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蛋白质层析新填料应用与选择

层析柱说明书

锐意进取、和谐创新 550层析柱 说 明 书 浙江中能轻工机械有限公司

一产品介绍: 层析过程是采用特殊的吸附剂,从植物提取液中选择性地吸附其中的有效部分,去除无效成分的一种分离纯化新工艺。可以解决植提生产中所面临的剂量大、产品吸潮和重金属残留等实际问题。经层析技术处理后所得到的精制物,可使有效成分高度富集,杂质少,提取得率仅为原生物的2~5%,而一般水煮法为30%左右,醇沉法为15%左右;可有效地去除吸潮成分,并增强产品的稳定性;可有效地去除重金属。层析分离工艺所得提取物体积小,不吸潮,容易制成外型美观的各种剂型,尤其适用于颗粒剂、胶囊剂、片剂等的生产。该技术将是对中药提取工艺影响最大、带动面最广的技术进步之一。用于生物工程、制药工业、精细化工领域的分离纯化设计制造的工业制备,具有分辨高、选择性好、流动连续、效率高、处理稳定、样品可多可少、易于操作的特点,适用于含量少的复杂高分子物质的分离纯化,是中草药、化学合成药及生物活性物质有效成分分离提纯的核心设备。 二产品特点: ①合理的高径比,精密的进出口流体分布装置,保证层析柱装填效 果和填料再生效果,为高效分离提供了保障。 ②产品采用不锈钢材料,并进行内外抛光,耐腐蚀、使用寿命长、 硬度高、运输安全,质量有保障。 ③本设备确保无污染、效率高、操作方便等。

三技术参数 容积550L 材质SUS304 设计压力-0.1 设计温度100 四操作说明 层析操作流程一般为:预处理,逆流洗柱,水洗,吸附,解吸、再生等工艺。 1、预处理:在吸附树脂的生产过程中,一般均采用工业级原料,产品没有经过进一步纯化处理,因此树脂内部往往残留少量单体,致孔剂和其他有机杂质,所以在使用之前必须进行预处理。 吸附树脂预处理方法如下: (1)将准备装柱使用的新树脂,用2倍左右体积的甲醇或其他水溶性溶剂(如乙醇、丙酮)浸泡2小时,并不时搅动,使树脂充分溶胀。 (2)、将已充分溶胀的吸附树脂装柱,以每小时3至4倍床体积的流速,将5至8倍的甲醇或其他水溶性的溶剂(如乙醇、丙酮)通过树脂层,至流出液加水稀释不变混。 (3)、甲醇处理后,以每小时6至8倍床体积的流速将去离子水通过树脂层,置换出甲醇即可投入使用。 2、逆流洗柱:逆流洗柱是用水洗除去水离子及破碎填料,树脂装入交换柱后,用蒸留水反洗树脂层,展开率为50-70%,直至出水清晰、无气味、无细碎树脂为止,再用50%-100%乙醇10-15倍体积慢速淋

蛋白质的纯化方法

蛋白质纯化的方法 蛋白质的分离纯化方法很多,主要有: (一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。

GST-FF层析填料说明书

Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 原理 谷胱甘肽S-转移酶是一种经常被使用的Tag,可以使含有谷胱甘肽S-转移酶的重组蛋白的纯化和检测更加容易,为了使产物的纯化更简单,GST融合蛋白的一步纯化是可用的。 纯化简要概述 结合缓冲液:140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4, pH 7.3 洗脱缓冲液:50mM Tris-HCl, 10mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.0 1,用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 2,上样。 3,用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱,直到基线,即所有未结合物质都被冲洗出柱子。 4,用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。 5,用5-10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子。 使用注意 1,样品上样期间和洗脱期间,保持较低的流速是非常重要的,因为GST和谷胱甘肽互相间的结合动力学作用是相对较低的。其结合容量是依赖于蛋白质的特性,因此其产量是依赖于蛋白质的类型而变化的。使用较低的流速或者将样品反复流过柱子几次,或许可以提高产量。 2,柱子的重复使用取决于样品的特性。对同一样品重复使用时,需考虑避免交叉污染的问题。 在位清洗 1,用2-3倍柱体积的,高端pH值为(0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0)和低端pH值为(0.1M 醋酸钠,0.5M NaCl,pH4.5)的缓冲液交替冲洗柱子。 2,重复循环3次。 3,立即用3-5个柱体积的结合缓冲液再平衡柱子。 沉淀蛋白质的去除 1,用2倍柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子。 2,立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。 通过疏水性互相作用结合到柱子上的物质的去除 1,用3-4倍柱体积的70%的乙醇冲洗柱子(或者2倍柱体积的非离子型去污剂如1%的曲拉通-100冲洗柱子)。 2,立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。

填料和层析柱使用规范

层析柱和填料使用规范 原理凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段,广泛用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离纯化、分子量的测定、脱盐、浓缩等。本实验室主要有排阻层析和离子交换层析两种。排阻层析利用生物大分子的相对分子质量差异进行层析分离。层析介质内部具有立体网状结构,形成孔穴,较大的分子完全被排阻在孔外,只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动,流程短,首先流出;较小的分子则完全渗透进入凝胶颗粒内部,流程长,所以最后流出。离子交换层析将具有交换能力的离子基团在固定相球形介质表面,这些离子基团可以与流动相中的离子发生可逆性离子交换反应而进行分离。 操作规程层析柱和凝胶填料是我们实验室的宝贵财富,为了方便大家使用和规范实验室操作,现将使用规范规定如下,请各位老师和同学务必严格按照操作规程。 1 使用前首先明确自己的分离目的,即要做哪一方面的分离,从而选择合适的凝胶填料,请大家务必查阅文献或者询问老师,同时根据自己的分离要求,选择合适长度和直径的层析柱; 2 征得老师或者负责同学同意后方可进行操作(外室人员务必征求老师同意); 3 选择好层析柱和填料以后,严格按照填料的要求来操作,包括填料的溶胀、脱气、装柱,期间务必严格按照说明书操作; 4 适当控制上样量,上样以前务必要过0.22μm滤膜; 5 选择合适的流动相,根据胶的性质决定能否用泵加压; 6 使用完毕后,请将层析柱做好处理(离子交换柱请用高浓度氯化钠溶液冲洗,最后用水冲洗),最后将层析柱堵好,以防干胶或者进气泡,同时请做好试验纪录,以便下一位同学用时方便查询使用情况; 7 试验过程中所有用水或者溶液必须经过抽滤和脱气,严防气泡; 8 若在使用过程中发生意外情况,请及时向负责同学反应,及时解决。 本规范解释权归本实验室,疑难问题请咨询老师或负责同学。 负责人:杨波刘斌 2004-12-15

层析柱使用方法

层析柱使用方法 层析柱使用方法柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术。这两项技术掌握与否,对于提高实验的效率至关重要。常见的例子是:在柱层析时,由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀(没有填严实),使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导致分离效果不好。更常见的例子是:层析柱虽然装得不错,但是由于淋洗剂选择不恰当,结果导致几十毫克产品,用了几百毫升淋洗剂都还没有完全分离。分离同样的东西,熟手可能只需要半个小时,而一个层析技术不过关的人可能半天都不能得到纯品。由此可见,这两项技术掌握与否,对于提高工作效率,减轻工作量,减少有机溶剂的使用,从而对身心健康和环境保护都有明显的作用。柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当。而淋洗剂的选择则是通过TLC确定。这里要指出的一点是:TLC的作用除了跟踪反应进程,检测试剂和原料纯度外,一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂。 首先谈柱层析: 1:装柱子(添硅胶)时,有两种方法:即湿法装柱和干法装柱,二者各有优劣。不论干法还是湿法,硅胶(固定相)的上表面一定要平整,并且硅胶(固定相)的高度一般为15cm左右,太短了可能分离效果不好,太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好。 湿法装柱:是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后,再填入柱子中,然后再加压用淋洗剂“走柱子”,本法最大的优点是一般柱子装的比较结实,没有气泡。 干法装柱:则是直接往柱子里填入硅胶,然后再轻轻敲打柱子两侧,至硅胶界面不再下降为止,然后再填入硅胶至合适高度,最后再用油泵直接抽,这样就会使得柱子装的很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”,一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。通常上面加压,下面再用油泵抽,这样可以加快速度。干法装柱较方便,但最大的缺陷在于“走柱子”时,由于溶剂和硅胶之间的吸附放热(可以用手摸柱子明显感觉到),容易产生气泡,这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙醚,二氯甲烷更为明显。虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉,但是,一旦撤去压力,如在上样、加溶剂等操作的时候,气泡就会释放出来,严重时,整个柱子变花,样品不可能平整地通过,当然也就谈不上分离了。解决的办法是:第一、硅胶一定要天结实;第二、一定要用较多的溶剂“走柱子”,一定要到柱子的下端不再发烫,恢复到室温后再撤去压力。也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂,防止添加溶剂的时候,使得样品层不再整齐。但我的感觉是如果小心上样,添加溶剂,则没有这个必要。 2:上样也有干法和湿法之分:干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后,在加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。干法上样较麻烦,但可以保证样品层很平整。湿法上样就是用少量溶剂(最好就是展开剂,如果展开剂的溶解度不好,则可以用一极性较大的溶剂,但必须少量)将样品溶解后,再用胶头滴管转移得到的溶液,沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后,再加入。湿法较方便,熟手一般采用此法。上样完毕后,接着即用淋洗剂淋洗。淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。由于层析柱和薄板的不同,即使两者使用的硅胶都相同,但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时,也显得极性偏大,所以要稀释一倍,但又不能稀释太多,否则成了靠扩散作用来分离,效果也不会好。 谈TLC,需要切记的是: 第一、某种样品在这种展开剂中只显示一个点,并不等于在别的展开剂中也只显示一个点。因此在寻找展开剂时,多尝试几种比例不同,成分不同的展开剂。展开剂的极性太小,点分不开,极性太大,也分不开.一般以目标产物的Rf值在0.3左右为最佳。 第二、点不能点得太浓,否则容易重叠,不易判断,因为如果两个点相近的话,一浓就变成一个点第三、板上点的展开的清晰程度和溶剂的极性和物质在该溶剂中的溶解性有关,只有两者比较合适了,才能有一个交好的分离效果。 选择适当的展开剂是首要任务.一般常用溶剂按照极性从小到大的顺序排列大概为:石油迷

层析填料Capto MMC的使用说明

Capto MMC 皇家药院 Captor MMC是一种耐盐的多模式的生物处理媒介,在使用填充床色谱法从大量的培养液中纯化蛋白质时可以作为捕获介质和中间纯化介质。Capto MMC 在提高生产力的同时降低了生产成本:在高电导率下具有很高的动态载量;高容量的吞吐量;新的选择性;更小的操作单元。 1 生物处理媒介 生物处理媒介因为生产规模的色谱层析而得到发展。所有的生物处理媒介均经验证方法进行生产,并且经过测试以满足生产的需求。安全的订购和交付模式能够为规模生产需要的媒介提供可靠的供应。法规支持文件(RSF)可用来协助工艺验证和提交给监管机构。生物处理媒介可以覆盖从捕获到精纯的所有纯化步骤。 2 Capto MMC的特性 Capto MMC 具有多种官能团的配体,多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性,且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性。 Capto MMC与大分子间存在多种作用方式,其中最显著就是离子作用,氢键和疏水作用。 Capto MMC是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速,而减短生产周期和提供生产力。 该媒介以高流速的琼脂糖为基质,典型的大规模柱子(直径为1m,柱床高度为20cm)在顶板压力低于3bar时流速为600cm/h或者更高。高交联度的琼脂糖

基质提供了很高的物理和化学稳定性。容量、洗脱行为和压力/流速等特性不受层析过程常用溶液的影响。 Capto MMC和琼脂糖6快速的压力-流速特性比较,工作条件 3 方法设计和优化 设计和优化生物大分子分离方法的目的是确定实验条件,在尽可能短的时间和尽可能高的产品回收率的条件下提高目的分子的最大吸附量。 在结合蛋白时,Capto MMC的作用类似于弱阳离子交换剂。因为允许在高

Heparin层析填料说明书

Heparin Sepharose 6 Fast Flow 原理 肝素是一种含硫酸酯的酸性多糖,将它偶联到交联及活化的琼脂糖凝胶上,该填料具有很高的物理化学稳定性。肝素能和抗凝血因子Ⅲ、凝血因子、蛋白合成因子、脂蛋白、干扰素、核酸结合蛋白、限制内切酶、凝血酶及类凝血酶等生物大分子结合,所以肝素琼脂糖凝胶可以用于这类物质的纯化。 *图为含有交互转换的抗坏血酸的肝磷脂多糖的结构(A)和D-葡萄糖残基(B) 分离操作 结合缓冲液:20mM Tris-HCl, pH 8.0或者10mM 磷酸钠, pH7.0 洗脱缓冲液:20mM Tris-HCl, 1~2M NaCl, pH 8.0或者10mM 磷酸钠,1~2M NaCl, pH7.0 1,用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 2,上样。 3,用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱,直到基线,即所有未结合物质都被冲洗出柱子。紫外吸光A280nm处监测。 4,用5-10倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。使用连续的或者阶梯式的梯度洗脱,洗脱缓冲液的浓度从0%-100%。 使用注意 1,通过改变缓冲液的pH值或者离子强度来修饰肝磷脂的选择性。洗脱时使用连续的或者阶梯式的洗脱方式,用NaCl,KCl或者硫酸铵溶液,浓度可以高达1.5~2M。 2,对于凝血因子而言,肝磷脂作为亲和配基,在结合缓冲液中含有一个低浓度的0.1M的NaCl是合适的。 3,如果增加盐离子浓度的梯度产生一个令人不满意的结果,使用肝磷脂(1~5mg/ml)在洗脱缓冲液中作为一个竞争性试剂。

净化 1,用0.5个柱体积的2M的NaCl冲洗10分钟去除离子键结合蛋白。 2,通过用4倍柱体积的0.1M NaOH溶液冲洗柱子1~2小时去除沉淀物或变性蛋白或用2倍的柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子30~60分钟,或者用2倍柱体积的6M的尿素冲洗30~60分钟。 3,用4倍柱体积的0.1%~0.5%的TritonX-100冲洗1~2小时,去除疏水键结合的蛋白质。 0.1M NaOH(1周在+20℃),0.05M醋酸钠,pH4.0,4M NaCl,8M尿素,6M盐酸胍。 储存 用5个柱体积的0.05M醋酸钠并且含有20%的乙醇冲洗介质和柱子,在4℃~8℃条件下储存。

蛋白质纯化方法及问题解答

蛋白质纯化 一.可溶性蛋白的纯化 1. 盐析 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离,是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子,从而破坏蛋白质表面的水化膜,降低其溶解度,使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大,温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单,一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白,可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以,到一定的浓度离心沉淀,上清继续加硫酸铵,再离心,上清再加硫酸铵,然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。 2. 亲和纯化 2.1. Ni柱纯化

2.1.1.Ni柱纯化操作流程 1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min);也可以让上清液缓慢流经Ni柱(≥6 sec/drop)。 2. 上清与填料混合后,低速离心(≤ 500 x g),吸去大部分上清,然后将填料悬起,加入柱子中。也可以直接上柱。 3. 上样后先用5-10 柱体积(CV)的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白,然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱(如10,20,30,40,50 mM),然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。 4. 清洗结束后,用高浓度咪唑(如200 mM)洗脱目的蛋白质。 5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外,透析除去咪唑,并换成下一步所需的buffer。 6. 一般情况下his tag不需要切除。当需要切除时: 的蛋白质最少1)TEV:咪唑对其没有影响,可以在洗脱后直接酶切。100 OD 280 的TEV切过夜,温度20或4℃(20℃的效率是4℃的三倍)。 可用1 OD 280 2) Thrombin:必须先除去咪唑才能进行酶切。在1 x PBS中,10 U/mg蛋白质,4或20℃酶切过夜。可适当加大酶量或延长酶切时间。 2.1.2.Ni柱纯化注意事项 1.新的Ni柱填料存放于20%乙醇中(体积约为1:1)。在取用前,请先估算目的蛋白质的量,再决定取用的填料体积(Qiagen的Ni-NTA Superflow最大结合能力为30 mg protein/ml beads)。填料用量不要大大超过所需量,不然会结合较多的杂蛋白,难以清洗干净。 O冲洗,除去乙醇。再2.新填料使用前,要先进行处理和平衡。填料先用ddH 2 用至少5 CV的buffer进行平衡。 3. 在使用前后,要注意不能让填料放干,不然会影响纯化的效果。 O清洗,3. 每次使用结束后,填料用高浓度咪唑(如500 mM)清洗,再用ddH 2 最后保存在20%乙醇中。 4. 不推荐Ni柱在柱酶切,这样效率很低。

Protein G层析填料说明书

Protein G Sepharose Fast Flow 原理 蛋白质G ,来自G 链球菌组的细胞表面蛋白,是III Fc-受体型蛋白。蛋白质G 通过非免疫机制结合抗体的Fc 区域。蛋白质G 特异性的结合IgG 的Fc 区域,但是对于一些多克隆抗体IgGs 对人源的IgG 抗体能够有更强的结合。在标准缓冲液条件下,蛋白质G 能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性的IgG 亚类抗体,包括鼠的IgG ,或者兔的IgGa 和IgGb 。 进行一个分离操作 结合缓冲液:20mM 磷酸纳,pH7.0 洗脱缓冲液:100mM 甘氨酸,pH2.7 中和缓冲液:1M Tris-HCl ,pH9.0 1, 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2, 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3, 上样,流速为1-4ml/min (1ml 的柱子),或者5ml/min (5ml 的柱子)。收集流穿片段。 4, 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱,直到基线,即所有未结合物质都被冲洗出柱 子(紫外检测器在280nm 波长检测)。 5, 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液(0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl ,pH9.0每毫升馏分)中和至中性。 6, 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。 使用注意 1, 样品需要离心(10000g/20min )去除细胞和细胞碎片。离心下来的上清经过一个0.45μm 的滤膜过滤。 2, 来自多数物种的IgGs 和亚类,在接近生理pH 值和离子强度的条件下,可以结合到蛋白 质G 上。对于特别物种IgG 的最佳结合条件,应该查阅近期的文献。 3, 当pH 值为2.7或者低于2.7时,大多数种类的免疫球蛋白能从蛋白质 G 上被洗脱下来。 4, 洗脱完成后,立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。 在通常使用的水溶性缓冲液中都是稳定的。

疏水层析填料

2008-6 Volume 8 疏水层析填料 疏水层析,是根据不同的蛋白与疏水表面产生的相互作用的差异,进行蛋白分离的一种方法。 一般而言,离子强度(盐浓度)越高,物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括:盐浓度,温度,pH,表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补,因此,可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 Chisso公司生产的疏水层析填料,有三种类型:Cellfine TM Butyl, Phenyl 和Octyl,分别为 在多孔的交联纤维素颗粒上通过一个短接头,共价键和丁基,苯基或者辛基的层析填料。结构见下 图: 填料的疏水性按丁基、苯基、辛基,疏水性程度依次增大。通常,Cellfine TM Octyl对疏水性 蛋白的吸附性会强于Cellfine TM Butyl对疏水性蛋白的吸附。然而,蛋白被吸附的越厉害,也就越难洗脱。Cellfine TM Phenyl,具芳香族物质的特性,因此,在某些情况下,可以更好地吸附丁基和辛基等脂肪族所不能吸附的物质。在使用疏水层析分离物质时,没有通法,只能根据待分离物质的特性,筛选合适的填料,摸索优化其分离纯化的条件。 三种疏水层析填料的疏水性差异(左图) 色谱柱:8.2 x 150 mm 柱体积:8 ml 流动相:2.0 - 0.0M Ammon ium Sulfate in 0.01M phosphate, pH 7.0 流速:1.32 ml/min

Asahipak NH2P 色谱柱是Shodex 公司生产的用于分析糖类物质的正相柱 色谱柱,是以聚合物为基材的氨基柱,化学稳定性良好,在 pH2-13的条件下均可使用。与硅胶基 材的氨基柱相比,聚合物基材的氨基柱 Asahipak NH2P ,可以很好地实现硅胶基材氨基柱的各种 应用;对流动相的耐受性更好,使用寿命更长久;另外, Asahipak NH2P 可用于定量分析;还可 以用碱性溶剂冲洗 聚合物基材氨基柱与硅胶基材 氨 基柱的柱寿命比较 左图为 Asahipak NH2P 色谱柱与硅胶基材氨基柱的寿 命对比试验。结果显示:随着 使用时间的延长,硅胶基材氨 基柱对单糖、二糖的保留快速 下降,其原因应是硅胶基材氨 基柱的氨基降解所致。 色谱柱:Asahipak NH2P-50 4E, 其它公司的氨基柱 2008-6 Volume 8 样品:5 mg/3 ml 100 卩 l Asahipak NH2P 色谱柱(氨基柱) Asahipak NH2P

CNBr-4B活化填料使用说明书(译文)

CNBr活化柱说明书 溴化氰活化琼脂糖?-4B是一种预活化并固定配体来结合氨基的介质。它提供了一个非常方便的固定溴化氰配体的方法。这个偶联反应是自发的、快速和容易实现的。它的应用领域涵盖了固定化蛋白质、多肽和核酸等。 注:线性流速=体积流速(L/h)/ 层析柱横截面积(cm2) 这里所给出的范围是基于我们的立论知识和经验估计的。请注意以下几点: pH值稳定、长期保存的pH值区间指的是凝胶在很长一段时间内可以保持稳定,没有在其随后的层析分离时出现不利的影响。pH值稳定、短期保存的pH值区间是相对于再生、在线清洗和维护程序来说的。 准备阶段 溴化氰活化琼脂糖?-4 B是以添加剂的形式冻干处理得到的。这些添加剂在填料螯合所需的配体前必须在低pH(pH 2 – 3)条件下进行清洗。活化后的活性基团也应该使用低pH 值(pH值2 – 3)保存,而在高pH值则会出现降解。 称取所需量的冻干粉(1 g冻干粉可获得3.5ml终体积的介质),使用1mM HCl悬浮。介质会立刻膨胀,再用1mM HCl在玻璃过滤器中进行清洗15min。每克冻干粉添加约200ml 1mM 的HCl溶胀,实际按几等分的量来添加。 螯合配体 常规的配体螯合过程

1.在螯合前,使用0.1 M NaHCO3、0.5 M NaCl pH 8.3的螯合缓冲液来溶解配体,每克冻干粉使用5ml螯合缓冲液溶解。一般,每毫升的填料介质可以结合5-10mg的蛋白配体。对于较小的配体,一般每毫升填料介质添加1-10μM的配体。 2.称出所需量的溴化氰活化琼脂糖-4B填料。如上所述,用1mM HCl来溶胀和清洗冻干粉。 3. 在一个密封的容器里,将溶解的配体与待螯合的介质混合。在室温下反复旋转混合约1 h或在4℃下过夜混合,其他温和的搅拌方法也可以使用的。 4.使用至少5倍填料体积的螯合缓冲液来洗去多余的配体。 5.排除任何剩余的活性配体,将填料转移到0.1M Tris-HCl缓冲液pH 8.0或1M 乙醇胺,pH值8.0溶液中,保持2h。 6.每个循环均要使用包括0.1M 醋酸盐缓冲液,0.5M NaCl pH4.0以及0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0的缓冲液来清洗,交替用两种pH缓冲液清洗填料至少三个循环,每次至少用5倍填料体积的缓冲液来清洗。 影响螯合的因素 pH 偶联反应最有大效率是pH值在8 – 10的范围内,此时配体上的氨基主要是以非质子化的形式存在。pH值在8.3的缓冲体系最常用于结合蛋白。 螯合反应在低pH值下效率较是很低的,但是也可能是有效的,比如说当采用多点附着稳定固定的时候,配体生物活性有所损失,或是在大量的高分子配体固定化时,结合位点之间出现位阻,此时pH在6.0的缓冲液则是适合配体的螯合。 螯合用缓冲液 螯合过程应该在碳酸氢盐或硼酸盐缓冲液中完成。Tris和其他包含氨基的缓冲盐液不应使用,因为这些氨基将会结合到凝胶上。 配体可能需要有机溶剂来溶解,可以使用终浓度在50%的二甲基甲酰胺和二恶烷,而在螯合缓冲液也应使用相同浓度的有机溶剂。由于有机溶剂通常处于较低pH值,在溶解配体后需要调整pH值。 盐离子 在螯合缓冲液中,为减少蛋白质吸附和蛋白质聚集的形成,建议高盐环境,如含0.5 M NaCl的缓冲液。 温度

蛋白质的纯化方法

蛋白质的纯化方法 蛋白质在外加电场作用下,带电的蛋白质颗的纯粒在电场中移动的速度(v)取决于化电场强度E,所带的净电荷q,蛋方白质的分子量、分子形状以及与介质法的摩擦系数f。几种常用的电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦IEF 双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法电影聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋法,聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的的多孔网状凝胶。纯不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子型表面活性剂,它能够与蛋白质多肽蛋链中的氨基酸残基按大约1 比例白结合。质每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDS而带有大量的负电荷,而蛋白质纯化分子原有的电荷则可以忽略。该法主方要利用了蛋白质分子量大小不同而分法离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准,则可以估算出不同蛋白质的分子量。等电聚焦将两性电解质eg:pH3-9,pH5-7同蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋凝胶中,在电场下,两性电解质首白质先达到它的等电点而平衡,蛋白质的样品根据它自身的等电点分别向两纯化极移动,最后也达到平衡。方等电聚焦:这种按等电点的大小,生物法分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度,使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦,从而达到分离、测定和鉴定的目的。蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色连续电泳几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析柱层析离子交换层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物,将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。蛋离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质如羧甲基纤维素CM纤维素)等,阴离子交的换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯纤维素)等。化带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强,而方带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法用不同浓度的阳离子洗脱液,如NaCl溶液进行梯度洗脱,通过Na的离子交换作用,可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法蛋白质的纯化方法凝胶过滤法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯

rProtein A层析填料说明书

rProtein A Sepharose Fast Flow 原理 蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属,包含5个区域,可以用来结合IgG的Fc区域。作为一个亲和配基,蛋白质A偶联到Sepharose上,似的这些区域可以结合游离的IgG分子。一份子的蛋白质A可以至少结合两分子的IgG。尽管蛋白质A主要是与人类免疫球蛋白IgG进行结合,一些其他类型的免疫球蛋白也显示出能够结合蛋白质A。蛋白质A能够与人初乳IgA发生相互作用,同时也可以和人类的骨髓瘤IgA2发生反应,但是不能与IgA1发生反应。一些人类的单抗IgMs和一些来自正常的和巨球蛋白血症血清中的IgMs能够结合蛋白质A。 进行一个分离操作 结合缓冲液:20mM磷酸纳,pH7.0 洗脱缓冲液:100mM柠檬酸-柠檬酸钠,pH3~6 中和缓冲液:1M Tris-HCl,pH9.0 1,用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2,用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3,上样,流速为1-4ml/min(1ml的柱子),或者5ml/min(5ml的柱子)。收集流穿片段。4,用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱,直到基线,即所有未结合物质都被冲洗出柱子(紫外检测器在280nm波长检测)。 5,用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液(0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl,pH9.0每毫升馏分)中和至中性。 6,立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子。 使用注意 1,样品需要离心(10000g/20min)去除细胞和细胞碎片。离心下来的上清经过一个0.45μm 的滤膜过滤。 2,来自多数物种的IgGs和亚类,在接近生理pH值和离子强度的条件下,可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱,应该避免过度冲洗,因为这样可能会减少最终的产量。 3,对于一些抗体,比如小鼠IgG,当使用蛋白质A进行纯化时,可能需要向结合缓冲液中加入3M的氯化钠,达到最有效的结合,例如1.5M的甘氨酸和3M的氯化钠,pH为8.9。4,当易变性的抗体被分离后,使用温和的洗脱方式进行洗脱。用洗涤缓冲液反向流过求和柱,用0.1M的glycyltyrosine的2M的氯化钠溶液,pH7.0在室温状态下洗脱。 5,洗脱完成后,立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。

分离纯化蛋白质的方法及原理

(二)利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有: 1、溶液的pH; 2、离子强度; 3、介电常数; 4、温度。但在同一的特定外部条件下,不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀: 原理: 蛋白质处于等电点时,其净电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时,他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时,蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥,阻止了单个分子聚集成沉淀,因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点,利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理,可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时,这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来,那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象,能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶: 原理: 低浓度时,中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强,因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出,这就是因为透析除去了盐类离子,使蛋白质分子之间的相互吸引增加,引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时,蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱和或半饱和程度,很多蛋白质可以从水中沉淀出来,这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低,原来溶液中的大部分甚至全部的

自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子,因此被移去以溶剂化盐离子,留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露,由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象,能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳,在水中的溶解度很高,而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法: 与水互溶的有机溶剂(甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性,如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下,然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂,以防局部浓度过高,那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此控制有机溶剂浓度也可以分 离纯化蛋白质。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。介电常数的降低将增加两个相反电荷之间的吸引力。蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇与蛋白质亲水集团发生相互作用并在空间上阻碍了蛋白质与水相接近。蛋白质在聚乙二醇中的溶解度明显的依赖于聚乙二醇的分子量。 4、温度对蛋白质溶解度的影响: 在一定温度范围内,约0~40℃之间,大部分球状蛋白的溶解度随温度升高而增加,在40~50℃以上,大部分蛋白质变得不稳定并开始变性,一般在中性pH介质中即失去溶解力。大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质的分级分离操作一般都在0℃或更低的温度下进行。 (三)根据电荷不同

亲和层析柱使用说明

亲和层析柱使用说明货号 名称规格说明DS0101 亲和层析柱1ml 含1个空管柱,上下盖和2个筛板(亲水性,孔径50um) DS0103 亲和层析柱3ml DS0106 亲和层析柱6ml DS0110 亲和层析柱10ml DS0130 亲和层析柱30ml DS0150 亲和层析柱50ml 一、产品说明 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。它是利用生物分子间 存在很多特异性的相互作用(如抗原和抗体、酶 和底物或抑制剂、激素和受体等),通过将具有 亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质 上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另 一个分子进行分离纯化。 提供的亲和层析柱工具可应用于如下方面: ①纯化重组蛋白;②纯化抗原和抗体;③纯化多 肽;④纯化DNA;⑤糖蛋白的纯化;⑥纯化磷酸 化蛋白和肽;⑦DNA 结合蛋白的纯化;⑧去除内毒素,等。 亲和层析柱空柱管的材质为医疗级的聚丙烯,这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒,不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWM-PE(超高分子量聚乙烯)为原料,经独特的工艺加工而成,具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端,以阻挡昂贵的基质渗出。亲水性筛板采用了领先的亲水性UHWM-PE 生产技术,该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时,该筛板和其它同类产品相比,不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外,该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡,气泡会使流速降低,液体通过基质不均匀。

二、产品应用 1,抗体纯化 纯化抗体一般用Protein A作为纯化的配体,也可以用Protein G或Protein L或异源性抗体作为配体。 2,小分子物质提取(以提取黄曲霉毒素M1为例) 试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合,形成抗体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。 3,重组蛋白纯化 近年来,随着生物技术,特别是基因工程技术的迅猛发展,重组蛋白表达和纯化越来越容易。常用的重组蛋白表达策略是把蛋白与亲和标签融合表达,利用亲和标签一步纯化出目标蛋白。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性,就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合,从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于,无需针对不同的蛋白质开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件,可一步亲和层析从粗提物中纯化出重组蛋白,纯度可达90%以上。 亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。亲和标签系统一般具有以下特征:(a)一步的吸附纯化;(b)对三级结构和生物活性影响小;(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质;(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确;(e)适用于大量的不同蛋白质。但是没有哪个标签是完美的,只能根据实际需要去自己筛选,下表是分的标签以及纯化的方案。

阴离子交换填料使用说明

阴离子交换填料使用说明 凝胶型号QAE葡聚糖凝胶A-25DEAE葡聚糖凝胶A-25DEAE葡聚糖凝胶A-50基团-N+(CH2CH3)3Cl--N(CH2CH3)2-N(CH2CH3)2 载量 2.6-3.2mmol/g3-4mmol/g3-4mmol/g 相应产品QAE Sephadex-A25DEAE Sephadex A-25DEAE Sephadex A-50颗粒大小(μm)干粉40-120干粉40-120干粉40-120 应用离子交换层析介质,纯化 蛋白及巨大分子等 离子交换层析介质,纯化 蛋白及巨大分子等 离子交换层析介质,纯化 蛋白及巨大分子等 pH稳定性2-132-132-12 1使用方法 将干粉浸泡于60-70%乙醇中过夜(充分搅拌),去离子水洗净乙醇。取适量凝胶湿态装柱,绝对不能出现凝胶断层,依次分别用五倍柱体积的0.15M氢氧化钠、水、0.15M盐酸、水、0.15M氢氧化钠、水上柱至中性。然后用上样的平衡液平衡柱后即可上样。 2上样量 上样的多少取决于分离的要求及漏出的控制,当作饱和吸附时可以多上样,富集时为70-80%的柱体积,需要分离不同组分时应减少上样量,上样量控制在柱体积的25%以内。柱高严格控制在25cm以内(A-50),因为这是软胶。 3洗脱方法: 上样后用平衡液淋洗三个柱体积,然后在平衡液中加入一定浓度的氯化钠(或其它无机盐)进行洗脱(改变平衡液PH值也是洗脱的方法)。 4在位清洗(CIP) 凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以0.15M氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。 请避免使用磷酸,醋酸缓冲液.而可以采用Tris-HCl作为使用Buffer。 5保存 第1页,共2页

Blue层析柱说明书

Blue预装柱(FF) Blue Sepharose 6 Fast Flow 原理 Cibacron TM Blue F3G-A是一种合成的多环染料,其作用类似于芳香族的阴离子配基,通过静电力和/或疏水性相互作用结合白蛋白。相似的互相作用也发生在凝血因子,脂蛋白和干扰素上。促皮质素Blue F3G-A连接到Sepharose上制备成Blue Sepharose亲和介质。 *图为Blue Sepharose 6 Fast Flow部分结构 分离操作 结合缓冲液:50mM KH2PO4, pH 7.0或者20mM 磷酸钠, pH7.0 洗脱缓冲液:50mM KH2PO4, 1.5M KCl, pH 7.0或者20mM 磷酸钠,2M NaCl, pH7.0 1,用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 2,上样。 3,用10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱,直到基线,即所有未结合物质都被冲洗出柱子。紫外吸光A280nm处监测。 4,用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。使用连续的或者阶梯式的梯度洗脱,洗脱缓冲液的浓度从0%-100%。 净化 1,用5倍柱体积冲洗,使用高pH(0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.5)溶液冲洗,然后再使用低pH(0.1M 醋酸钠,0.5M NaCl,pH4.5)冲洗。重复4~5次,立即再用结合缓冲液再平衡。2,用4倍柱体积的0.1M NaOH溶液在较低的流速下去除沉淀的蛋白质,接下来用3~4倍柱体积的70%的乙醇或者2M的硫氰酸钾冲洗。也可以选择用2倍柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子。立即用结合缓冲液在此平衡柱子。 3,通过用3~4倍柱体积的70%的乙醇或者30%异丙醇冲洗柱子,去除结合很强的疏水性蛋白质,脂蛋白和脂质等物质。另外可以选择用2倍柱体积的碱性或者酸性去污剂溶液,例如0.1%的非离子去污剂在1M乙酸溶液中,以较低的流速流过柱子,接下来用5倍柱体积的70%的乙醇除去残留的去污剂。立即用结合缓冲液在此平衡柱子。

浅述蛋白质分离纯化的新技术(综述模板)

浅述蛋白质分离纯化的新技术 摘要:本文主要介绍了浊点萃取法、置换色谱法、亲和层析法、亲和色谱法、凝胶电泳、双水相萃取等蛋白质的最新分离纯化技术,综和近年来国内外的一些研究结果,结合实际应用的例子,分析了各种分离纯化方法的优点,同时指出其不足之处。文章最后展望了蛋白质分离纯化技术的发展趋势。 关键词:分离纯化蛋白质进展 生物技术的发展非常迅速,基因工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术,已经能设计、制造、生产人们急需的多种蛋白质。和其它生物产品的生产过程一样蛋白质的生产过程一般也分为上、中、下游过程。上、中游过程是运用生物技术生产目标产物,下游过程是指对含有目标产物的物料进行处理、分离、纯化、加工目标产物。本文主要综和近年来国内外的研究结果,介绍了蛋白质的最新分离纯化技术。 2. 蛋白质的分离纯化方法: 2.1 浊点萃取法(CPE): 2.1.1 概念及原理: 浊点萃取法(cloud point extraction,CPE)〔1〕是近年来出现的一种新兴的液—液萃取技术,它不使用挥发性有机溶剂,不影响环境。它以中性表面

活性剂胶束水溶液的溶解性和浊点现象为基础,改变实验参数引发相分离,将疏水性物质与亲水性物质分离。目前该法已成功地应用于金属螯合物、生物大分子的分离与纯化及环境样品的前处理中[2-5]。 CPE 法除了利用增溶作用外,还利用了表面活性剂另一个重要性质——浊点现象。溶液静置一段时间(或离心)后会形成两个透明的液相:一为表面活性剂相(约占总体积的5%);另一为水相(胶束浓度等于CMC)。外界条件(如温度)向相反方向变化,两相便消失,再次成为均一溶液。溶解在溶液中的疏水性物质如膜蛋白,与表面活性剂的疏水基团结合,被萃取进表面活性剂相,亲水性物质留在水相,这种利用浊点现象使样品中疏水性物质与亲水性物质分离的萃取方法就是浊点萃取。图1显示了由温度变化引发的这种相分离现象。温度的改变,引起水化层的破坏,增强了表面活性剂的疏水性。 2.1.2 蛋白质分离纯化中的应用: CPE 法可用于分离膜蛋白、酶、动物、植物和细菌的受体,还可以替代一些分离方法如硫酸铵分级法作为纯化蛋白的第一步,与色谱方法联用。另外,CPE 法分离纯化蛋白质已经可以实现大规模操作。Minuth等人成功地进行了胆固醇氧化酶浊点萃取的中试研究。虽然使用离心分离器可以使CPE大规模连续进行,但商品离心分离器用于CPE 的效率和容量仍需进一步研究。而且,他们发现相分离操作受细胞培养时产生的表面活性物质

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