现代食品检测技术第二部分
第12章核酸探针检测技术
赵杰文邹小波
江苏大学食品与生物工程学院
第十二章核酸探针检测技术
1 核酸探针的种类及其制备方法
2 探针标记物与标记方法
3 探针杂交与信号检测
4 核酸探针在食品微生物检测中的应用
1核酸探针的种类及其制备方法
一、基因组DNA探针
二、cDNA探针
三、RNA探针
四、寡核苷酸探针
一、基因组DNA探针
这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。
二、cDNA探针
cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。
三、RNA探针
mRNA作为核酸分子杂交的探针是较为理想
四、寡核苷酸探针
用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响
2 探针标记物与标记方法
一、核酸探针标记物种类及其特点
二、探针标记方法
三、探针的纯化
四、探针标记效率的评估
一、核酸探针标记物种类及其特点 标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交
一、核酸探针标记物种类及其特点 一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性
二、探针标记方法
（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法
（一）探针的放射性核素标记法
1．缺口平移法
2．随机引物法
3．单链DNA探针的标记
4．cDNA探针的标记
5．寡核苷酸探针的标记
缺口平移法
（二）探针的非放射性标记法
1．PCR标记法
2．体外转录标记RNA探针
PCR标记法
体外转录标记RNA探针
三、探针的纯化
（一）凝胶过滤柱层析法
（二）反相柱层析法
（三）乙醇沉淀法
四、探针标记效率的评估
通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。
估计探针产量的推荐方法
估计探针产量的推荐方法
3 探针杂交与信号检测
一、核酸杂交
二、杂交信号检测
分子信标：新型核酸分子探针 摘要： 分子信标是基于荧光共振能量传递原理设计的一种发夹型寡聚核酸分子荧光探针，能够与待测核酸序列分子相互作用发生结构变化产生不同强度的荧光信号及电化学信号等，具有高灵敏度、高选择性、适于活体检测等优点。本文介绍了分子信标的作用原理，不同的分子信标类型以及应用，最后对前景作出了预测。 关键词：分子信标荧光探针灵敏度选择性活体检测 引言： 从20世纪60年代初至今，分子信标（Molecular beacon,MB）已被广泛地应用于生物、药物、化学等多个领域【1,2,3,4】。近年来，MB特别是基于DNA结构的MB，已成为一种重要工具，用于核酸的复制、重组、翻译和表达的研究【5,7,12】。为了满足后基因组时代的发展需求，人们通过各种分子工程策略，发展了许多敏锐性更高、选择性更优的MB。 自从1996年Tyagi和Krame【6】首次建立了分子信标探针，由于其独特的性质和多功能性，如操作简单、灵敏度高、特异性强等。在它出色地完成了液相靶标测定(实时PCR测定)任务之后，人们又将其应用于核酸实时定量测定、活体分析、化学与生物传感、疾病基因检测与诊断等研究中【8,9,10,11】。又由于易于对其进行修饰和改性，在这十来年的发展中，人们在经典分子信标模型的基础上，设计出了许多新型的分子信标，如无茎分子信标，用PNA【13】链代替ssDNA形成的PNA分子信标，以及LNA分子信标等。这些新型的分子信标是为了满足不同的需要而设计的，特异性更强，稳定性更好，为许多新的研究领域提供了一个平台。为了满足基因组学和蛋白质组学的发展，对分子信标的固定化也成了必然的发展趋势，自从谭蔚泓【14】首次将分子信标固定在硅胶上以来，固定化分子信标也迅速发展起来。尤其是后来设计的将分子信标固定在金表面【15,16】，利用金的强摩尔消光系数进行淬灭，简化了分子信标的设计，更加方便对其进行操作，大大促进了基因微阵列技术的发展。
核酸检测基本知识 1.什么是核酸检测 核酸的定义：核酸是由核苷酸或脱氧核苷酸通过3′，5′-磷酸二酯键连接而成的一类生物大分子。 核酸具有非常重要的生物功能，主要是贮存遗传信息 和传递遗传信息。 2.核酸的分类 核酸大分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 3.核酸的组成
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸(nucleotide)头尾相连而形成的，由C、H、O、N、P，5种元素组成。DNA是绝大多数生物的遗传物质，RNA是少数不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遗传物质。RNA平均长度大约为2000个核苷酸，而人的DNA却是很长的，约有3X10^9个核苷酸。 4.核酸的功能 在蛋白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的 作用。核酸不仅是基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物 合成上也占重要位置，因而在生长、遗传、变异等一系列 重大生命现象中起决定性的作用。 DNA与RNA都是核酸，它们在化学组成上有什么区别如 下： DNA与RNA的比较DNA RNA 主要存在部位细胞核细胞质 基本组成单位脱氧核苷酸核糖核苷酸碱基种类A、G、C、T A、G、C、U 五碳糖种类脱氧核糖核糖 核苷酸链两条脱氧核苷酸链一条核糖核苷酸链 5.检测方法 核酸检测方法，主要通过同时进行靶核酸扩增和可检 测信号的生成来检测样品中的靶核酸。可应用于临床微生
物学、血液筛选、遗传病诊断和预防、法医学等领域的核 酸检测。 目前主要使用的方法有以下几种： a.核酸序列依赖性扩增法 NASBA是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性 核苷酸序列等温扩增RNA的新技术。反应在42℃进行,可在2h内将RNA模板扩增约109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。 整个反应分非循环相和循环相:在非循环相中,引物I与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA 杂合体,随即RNaseH降解RNA,引物Ⅱ与cDNA退火,在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,经其启动子序列起动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相,对模板进行大量 扩增。 b.转录介导的扩增技术 TMA技术原理与NASBA基本一致，略有不同之处是TMA利用的是MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性。反应在41.5℃进行,可在1h内将RNA模板扩增约109倍。 c.连接酶酶促链式反应(LCR) LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种
编号：2-9 主题：digital PCR 概述： Digital PCR（dPCR)即数字PCR，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可以直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字PCR是最新的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。由于数字PCR能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量，因此特别适用于依靠Real-time PCR的Ct值不能很好分辨的应用领域，例如：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。目的： 对DNA分子的个数进行绝对定量。 原理： 其主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。 步骤： 1.分离并纯化基因组DNA； 2.计划数字PCR实验，确定样品的最佳稀释度，以获得数字PCR答案；
3.上样，将DNA样品与TaqMan Assay以及OpenArray数字PCR预混液上样到OpenArray 384孔板； 4.循环和成像，利用OpenArray AccuFill 系统将反应上样到OpenArray平板。将OpenArray平板插入OpenArray箱中，装满浸液，并用封箱胶水密封。利用OpenArray? 实时定量PCR系统开展读取。 5.快速轻松地获取和分析数据。 流程图：
第六章核酸检验基本技术 第一节分子生物学基本知识 一、DNA和RNA DNA是脱氧核糖核酸的英文缩写。DNA以核苷酸排列顺序形式储存遗传信息。 DNA分子由4种核苷酸组成，由碱基互补维持DNA双螺旋结构。 在动植物、细菌和真菌中都含有DNA，但在病毒中不一定含DNA。 DNA为长丝状分子相互纠缠，其溶液十分黏稠。 它对紫外线有最强的吸收，通常用260nm波长测DNA溶液浓度，它在近中性环境中带负电荷，DNA变性后OD值会升高。 因DNA不溶于乙醇，常用二倍量乙醇沉淀DNA。 在变性温度时，它的黏性突然降低。淬火是为了保持DNA单恋状态。 DNA变性后溶液慢慢冷却，DNA会自动回复双螺旋结构。 RNA是核糖核酸的英文缩写，在大多数生物类型中，RNA起遗传信息传递作用并指导合成蛋白质，但在一部分病毒中，RNA也是遗传信息的保存者。 RNA分子中除了含有核糖而不是脱氧核糖外，凡DNA中出现胸腺嘧啶的地方都代之以尿嘧啶。 二、DNA的复制和修复 细胞分裂一次，染色体DNA就合成一次。 DNA分子拆开成两条链，每一条单链按照碱基配对的原则合成另一条新的单链，成为半保留复制。 在合成DNA时限制性核酸内切酶不是合成DNA的必要条件。 DNA多聚酶只能结合在一长段DNA单链的一小段局部双链结构上，才能顺利开始DNA合成。 在DNA合成中单核苷酸分子必须顺序以共价链连接在已形成核酸链3?末端的羟基上。 在合成大声错误时，DNA多聚酶会切除错误核苷酸，在那个位置上重新加一个正确核苷酸。 在人工合成DNA时，至加一种或两种三磷酸单核苷酸，那么和成就会停止在缺失的核苷酸位置上。 在大肠菌DNA损伤修复时填补缺口最重要的酶是DNA聚合酶Ⅰ，而复制最主要的DNA聚合酶是DNA聚合酶Ⅱ。 该酶的核心聚合酶中，具有3?-5?外切酶活性。DNA修复过程中尿嘧啶糖基酶系统不包括SⅠ核酸酶。 逆转录酶的RNAaseH活性是一般DNA聚合酶所不具备的。 三、转录 在生物体内，DNA知道的RNA合成过程称为转录。 它是按照储存在DNA尚的遗传信息合成。 合成RNA时DNA双链也要解旋，解旋部位称启动子。 大肠菌的RNA聚合酶有5个亚基，其σ亚基有启动子作用。 四、翻译 再合成各种不同RNA中，tRNA具有搬运氨基酸功能。 构成核糖体骨架的是rRNA，而mRNA直接决定蛋白质的结构。 4种核苷酸排列组成遗传信息，很撑蛋白质时转换成20种氨基酸的排列顺序，遗传信息的这种转换称为翻译。 3个核苷酸排列顺序代表一种氨基酸密码，表示蛋白质合成开始的密码有一种，DNA3个终止密码子分别是UAA、UAG、UGA。 在细菌里，依靠rRNA和mRNA之间一段互补序列能发现蛋白质合成开始的位置。 元和生物核糖体是由16SrRNA、23SrRNA和5SrRNA组成，在振和生物核糖体的五种主要的组蛋白中，H1在进化中最不保守。 在核糖体上，有2个位置上暴露出mRNA分子相邻的2个密码子，当蛋白质合成进行到没有携带任何
核酸检测技术的应用 规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别实行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本实行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling实行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求实行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 其中112394人份采用单人份核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统实行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数78例，不合格率为2.8‰.两者不合格 率比较，有显著性差异（P<0.05）。 类，一类为NAT反应性而ELISA无反应性，即为单独NAT不合格结果, 此类不合格的检出即为NAT在血液筛查中所发挥的检测效能。另一类 为NAT反应性ELISA亦为反应性。303616份标本中全血标本和单采血
核酸检测技术的应用 1资料与方法 1.1检测方法及判定规则305912份全血标本和单采血小板标本进行常规ELISA检测。部分标本因为ELISA检测项目不合格直接被淘汰而未 进入到核酸检测环节，有303616份标本分别进行混样核酸检测（191222人份）和单人份核酸检测（112394人份）。⑴混样核酸检测：按照试剂盒说明书要求，筛选ELISA检测合格标本进行8个标本混样 核酸检测，无反应性pooling的8个标本视为该项目核酸检测合格， 有反应性pooling进行标本的拆分单检，拆分无反应性的标本判为合格，拆分亦有反应性的标本判为该项目核酸检测不合格。⑵单人份核 酸检测：采用单个标本核酸检测模式，按照试剂盒和全自动核酸检测 设备要求进行检测，检测无反应性的标本视为HBVDNA、HCVRNA、HIV- 1RNA项目联检合格，检测有反应性的标本则视为HBVDNA、HCVRNA、 HIV-1RNA项目联检不合格。 1.2统计学处理采用x²检验,比较各项目不合格率的差异， p<0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1单检模式及混检模式下的NAT结果303616人份标本进行核酸检测，其中112394人份采用单人份核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不 合格数148例，不合格率为1.32‰；191222人份标本采用另外的混样 核酸检测系统进行检测，检出单独NAT不合格数63例，不合格率为 0.33‰.两者不合格率比较，有显著性差异（P<0.05）。 2.2全血标本和单采血小板标本ELISA检测结果305912份全血标本和单采血小板标本中，采用ELISA方法检测全血标本278214人份，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV-1/2三项不合格数2536例，不合格率为 9.1‰；采用ELISA方法检测单采血小板标本27698人份，HBsAg、抗-
如何自制核酸探针？ 什么是核酸探针？ 核酸探针是能与特定的靶分子发生特异性结合的一段核苷酸分子。通过在核酸探针上连接一些小分子化合物，如生物素、荧光素、地高辛等，或者放射性同位素标记核苷酸，可以达到检测靶基因序列和纯化的目的。这一过程被称为核酸杂交。其原理是碱基互补的两条核酸分子退火形成双链。 探针应用 核酸探针技术作为分子生物学中最常见的技术之一，是印记杂交，原位杂交，实时荧光PCR，microarray（微阵列）等技术不可或缺的组成部分。探针技术能定性或者检测特异性DNA/RNA序列，还可用于病原微生物和寄生虫的检测，疾病诊断等领域。 探针制备 探针标记主要分为放射性和非放射性标记法。探针制备流程如图1所示。Southern印迹、Northern印迹等需要较长的DNA探针，常使用缺口平移法和随机引物法进行标记。而这些方法对于较短的DNA（200 bp以下）来说，效率很低，常使用末端标记法。除了这三种方法，常见的还有PCR标记法。 图1. 探针制备流程。 随机引物法 随机引物法的原理是利用随机引物（random primer，即DNA 水解、分离得到的六聚脱氧核苷酸作）与单链DNA随机互补结合，在Klenow大片段酶的作用下，合成互补链，直至下一个引物。如果模板是RNA，则使用反转录酶。随机引物法可以使标记均匀跨越探针全长。相比于缺口平移法，探针的活性更高，但是产量相对较低。
图2. 随机引物法的原理。 Protocol 试剂： [α-32P]dCTP (3000Ci/mmol), dATP,dTTP,dGTP (5 mmol/L),Klenow大片段（2U/uL），模板，随机引物， NA终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS） 5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。） 实验步骤： 1、在一个 0.5 mL 的微量离心管中加入溶于 30 uL 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 uL 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。 2、使用PCR或者预热的水浴锅95℃热变性10min，迅速放冰上1min。 3、4℃离心混合物10s，重新置于冰上。 4、引物和模板的混合物中加入： dATP, dTTP, dGTP 各1 uL 5X 随机引物缓冲液 10 uL
地高辛标记核酸探针的标 记方法 Last revision on 21 December 2020
地高辛标记核酸探针的标记方法 核酸探针已被广泛用于筛选重组克隆、基因多样性的种性检测和真菌种群内及种群之间的系统发育关系评价。最早使用的放射性同位素标记核酸探针具有敏感性高、特异性好、分辨力强的特点，但放射性同位素标记也存在着一系列令人困扰的问题,如成本高、探针半衰期短、放射性物质危害人体健康等。而且在进行放射性同位素标记实验时,需要有专门的实验室及相应的实验保护设施，还需要由经过培训的专业人员来操作,因而限制了在普通实验室进行分子生物学实验。 近几年发展起来的非放射性核酸探针大多通过酶促、光化学和化学手段掺入一种报道基团,这种报道基团可通过高灵敏度的冷光、荧光或金属沉淀等检测系统检测。另外,应用pH电极或感应器技术的电化学检测系统也有报道。在这些检测系统中,灵敏度最高的是生物素- 亲合素检测系统和半抗原-抗半抗原地高辛检测系统。由于生物样品中常含有内源性生物素及生物结合蛋白，生物素标记的核酸探针会发生一些非特异性结合，从而影响实验效果。与生物素-亲合素系统同样具有高灵敏度，却减少了非特异性结合的地高辛检测系统，已为人们所接受,并得到广泛的应用。 地高辛(Digoxigenin ,DIG) 又称异羟基洋地黄毒甙元，是一种类固醇半抗原分子。其化学结构如图1 所示。 采用人工方法可以将地高辛的线型间隔臂与dUTP 连接起来,形成DIG-11-dUTP，通过随机引物法或PCR法将其掺入到DNA
探针中。RNA探针的标记是使用噬菌体信息编码的RNA聚合酶，通过体外转录将DIG-11-dUTP掺入到RNA探针中。寡核苷酸探针的标记则是通过末端转移酶催化，在3'末端加上DIG-11-dUTP/dATP 或DIG-11-ddUTP 尾巴。 对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后,杂交部分可通过ELISA 实验程序加以检测，即加入一种结合有碱性磷酸酶的地高辛-特异性抗体，它与地高辛半抗原分子形成酶联抗体-半抗原(DIG) 复合物，再加入相应的显色底物，使杂交部分得以显示。 1 地高辛标记核酸探针的主要标记方法 1. 1 DNA 探针的标记方法 1. 1. 1 PCR 掺入法这种标记方法是通过聚合酶链式反应，在Taq 酶的作用下，将DIG-11-dUTP 掺入到新合成的DNA 链中。以本法标记的探针不但灵敏度高，产量也很高。少量的基因组DNA(1ng～50ng) 便可直接通过PCR 进行扩增、标记。 1. 1. 2 随机引物法用随机引物法可将DIG-11-dUTP 标记于DNA 链上。为得到最佳标记效果，标记前模板DNA 需作线性处理，而且至少要用苯酚-氯仿进行一次抽提，再用乙醇沉淀。100～10000 碱基的模板链均可被有效地标记，但大于10000 碱基的模板链则需要在标记前作限制酶切消化。处理好的模板加入随机引物，按碱基互补原则，随机引物与模板DNA 退火后由Klenow 片段从引物3' 端延伸引物，便可将DIG-11-dUTP 均匀掺入到新合成的DNA 链中。
核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用 输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。 1. NAT在血液筛检中的必要性 酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播HBV、HCV和HIV 的危险性分别为1∶66000、1∶103000和1∶676000[1]。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误[2]。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间[3]。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如HBsAg、抗-HIV、抗-HCV检测的“窗口期”分别为45-56ｄ、22ｄ、72ｄ[4,5],故美国90%以上输血传播HIV和HBV以及75%以上输血传播HCV的危险性来自“窗口期”感染献血[6]。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT敏感性高,可检出标本中极微量的核酸,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期”。初步研究表明,混合血样NAT检测可将HBV、HCV和HIV感染的平均“窗口期”缩短9d(缩短“窗口期”20%)、59d(82%)和11d(50%)[5,7];此外NAT还可以检出因上述其它3种原因而漏检的被感染献血。如法国应用NAT,从大约150万份献血中筛检出4份HCV RNA阳性、抗体阴性的样本,其中1份即为免疫静默感染[8]。尽管NAT从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病[9]。因此,NAT的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低[10]。 2. NAT检测的技术方法 1985年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着NAT 的诞生。随后,在PCR的基础上,派生出许多其它原理的体外NAT方法[11]。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为PCR技术和TMA技术。 2.1 PCR扩增方法 PCR是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的PCR方法,如检测RNA的逆转录PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量PCR、检测基因超长分布的多重PCR以及PCR结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光PCR和免疫PCR等。 目前在临床检测中使用较多的是荧光定量PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA结合的荧光素检测PCR扩增产物,
全面推行核酸检测试运行工作方案 为预防和控制经血传播疾病的发生，保障临床用血质量和安全，经研究决定我站将全面开展核酸检测。为稳步推进核酸全面检测，不影响血液批放行，满足临床用血需求，制定本 试运行方案。 一、组织管理 为顺利开展全面核酸检测工作，成立核酸检测工作小组，工作组负责全面推行核酸检测试运行工作，协调处理试运行过程中的相关问题。核酸检测工作小组由田站长总负责，分管 站领导和相关科室积极配合。 二、工作目标 根据卫计生发〔2013〕22 号，国家卫生和计划生育委员会关于印发全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013 —2015 年）提出的工作目标，到2015 年，血液筛查核酸检测基本覆 盖全国。 2014 年 5 月 27 日，山东省卫计委又下发了“关于全面推进供血核酸检测工作的通 知”，要求各市要按照原卫生部《全面推进血站核酸检测工作实施方案（2013-2015年）》要求，迅速开展核酸检测工作。确保 2014 年下半年在全省全面开展供血核酸检测。为全面推进我站核酸检测工作，目前前期准备工作已就绪，人员、设备、资金已到位。经研究决定自2014年7 月 1 日开始对我站所有献血员标本（包括沂源采血点）进行核酸检测。 三、保障措施 1、资源保障：器械科购买进口核酸采血管，仅供沂源采血点使用，为沂源采血点配备标本 离心机二台（一台备用），购买标本运输箱 3 个（ hiv 送检一个，沂源采血点一个，备用一个）。 （确认 6.20 号之后到位， 6.30 前完成） 2、沂源采血点标本的运送：沂源采血点工作人员严格按《血液标本留取程序 》留取标本和离心，置于2-6 ℃冰箱保存。标本由计划送血人员运回。根据工作需要，沂源计划送血增加一次，同时减少一次急症送血。即每周二、四、六计划送血三次，中午下 班时由送血司机把标本及原料血捎回。为保证核酸标本检测不超 48 小时，沂源采血点工作人员工 作时间调整，接血当日下午采血点工作人员休息，周日休息。 3、机采血小板计划的下达：血液供应科提前和临床沟通，说明我站下一步的工作目标和 任务（全面核酸检测并纳入批放行）及造成的血液供应时间的变更，达成共识，取得谅解。 合理安排血小板预约和采集计划，血小板采集计划截止到每天下午16：00 点之 前。？？？？？？ 4、机采血小板标本的交接：机采成分科按照血液供应科下达的采集计划预约献血员，安 排献血员第二天早上7：30 分之前到达血站，血小板标本必须于每天上午9： 30 之前分别与 酶免实验室和核酸实验室当面交接。 5、全血标本的交接：各采血点 2014 年 7 月 1 日起，所有采集的血液同时留取核酸标本和 酶免实验室标本。待检室每天早上与酶免实验室和核酸实验室当面交接标本，未检、待检 和待放行的原料血和成分血分别存放并标识。 四、核酸检测 1、核酸实验室与酶免实验室同步对当天采集的单采血小板标本和前一天接回的沂源采血 点的标本进行血筛三项检测，并对酶免实验室前一天初次检测无反应性的标本进行血筛三项的 检测，对酶免实验室前一天初次检测单试剂呈反应性的标本进行血筛三项的单检模式，每 天15:30 前完成实验。若遇拆分标本，及时与相关科室沟通，调整放行和血小板发放时间， 并且完成当天拆分检测，保证该批试验中不留待测的标本。若遇突发应急事件，核酸实验室和 酶免实验室同步检测。每天核酸检测完毕后出具书面检测报告交血液质量控制科、血液成 分制备科和献血服务科机采成分。 2、质量保证：核酸实验室应建立室内质控标准操作规程，实验室的每一批检测应至少有
科目：食品生物技术导论 学院：化学生物与材料科学学院专业：生物技术 班级：090551 学号：09055106 姓名：黄菁
核酸探针技术在食品检测中的应用 摘要：本文对于核酸探针技术进行了一系列的介绍，包括探针种类，标记原理，制备方法以及在食品检测中的应用及发展方向。 关键词：食品检测核酸探针基因工程 The nucleic acid probe of the application of the technique in food testing Abstract: in this paper the nucleic acid probe techniques for a series of introduction, including probe types, mark principle, the preparation methods and application in food testing and development direction. Keywords: food testing nucleic acid probe genetic engineering 正文：一、现代生物技术在食品检验中应用的意义 食品检验检测对于保障食品安全、促进食品生产水平都起着及其重要的作用。长期以来获得广泛应用的物理、化学、仪器等检测方法，由于存在某些局限，已不能满足现代食品检测的需要，随着生物技术的发展，人们已逐步认识到生物技术在食品检验中的重要作用及其意义。 生物技术检测方法以自身独特优势在食品检验中显示出巨大的应用潜力，其应用几乎涉及到了食品检验的各个方面，包括食品的品质评价、质量监督、生产过程的质量监控及食品科学研究。 生物技术检测方法不仅具有特异的生物识别功能、极高的选择性，而且它可与现代的物理化学方法相结合，产生一些简单、结果精确、灵敏、专一、微量和快速、成本低廉的检测方法，因此其在食品检验中占有越来越重要的地位。 二、核酸探针技术 化学及生物学意义上的探针(probe)，是指与特定的靶分子发生特异性相互
1.临床实验室若对检测系统进行性能核实,需要进行以下哪组实验(单项该题正确答案: A.精密度、准确 2.基因芯片技术的本质是(单项)该题正确答案: A、核酸分子杂交技术 3.新型冠状病毒肺炎患者行有创机械通气时,正确的方法是(。(单项)该题正确答案: D.小潮气量和低吸气压力 4.合成RNA的原料是:(单功该题正确答案: C、NTP 5.个人防护装置是用于防止人员个体受到生物性、化学性或物理性等()伤害的器材和用品。(单项该题正确答案:A危险因子 6.标记的参与杂交反应的已知核酸序列是(单项该题正确答案 探针 7.级A1型和A2型生物安全柜的通风连接是使用:(单项该题正确答案 A套管“或“伞型罩“连接 8.第三代测序技术的特征(单项该题正确答案 E、单分子测序 9.新冠病毒核酸检测实验室中,不属于净化实验室专用门特点的是:(单项该题正确答案D 以上均不是 10.以下对应关系正确的是()(单项)该题正确答案: B.敏感性一一真阳性/真阳性+假阴性)*100% 11.目前的DNA自动化测序技术可以一次性读取的序列长度约(单项) 该题正确答案D、1000bp 关于分子信标技术的描述,不正确的是(单项该题正确答案 E、分子信标设计简单 13.国内的生物安全实验室一定要按照国务院发布的()进行管理。(单项)该题正确答案: A《病原微生物实验室生物安全管理条例》 14.从鼻咽拭子中提取的检测新型冠状病毒的剩余核酸提取物不可用于哪种病原体诊断(单项该题正确答案 D丙型肝炎病毒 15.退火温度是决定PCR反应特异性的关键因素,通常退火温度为()该题正确答案 C.Tm减5℃ 16.实验室人员培训的主要内容:0(单项该题正确答案E以上都是 17.下列关于Taq DNA聚合酶的描述,正确的是(单项该题正确答案 E、在引物的3-OH末端加入脱氧单核苷酸,形成3',5磷酸二酯键 18.下列关于恒温金属浴的使用说法错误的是()(单项该题正确答案 D孔位不足时,可将0.5mEP管放入1.5m加热孔中进行热裂解,加热时间不变。 9.脱卸三级防护装备的顺序是:0(单项该题正确答案: A.鞋套→护目镜→外层手套→防护服→帽子→内层手套→口罩 20.下列哪项不是临床分子生物学检验分析前质量控制的内容()(单功该题正确答案 E.进行核酸提取的有效性评价 21.在核酸检测体系中加入内质控,其作用不是监控的是(单项) 该题正确答案
常用核酸探针标记方法 1、切口平移法（nick translation） 原理：先用适量的DNase I 在Mg2+存在下，在双链DNA 上打开若干个单链缺口。利用E. coli DNA 聚合酶I 的5'- 3' 核酸外切酶活性在切处将旧链从5’-末端逐步切除。同时DNA 聚合酶I的5'- 3'聚合酶活性的作用下，顺序将dNTP连接到切口的3’-末端-OH上，以互补的DNA 单链为模板合成新的DNA单链。 图1 切口平移法原理示意图 特点：1）各种螺旋状态（超螺旋、闭环及开环）及线性的双链DNA均可作为缺口平移法的标记底物。但单链DNA和RNA不能采用此方法进标记。双链DNA小片段（>100-200bp）也不是此法标记的理想底物。 2）DNA多聚酶必须是E·Coli DNA多聚酶的全酶。 3）DNA模板要用纯化过DNA
2、随机引物法（random priming） 原理：将待标记的DNA探针片段变性后与随机引物一起杂交，然后以此杂交的寡核苷酸为引物，大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（E·Coli DNA polymerase I Klenow Fragment）的催化下，合成与探针DNA互补的DNA链。当反应液中含有标记的dNTP时，即形成标记的探针。 图2 随机引物标记法原理示意图 特点：1）除了能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA和RNA探针的标记。 2）所得到的标记产物是新合成的DNA单链，而所加入的DNA片段本身并不能被标记。 3）新形成的标记DNA单链的长度与加入寡核苷酸引物的量成反比，因为加入的寡核苷酸数量越多，合成起点也越多，得到的片段的长度也越短。按标准方法得到 的标记产物长度一般为200-400bp。
核酸检测试剂 一、基本要求： 1.试剂名称：核酸检测试剂(进口) 2.用途：对献血者血液标本进行乙肝病毒DNA、丙肝病毒RNA，人类免疫缺陷病毒RNA检测。要 求HBV/HCV/HIV单管联检试剂。 3.数量：65000人份。[乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（1+2）型核酸检测试剂盒 （PCR-荧光法）：乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人类免疫缺陷病毒（1+2）型核酸质控试剂（PCR-荧光法）]。 4.★试剂适用设备：可以在现有S201设备上使用。 5.适用检测样本种类：血清及EDTA、ACD抗凝血浆。 6.★试剂原理基于荧光PCR技术的汇集模式或基于TMA技术的单检模式。 二、技术要求： 1.试剂必须通过美国FDA批准或欧洲CE（IVD）认可，以保证产品技术和质量达到国际认可水 平，投标试剂的注册标准应具有进字号的注册许可，投标人需在投标文件中提供相关证明文件。 2.试剂可检测到的基因亚型要求覆盖：HBV A-H所有亚型；HCV 1-6亚型；HIV－1 M组A－G所 有亚型、O组、N组；HIV-2组。 3.检测灵敏度(≥95%可信限)：HBV DNA≤20 IU/ml；HCV RNA≤50 IU/ml；HIV RNA≤51 IU/ml； 临床特异性≥99.7%。 4.★根据国家相关机构质控要求进行质控，试剂含有内标质控（Internal Control），为RNA内标 或RNA\DNA双内标，全程监控检测过程，包括核酸提取，扩增及检测步骤，以防止技术性的假阴性。系统内部有UNG酶防扩增污染控制。 5.试剂使用时操作简便，不需要用专用设备进行孵育融化。不需要人工配制或分装，不需要开盖， 试剂封闭操作，能有效防止交叉污染。试剂包装容器需带条形码，满足检测设备自动扫描、自动读取判断试剂组分的需要。 6.装载样本及对应耗材试剂后，无需人工值守，直至试验结束接收结果，避免试验污染。 7.实验结束后，试剂架等材料无需84消毒液浸泡处理，方便操作人员对实验室的维护。 三、配套要求： 1.成交方无偿提供核酸检测正常运转的相关配套设备(包括2台混匀器)。 2.成交方无偿提供所有核酸检测正常运转的相关检测仪器（加样、核酸提取、纯化、扩增、检测） 以及配套实验台等，以进行自动核酸提取、扩增、检测和鉴别；成交方无偿提供设备、安装、调试、培训和维修的服务。 3.检测设备需求量：满足常规8小时至少完成600个标本检测的需求。 4.成交方无偿提供核酸检测正常运转的所有配套耗材，其中须包括一次性带滤芯移液头、一次性 使用核酸检测专用真空采血管、KIMTECH擦拭纸。
核酸探针技术原理是碱基配对。互补的两条核酸单链通过退火形成双链，这一过程称为核酸杂交。核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。每一种病原体都具有独特的核酸片段，通过分离和标记这些片段就可制备出探针，用于疾病的诊断等研究。 (一) 核酸探针的种类 1.按来源及性质划分可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA 探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。 作为诊断试剂，较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。其中，前者应用最为广泛，它的制备可通过酶切或聚合酶链反应(PCR)从基因组中获得特异的DNA后将其克隆到质粒或噬菌体载体中，随着质粒的复制或噬菌体的增殖而获得大量高纯度的DNA探针。将RNA进行反转录，所获得的产物即为cDNA。cDNA探针适用于RNA病毒的检测。cDNA探针序列也可克隆到质粒或噬菌体中，以便大量制备。 将信息RNA(mRNA)标记也可作为核酸分子杂交的探针。但由于来源极不方便，且RNA极易被环境中大量存在的核酸酶所降解，操作不便，因此应用较少。 用人工合成的寡聚核苷酸片段做为核酸杂交探针应用十分广泛，可根据需要随心所欲合成相应的序列，可合成仅有几十个bp的探针序列，对于检测点突变和小段碱基的缺失或插入尤为适用 2.按标记物划分有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。放射性同位素是最早使用，也是目前应用最广泛的探针标记物。常用的同位素有32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。放射性标记的优点是灵敏度高，可以检测到Pg级；缺点是易造成放射性污染，同位素半衰期短、不稳定、成本高等。因此，放射性标记的探针不能实现商品化。目前，许多实验室都致力于发展非放射性标记的探针。 目前应用较多的非放射性标记物是生物素(Biotin)和地高辛(digoxigenin)。二者都是半抗原。生物素是一种小分子水溶性维生素，对亲和素有独特的亲和力，两者能形成稳定的复合物，通过连接在亲和素或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光素等)进行检测。地高辛是一种类固醇半抗原分子，可利用其抗体进行免疫检测，原理类似于生物素的检测。地高辛标记核酸探针的检测灵敏度可与放射性同位素标记的相当，而特异性优于生物素标记，其应用日趋广泛。 (二) 核酸探针的标记 1.放射性同位素标记法常将放射性同位素如32 P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。 切口平移法(nick translation)是利用大肠杆菌DNA聚合酶I (E.coli DNA polymerase I) 的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下： (1) 取1?g DNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液( 0.5mol/L Tris－HCl，PH7.2；0.1 mol/L MgSO4 ；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL 牛血清白蛋白)，加入除标记物(如?-32 p-dATP)外的其它三种dNTP(如dCTP，dGTP，dTTP)溶液，20mmol/L溶液各1?l。 (2) 加入100?ci(10?l)标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l,混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l(约5单位)E.coli DNA polymerase I，混
简述核酸探针技术及其在微生物检测中的应用 核酸探针技术及在病原细菌检测中的应用 随着分子生物学和分子化学的飞速发展，对病原微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针（Nuclear acid probe）以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于病原微生物的检测。 核酸探针是将已知核苷酸序列DNA片段用同位素或其他方法标记，加入已变性的被检DNA中，在一定条件下即可与该样品中有同源序列的DNA区段形成杂交双链，从而达到鉴定样品中DNA的目的，这种能认识到特异性核苷酸序列有标记的单链DNA分子就称为核酸探针或基因探针。根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA 探针，一般大多选用DNA探针；根据选用基因的不同分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，如编码致病性的基因组，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。这类探针检测的基因相当保守，包括大部分rRNA，因为他既可能在一种微生物中出现，又可代表一群微生物。如应用rRNA探针检测作为筛选食品污染程度的指示菌E.Coli。选择探针的原则是只能同检测的细菌发生杂交反应，而不受非检菌存在的干扰。 1 核酸探针的特点： 1.1探针的特异性核酸探针检测技术的最大特点是特异性，就是说一个适当组建的DNA探针能绝对特异性地与所检微生物而不与其他微生物发生反应。对食品检测而言，就是不与样品中内源性杂菌和样品自身DNA发生非特异性反应。以往检测方法检测的是基因的表达产物（蛋白质或其他产物）。检测这种物质受多种因素影响。比如食品中微生物因受应激损伤（高温、冷冻、化学制剂等）会导致基因组的变化，从而引起其表达产物的变化。而核酸探针检测的基因本身，它能识别基因本身的变异，不受基因表达产物的影响。常规免疫学方法检测抗原、抗体，他们都是蛋白质，这些蛋白质由氨基酸组成，而氨基酸由核苷酸序列确定，一旦这种序列受外界影响发生变异，就会导致其产物的变化，影响抗原抗体间的反应，使检测特异性下降。检测病毒主要通过组织培养后，检测病毒相关的蛋白质囊膜，即使采用超低温保存，有时也会引起编码蛋白质囊膜基因的变化，而采取DNA探针检测病毒则不用改变其蛋白质结构，而只需检测是否有相应特异性的编码蛋白质囊膜的病毒靶DNA 序列。另外，核酸之间的识别连接比抗原抗体准确，并且探针检测比免疫学方法灵活。尽管看来形成抗原抗体复合物比核酸杂交快，但能通过加磺化葡聚糖把退火速度增加100倍，从而提高反应速度，核酸比蛋白质耐受高温（100℃）、有机溶剂、螯合剂和高浓度工作液的破坏作用，所以用比提取蛋白质强烈的多的方法制备核酸，不会影响杂交反应。当然RNA探针除外，因为RNA不耐受碱处理，需用其它方法制备检测用RNA。核酸探针的特异性取决于探针的碱基序列和使用条件，如在不严格条件下（低温高盐）探针与靶DNA误交结合力比严格条件下稳定。探针长度也会影响反应的特异性，一般加Formamide增加反应特异性。 1.2 探针的敏感性研制核酸探针是为了检测出单个病毒和细菌。DNA探针敏感性取决于探针本身和标记系统。32P标记物通常可检出10－8摩尔特异DNA片段，相当于0.5pg，1000个碱基对的靶系列，相当于1000－10000个细菌。用亲和素标记探针检测1小时培养物DNA含量在110pg，两者敏感性大致相同，而血清学方法只能达到1ng的水平。延长培
第六章 基于分子工程的核酸分子探针
生命的本质是一系列可自主调控的化学、物理过程，但主角不是简单的化合物而是复杂的生物大分子。核酸与蛋白质是生命发生、发展和繁衍中最重要的两类物质，正是它们之间复杂、精巧而协调的相互作用演绎出神奇、千变万化、令人叹为观止的生命现象。 因此，在分子水平上研究核酸、蛋白质等生物大分子及其相互作用是我们深入理解生命现象、揭示生命奥秘最为关键的内容之一。
红细胞:6,000-9, 000nm 白细胞:10,000nm 一般细菌: 1,000 –10,000 nm 一般病毒:75 –100 nm 蛋白质5 –50 nm DNA (双链宽) 2 nm 研究人员需要一些合适的分析工具和手段，在分子水平上，最好是在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用等信息转变为易于检测的光、电信号变化，非常灵敏、准确地反映出来。
以体系的功能为导向，在分子水平上设计所需结构，并定向合成功能分子，是分子工程的重要特征。通过在分子水平上研究生物分子间的相互作用，设计、合成和筛选具有特定功能的分子探针并发展其生物医学应用，是分子工程的前沿研究领域之一。 核酸分子探针是一种重要的分子生物学研究手段。它非常巧妙地利用了核酸的结构及其识别能力上的特点，例如核酸的杂交、立体构象转变、与蛋白质、寡聚高分子甚至金属离子的特异性结合等，结合分子水平的信号传导机制，将相关的生命信息转变为易于检测的信号，例如拉曼、荧光、化学发光、电流、放射性等。随着其他相关学科如化学、材料科学的发展，核酸分子探针的合成、标记和检测技术取得了长足的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为。与荧光蛋白技术相比，核酸分子探针一般不需要对目标细胞预先进行基因操作，不仅更能反映生命活动的真实状况，而且也便于直接研究临床样品。