doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2009．02．025综述蛋白质磷酸化修饰的研究进展
姜铮，王芳，何湘，刘大伟，陈宣男，赵红庆，黄留玉，袁静
中国人民解放军疾病预防控制研究所，北京100071
［摘要］蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，它参与和调控生物体内的许多生命活动。通过蛋白质的磷酸化与去磷酸化，调控信号转导、基因表达、细胞周期等诸多细胞过程。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。我们介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备、磷酸化蛋白的鉴定及磷酸化位点的预测、蛋白分离后磷酸化蛋白的检测，及蛋白质磷酸化的分子机制，并综述了近年来国内外的主要相关研究进展。
［关键词］磷酸化修饰；磷酸化蛋白鉴定；磷酸化位点检测
［中图分类号］Q52［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2009)02－0233－05
Progress on Protein／Peptide Phosphorylation
JIANG Zheng,WANG Fang,HE Xiang,LIU Da－Wei,
CHEN Xuan－Nan,ZHAO Hong－Qing,HUANG Liu－Yu,YUAN Jing
Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,100071Beijing,China
［Abstract］Phosphorylation is one of the most important post－translational modifications of proteins,which is related to many activities of life．By reversible protein phosphorylation eukaryotes control many cellular processes including signal transduction,gene expression,and the cell cycle etc．As the development and application of the proteomics,the studies of the protein phosphorylation have become more important．This article has introduced the main types and functions of the protein phosphorylation,the enrichment and preparation of phosphoproteins and phosphopeptides,the identification of the phosphopeptides,the determination and prediction of the specific－phosphorylation－site,the phosphorelated modifications of the proteins,and the progress on studies above as well．
［Key words］phosphorelated modifications;identification of the phosphopeptides;determination of the specific－phosphory-lation－site
几乎所有的蛋白质在合成过程中或合成后都要经过某些形式的翻译后修饰，一些不合适的修饰常常与疾病相关，某些特定的翻译后修饰还被作为疾病的生物标志或治疗的靶标。
磷酸化是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式[1－2]，由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，发生酯化作用，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力，在许多生物学过程，如信号传导、基因表达、细胞分裂等的调控中起着重要作用，异常的蛋白质磷酸化通常与癌症有关。在真核生物中，磷酸化主要发生于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等残基；而在细菌中，蛋白质主要通过天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸等残基被磷酸化；有些蛋白质在原核生物和真核生物中均可被磷酸化，它们的磷酸化位点通常是精氨酸、赖氨酸和半胱氨酸残基。编码蛋白激酶和磷酸酶的基因约占真核生物基因组的2％～4％（酵母基因组中约有120个激酶基因和40个磷酸酶基因，人类基因组中约有500个激酶基因和100个磷酸酶基因）。人类蛋白质组中含有10万多个潜在的磷酸化位点，大多数磷酸化蛋白含有一个以上的磷酸化位点，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，在胞内活性调控中发挥着重要的作用。此外，磷酸化蛋白质是各种磷酸化形式的复合物，而且是动态变化的，所以对磷酸化蛋白质组的定量研究也非常重要。随着磷酸化蛋白质富集手段的发展及用于分析磷酸肽的质谱技术的提高，对磷酸化蛋白质的分析进展迅速。
对磷酸化蛋白质组（细胞内所有磷酸化蛋白质的统称）所涉及的磷酸化蛋白种类、磷酸化位点，以及不同条件下各种磷酸化形式的丰度组成的系统研究是目前的热点。
1蛋白质磷酸化的主要类型与功能
根据磷酸氨基酸残基的不同，可将磷酸化蛋白质分为4类，即O－磷酸盐、N－磷酸盐、酰基磷酸盐和S－磷酸盐。O－磷酸盐是通过羟基氨基酸的磷酸化形成的，如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸、羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化；N－磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸
［收稿日期］2008－08－30
［基金项目］国家高技术研究发展计划（2007AA02Z118）；
国家自然科学基金（30771809）
［作者简介］姜铮（1980－），男，硕士研究生
［通信作者］袁静，（E－mail）yuanjing6216＠sohu．com
的磷酸化形成的；而S－磷酸盐则通过半胱氨酸磷酸化形成。
蛋白质磷酸化具有以下功能：①磷酸化参与酶作用机制，在此过程磷酸化为反应中间产物（多为S－或N－磷酸盐），如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统（PTR）中的组氨酸蛋白激酶（HPr）；②磷酸化介导蛋白活性，蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化，如蛋白激酶A（丝氨酸和苏氨酸残基）或不同的受体酪氨酸激酶（酪氨酸残基）；③天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。
2磷酸化蛋白质分析样品的富集及制备
通常在检测和鉴定磷酸化蛋白、定位磷酸化修饰位点，并定量分析不同条件下的磷酸化情况时，由于很多样品是磷酸化和非磷酸化蛋白质的混合物，磷酸化肽段丰度很低，在质谱鉴定时易被其他肽段掩盖，所以常常需要对磷酸化蛋白质或肽段富集后再进行鉴定。
富集磷酸化蛋白质、肽段的经典方法有金属离子亲和层析（IMAC）[3]、生物素亲和素富集[4]、免疫沉淀[5]和磷酸化抗体亲和层析[6]等。利用抗体与磷酸化蛋白特异结合是最简单的富集方法，高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白。酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体是已知较好的检测抗体，可通过免疫共沉淀分离纯化酪氨酸磷酸化的蛋白质[7]。Tilley等[8]利用磷酸化酪氨酸抗体对小麦的高分子量谷蛋白进行了Western印迹分析，发现了酪氨酸磷酸化的高分子量谷蛋白亚基。Pandey等[5]利用特异性抗磷酸化酪氨酸抗体研究表皮生长因子（EGF）的信号途径，发现该途径正是靠酪氨酸的磷酸化调节的。EGF受体的寡聚体在EGF刺激下，通过其他亚单位的酪氨酸激酶的活性（自体磷酸化）诱导了一个潜在的激酶的活性，使寡聚体受体亚单位磷酸化。SRC同源体2结构域（SH2）或磷酸化酪氨酸相互作用结构域（PID）的蛋白被受体激活，特异性结合磷酸化酪氨酸的残基，并被磷酸化。他们进一步采用2种抗体的混合物分别免疫沉淀HeLa细胞中受EGF刺激和未受EGF刺激的含有磷酸化酪氨酸的蛋白，鉴定到9个酪氨酸磷酸化的蛋白对EGF有特异性应答，其中7个是已知的EGF途径中的蛋白，另外2个蛋白VAV2和STAM2是未知的。2002年，磷酸化酪氨酸特异的片段离子扫描技术被用于研究EGF途径，鉴定到10个组分，新发现了位于蛋白SHIP－2、Hrs、Cbl、STAM和STAM2的5个磷酸化位点[9]。此外，其他磷酸化残基如丝氨酸和苏氨酸的抗体也有相应的商品。Gronborg等[10]用6种不同的检测丝氨酸和苏氨酸磷酸化蛋白质的抗体对细胞总蛋白质进行免疫沉淀，其中3种抗体可对丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质进行免疫沉淀，共鉴定出7个与丝氨酸和苏氨酸发生磷酸化的蛋白质。直接作用于磷酸化丝氨酸或磷酸化苏氨酸的抗体也能用于Western印迹分析，但由于在免疫共沉淀时抗体特异性不高，因而未得到广泛应用。
另一种磷酸肽的富集方法是金属离子亲和层析法[3]。磷酸基团与固相化的金属离子有高亲和力，可被选择性地吸附在上面，富集微量磷酸肽样品[11－12]，可以进行IMAC纯化的磷酸肽的离线分析与在线的电喷雾质谱分析。由于IMAC柱会与其他带负电的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸等相结合，层析之前应对蛋白样品中所有的羧酸基团进行甲酯化修饰。
亲和纯化磷酸肽时需要的起始材料较多，常采用2种方法进行。第一种方法是在强碱性环境中加入硫基乙醇，替换丝氨酸和苏氨酸残基上的磷酸基团，使巯基暴露并与生物素亲和标签相结合，然后通过链霉素包被的磁珠将磷酸化蛋白或磷酸肽从复合体中分离出来。胱氨酸和甲硫氨酸也可以这种方法进行衍生，在反应之前须用蚁酸处理将其氧化。巯基乙醇处理时最大的缺点是它不能与磷酸化的酪氨酸反应，而且O－糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基也会被这种方法衍生，因此需要进一步的实验来确认蛋白是否真的被磷酸化。第二种方法是通过碳二酰乙胺浓缩反应将胱胺加到磷酸基团上，再通过碘乙酰磁珠对磷酸化蛋白或磷酸肽进行亲和分离。
在以上这些基于层析技术的方法中，层析柱填料的性质是影响富集效果的关键因素。2004年，Pinkse等[13]利用TiO2填料自制层析柱，将自磷酸化蛋白PKG酶切产物分离后进行在线ESI－MS／MS分析，鉴定出PKG至少有8个磷酸化位点，并发现了Ser26和Ser44等2个新的磷酸化位点。他们认为TiO2填料可与磷酸化肽段高效、特异地结合，可以有效富集磷酸化肽段。Larsen等[14]比较了反相树脂与石墨填料柱对磷酸化肽段的分离效果，认为后者可有效滞留磷酸化肽段，更适合磷酸化肽段的富集、分离和鉴定。Steven等[15]发现在pH2．7左右大部分胰蛋白酶酶切肽段带有2个正电荷,而肽段上有一个磷酸化修饰时则带有1个正电荷，可利用强阳离子交换色谱将其富集，并在HeLa细胞核中鉴定出967个蛋白中的2002个磷酸化位点，得到了迄今最大的磷酸化蛋白谱。
3蛋白分离后磷酸化蛋白的检测
可以通过对磷酸化蛋白的选择性染色或标记检测胶中、膜上及层析柱洗脱组分中的磷酸化蛋白质组。胶／膜的染色灵敏度较低，只能检测丰度很高的磷酸化蛋白，但有助于鉴定不同的磷酸化修饰形式（这些不同修饰形式的磷酸化蛋白在凝胶中的迁移形式会略有差别，如形成链状的点等），还可用于检测不同样品之间某些蛋白质是否发生了磷酸化，以及磷酸化程度明显不同的蛋白。
用32P选择性标记磷酸化蛋白是一种经典的技术，可以通过纯化激酶及［γ－32P］进行体外标记，或利用［γ－32P］－ATP或32PO43－（正磷酸盐）平衡胞内的ATP水平进行体内标记，然后通过SDS－PAGE、2D－GE或薄层层析对蛋白质进行分离，再经放射自显影或光学成像检测标记的磷酸化蛋白，单个蛋白点可以从胶上或膜上剪切出来，也可以从色谱柱中洗脱时收集放射性标记的蛋白质组分。体外检测到的磷酸化蛋白是否具有生物学意义，必须对它在体内的磷酸化情况进行验证，因为在体外情况下激酶可能会与许多在生理条件下因处于不同的细胞或亚细胞结构而根本无法接触到的蛋白质发生作用，从而得出假阳性结论；蛋白质被［γ－32P］－ATP放射性标记，通常在消化后通过凝胶电泳或薄层层析分离，可以鉴定磷酸化酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸。而体内磷酸化标记研究也取决于机体本身磷酸化的效率及靶蛋白磷酸化与非磷酸化形态之间的平衡关系。如果某一蛋白已经被磷酸基团所饱和，那么不论激酶的活性如何也不会有放射性标记的磷酸基团插入，因此也检测不到磷酸化蛋白；对于经体内32PO43－标记的蛋白质，需要通过双向电泳进行高分辨率的分离。如果蛋白或磷酸化的氨基酸残基可以通过荧光试剂衍生，那么就可以通
过HPLC结合紫外检测鉴定和定量磷酸化残基。Lees－Miller等[16]利用放射性32P对人体内的2种热激蛋白进行了标记，最终鉴定出保守的丝氨酸磷酸化位点。de Carvalho等[17]在昆虫细胞表达了人单核细胞中的细胞质磷脂酶A2，并采用放射性32P标记法鉴定出磷酸化蛋白及其磷酸化位点。
同位素编码亲和标签（ICAT）[18]作为蛋白水平定量的质量标签，已被进一步扩展用于蛋白质磷酸化研究。目前，应用磷酸同位素标记亲和标签（PhIAT）已建立了2种从复杂混合物中专一分离磷酸化蛋白／肽的方法。Goshe等[19]将肽或蛋白混合物置于碱性硫代二乙醇溶液中，通过β－消除从磷酸化丝氨酸或苏氨酸中去掉H3PO4，形成的双键受到硫代二乙醇的作用，巯基取代磷酸根，生物素与巯基相连，这样标记过的蛋白肽即可用色谱分离。Zhou等[20]用另外一种方法修饰磷酸化肽，用碳二亚胺浓缩反应将半胱氨酸加在磷酸盐部分，修饰过的肽段以共价键与碘乙酰胺树脂结合，酸洗涤释放。此方法既可用于标记富集磷酸化酪氨酸，也可用于标记富集磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸。
从20世纪80年代起，人们开始研究蛋白质磷酸化的非放射性分析方法。Meyer等[21]用ABI470气相蛋白质顺序仪固相法非放射分析磷酸化酪氨酸，并采用毛细管电泳鉴定从顺序仪上收集得到的流出液中的磷酸化酪氨酸PTH衍生物。车发云等[22]进一步建立了运用毛细管电泳分析非放射性标记蛋白质或多肽中的各种O－磷酸化氨基酸的方法，在低（pmol）范围同时分析所有3种PTH－磷酸化氨基酸，进而分析蛋白质或多肽中磷酸化氨基酸残基，用3个模型对磷酸化肽及天然的磷酸化蛋白β－酪蛋白和卵黄高磷蛋白的磷酸化位点进行了分析，还以七肽（LR-RASLG，肯普肽，Kemptide）为蛋白激酶A的底物模型[23]，研究硫代磷酸化和荧光标记反应条件及标记产物的性质，用荧光标记分析蛋白质磷酸化和蛋白激酶的专一性。杨琴等[24]利用免疫荧光标记技术对磷酸化组蛋白H3在乳腺癌细胞中的分布进行了研究。近年来发展了一些可以对一向或二向分离的凝胶、膜或层析组分中的所有磷酸化蛋白染色的技术。Schulenberg等[25]报道，荧光染料Pro－Q Diamond dye可对磷酸化蛋白质特异性染色。Martin等[26]利用Pro－Q Diamond dye检验芯片上的蛋白质及多肽的磷酸化水平，灵敏度可达到312～625fg，将芯片与高灵敏度检出方法结合提供了一个强有力的研究信号通路及磷酸酶抑制物的平台。商品化的Pro－Q Diamond染色，可以与常用的SYPRO 染色剂结合使用。此外，抗磷酸化酪氨酸抗体的Western印迹检测及荧光素对磷酸基团进行化学修饰标记等技术，也被用于对磷酸化蛋白的检测中，尽管抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸的抗体在用于免疫共沉淀时亲和度不足，但通过免疫杂交分析检测固定于膜上的相应磷酸化蛋白还是绰绰有余的。Seisuke等[27]利用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白后，用荧光双向差异凝胶电泳（2D－DIGE）技术进行差异分析，大大提高了对磷酸化蛋白的检测力。
4磷酸化蛋白的鉴定及其磷酸化位点的预测
4．1埃德曼降解与质谱
在20世纪90年代，磷酸化位点分析的标准途径是用32P标记纯化的磷酸化蛋白，通过一向的薄层电泳和二维的薄层层析（被称为二维肽谱）对所得到的肽段进行分离，放射自显影检测磷酸化肽段，进行埃德曼降解测序；或使用荧光标记磷酸肽，然后通过磷酸化残基特定的滞留时间、荧光标记或放射性标记的氨基酸的释放最终定位磷酸化位点释放的氨基酸进行鉴定。尽管目前二维肽谱与埃德曼降解仍然用于磷酸化位点分析，但大规模应用时工作量显然太大。质谱技术用于磷酸化蛋白分析是一个革命性突破。质谱技术主要基于2个原理：一是与非磷酸基团修饰的肽段相比，单磷酸基团修饰的肽段在相对分子质量上增加了79．983；二是磷酸肽还将产生一个可用于诊断的片段离子，而非磷酸化修饰的肽则没有这种现象。在实际应用中，磷酸化蛋白的质谱分析常常会遇到很大的麻烦，因为与非磷酸化形式相比，磷酸肽所占比例很低，而且由于许多影响因素不是很清楚，等摩尔混合的肽段可能会产生不同强度的信号，有时甚至检测不到，因而所获得的肽谱是不完全的。因为磷酸肽更难离子化，而且非修饰肽段还可能抑制磷酸肽的信号，因此在应用质谱鉴定磷酸肽之前，首先应对磷酸肽进行富集，并通过HPLC初步分离肽段，这可在一定程度上提高分析的成功率。应该注意的是，磷酸基团会抑制胰酶对相邻肽键的裂解反应，使得到的肽段对蛋白质的覆盖效率很差。当质谱分析不能提供足够数据时，埃德曼降解法仍然是一个很好的补充工具。
4．2MALDI－TOF MS对完整的磷酸肽离子的分析
MALDI－TOF MS常被用于分析完整的肽谱及对蛋白质进行鉴定[3]。因此，如果是一个已知蛋白或通过肽谱匹配得到鉴定的蛋白，那么通过检测所得肽谱与理论肽谱中是否发生79．983的相对分子质量迁移就可以很简单地鉴定磷酸肽。此外，通过碱性磷酸酶处理样品，可使磷酸化的质量迁移的肽段迁回至理论预测位置，有助于确定磷酸化的肽段。如果该肽段只含有一个可能的磷酸化位点，而且含有某种激酶相应的靶位点或已对磷酸化残基的化学修饰进行过鉴定，就可能准确地鉴定出磷酸化修饰的位点。
4．3片段离子分析
在磷酸化蛋白质组学研究中，磷酸肽会产生特异的离子片段，如H2PO4－、PO3－、PO2－等，相对分子质量分别为97、79和63。因此，质谱中这些离子的出现表明样品中含有磷酸肽。此外，多肽骨架片段化技术可能使肽链序列重构，如果序列中包含磷酸化残基，则可以对其进行明确定位[29]。
电喷雾离子源在负电模式下激发带有负电的磷酸基团，进行串联质谱分析可以得到特异的磷酸化片段离子。碰撞诱导解离（CID）用于产生片段离子，所得到的片段离子再通过三联四极杆或更灵敏的四极杆－四极杆－飞行时间质谱进行分析（也可以用离子肼），从而鉴定磷酸肽[30]。片段离子分析技术可以与HPLC 相结合，既可以是单独的反相液相色谱，也可以再连接其他的分离基质进行二维分离，如强阳离子交换树脂，这是目前鉴定蛋白质修饰惟一的高通量手段，如果与IMAC磷酸肽富集程序相结合，则可以简化分析物并减轻离子抑制效应。CID谱的解释是一个复杂的过程，通过对应于一套相互重叠的肽的片段离子的鉴定从而构建出其完整序列，计算组成性离子之间的相对分子质量差别，并将该差别与标准的氨基酸相对分子质量进行比较。Ficarro等[3]用胰酶消化酵母蛋白裂解物，将肽转变成甲基酯并通过IMAC富集磷酸化肽，然后与纳升级HPLC连用，将片段离子直接进行电喷雾质谱分析，鉴定了1000多个磷酸肽，得到了216个肽段序列，并鉴定了383个磷酸化位点。
姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展235
生物技术通讯
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY Vol．20No．2Mar．,2009
用于蛋白质测序的片段离子需要通过阳离子模式制备，在测序之前须进一步纯化并用合适的阴离子缓冲体系重新溶解。采用PSI扫描技术可以很容易地检测在磷酸化酪氨酸两侧多肽骨架的切割所产生的特异的相对分子质量为216．043的NH4＋片段，尽管该法无法用于对其他磷酸化残基的分析，但可以在阳离子模式下运行，这意味着它可以与其他策略相结合来鉴定磷酸化位点[31]。
尽管ESI－MS／MS是最广泛应用的磷酸化蛋白分析方法，但一些研究者也在MALDI－TOF中使用源后衰变来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段。可应用电子捕获解离（ECD），在傅立叶变换回旋共振质谱（FT－ICR MS）中通过用亚热电子轰击离子流来获取含磷酸基的离子和磷酸肽片段，FT－ICR MS是迄今准确度最高的质谱分析，可得到1～2ppm或更好的分辨率，适于磷酸化位点的分析。ECD技术可以轻松打开二硫键，而易断的翻译后修饰的共价键却可以在ECD破碎肽链时保存下来，因而适于翻译后修饰的研究，所得到的离子谱系比CID的更容易解释，对小的蛋白来说甚至可以不通过蛋白消化便确定其磷酸化位点[32－33]。
5蛋白质磷酸化的研究趋势
蛋白质的磷酸化和去磷酸化过程调节着细胞信号转导、细胞分化和细胞生长等几乎所有的生命活动过程，因此被生动形象地描述为细胞生理活动的分子开关。蛋白质在蛋白激酶作用下发生磷酸化，在磷酸酶的作用下去磷酸化。不同的蛋白激酶可识别和修饰不同蛋白质的不同位点，扩大了磷酸化蛋白质研究的复杂性，使磷酸化蛋白质成为蛋白质翻译后修饰研究的热点。大量实验已经表明，生物生长环境的改变可诱导生物体内的蛋白质发生磷酸化，从而导致细胞内蛋白质的组成和数量发生变化，最终使生物体的生理状态发生改变。因此，当细胞中的蛋白激酶或磷酸酶的活性受到抑制或过表达时，蛋白质磷酸化过程就会紊乱，从而导致细胞周期调控异常。蛋白质磷酸化的分子机制对于癌症等重大疾病的研究具有相当的指导意义，已成为生物学研究领域中的热点。
随着蛋白质组学技术的不断发展，蛋白质组学研究已经进入定量分析及功能蛋白质组阶段，磷酸化修饰成为众多学者关注的重点。现有的磷酸化修饰研究技术只能发现或分析那些结构性磷酸化位点，而蛋白质功能的变化往往要借助于瞬时的磷酸化变化。因此，瞬时磷酸化修饰研究技术的涌现和突破将是磷酸化蛋白研究的新方向。
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表1已用各种激酶确定的磷酸化序列基序[28]
序列模体酶蛋白质（底物）Ser／Thr磷酸化
Ser-Ser-Xaa-Ser(P)
Arg-Xaa-Arg-Yaa-Zaa-Ser(P)/Thr(P)-Hyd
Ser(P)-Xaa-His
Ser(P)-Leu-Gln-Xaa-Ala
Glu-Val-Glu-Ser(P)
Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)
Ser/Thr(P)-Pro-Xaa,
Pro-Xaa-Thr(P)-Pro-Xaa
Thr(p)-leu-Pro
Arg-Xaa-Ser(P)
Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Ser(P)
Arg-Xaa-(Xaa)-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Ser/Thr
Hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Xaa-Xaa-Xaa-Hyd Ser-Xaa-Glu-Ser(P)
Ser-Xaa-Xaa-Glu-Ser(P)
Xaa-Ser(P)/Thr(P)-Pro-Xaa
Ser-Pro-Arg-Lys-Ser(P)-Pro-Arg-Lys
Ser(P)-Pro-Lys/Arg-Lys/Arg
Lys-Ser(P)-Pro 骨形态发生蛋白受体激酶
蛋白激酶B
蛋白激酶C
cGMP－依赖型激酶
c－Myb激酶
磷酸转移酶
细胞周期蛋白依赖型激酶
神经酰胺活化的蛋白激酶
cAMP－依赖型蛋白的丝氨酸激酶
糖原合成酶激酶3
自身磷酸化依赖型蛋白激酶
钙调素依赖型蛋白激酶1a
酪蛋白激酶
酪蛋白激酶Ⅱ
脯氨酸指导的蛋白激酶
组蛋白H1激酶
丝氨酸激酶
TGF－β家族调节因子Smad1蛋白
合成肽
Na，K－ATP酶
慢病毒属Vif蛋白
脊椎动物c－Myb蛋白
血清反应因子，c－Fos，Nur77及40S核糖体蛋白S6
细胞周期蛋白A或E
Raf蛋白
PⅡ蛋白（glnB基因产物）
cAMP反应元件结合蛋白
髓鞘碱性蛋白
多肽相似体
牛骨桥蛋白，
源于鲨鱼、羊、鼠、牛和人的维生素K依赖型基质Gla蛋白
牛骨桥蛋白
Tau蛋白
海胆，精子特异性组蛋白H1和H2B
鼠神经丝蛋白
Tyr磷酸化
Tyr(P)-Met-Asn-Met，Tyr(P)-Xaa-Xaa-Met Tyr(P)-Met-Xaa-Met
Asn-Pro-Xaa-Tyr(P)
Tyr(P)-Xaa-Xaa-Leu
Glu-Asp-Ala-Ile-Tyr(P)磷脂酰肌醇－3－激酶，在细胞质尾部
粘着斑激酶，在细胞质结构域内
蛋白酪氨酸激酶，在细胞质尾部
蛋白酪氨酸激酶
CD28T细胞共刺激受体
整合蛋白β3
肥大细胞功能相关抗原
合成肽
Thr和Tyr双磷酸化
Thr(P)-Xaa-Tyr(P)细胞分裂素－激活的蛋白酶激酶P38细胞分裂素－激活的蛋白激酶236
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姜铮等：蛋白质磷酸化修饰的研究进展237
摘要 磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，蛋白质磷酸化和去磷酸化为真核细胞提供了调节机制。随着高通量鉴定磷酸化蛋白质技术的发展，尤其是质谱技术在蛋白质组学中的应用，磷酸化修饰数据不断积累，从现有数据中挖掘规律从而对未知蛋白质进行磷酸化修饰位点预测的条件日益成熟。将计算方法引入磷酸化蛋白质组学的研究中，将有利于发现新的磷酸化修饰规律并为生物学实验提供验证信息，从而推动磷酸化蛋白质组学的发展。 计算智能领域的方法可以很好地应用于位点预测问题。但对于生物信息学来说，除了给出较为准确的预测结果外，还需要给出对判断结果易于理解的解释才能够增加预测方法的可信度。规则抽取不但可以提供合理的解释来指导生物学实验，而且可以从现有数据中发现新的具有生物学意义的磷酸化修饰规律为磷酸化蛋白质的进一步研究提供有价值的参考信息。 本文深入分析了磷酸化修饰位点数据的特点，采用支持向量机分类方法试验和比较了多种特征构造提取、特征选择和分类方法的有效性；提出用AdaBoost 方法对筛选后的氨基酸性质和邻近序列位置进行特征选择并进行分类器训练，形成了新的磷酸化位点预测算法AproPhos，该算法在特异性高于已有预测算法（约2个百分点）的基础上，大大提高了预测的灵敏度（约10个百分点）。同时设计了一种新的基于AdaBoost方法的规则抽取方法，可以给出可理解的修饰位点邻近序列上氨基酸性质分布规律，并对分类结果进行解释。AproPhos及其规则抽取算法扩展了磷酸化位点预测方法在实际中的应用范围，既可以用于提供充分信息的位点预测，又可以用来提高磷酸化蛋白质质谱鉴定效率。 最后本文提出了一种利用串联质谱同位素信息进行分子式预测的算法和系统FFP(Fragment ion Formula Prediction)，无论从计算效率上还是预测精度上较以前的方法都有了很大的提高。使分子式预测可以广泛用于质谱的预处理和蛋白质（包括磷酸化蛋白质）的鉴定，提高鉴定效率。 关键词：磷酸化，位点预测，规则抽取，SVM，AdaBoost
论述蛋白质磷酸化与去磷酸化在细胞信号系统传导中的作用及研究进展 病毒所梁晓声200628012415030 细胞信号传导过程中磷酸酶/磷酸激酶对蛋白磷酸化程度的调控控制了细胞信号传递与否，信号强度等等细胞信号传导的过程从某种程度上说就是信号传导相关分子磷酸化水平的调节过程。 磷酸酶/磷酸激酶作为胞内信号直接或间接的靶酶通过磷酸化程度控制其它酶类或蛋白质的活性，一般情况下被磷酸化的酶有活性，脱磷酸后的酶没有活性。通过这种方式可以在不改变细胞内酶或相关蛋白的浓度的情况下将部分酶活冻结或解冻。在有外界信号刺激的时候可以迅速解冻酶活而不必合成新的酶。 由于酶反应具有高度专一性，使得蛋白质磷酸化与去磷酸化这种方式在胞内介导胞外信号时具有专一应答的特点。这就使得细胞信号传导途径的上游成分只能针对一个或几个的下游成分起作用,使信号传递具有很强的专一性。同时对信号的灭活也不会由于识别的错误而影响其他信号传导途径。 磷酸化与去磷酸化在细胞对外界信号的持续反应中具有重要的作用。信号引起的细胞生理学效应中，有许多是相当持久的，如细胞的分裂、分化等。虽然胞内信号分子的寿命可以很短，但蛋白激酶一旦激活，其活性却可以通过某些方式（如自身磷酸化）维持较长时间；更重要的是被它磷酸化所调节的蛋白质和酶类，其效应可以维持更长时间，直到被蛋白磷酸酶脱磷酸化为止。 蛋白磷酸化对外界信号具有放大作用，由于是酶促反应，一个酶分子可以催化成百上千个底物分子，即使只有很弱的胞外信号也可以通过酶促反应得到充分的放大。 蛋白质激酶 蛋白质激酶是一类磷酸转移酶，其作用是将ATP的磷酸基转移到它们的底物上特定氨基酸残基上去。依据这些氨基酸残基的特异性，将这些激酶分为4类。其中主要的两类是蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶(STK),和蛋白质酪氨酸激酶(PTK)。这两类酶的蛋白质激酶结构域的大小约为250-300个氨基酸残基。二者的催化域在进化上是密切相关的，并认为它们有共同的祖先。因此，它们的催化域的氨基酸残基序列在很大程度上也是一致的。更重要的是，这些序列表现为一组组高度保守的，甚至是完全保守的氨基酸模体，这些模体却嵌埋在氨基酸残基序列保守性很差的区域之内。一共有11种这类高度保守的短氨基酸残基序列模体。它们都以罗马数字命名，从最N-端的I开始,到最C-端的XI。对这些酶的结晶进行X-射线结构分析，发现这些模体对这些蛋白质激酶催化结构域的磷酸转移酶活性十分重要。据以为，亚域I,II和VII在结合ATP中起重要作用；而亚域VIII则在识别肽底物中起主要作用。对酪氨酸激酶家族来说，在亚域VIII中，紧靠关键模体上游的氨基酸残基有十分有趣的差异，它们是-KWTAPE- 或-KWMAPE-，看来这些序列造成了激酶家族的这个分支的底物专一性。 蛋白磷酸酯酶 丝氨酸／苏氨酸蛋白磷酸酯酶，选择性地作用于含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基的肽链，使之脱去磷酸基团并改变生物活性。主要成员：PPl，PP2A，PP2B，PP2C等。 酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)分胞质型(非受体型)和受体型(PTPR)
TiO2法磷酸化富集 试验：pH值对TiO2富集磷酸化蛋白的影响 共5个样品，各400ug蛋白（酶解之前），每个样品用1mg TiO2，共用5mg。流程： 1.TiO2 Beads 活化 ①向10mg TiO2 Beads中加入1000 ul Elute buffer 2，震荡20min，8200×g，2min，离心，弃上清； ②更换wash buffer 1 1000ul，第一遍摇晃两次，弃上清；第二遍，震荡20min，弃上清； ③更换Loading buffer 1000ul，2遍震荡30min，最后TiO2 Beads保存在Loading buffer中。 2.酶解后的肽段溶液中加入TFA酸化，使TFA终浓度为0.1%—0.5%，离心浓缩抽干，之后重新用Loading buffer溶解（体积控制在400ul左右）。 3.每400ug蛋白用1mg TiO2 Beads 富集，将1mg TiO2 加入到一个样品中，室温旋转30min，转速1100转/分。 4.将孵育好的肽段溶液加入脱盐柱中，8200×g，2min，收集为Flow Through。 5.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 1，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 6.再向脱盐柱中加入200ul wash buffer 2，8200×g，2min，，重复3次，收集600ul。 4、5、6合并到一起，为Flow Through。 7.再向脱盐柱中加入200ul Elute buffer 1，8200×g，2min，，重复2次，收集400ul，为elute1；再加入200ul Elute buffer 2，8200×g，2min，收集200ul，为elute 2；合并elute 1和elute 2，总共600ul磷酸化多肽。
蛋白质磷酸化概述 蛋白质磷酸化是敏感而可逆地调节蛋白质功能的一种最常见和最重要的机制，是调节细胞增值的基础。很多多肽生长因子(血小板来源的生长因子和表皮生长因子)和细胞因子(白细胞介素-2、集落刺激因子-2和γ-干扰素)在与其受体结合后均激发磷酸化作用，而这些被诱导的磷酸化反过来激活细胞质内的蛋白激酶如raf、MEK和MAP。此外，在所以有核生物中，细胞周期中G1/S期和G2/M期的转换均受依赖细胞周期蛋白的蛋白激酶(CDK)的调节。磷酸化作用也控制着分化和发育，如果蝇视网膜的R7细胞和秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的阴门发育受控于受体蛋白激酶和胞内蛋白激酶。最后，新陈代谢受磷酸化作用的调节控制，尤其是葡萄糖和糖元的相互转换及葡萄糖的转运的代谢作用。因而，形形色色的生物学家为了弄清楚他们最感兴趣的基因及其编码产物的调控和功能，他们常常不约而同，有时还是不由自主地必须蛋白质地磷酸化。 研究蛋白质磷酸化最常用地方法是利用32P标记的无机磷酸盐（32Pi）进行生物合成标记。这种方法非常简单，而只将标记物中加入到培养基中。在节中描述了用32Pi进行生物成标记的一般方法。该方法能达到最大限度的提高掺入效率和降低放射性对工作人员的伤害及对设备的污染。 大多数蛋白质是在丝氨酸和苏氨酸残基上磷酸化，而许多与信号传导有关的蛋白质还在酪氨酸位置上被磷酸化。这三种羟基磷酸氨基酸在
酸性PH条件下化学性质稳定，酸水解后它们可被回收并被直接鉴定出来。在节中介绍了通过酸水解和双向薄层电泳鉴定磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的技术。蛋白质也可在组氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸位置上与磷酸共价键合，它们可以是以磷酸－酶的中间体或稳定修饰物的形式存在，这些磷酸氨基酸在酸性条件下不稳定，不能用对酸稳定磷酸氨基酸的标准技术来研究，它们只能通过排除法或演绎法来鉴定。研究这些酸不稳定的氨基酸已超出本书的范围，读者可以参考《酶学方法》（Methods in Enzymolcgy）第200卷有关鉴定这些新磷酸氨基酸的技术。 磷酸酪氨酸不是含量丰富的磷酸氨基酸，因而一般很难在用32Pi标记的样品中检出，尤其是当样品中含有大量在丝氨酸残基上磷酸化的蛋白质或有RNA污染时则更难。凝胶电泳分级后的样品以碱处理，使RNA水解并使磷酸丝氨酸脱磷酸，可以大大提高磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸的检出率，在节中描述一种碱处理的简单方法。 如果蛋白质被磷酸化，无需借助生物合成标记方法也可鉴定磷酸氨基酸。例如，蛋白质中所含的稀有的磷酸酪氨酸可用抗磷酸酪氨酸的抗体来检测，其特异性和敏感性相当高。更普遍的是，蛋白质的磷酸化常常使蛋白质在SDS－聚丙烯酰氨凝胶电泳中的迁移率发生变化，而且几乎总是改变它的等电点。将蛋白质和磷酸酶共同温育后，从凝胶迁移率的变动可以推论出非标记蛋白质存在磷酸化残基。这种方法在内源性ATP以[γ-32P]ATP进行标记的效率很差时很实用，如目的蛋白是来源于某些难以进行生物合成标记的组织或来源于体外翻译的情
浅谈蛋白质磷酸化 摘要：蛋白质翻译后修饰几乎在所有的蛋白质上都会发生，被修饰后的蛋白质功能将会发生显著的变化。而蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式，在蛋白质翻译后修饰研究中有着重要地位，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组学技术的发展和应用，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文主要介绍了蛋白质磷酸化的主要知识，主要类型与功能，以及研究蛋白质磷酸化的主要目的，最后简单了提到了预测蛋白质磷酸化位点的方法。 关键词：蛋白质修饰；蛋白质磷酸化；磷酸化位点预测 随着基因组计划基本完成，生命科学研究已进入后基因时代，主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。蛋白质组研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑，也是生命科学研究的核心内容。传统的蛋白质研究注重研究单一蛋白质，而蛋白质组学注重研究参与特定生理或病理状态的所有的蛋白质种类及其与周围环境（分子）的关系。它的研究内容包括：（1）蛋白质鉴定；（2）蛋白质翻译后修饰的研究；（3）蛋白质结构研究；（4）蛋白质细胞内定位及功能确定；（5）发现药物靶分子及制药等。 早期蛋白质组学的研究范围主要是指蛋白质的表达模式，随着学科的发展，蛋白质组学的研究范围也在不断完善和扩充。蛋白质翻译后修饰研究已成为蛋白质组研究中的重要部分和巨大挑战。所谓蛋白质翻译后修饰指的是蛋白质折叠过程中和折叠过程后再多肽链上发生的共价反应，使蛋白质质量发生改变并且赋予蛋白质各种功能。 一、蛋白质磷酸化的概述 蛋白质的磷酸化反应是指通过酶促反应把磷酸基团从一个化合物转移到另一个化合物上的过程,是生物体内存在的一种普遍的调节方式，在细胞信号的传递过程中占有极其重要的地位。已经发现在人体内有多达2000个左右的蛋白质激酶和1000个左右的蛋白质磷酸酶基因。蛋白质的磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上γ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白质磷酸酶催化的，称为蛋白质脱磷酸化。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。其磷酸化和去磷酸化这一可逆过程,受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制.酶蛋白的磷
蛋白磷酸酶PHLPP与PI3K／Akt信号通路的研究进展 近年来有关肿瘤形成机制的研究发现，多数肿瘤细胞中促细胞生存基因Akt的活性升高，并且证实Akt激酶活性的平衡对细胞生长与凋亡具有重要的调节作用。如何抑制Akt活性随之成为抑制肿瘤生长研究的热点。2005年新发现的一种天然抗癌基因——PHLPP(PH domain Leucine-rich repeat Protein Phosphatase)能特异性地使Akt C末端的疏水基团去磷酸化，降低Akt的活性和表达水平，从而抑制肿瘤的生长。这为抗肿瘤药物的研制提供了新的方向，PHLPP 的研究也日益受到重视。现将PHLPP与PI3K/Akt信号通路的研究进展综述如下。 Akt/蛋白激酶B（PKB）即丝/羟丁氨酸蛋白激酶，作为磷脂酰肌醇激酶-3（PI3K）的一个靶分子被发现至今已有十余年[1]。Akt基因所表达的蛋白激酶，可被PI3K磷酸化激活。生理状态下，PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一，通过影响下游多种效应分子的活化状态，在细胞内发挥着抑制凋亡、促进增殖的关键作用。但是，如Akt基因表达异常增高时，则导致细胞生长与凋亡失衡，不仅可使正常细胞生长分裂加速，并且可抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤生成，与人类多种肿瘤的发生、发展密切相关。研究表明，该信号通路在人类大多数恶性肿瘤中都出现异常，在肿瘤的增殖、存活和抵抗凋亡、血管发生以及细 胞运动中发挥了重要作用。 2005年由美国加州大学圣地亚哥分校医学院药理学系的科研人员在人体中发现的PHLPP基因位于人体18号和16号染色体上，它所编码的PHLPP蛋白为蛋白磷酸酶，其生理作用是特异性地将磷酸化激活的Akt脱磷酸化而失去蛋白激酶活性，从而抑制Akt的促细胞生长作用。而且，PHLPP在人体各组织器官及细胞中均有广泛表达。通过对人体多种肿瘤细胞进行分子和生化分析，发现某些肿瘤（如结肠癌）细胞中PHLPP水平显著降低，而Akt的磷酸化水平明显升高。提示，PHLPP可能参与肿瘤生长的负性调节。因此，PHLPP作为肿瘤抑制因子 将可能用于所有与Akt水平升高的有关癌症的治疗。 1 PI3K/Akt信号转导通路的组成及其功能 1.1 PI3K的结构和功能由Whitman M等首先发现的磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）是参与细胞内信号转导的信号分子之一。根据其作用底物的不同，PI3K一般被分为Ⅰ型（ⅠA型，ⅠB型)、Ⅱ型、Ⅲ型3个亚型[2]。Ⅰ型PI3K在细胞内主要磷酸化PI-4，5-P2，此酶的产物主要是磷脂
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来[60, 61]。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集[62] 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，从而鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/ 苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较少。 图片来源：https://www.doczj.com/doc/5013744257.html,/wiki/Phosphoproteomics
肌球蛋白磷酸化的研究进展 摘要：肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，由多条重链与多条轻链组成，被视为一种分子马达。在肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等生理过程中起重要作用。目前肌球蛋白磷酸化是研究的一个热点，它对细胞的迁移、收缩、胞质分裂以及其他未知功能都有着至关重要的作用。肌球蛋白磷酸化分为重链的嶙酸化与轻链的磷酸化。根据国内外的最新相关研究报道，分别从肌球蛋白的结构与功能、磷酸化的作用机制、磷酸化的生物学功能以及最新研究成果等方面，对肌球蛋白的嶙酸化研究进展进行阐述。关键词：肌球蛋白；β-抑制蛋白；肌球蛋白重链磷酸化；肌球蛋白轻链磷酸化中图分类号：Q71文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）02-0154-06Progresses on Myosin PhosphorylationHAO Li-juan，KANG Zhi-qiong，MA Shang-shang，LU Peng，YAO Qin，CHEN Ke-ping*（Life Sciences Institute，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China）Abstract ：Myosin is the unit of myofibril raw silk，composed of multiple heavy chains and light chains，is regarded as a kind of molecular motors. It mainly works on muscle contraction，chemotaxis cytoplansmic* division，cell function，vesicular transport and signal transduction. Recently myosin phosphorylation is a hot topic，as it plays an important role in cell migration，contraction，cytokinesis and other unknown functions. Myosin phosphorylation is divided into heavy chain and light chain phosphorylation. According to the latest reports，it mainly elaborates the research progress on the phosphorylation of myosin on the structures and functions，the action mechanism of phosphorylation，the biological function of phosphorylation and the latest research results.Key words：myosin；β-Arrestin；phosphorylation of myosin heavy chain；phosphorylation of myosin light chain （LifeScienceResearch，2015，19（2）：154-159）l肌球蛋白的结构与功能肌球蛋白主要存在于平滑肌中，它是肌原纤维粗丝的组成单位。其分子形状如豆芽状，由多条重链与多条轻链组成。肌球蛋白的家族较大，目前发现的肌球蛋白有24种，但依据其来源又可分为传统的肌球蛋白和非传统的肌球蛋白，如传统的肌球蛋白为肌肉的肌球蛋白，即肌球蛋白Ⅱ，但非肌肉细胞也存在肌球蛋白Ⅱ，为非肌肉肌球蛋白Ⅱ；非传统的肌球蛋白是指肌肉中不含有的肌球蛋白，如肌球蛋白I、Ⅲ、IV、V，只存在于非肌肉细胞中；肌球蛋白VⅢ、XI和XⅡ只存在于植物当中。此外，肌球蛋白I在生物体内的作用是细胞运动，胞引作用和泡液收缩；骨骼肌肌球蛋白Ⅱ的作用是使骨骼肌肌肉收缩；肌球蛋白v主要功能是靶向小包运输和mRNA的靶向运输[1]。在生物有机界中，利用化学含故化学势能进行机械做功的生物大分子，称为分子马达。而肌球蛋白作为一种分子马达[2]，参与了肌肉收缩、趋化性胞质分裂、胞引作用、膜泡运输以及信号传导等活动[1]。目前研究得较多的是肌球蛋白Ⅱ，其最早发现于动物细胞的肌肉组织和细胞质中，形状如“Y”型，是一个六聚体的大分子蛋白质，包括两条相对分子质量约为220kD的重链、两条约17kD的必须轻链和两条约20kD的调节性轻链[3]。根报重链在细胞内所起的作用，按照结构和功能不同可划分为3个区域：1）位于重链的N末端形成-个球状的头部，含有一个肌动蛋白（actin）结合位点和ATP结合位点的催化区域，负责释放化学能；2）重链的C末端则形成一个细长的a-螺旋状的尾部，尾部结构域含有决定尾部是同膜结合还是同其他
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来. 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC 柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。 1.3 TiO2色谱 近期金属氧化物亲和富集技术得到了人们极大的关注。2004年，Pinkse等人将二氧化钛（TiO2）技术引进磷酸化蛋白质组学领域，利用TiO2与磷酸肽上磷酸基团的亲和能力实现对磷酸肽的相对富集，并建立了通过TiO2作为预分离的2D-NanoLCESI-MS/MS 技术平台。虽然该技术在对磷酸化肽段富集时的选择性和灵敏度方面都优于IMAC技术，但仍然存在非特异性吸附等问题。后来，人们又利用纳米材料比表面积大的特点，对TiO2纳米级材料进行了开发
多学科的相互渗透和研究技术手段的高速发展，生命科学在20世纪取得了巨大的进步。特别是在基因组研究方面已取得了许多的成果，包括人类基因组在内的多种生物的基因组全序列测定已陆续完成，面对庞大的遗传信息，人们开始关注这些序列信息与生命活动之间的直接或间接的联系。基因的功能是什么？它们又是如何发挥这些功能的？ 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰,它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸化定义、修饰的主要类型与功能、磷酸化蛋白质鉴定技术、检测方法并综述了近年来国内外的主要研究进展。 蛋白质磷酸化：指由蛋白质激酶催化的把ATP或GTP上的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
磷酸化蛋白质根据其磷酸氨基酸残基的不同大致可分为四类，即:O-磷酸盐、N-磷酸盐、酰基磷酸盐和S-磷酸盐。O-磷酸盐是通过羟氨基酸的磷酸化形成的,如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸,羟脯氨酸或羟赖氨酸磷酸化仍不清楚；N-磷酸盐是通过精氨酸、赖氨酸或组氨酸的磷酸化形成的；酰基磷酸盐是通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成；而S-磷酸盐通过半胱氨酸磷酸化形成。 蛋白质磷酸化具有以下功能: (1) 磷酸化参与酶作用机制,在此过程磷酸化为反应性中间产物(多为S-或N-磷酸盐) ,如在磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶依赖的磷酸转移酶系统( PTR) 的组氨酸蛋白激酶(HPr) 。 (2) 磷酸化介导蛋白活性,蛋白分子通过蛋白激酶发生磷酸化,如蛋白激酶A(丝氨酸和苏氨酸残基) 或不同的受体酪氨酸激酶(酪氨酸残基) 。 (3) 天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸的磷酸化在细菌趋化反应的感觉性传导中发生解离。 [32 P]放射性标记法是最经典的磷酸化蛋白质检测方法。体内代谢培养用[32P]标记磷酸盐作为磷酸基团供体,被[32P]标记的蛋白质进行一维或二维凝胶电泳分离,用放射自显影或磷储屏检测磷酸化蛋白质。磷蛋白酸水解产物用二维磷酸肽作图法分析可以确定蛋白质的磷酸化氨基酸类型。磷蛋白水解肽段经HPLC分离,通过监测放射性活度收集到磷酸肽,用Edman测序或串联质谱分析都可以确定磷酸化位点,当然这需要有足够量的磷蛋白用于分析。早在1991年, Arrigo等就采用[32P]代谢标记和二维凝胶电泳分析的方法观察了细胞在耐热处理后再经热刺激和肿瘤坏死因子刺激后热休克蛋白hsp28磷酸化程度的变化,发现耐热处理后细胞在热刺激和肿瘤坏死因子刺激下所引起的hsp28的磷酸化程度会显著降低。[32P]放射性标记可以非常灵敏、直观地检测磷蛋白,尤其是与二维凝胶电泳结合后可以从蛋白质组的角度整体观察细胞内蛋白质磷酸化程度的变化,它的缺点是不能标记组织样本,并且存在放射性污染的问题。
蛋白质磷酸化和信号转导 一、蛋白质磷酸化过程和功能 1、蛋白质磷酸化p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n （1）过程： P r o t e i n k i n a s e(蛋白激酶) P r o t e i n p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n A T P A D P P h o s p h a t a s e（磷酸酶） P i （2）主要磷酸化位点（对有-O H的氨基酸进行磷酸化） 丝氨酸（S e r）/苏氨酸（T h r）:磷酸化之后电荷发生变化使蛋白质活性改变 酪氨酸（T y r）:磷酸化之后通常招募其他蛋白因子，使下游蛋白质活性改变 （3）蛋白质磷酸化的功能 生物热力学；蛋白质降解；酶活性的调控（激活o r抑制）；蛋白质相互作用 2、重要的蛋白激酶 （1）C D K s：c y c l i n-d e p e n d e n t k i n a s e周期蛋白依赖性蛋白激酶，属于一组调控细胞周期的S e r/T h r蛋白激酶，和周期蛋白c y c l i n协同作用发挥激酶活性，作用于细胞周期的不同阶段 （2）R T K s：R e c e p t o r T y r o s i n K i n a s e受体酪氨酸激酶，是具有酪氨酸激酶活性的受体，如E G F R（表皮生长因子受体） （3）C y t o p l a s m i c P r o t e i n-T y r o s i n e K i n a s e s：非受体酪氨酸激酶，存在于细胞质中，大部分结构中存在S H2、S H3结构域，是磷酸化的结合位点。如S r c、J A K、 F A K等 二、信号转导 1、信号转导的种类 E n d o c r i n e（内分泌）：激素 P a r a c r i n e（旁分泌）：神经递质 A u t o c r i n e（自分泌）：生长因子 2、信号转导的步骤 （1）信号分子的合成 （2）信号分子释放 （3）信号分子传导 （4）信号分子与受体结合 （5）激活细胞内信号通路 （6）细胞内信号传导
磷酸化蛋白质组学常用定量方法介绍 蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来。 1. 磷酸化蛋白质和磷酸肽的富集 1.1 免疫亲和色谱 富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。因此，目前采用磷酸化丝氨酸/苏氨酸的抗体来富集磷酸化蛋白质的研究相对较 少。 1.2 固相金属亲和色谱（IMAC） 固相金属亲和色谱（immobilized metal affinity chromatography, IMAC）是一项较为成熟的磷酸化多肽分离富集技术。它是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。目前发展的高通量磷酸化蛋白质组分析途径主要采用IMAC亲和色谱-反相液相色谱-串联质谱-数据库检索联用的方法。Ficarro等人最先将IMAC 富集技术应用到细胞系大规模磷酸化蛋白质组学的分析中，并从啤酒酵母中鉴定出了216个磷酸化肽段和383个磷酸化位点。该方法的优点在于对每个可溶磷酸肽，不管其长度如何，都有富集作用，而且IMAC柱洗脱下的样品可直接用于RP-HPLC分析，但有可能丢失一些与IMAC柱结合能力较弱的磷酸肽或某些因有多个磷酸化位点而难以洗脱的磷酸肽。另外，那些富含酸性氨基酸的非磷酸化肽段与固相金属离子也有结合能力，也可能被富集。为了解决IMAC柱的非特异性吸附的问题，可以采用对羧基进行酯化反应以及改变洗脱液的体系等方法来提高IMAC柱的特异性。此外，自动化IMAC- capillary RP HPLC-ESI MS/MS技术平台的研究开发，使磷酸肽的富集、反相分离和质谱检测都能自动在线进行，为IMAC在蛋白质组学中的高通量应用开辟了道路。
蛋白质修饰位点分析 目录 实验目的 (2) 实验平台 (2) 实验过程 (3) 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 (3) 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 (3) 2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 (4) 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 (6)
（1）DISPHOS 1.3预测未知蛋白磷酸化位点 (6) （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 (11) 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 (14) 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 (15) 1、N型糖基化位点预测 (15) 2、O型糖基化位点预测 (18) （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 (18) （2）真核生物O型糖基化位点预测 (20) 3、uniprot数据库查看蛋白质糖基化修饰位点 (22) 4、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰结论 (22) 实验结论 (23) （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点， 并说明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: https://www.doczj.com/doc/5013744257.html,/(查看蛋白的修饰 情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS:https://www.doczj.com/doc/5013744257.html,/disphos/
PhosphoSitePlus:https://www.doczj.com/doc/5013744257.html, 预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ O型糖基化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/ http://www.cbs.dtu.dk/services/YinOY ang/ 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：fasta.txt
磷酸化蛋白之western blot检测操作细节和注意事项 1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂（配方见后页），还要加入一定量的磷酸酶抑制 剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。 2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量 的极少部分。4度也可使一抗重复使用多次（站长注：可加入防腐剂，如叠氮钠，Proclin TM 等，保存时间更长）。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温1小时即可。 3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为，Cell signaling公司 做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体 4.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。如Cell signaling会建议用 含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk的TBST。 5.抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。 6.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完phospho-p 38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标acti n。 7.做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的band以外,往往会出现非特异性的band.磷酸化抗体 不好的话,甚至会压出非特异性的band,而没有你想要的band,所以压片以后,你一定要根据markers比对一下,你压出的band分子量是否正确.我以前压WB时,压出了一条band,就以为是我想要的那条,然后还根据趋势推测可能的机制,走了不少怨枉路.还有一次,把markers 的分子量记错了,比对出来的结果当然也不对. 8.磷酸化蛋白WB时backgroud也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则b ackgroud太深盖住想要的那条band,时间过短则可能没有band或者band太浅.
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin）介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号调控。 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰中所占的比例却非常低。大概10%的细胞蛋白会受到磷酸化共价修饰，但每100次蛋白的磷酸化修饰中仅有1次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸化的水平估计要低2000倍。正是由于细胞中酪氨酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作用。 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 磷酸化Western Blot 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过Western Blot或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在Western Blot上检测内源或外源表达的磷酸化蛋白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要指标。 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也可以达到同样的检测目的。以Yuan的文章为例，他们需要检测BCR-ABL的磷酸化，但他们没有特异性的磷酸化抗体。他们首先使用了抗c-ABL的抗体和蛋白G-琼脂糖珠子来免疫沉淀富集BCR-ABL蛋白，然后再通过Western-Blot和4G10通用型酪氨酸磷酸化抗体（pan-phosphotyrosine）来鉴定BCR-ABL蛋白的酪氨酸磷酸化水平。另外一组以Clemens 为首的科学家，则利用抗Dock蛋白抗体先免疫共沉淀了DACK蛋白，再用4G10酪氨酸磷酸化抗体来检测DACK蛋白和DSH3PX1蛋白的酪氨酸磷酸化水平，通过区分这些蛋白的分子量大小，来确认相应的磷酸化条带的蛋白身份。 与做普通的Western Blot相比，磷酸化Western Blot有一些要额外需要注意的事项： 首先，由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个免疫检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，我们在样品制备时，需要在细胞裂解液中加入足量的并且是新鲜的磷酸酶抑制剂，如
蛋白质修饰位点分析 目录 （特别提示:ctrl+单击目录下的标题链接，可以跟踪标题；ctrl+单击标题后
的图标可以返回目录） 实验目的 ●找出“人类connexin43”蛋白质上面的所有可能磷酸化位点，并说 明为什么（注释） ●找出“人类血红蛋白”上面的糖基化位点，注释结果 实验平台 ●uniprot数据库: (查看蛋白的修饰情况) ●预测未知蛋白磷酸化位点 DISPHOS: PhosphoSitePlus: ●预测未知蛋白的糖基化修饰位点 N型糖基化位点预测： O型糖基化位点预测： 实验过程 一、“人类connexin43”蛋白质磷酸化位点修饰 1、“人类connexin43”蛋白质序列下载 蛋白序列：
2、uniprot数据库查看蛋白磷酸化位点 网站链接： 3、在线软件预测指定蛋白磷酸化位点 （1）DISPHOS 预测未知蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测 ●结果 DISPHOS由蛋白序列预测蛋白磷酸修饰位点，总共有37个丝氨酸修饰位点，13个苏氨酸修饰位点，16个酪氨酸修饰位点。但是根据打分，只有8个丝氨酸修饰位点可能存在。 （2）PhosphoSitePlus预测指定蛋白磷酸化位点 网站链接： ●开始预测 ●结果 筛选参考文献来源多于5篇的磷酸化修饰位点，丙氨酸磷酸化修饰位点数目为1、丝氨酸为17、苏氨酸数目为1、酪氨酸数目为7。 4、“人类connexin43”蛋白质磷酸修饰结论 在线数据库查询和在线软件预测结果基本一致，“人类connexin43”蛋白质磷酸位点数量相对一般蛋白质较多，且丝氨酸磷酸修饰位点最多。“人
类connexin43”蛋白质极有可能是一种活性较高的蛋白质，与机体的生物活性显着相关。 通过各种文献阅读和网络筛选发现connexin43蛋白质是一种哺乳动物连接蛋白，是主要的细胞缝隙连接蛋白，其表达的异常与多种疾病的发生有关。 二、“人类血红蛋白”糖基化位点修饰 Ncbi下载人类血红蛋白的蛋白序列保存为： 1、N型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测 ●结果 2、O型糖基化位点预测 （1）哺乳动物O型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测 ●结果 （2）真核生物O型糖基化位点预测 网站链接： ●开始预测