第25卷第4期2004年12月
扬州大学学报(农业与生命科学版)
Journal of Yangzhou U n iversity(A gricultural and L ife Sciences Editi on)
V o l.25N o.4
D ec.2004
鸡CD4和CD8Α基因c D NA的克隆及其
真核表达质粒的构建
胡青海1,2,焦新安1,23,徐耀辉1,2,潘志明1,黄金林1
(1.扬州大学生物科学与技术学院,江苏扬州,225009;2.扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009)
摘 要:用T rizo l提取6周龄白莱航鸡胸腺组织的总RNA,再用O ligo2dT纤维素富集mRNA后,用R T2PCR分别扩增出鸡CD4和CD8Α基因c DNA。PCR产物切胶回收后连入T载体,测序正确后再连入pc DNA311(+)。将重组质粒pc DNA3112CD4和pc DNA3112CD8分别转染CO S27细胞,用已知的抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体检测到转染细胞中CD4和CD8Α分子的表达,这说明构建的真核表达质粒正确,为下一步用DNA免疫方法研制抗鸡CD4和CD8的单克隆抗体以及研究鸡CD4和CD8分子的结构和功能打下基础。
关键词:鸡;CD4;CD8;c DNA;克隆;真核表达;质粒
中图分类号:Q786;S858.31 文献标识码:A 文章编号:16714652(2004)04005605
Clon i n g of Ch i cken CD4and CD8Αc D NA and Con structi on of
The i r Eukaryoti c Expressi on Pla s m i ds
HU Qi n g-ha i1,2,J I AO X i n-an1,23,XU Yao-hui1,2,PAN Zh i-m i n g1,HUANG J i n-l i n g1
(1.B iosci and B iotech Coll,Y ang zhou U niv,Yangzhou,225009,Ch ina;
2.V et M ed Coll,Y ang zhou U niv,Yangzhou,225009,Ch ina;)
ABSTRACT:To tal RNA s of thymocytesw ere ex tracted from62w k2o ld L egho rn ch icken,mRNA sw ere is o lated from to tal RNA s using o ligo2dT cellul o se,then CD4and CD8Αc DNA sw ere amp lified w ith R T2PCR using the purified mRNA s as the te mp lates.T he sequences w ere verified th rough sequencing after CD4and CD8Αc DNA s w ere ligated in to pGE M T easy vecto r.T he eukaryo tic exp ressi on p las m ids w ere con structed by cl on ing the CD4and CD8Αc DNA in to pc DNA311(+)re2 s pectively,and then the CO S27cells w ere tran sfected w ith recom binan t p las m id pc DNA3112CD4o r pc DNA3112CD8.40h after tran sfecti on the exp ressi on of CD4o r CD8gene on CO S27cells could be detected using indirect i m m unofluo rescen t as2 say(IFA)w ith m urine monocl onal an tibody again st ch icken CD4o r CD8,indicating that the co rrect con structs of eukary2 o tic exp ressi on p las m ids w ere obtained and it w ill p rovide usefulm aterials fo r the devel opm en t of mA b2CD4,mA b2CD8and fo r the study of the structure and functi on s of ch icken CD4and CD8mo lecules.
KE Y WOR D S:ch icken;CD4;CD8;c DNA;cl on ing;eukaryo tic exp ressi on;p las m id
CD4和CD8分子是T细胞表面跨膜糖蛋白,也是T淋巴细胞的表面标志。CD4分子以单体的形式存在,而CD8分子以ΑΑ同型二聚体或ΑΒ异型二聚体的形式存在[1]。CD4和CD8分子作为TCR的辅受体参与对M HC分子递呈抗原的识别。CD4+T细胞能识别M HC 类分子递呈的抗原,而CD8+T细胞能识别M HC 类分子递呈的抗原。CD4和CD8T细胞与M HC分子的相互作用能加强M HC分子和TCR 之间结合的亲和力。另外,它们除了作为细胞粘连分子发挥作用外,还是传递信号的分子,具有信号传递功能。鸡和哺育动物的CD4分子和CD8分子在生物化学和功能上的相似性很明显,它们与鸡的免疫防御紧密相关[1]。
收稿日期:20040922
基金项目:全国优秀博士学位论文作者专项资金资助项目(FAN EDD:200358);江苏省六大人才高峰项目(G2*******)
作者简介:胡青海(1971- ),男,安徽怀宁人,扬州大学博士研究生,主要从事分子免疫学及畜禽传染病诊断与防制方法研究。
3联系作者,E2m ail:xajiao@https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html,
在现代疫苗设计中,一改过去只强调体液应答水平的提高,转为全面评价体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫等在抗感染免疫中的作用。对于某些抗原或病原体,细胞免疫等可能在抗感染或免疫中起主要或重要作用,所以对细胞免疫的研究以及对细胞免疫状态的检测越来越受到重视。针对鸡CD 4和CD 8分子的单克隆抗体可用于测定鸡体内(外周血、胸腺和脾脏)这两类分子的百分比、分选出CD 4+或CD 8+的T 细胞以及研究鸡CD 4+和CD 8+的T 细胞在感染和免疫中的作用等,研制鸡CD 4、CD 8分子单抗就显得尤为迫切。由于用淋巴细胞直接免疫BALB c 小鼠制备单抗不易成功,而近几年来用基因免疫的方法免疫BALB c 小鼠已成为研制单克隆抗体的一种重要手段,故本研究通过克隆鸡胸腺中的CD 4和CD 8Α基因,构建了能表达CD 4和CD 8Α分子的真核表达质粒,为研制抗鸡CD 4和CD 8分子的单克隆抗体奠定基础,并为鸡CD 4、CD 8的结构与功能研究提供理论依据。
1 材料与方法
111 试验动物
6周龄白莱航鸡购自山东家禽研究所SPF 鸡场,6周龄BALB c 雌鼠购自扬州大学实验动物中心。112 试剂
T rizo l R eagen t 购自美国Invitrogen 公司;EZ s p in co lum n mRNA purificati on K it 购自加拿大BB I 公司;I m p rom 2II R everse T ran scri p tase 和T 2easy vecto r 购自美国P rom ega 公司;H igh 2fidelity PCR sys 2te m 购自德国Roche 公司;P las m id M in i K it (cat .N o .12123)和Po ly Fect T ran sfecti on R eagen t 购自德国Q iagen 公司;抗鸡CD 4和CD 8的单克隆抗体CT 4和CT 8由英国In stitute fo r A n i m al H ealth 的D avi 2s on 博士提供;限制性内切酶购自大连宝生物工程公司。
1.3 引物设计:
根据GenBank 中发表的鸡CD 4和CD 8Α基因的mRNA 序列用P ri m er P re m ier 510软件辅助设计2对引物,引物的5′端分别加有B a m H 、X ba 或X ho 酶切位点,上游引物A T G 附近含有Kozak 序列(-3位为G A ,+4位为G ),分别用于鸡CD 4和CD 8Α基因c DNA 的扩增。
预期扩增片段长度分别为1506和729bp 。引物由大连宝生物工程公司合成。
CD 4上游引物:5′
2GTA GGA T CC T T GGA GA T GGA GA GGT GT G 23′;CD 4下游引物:5′
2CA C T CTA GA GT CCCT CA GT CT GCA A A GC 23′。CD 8Α上游引物:5′
2TA GGA T CCA CGA T GGCCA GGT CT CCT 23′;CD 8Α下游引物:5′2CT T CT CGA GT GCT CA TA T GT GT CGGGT T G 23′
。114 方法
1)胸腺细胞mRNA 的提取:无菌取出6周龄白莱航鸡胸腺,剪碎后取少量至115mL 指形管中,加入T rizo l R eagen t 1mL ,然后按T rizo l R eagen t 说明书操作步骤提取胸腺细胞总RNA ,用少量无R nase 水溶解RNA 。再利用EZ s p in co lum n mRNA purificati on K it 中的O ligo 2dT 纤维素富集mRNA 。最后用少量无R nase 水溶解mRNA 。
2)R T 2PCR :分别采用CD 4和CD 8Α下游引物为反转录引物,以mRNA 为模板合成c DNA 。反转录主要步骤:在经D EPC 处理过的115mL 指形管中加入414ΛL mRNA 、0.6ΛL CD 4或CD 8Α下游引物,70℃作用5m in ,再置冰水中10m in 。在另一指形管中加入无R nase 水516ΛL ,5倍buffer 4ΛL ,M gC l 2214ΛL ,dN T P s (10mo l L -1each )1ΛL ,R asin 10U ,p rom ega I m p rom 2 R everse T ran scri p tase 1ΛL ,轻轻混匀后合并以上2管为1管,总反应体系20ΛL 。
25℃作用5m in ,42℃作用1h ,70℃处理15m in 后移至冰水中。
PCR 扩增参照黄金林等[2]方法进行。PCR 反应的循环参数为:95℃3m in ;94℃50s ,63℃50s
(CD 4)或60℃50s (CD 8),72℃1m in 30s ,共25个循环;再以72℃延伸7m in 。
3)PCR 产物克隆到T 载体:PCR 产物切胶回收后,用大连宝生物工程公司的胶回收试剂盒回收,再与P rom ega T 2easy vecto r 连接,4℃过夜,第2天转化JM 109感受态细胞,涂A I X 板(含Amp +,
75第4期胡青海等:鸡CD 4和CD 8Α基因c DNA 的克隆及其真核表达质粒的构建
85扬州大学学报(农业与生命科学版)第25卷
IPT G,X2gal),挑取白色菌落,扩增后提取质粒,酶切鉴定。选酶切大小与预期相符的质粒由上海联合基因公司测序,并向GenBank提交序列。
4)真核表达质粒的构建:从pT2CD4或pT2CD8上B a m H 、X ba 或X ho 切下CD4或CD8Α
c DNA,电泳后切胶回收,再与同样酶切后回收的pc DNA311(+)连接,4℃过夜。第2天将连接产物转化DH5Α感受态细胞,从转化板上挑取单菌落扩增后酶切鉴定。
5)重组质粒pc DNA3112CD4和pc DNA3112CD8转染CO S27细胞:用P las m id M in i K it分别提取pc DNA3112CD4和pc DNA3112CD8质粒,再用紫外分光光度计定量。待CO S27细胞密度生长到40%～70%,且状态良好时,按每孔018Λg质粒(24孔板)转染CO S27细胞。具体操作按Po ly Fect T ran sfecti on R eagen t说明书进行。转染40h后用间接荧光法检测。先用PBS洗细胞1次,再用预冷的丙酮 甲醇(体积比为2 3)固定10m in,用PBS洗细胞3次,加抗鸡CD4或CD8单克隆抗体,37℃作用1h,加稀释好的F ITC标记羊抗鼠IgG,37℃作用1h,用PBS洗细胞3次后在荧光显微镜下观察结果。
2 结果与分析
211 鸡CD4和CD8基因c D NA的扩增
从6周龄雏鸡的胸腺中提取mRNA,反转录后,经PCR扩增得到了与预期目的基因大小相符的条带(图1)。
212 鸡CD4和CD8Α基因c D NA的克隆与序列测定
扩增的鸡CD4和CD8Α基因c DNA PCR产物连到T载体后,由上海联合基因公司测序。用DNA S2 tar(4105)软件分析测序,结果表明克隆的白莱航鸡CD4基因c DNA序列(GenBank accessi on N o.
A Y528652)与GenBank上发表的鸡CD4c DNA序列[2]完全一致,其OR F全长1464bp,编码的蛋白质有402个氨基酸的胞外区(含4个Ig样区)、24个氨基酸的亲水性的跨膜区和33个氨基酸的胞浆区。据推测前28个氨基酸是鸡CD4分子的信号肽。鸡CD4的胞外区有7个潜在的N2糖基化位点,其中3个可能的N2糖基化位点靠近膜的区域,第2、3区分别有2个位点。整个c DNA序列与鼠和人有24%的同源性。
克隆的白莱航鸡CD8Α基因c DNA序列(GenBank accessi on N o.A Y519197)中OR F全长708bp,编码的前19个氨基酸据推测是鸡CD8Α
分子的信号肽。与GenBank上发表的
鸡CD8Α基因c DNA序列(GenBank
accessi on N o.Z22726)相比,前者在胞
外区有8个碱基的变化,编码氨基酸的
变化有5个,分别位于第40、50、53、64
和85位的氨基酸。而测得的信号肽和
跨膜区序列与后者完全相同。
213 真核表达质粒的构建
分别用B a m H 和X ba 以及
B a m H 和X ho 将CD4和CD8Α基
因c DNA从pT2CD4和pT2CD8上切
下,再与相同酶切的pc DNA311(+)
连接,转化DH5Α宿主菌。挑菌落扩增
后提取质粒,酶切结果显示重组质粒
构建正确(图2)。
214 重组质粒转染COS-7细胞结果
真核表达质粒pc DNA3112CD4和pc DNA3112CD8转染CO S27细胞40h后用抗鸡CD4或CD8单克
隆抗体检测转染的CO S 27细胞其CD 4或CD 8分子的表达。间接荧光检测结果表明,真核表达质粒pc DNA 3112CD 4和pc DNA 3112CD 8转染CO S 27细胞膜上有明显的特异性荧光;而对照的pc DNA 311转染CO S 27细胞无荧光(图3)
。图3 pc D NA 311-C D 4和pc NA 311-C D 8转染C OS -7细胞结果
F i g 3. Result of C OS -7cells tran sfected w ith
pc D NA 311-C D 4or pc D NA 311-C D 8respecti vely
a .pc DNA 3112CD 4转染CO S 27细胞结果;
b .p
c DNA 3112CD 8转染CO S 27细胞结果;
c
.pc DNA 311转染CO S 27细胞结果3 讨论
CD 4和CD 8分子是T 细胞表面跨膜糖蛋白,也是T 淋巴细胞重要的表面标志。
大多数胸腺细胞表达CD 4和CD 8分子,但大多数脾脏和外周血中的T 细胞只表达其中1种或2种都不表达[5]。本研究从鸡的胸腺中成功地克隆到鸡CD 4和CD 8基因的c DNA ,与GenBank 和胡青海等研究中国地方鸡种CD 4和
CD 8基因的c DNA 的资料(待发表)比较分析,证实与L uh tala 等
[1,3]和Ko sk inen 等[6]研究结果一致,即鸡的CD 4基因在进化上高度保守,而鸡的CD 8基因在胞外区具有较高的可变性。鸡的CD 4基因c DNA 与人和鼠相比,同源性只有24%,但鸡的CD 4和CD 8分子的功能在进化上高度保守。因此这说明鸡CD 4和CD 8基因c DNA 的克隆,为今后研究鸡CD 4和CD 8基因的结构与功能创造了条件,对抗鸡CD 4和CD 8分子单克隆抗体研制以及这些单抗在研究鸡CD 4和CD 8基因的结构与功能等方面也具有重要意义。
鸡的CD 8Α分子与人的CD 8Α相比,在推测的M HC 类分子结合位点上存在更多的负电荷氨基酸,而在鸡的M HC 类分子上相应的CD 8Α相互作用位点处比人的M HC I 类分子存在更多的正电荷氨基
酸[4,12]。L uh tala 等[4]猜测,与哺乳动物的CD 8Α和M HC I 类分子的结合区相比,鸡的CD 8Α和M HC I 类
分子结合区的互补变化在共进化压力下可能导致因配体2受体的配对而相应突变[4]。CD 8Α多型性是否影响CD 8 M HC I 类分子的相互作用也是人们感兴趣的课题。
与鸡CD 8Α分子同样广泛的多型性在其他动物中尚未见报道,提示鸡的CD 8Α和CD 8Β是在不同的选择压力下进化的。
L i 等[13]将5个品系的火鸡外周血淋巴细胞与抗鸡CD 8Α单克隆抗体作染色分析,发现有些单抗与某些品系火鸡的淋巴细胞不反应,说明火鸡CD 8Α分子存在多样性;而另一些单抗能与所有品系火鸡的淋巴细胞反应。鸡的CD 8Α分子的多型性比其他动物高得多,而CD 8Β则保守得多[1]。鸡CD 8Α分子CDR 区突变的聚集也显示是由选择压力所致。人们猜测这种选择可能是为了适应病原微生物,尤其是反转录病毒,它可感染T 细胞并且能利用CD 8Α分子作为受体[9～11]。CD 8Α和CD 8Β间突变频率的差异可能反映了不同水平的约束或压力使T 细胞在胸腺选择中功能的保守[1]。与这种假设相符合的是CD 8Β敲除鼠不能进行CD 8+T 细胞的正向选择。有趣的是,在虹鳟中也发现了Β2微球蛋白的多样性[7]。一些动物可能在Β2微球蛋白和CD 8的多样性中获得了额外的TCR M HC I 抗原识别能力。
与鸡CD 8分子相似的多样性在小型猪的CD 4分子上也存在。猪的2种同种型间有11个氨基酸的替代,且突变集中在CDR 2区。人CD 4分子的CDR 2区可作为H I V 的结合位点。因此猪CD 4分子的多型性可能作为一种选择机制以改变作为某一未知病毒的受体。鸡CD 8Α的多型性是否在拓展TCR 的抗原识别能力或在逃避病毒感染中
95第4期胡青海等:鸡CD 4和CD 8Α基因c DNA 的克隆及其真核表达质粒的构建
06扬州大学学报(农业与生命科学版)第25卷
起一定作用尚不清楚。
真核表达质粒pc DNA3112CD4和pc DNA3112CD8转染CO S27细胞的结果表明,构建的质粒能在真核细胞中很好地表达。这为今后用基因免疫的方法免疫BALB c小鼠研制抗CD4和CD8分子的单克隆抗体、建立稳定表达鸡CD4或CD8分子的细胞系以及研究鸡CD4和CD8分子的结构与功能等打下了基础。
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临床分子生物学 1. 试述荧光定量PCR技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用。 （1）原理：实时荧光定量PCR是一种将PCR扩增和扩增结果的检测有机地结合在一起的一种分子生物学技术，系在PCR反应体系中加入能够反映PCR反应进程的荧光报告基团，随着PCR 反应的进行，荧光信号强度也按特定的规律随PCR产物不断累积而增加。同时，每经过一个热循环，定量PCR仪收集一次荧光信号，通过实时监测反应体系荧光强度的变化来实时监测PCR扩增过程，最终得到荧光强度随PCR循环数的变化曲线。理论上，PCR的扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,其荧光量与扩增产物量亦成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。最后根据该曲线的特征及标准曲线实现起始模板数的精确定量。 荧光定量PCR的扩增曲线可以分为三个阶段：荧光背景信号阶段，荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。在荧光信号背景阶段，由于PCR扩增产生的荧光信号远远小于荧光背景信号，为背景荧光所掩盖，我们难以判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已经不再呈指数增加，PCR的终产物量与起始模板之间没有线性关系，所以用终产物量不能计算出起始模板的量。为了定量和比较的方便，在定量PCR中引入了三个非常重要的概念：荧光基线、荧光阈值和CT值。基线是指PCR循环开始时，虽然荧光信号累积，但仍在仪器可以检测的灵敏度下。基线范围的定义是从三个循环开始起到CT值前的第三个循环止。荧光阈值的确定是3－18个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。CT值的定义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。可见CT值取决于阈值，而阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，因此CT值是一个完全客观的参数。 （2）方法： 1、引物设计遵守的原则 2、探针设计遵守的原则 3、RNA提取 4、逆转录逆转录成cDNA 5、常规PCR扩增 （1）反应体系 （2）混匀，瞬时离心。 （3）设定扩增条件，进行扩增反应，循环35次。 （5）产物用于琼脂糖电泳或-20℃长期保存。 6、 实时荧光定量PCR扩增目的基因 用假定初始拷贝数（X）的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，自每个稀释模板中取样5μl，分别加入30μl的反应体系中，行实时荧光定量PCR。 反应体系在荧光定量PCR仪上进行，这种仪器较普通的PCR仪增加了一套复杂而紧密的荧光强度检测系统及数据分析系统，可对PCR反应过程中的每一循环的系统荧光强度进行实时（real-time）检测，通过对荧光强度的分析来达到等量检测的目的。 将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45循环的扩增反应结束后，系统将采集到的每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数（DRn）进行分析绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值（threshold）时的扩增循环数（Ct值），根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图，得到该样品的标准曲线。在此反应系统中，荧光强度的增加与模板量的增加成正比，荧光强度的变化可反应模板产物量的变化。 7、基因相对拷贝数的检测与计算 8、统计学分析
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
第6卷第4期(专辑) 2002年12月 生命科学研究 Life Science Research Vol.6No.4(Suppl.) Dec.2002基因克隆技术的研究进展X 钟军,李,官春云 (湖南农业大学油料作物研究所,中国湖南长沙410128) 摘要:为能快速而准确地克隆目的基因,综述了一些基因克隆常用技术,包括差异表达基因分离技术、转座子标签技术、图位克隆技术、同源序列技术、表达序列标签技术的原理、应用及应用潜力,并对其作了简要的评价. 这些技术有利有弊,应根据不同的实验目的和水平来选择相应的技术. 关键词:基因;克隆;差异表达基因分离技术;转座子标签技术;图位克隆技术;同源序列技术;表达序列标签技术 中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1007-7847(2002)S1-0148-05 Advances in Gene Cloning Technique ZHONG Jun,LI Xun,GUAN Chun-yun (T he Oil Crop Institute of H unan Agriculture University,Chan gsha410128,H unan,China) Abstract:To clone candidate gene quickly and correctly,advances about gene cloning included map-based cloning, transposon tagging,homology-based candidate gene method,expressed sequence tagging methods and some differen-tially expressed gene clone method are introduced and appraised.Because of the advantages and disadvanta ges of those techniques,various technique should be selected according special purpose and level. Key words:gene;clone;differentially e xpressed gene clone method;transposon tagging;map-based cloning;ho-mology-based candidate gene method;e xpressed sequence ta gging method (Li f e Science Research,2002,6(Suppl):148~152) 克隆基因的途径有两种,正向遗传学和反向遗传学途径.前者是依据目标基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型突变而进行的;后者则着眼于基因本身,通过特定的序列或在基因组中的位置进行.近几十年来,许多重点实验室致力于植物基因的克隆,到1992年取得了突破性进展.基因的克隆一般采用下列技术:差异表达基因分离技术、转座子标签技术、表达序列标签技术、图位克隆技术和同源序列技术等. 1差异表达基因分离技术 1.1扣除杂交技术 扣除杂交技术的原理是用有特异性表达基因的目标样提取mRNA经逆转录形成cDNA探针,与无特异性表达基因的参照样的过量mRNA或cDNA杂交,经两轮充分杂交后,移去杂交分子和过量的无特异性表达基因的参照样mRNA或cD-NA,将不形成杂交体的有特异性表达基因的目标样cDNA纯化富集、扩增,建立相应cDNA文库即为差异表达基因cDNA文库.此技术最早是由Lamar和Palmer于1984年提出[1],他们先用超声波打断雌性小鼠的DNA,用Mbo1完全消化雄性小鼠DNA;将两者一起变性、复性,再将产物克隆入表达载体的Bam H I位点中,只有那些两端有GATC序列的基因才能被克隆入载体,这样就达到了扣除两者共有序列的目的,并得到雄性小鼠 X收稿日期:2002-06-11;修回日期:2002-10-14 作者简介:钟军(1973-),女,湖南沅江人,博士研究生,从事分子遗传学研究.Tel:+86-0731-*******,E-mail:zhhjp@s https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html,
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
第九讲目的基因的克隆 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
目录 一、基因克隆的一般概念 1．基因克隆定义 2．“克隆”的不同含义 3．基因克隆的过程 4．DNA片段的产生与分离 5．基因文库 二、基因克隆与分离的实验策略 1．物理策略 2．生物策略 3．克隆样品的选择 4．基因文库库容测算 三、cDNA基因克隆 1．概述 2．cDNA文库的构建 3．低丰度mRNA之cDNA克隆 4．稀少mRNA的cDNA克隆 5．全长cDNA的合成 6．cDNA克隆的优越性 四、基因组DNA克隆
1．cDNA克隆的局限性 2．基因组DNA克隆的优越性 3．构建基因组文库的载体类型五、基因定位定隆 1．基因定位克隆概述 2．RFLP分子标记 3．RFLP作图原理与步骤 4．染色体步移 5．大尺度物理图谱的构建
目的基因的克隆 一、基因克隆的概念 1．基因克隆的定义 基因克隆亦叫做DNA克隆(DNA cloning)，它是指将外源基因或DNA片段插入到克隆载体的分子上，构成重组的DNA群体，并转化到寄主细胞进行复制和繁殖，以便从大分子DNA或DNA片段混合物中分离纯化目的基因或特定DNA片段的实验操作，叫做基因克隆。严格地说，基因克隆应叫做DNA克隆，因为被克隆的是基因组的全部(理论上)的DNA片段，而并不是所有的DNA片段都编码有基因。 *要注意基因克隆与基因分离两者在概念上的差别！完成了基因克隆并不等于完成了基因的分离！尽管两者之间存在密切的相互关系。因此在日常交谈中或是一般文字叙述中，甚至于某些正式有关文件中，常把“基因克隆”与“基因分离”等同使用，不作区分，是不妥当的。 *有时我们所说的基因克隆，即所谓的“分子克隆”(Molecular cloning)，实质上包含着目的基因的分离与鉴定两个主要的内容，基因克隆的全过程包括如下四个步骤：
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
β—肌动蛋白的克隆与验证 李亚楠邹曾阳孟冠奇李军张建忠沈彤 摘要：Actin即“肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白。Actin在不同物种之间高度保守，以至于很难获得较好的针对actin的抗血清。Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal muscle actin，α-cardiac muscle actin，α-smooth muscle actin，和γ-smooth muscle actin；其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-acti n(β-non-muscle)和γ-non-muscle actin。[1]β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。具有收缩功能，分布广泛。β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot 很好的内参指数。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。[2] 本次实验主要通过PCR的手法来扩增目标蛋白。通过组织细胞提取DNA，用琼脂凝胶电泳来验证是否得到目标DNA；回收后的目标DNA 用PCR仪扩增，并用电泳进行回收；与T载体（PUD-18T）连接；用培养的大肠杆菌DH-5a来制备感受态细胞；将制备完成的感受态细胞均匀的涂布于含有x-gal和IPTG的混合液的LB培养基平板中进行蓝白斑的筛选；最后提取质粒DNA，经验证后保藏菌种。 关键词：β-肌动蛋白横纹肌蛋白质PCR 1材料与方法 1.1 组织细胞DNA提取。[3] 1.1.1 试剂：细胞裂解缓冲液、蛋白酶K、TE缓冲液、酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）、7.5mol/l乙酸铵。 器材：胶头滴管、离心机、烧杯、动物组织、研钵、水浴。 1.1.2 方法 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g，尽量剪碎，置于石英研钵中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶K20微升，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴20min，间歇震荡离心管数次。于台式离心机以
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.doczj.com/doc/5e13692338.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆技术 摘要：基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术：目的基因的获得、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 关键词：目的基因；限制性内切酶；克隆；重组分子 ABSTRACT：Gene cloning technology is the core of molecular biology technology, its purpose is obtain a gene or DNA fragments of the copy, used for in-depth analysis the structure and function of genes, and may achieve human cells and the transformation of the species genetics purpose.This thesis mainly from the following several aspects to introduce gene cloning technology: the purpose of the gene for the purpose, genes and carrier, restructuring of the molecules connected amplification and identification. Keywords：purpose gene;restriction endonuclease;clone;restructuring molecules 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 1. 目的基因的获得 目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选[1] 1.1 PCR方法
Bop基因克隆 摘要：以pUC18质粒为载体，bop基因为目的基因，通过PCR扩增出含目的基因，将克隆载体pUC18和bop基因经限制性内切酶酶切后，在T4DNA接酶连接下，形成重组质粒并转化入大肠杆菌DH5a。通过氨苄青霉素平板筛选出抗性转化子，对重组子进行PCR和酶切，电泳鉴定检测完成了bop基因额的克隆。 关键词：基因克隆；PCR；BOP基因 第一章 1.前言 1.1 基因工程 狭义上仅指基因工程。 是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状。 重组DNA分子需在受体细胞中复制扩增，故还可将基因工程表征为分子克隆（Molecular Cloning）或基因克隆（Gene Cloning）。 广义上包括传统遗传操作中的杂交技术、现代遗传操作中的基因工程和细胞工程。 是指DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；
下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。 广义的基因工程概念更倾向于工程学的范畴。 广义的基因工程是一个高度的统一体： 上游重组DNA的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想； 下游过程则是上游重组蓝图的体现与保证。---基因工程产业化的基本原则。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞或基因工程生物体的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新特性的生物类型。 从实质上讲，基因工程的定义强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按工程学的方法进行设计和操作的，这就赋予基因工程跨越天然物种屏障的能力，克服了固有的生物种（species）间限制，扩大和带来了定向改造生物的可能性，这是基因工程的最大特点。 基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送到受体生物中去表达，从而产生遗传物质的转移和重新组合。[1] 1.2 PCR技术基本原理 PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将
动物遗传学读书报告 之 新基因的分离克隆及功能鉴定 学院班级：动物科技学院动物科学10级2班 新基因分离克隆及功能鉴定方法研究进展 前言 随着DNA 分子双螺旋结构、密码子等的被发现，几种模式生物基因组测序和人类基因组计划的相继完成，使人们对基因的研究很快进入后基因组时代。基因组学时代的主要任务是图谱制作性和序列测定，后基因组学时代则是进行基因组功能注释，这也是功能基因组学的主要研究目标。而PCR 技术的诞生，推动了许多新技术和方法的应用。 1. 基因的分离克隆 基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。分子克隆是指在体外对不同生物的DNA 分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA 。基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。 1.1基因的分离克隆主要方法 基因分离与克隆是基因工程的第一步，它是利用分子克隆技术获取用于转化、控制目的性状相关的基因。一般方法是先建立文库(基因组文库或cDNA 文库，再利用适当的探针，通过分子杂交从基因文库分离出目的基因，这是应用最早，目前最为成熟的一种方法。而对于未知序列，常采用步移的方法，其原理是如果知道离开该基因一定距离上的DNA 序列，则可用这个DNA 序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。先用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将
这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。以下对目的基因分离和克隆方法作一总结。 1.1.1功能性克隆 通过基因产物的克隆技术在传统遗传学占主导地位的时代，人们以基因产物为导向来分离克隆基因。由于基因产物的结构、功能已知，可通过分析部分多肽或末端氨基酸序列，反推其核苷酸序列，设计探针或引物从基因组DNA 文库或cDNA 文库中筛选克隆，也可以制备产物抗体，从表达载体构建的cDNA 文库中筛选相应克隆，进而分离目的基因。若可得到足够多的纯化目的蛋白以用于制备特异性抗体时，可以采用经典的免疫筛选表达文库的方法，筛选阳性克隆获取其目的基因。除了免疫筛选方法外，也可根据目的蛋白的生物学功能，利用同位素标记的配体来筛选受体表达的阳性克隆。当所分离的目的蛋白较难大量获得，但纯度较高时，可利用其中的一段氨基酸序列，反推出其基因序列，据此合成寡核苷酸用于cDNA 文库的筛选；或根据所获得的基因序列，指导5’端的引物合成，根据mRNA 3’端poly —A 序列指导合成poly —T 的3’端引物，用PCR 技术从制备细胞的mRNA 或直接从胞浆内溶物中合成相应的cDNA ，将该cDNA 克隆到表达载体上进行产物表达。 1.1.2同源性序列克隆技术 随着基因研究的不断深入，人们发现几乎所有的基因与其他的基因都有一定的联系：生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。基于此原理，在其他种属同源基因被克隆的前提下，构建cDNA 文库或基因组文库，然后用已知分子高保守序列设计简并引物，并用简并引物对含有目的基因的DNA 文库
RT-PCR 逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 一、反转录酶的选择 1．Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2．Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。 二、试剂准备 1．RMA提取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 4．Taq DNA聚合酶 三、操作步骤 1. 总RNA的提取：见相关内容。 2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 （1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。 （2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10×PCR buffer 2μl 25mM MgCl2 2μl