精卵发育成新个体D．杂交瘤细胞在小鼠体内培养 7．关于动物体细胞培养过程中细胞的活动或特性，下列表述错误的是（）A．细胞通常贴壁生长B．细胞进行有丝分裂 C．细胞之间有接触抑制现象D．细胞的遗传物质均发生改变 8．下列对动物核移植技术的描述正确的是（）
课题第三章细胞工程 第２节动物细胞工程 【学习目标】 1.简述动物细胞培养的过程、条件及应用。 2.简述通过动物体细胞核移植技术克隆动物的过程。 3.了解体细胞核移植技术的应用前景。 预习案 【使用说明及学法指导】 1.阅读课本第53—63页，独立完成基础知识梳理和预习自测，用时10~15分钟； 2.不会的或有疑问的地方用双色笔标出，留到课堂解决； 3.正课结束后及时整理导学案，进行纠错反思。 Ⅰ.教材助读：基础知识梳理 一．动物细胞工程 1.常用的技术手段:、动物细胞核移植、、单克隆抗体的制备等。 2.基础:。 二．动物细胞培养 1.原理：____________。 2.概念:从动物机体中取出相关的组织，将它分散成，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞 生长和增殖。 3.过程： 取动物组织块 分散组织细胞:剪碎和用或胶原蛋白酶处理一段时间 配制细胞悬浮液 原代培养:具有_____生长和______抑制的特点
传代培养：????? ①先用胰蛋白酶等处理贴满瓶壁的细胞，再分瓶继续培养②10～50代左右时，细胞增殖缓慢，甚至停止 ③部分细胞核型发生改变，获得不死性，能无限增殖 4.条件 ⑴无菌、无毒的环境：对__________和所有___________进行无菌处理。 ⑵营养：合成培养基中有糖、_______、__________、无机盐、_________，通常需加入血清、血浆等。 ⑶温度和pH ：①适宜温度：_________±0.5 ℃。 ②适宜pH ：___________。 ⑷气体环境：主要是____和______，O 2是________所必需的，CO 2的主要作用是维持培养液的_____。 5.应用 ⑴生产生物制品：如_____疫苗、干扰素、_____________的生产。 ⑵检测__________，判断某种物质的______。 ⑶应用于基因工程：动物细胞是基因工程技术中常用的___________，离不开动物细胞培养。 ⑷用于_____、______、药理等方面的研究，如筛选抗癌药物等。 三．动物细胞核移植技术和克隆动物 1.理论基础：动物的细胞核具有________。 2.概念：将动物的一个细胞的________，移入一个已经去掉细胞核的__________中，使其重组并发育成一个___________，最终发育为动物个体。用_________的方法得到的动物就是克隆动物。 3.分类：包括________________和________________，其中_______________较易成功。 4.过程： 5.应用前景 ⑴在畜牧生产中：可以加速家畜遗传改良进程，促进________________。 ⑵在保护濒危物种方面：可增加这些动物的__________。 ⑶在医药卫生领域：转基因克隆动物可以作为______________生产珍贵的医用蛋白。 ⑷在治疗人类疾病方面：转基因克隆动物细胞、组织和器官可以作为___________的供体。 ⑸人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官后，可以用于_________________。 ⑹研究胚胎发育及衰老过程，追踪研究疾病的__________和___________。
细胞工程 主讲人王文星 学前导引 本课程为必修考试课,理论授课32学时，期末考试闭卷 总成绩为100分：出勤+课堂提问占10%, 平时测验占20%,期末试卷占70%. 平时测验1～次,随堂考试,闭卷. 选用教材: 安利国,杨桂文.?细胞工程?第3版，科学出版社，2016 主要参考教材: 李志勇.?细胞工程?第2版，科学出版社，2010 殷红.?细胞工程?第2版，化学工业出版社，2013 第1章细胞工程简介 内容提要 一、定义五、主要研究内容 二、与其它生物工程的关系六、重要应用 三、发展历史七、本章小结 四、研究对象八、思考题 一、细胞工程定义 细胞工程：应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获取新型生物或特种细胞产品的一门科学技术。 广义的细胞工程：包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。 二、细胞工程与其它生物工程的关系 生物化学工程为基因工程、细胞工程、微生物工程、蛋白质工程、酶工程、代谢工程提供产业化技术支持。
基因工程技术为细胞工程提供转基因细胞。 细胞工程技术为微生物工程、酶工程及工程产业化提供充足的 经过遗传改良和性状稳定的微生物、动植物细胞原料。 总结：细胞工程技术是现代生物工程技术各领域连接的桥梁和 纽带；与其它生物工程技术是密切联系，不可分割的有机整体。 三、细胞工程发展历史 细胞工程的理论基础是细胞学说和细胞全能性学说。 在植物学界，100年前，德国学者Haberlandt(1902)发表了着名 的论文《植物细胞离体培养实验》，提出了细胞全能性的观点。 20AD中叶，植物细胞组织培养与细胞的遗传操作相结合，发展 成为植物细胞工程。 20AD60s末兴起的植物单倍体技术是一项在植物育种上用途广 泛的细胞工程技术。 20AD90s以来，虽然基因工程成为生物技术的主流，但是细胞工 程并为失去独立存在价值，它继续在优良苗木繁育、农作物育种和 植物天然药物的开发中起着举足轻重的作用。 在动物学界，1907年美国学者哈里森等人采用盖玻片悬滴培养 蛙胚神经组织，存活数周，而且观察到生长现象，从而开创了动物细 胞培养的先河。 1965年，哈利斯和沃特金斯证明了灭活的病毒在控制的条件下 可以用来诱导动物细胞的融合。至此细胞融合作为一个重要的研究 领域已经引起人们的浓厚兴趣。 20AD70s初，诞生了细胞拆合工程。1972年，Prescott等人首先应用离心技术结合细胞松弛素B分离哺乳类细胞的胞质体获得成功，为研究哺乳类细胞核、质相互关系、细胞质基因的转移开创了新的途径。 近年来，细胞工程取得了迅速发展。如试管植物、试管动物、克隆动物、转基因生物反应器、干细胞等等。其中最具代表性的成就有：1977年，英国采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿。1997年英国利用成年动物体细胞首次克隆出绵羊“多莉”。2001年英国又宣布成功培育出世界首批转基因猪。2008年：美国科学家利用人胚胎干细胞可以在实验室培育出有携带氧功能的成熟红细胞，这个成果将可能解决个别血型血源紧缺的问题，也可帮助避免输血相关疾病的发生；美国研究人员在患糖尿病的老鼠身上做实验，将普通细胞转化成可分泌胰岛素的胰岛β细胞，减轻了病情。这一研究利用基因重组技术，实现不同种类成体细胞间直接转化，代表再生医学的重大进步。 细胞工程发展历史 2009年，马萨诸塞州总医院(MGH)的研究人员找到一种成功地体外培养肝细胞的方法，培养的肝细胞具有药物毒性筛选功能。研究报告详细介绍了肝细胞如何在高氧条件和无动物血清的条件下生长，并如何快速发挥正常肝脏所具有的功能。 2010年，科学家首次实现将多功能干细胞变成功能性人体肠道组织。 2011年，肿瘤的细胞免疫治疗研究进展：细胞免疫疗法能够靶向肿瘤细胞而不伤及正常组织细胞，并可产生免疫记忆来预防肿瘤复发，有可能成为肿瘤治疗的第四种方法。四、细胞工程的研究对象 细胞或其组成部分和构成的组织、器官等如染色体、细胞核、原生质体、整个细胞、受精卵、胚胎、组织或器官。 五、细胞工程的主要研究内容
教案—黄裕军—动物细胞工程—2018年春季第5周 教学设计理念： 随着信息技术走入课堂，如何利用信息的资源性和共享性，使学科课程的教与学的方式有所突破，不再局限于传统的单向活动和双向活动，拓展学生的学习途径。这是我应用的教学模式要突破的问题。根据学习内容让学生们承包学习任务，学生先阅读教材进行初步的学习，就会发现一些问题。通过教师的指导，让学生上网查询、搜集、筛选相关的资料，经加工提炼成为每组要发表的成果，当然也有他们没有解决的一些问题和新的想法。通过课堂为平台。引导他们互教互学，互相切磋，讨论求解，共同提高，师生之间、学生之间的互动得到了充分的运用，使问题深入，加深学生对知识的理解和应用能力。利用信息资源实现学生的自主学习。教师由教学的主宰者转变为教学的参与者、指导者，以平等的身份参与到学习中去。充分发挥学生的主体作用，发展学生的兴趣、爱好和特长，使学生的创新和实践能力、自身的综合素质得到锻炼和提高。这一教学模式的尝试充分的体现了素质教育的教学原则： 1、教学要适应这个年龄阶段学生的发展的特点； 2、让学生在经验中学习； 3、教学中努力培养学生的兴趣； 4、教学中要以学生为主体； 5、教学中要充分尊重和重视个性差异； 6、教学要多样化。 教学目标： 1、知识目标： 知道动物细胞培养技术、细胞融合技术、单克隆抗体的制备及应用。 2、能力目标： （1）、提高学生获取知识的能力、逻辑思维能力以及分析问题和解决问题的能力。（2）、使学生学会获取知识和探索生物科学的基本方法。 3、情感目标： （1）、培养学生刻苦学习、勇于探究的科学精神。 （2）、提高学生的合作意识和团队精神。 重点难点： 重点：单克隆抗体。
专题二细胞工程 （一）植物细胞工程 概念：在无菌和人工控制的条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。 1.理论基础（原理）：细胞全能性 全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞 2.植物组织培养技术 （1）原理：植物细胞的全能性，即具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞，都具有发育成完整个体的潜能。 （2）过程： （3）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。（4）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。 3.植物体细胞杂交技术 （1）概念：将不同植物的体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，培育成新的植物体的技术。细胞融合的生物学原理：细胞膜的流动性。 （2）过程： （3）诱导融合的方法：①物理法：离心、振动、电刺激等。 ②化学法：一般用乙二醇(PEG)作为诱导剂诱导原生质体融合。 ③融合成功的标志：杂种细胞再生出细胞壁。 （4）植物体细胞杂交的终点是培育成杂种植株，而不是形成杂种细胞就结束。杂种植株特征：具备两种植物的遗传特征。原因是杂种植株中含有两种植物的遗传物质。 （5）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。 4.植物细胞工程的实际应用 (1)植物繁殖的新途径：微型繁殖(快速繁殖)、作物脱毒、人工种子 (2)作物新品种的培育：单倍体育种、突变体的利用、细胞产物的工厂化生产。 （二）动物细胞工程 1. 动物细胞培养 （1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 （2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代 培养。 ①选用幼龄动物组织或胚胎的原因：它们的细胞分化程度低，增殖能力很强，更易于培养。 ②进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，不用胃蛋白酶的原因：胃蛋白酶作用的适宜pH 约为 2，当 pH 大于 6时，胃蛋白酶就会失去活性。而胰蛋白酶作用的适宜pH 为7.2～8.4，多数动物细胞培养的适宜 pH 为7.2～7.4，因此胰蛋白酶适用于细胞培养时细胞间质(主要为蛋白质)的分解。 （3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
第三节动物细胞工程 课前?预习导学 KEQMJVYI J XWAOXL'F 退疋$导航—* ............ .?八? 蘭物学引：：：：：：：：：：：：：：：：： 一、动物细胞与组织培养 1 ?概念：指在体外模拟___________ 环境，将动物细胞或组织在 ________ 、_________ 和营养充 足的条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术。 2. _____________________________________________________________ 常用技术：动物细胞工程一般包括_________________________________________________________________ 、体细胞克隆、细 胞融合、 ___________________ 等技术。 3.动物细胞培养与动物组织培养的主要区别： 动物细胞培养需要用___________ 等使组织块中的细胞离散，而动物组织培养过程则不需 要。 4. _____________________________________________________________ 培养基分类：根据营养物质的来源，可将培养基分为_________________________________________________ 和 ___________ 。 前者主要取自___________ 、动物组织提取液和鸡胚汁等。具有营养价值高、成分复杂的特 点。 后者是人工配制的，具有____________ 、便于控制实验条件的特点。 5.原代培养与传代培养。— (1) ______________________________________________ 原代培养：指从供体获得组织或细胞的 _____________________________________________________ 。 (2) _______________________________________ 传代培养：指将原代培养的细胞后转入新的 培养瓶中 _____________________________________ 。 一般情况下，传代培养_________ 次后，细胞增殖会明显________ ，甚至完全停止。 预习交流 用于培养的动物细胞与组织为何大多数要取胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织？ 二、动物体细胞克隆 1.克隆：现在克隆是指上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的 2. _________________________________________ 动物体细胞克隆：指将供体体细胞的与的细胞质进行人工 组合，借助于卵细胞的发育能力，经过培养发育成胚胎进而形成的技术。体细胞克隆的关键是技术。 3.动物细胞核移植技术：一种利用显微操作技术将某种动物细胞的______ 移入同种或 异种动物的去除细胞核的成熟___________ 内的技术。 预习交流 “多利”等克隆动物的培育成功，为何只能说明动物细胞核具有全能性，而不能说明动
动物细胞工程试题 1用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（C）A都须用液体培养基 B都需用培养箱 C都要在无菌条件下进行 D都可体现细胞的全能性 解析：动物细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物，植物体细胞离体培养体现的是全能性。植物体细胞是固体培养基。动物体细胞培养需要二氧化碳培养箱。 动物细胞培养： 1、动物细胞的培养：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。 2、动物细胞培养液的成分：葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。 3、动物细胞培养液的特点：液体培养基含动物血清。 4、动物细胞培养需要满足以下条件 (1)充足的营养供给——微量元素、无机盐、糖类、氨基酸、促生长因子、血清等。 (2)适宜的温度：36.5℃±0.5℃；适宜的pH：7.2～7.4。 (3)无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。 (4)气体环境：95%空气+5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。 5、动物细胞培养的过程： 取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理
分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。 2下列关于细胞工程的叙述，错误的是（D） A. 电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合 B. 去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理 C. 小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体 D. 某种植物甲乙两品种的体细胞杂交与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同 解析：A正确诱导原生质体融合的方法有物理法（离心振动电刺激）化学法（聚乙二醇PEG）生物方法（灭活的病毒）. B正确去除植物细胞壁需要纤维素酶和果胶酶，将动物组织分散成单个细胞需要胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间。C正确小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合既可以无限增殖，又可产生特异性抗体。D错误，假设甲植物体细胞是2N,乙植物体细胞是2M，甲乙体细胞杂交染色体数目为2N+2M；而甲乙品种杂交染色体数目是N+M。 3制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（A） ①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植 A．①②B．①③C．②③D．③④ 解析：单克隆抗体的制备过程是人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，经过培养获得的杂交瘤细胞获得单克隆抗体。 4利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（D）
2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体 一、选择题 1．生产单克隆抗体时，在培养液中加入某种试剂能筛选出杂交瘤细胞，因为该试剂( ) A．能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA复制 B．能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活 C．选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制 D．能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成 解析：选C 因为要筛选出杂交瘤细胞，而杂交瘤细胞与骨髓瘤细胞在适宜条件下都能进行增殖，故必须用一种试剂来抑制骨髓瘤细胞的DNA复制，才能避免骨髓瘤细胞的干扰。 2．下列是应用动物细胞工程技术获取单克隆抗X抗体的具体操作步骤，选项中对单克隆抗体制备的相关叙述不正确的是( ) ①将X抗原注入小鼠体内，获得能产生抗X抗体的B淋巴细胞②从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞③利用促细胞融合因子使两种细胞发生融合④将杂交瘤细胞注入小鼠腹腔培养⑤筛选出能产生抗X抗体的杂交瘤细胞⑥从腹水中提取抗体A．实验顺序应当是①②③⑤④⑥ B．④过程中产生的多个杂交瘤细胞也称为克隆 C．③过程获得的细胞均可无限增殖 D．③到⑤的过程中通常要经过两次筛选 解析：选C 克隆是一种无性生殖，④过程中，杂交瘤细胞在小鼠腹腔培养产生的多个杂交瘤细胞是细胞的增殖，也属于克隆，B正确；③过程是细胞融合过程，会得到多种融合细胞，只有杂交瘤细胞能够无限增殖，C错误；③～⑤要经过两次筛选才能获得无限增殖以及能产生特定抗体的杂交瘤细胞，D正确。 3．下列有关制备单克隆抗体的叙述，错误的是( ) A．采用的细胞工程技术包括细胞培养和细胞融合 B．两次筛选的目的分别是筛选出杂交瘤细胞和筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞C．要先用胃蛋白酶处理得到单个细胞，然后用诱导剂处理得到杂交瘤细胞 D．运用的生物学原理包括细胞分裂和细胞膜具有一定的流动性 解析：选C 单克隆抗体的制备采用了动物细胞融合和细胞培养技术，A正确；第一次筛选是筛选出杂交瘤细胞，第二次筛选是筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞，B正确；用胰蛋白酶处理得到单个细胞，C错误；制备过程中依据的原理有细胞分裂和细胞膜的流动性，D正确。