综述文章编号：１００９－０００２（２００７）０２－０２７０－０４
一个新的与泛素化有关的蛋白家族——
—ＴＲＩＭ家族
田利源，陈红星，邓继先
军事医学科学院生物工程研究所，北京１０００７１
［摘要］ＴＲＩＭ家族是一个结构保守、进化快速的蛋白家族，它参与了细胞凋亡、周期调控、细胞对病毒的应答等重要的生命过程。结构上的保守预示着ＴＲＩＭ家族可能是以一种共同的机制参与各种生命过程的。最近的一些研究显示ＴＲＩＭ家族可能是一类新的ＲＩＮＧ指泛素连接酶。
［关键词］ＴＲＩＭ家族；锌指结构；泛素连接酶
［中图分类号］Ｑ５１［文献标识码］Ａ
ＴＲＩＭＰｒｏｔｅｉｎｓ：ａＦａｍｉｌｙＩｎｖｏｌｖｅｄｉｎＵｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ
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［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ＴＲＩＭ[ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ[ｕｂｉｑｕｉｔｉｎＥ３ｌｉｇａｓｅｓ
ＴＲＩＭ家族是一个近年来越来越受到重视的蛋白家族，这与该家族在结构上的保守性、在功能上的重要性，以及家族基因在进化上的特点是分不开的。目前在人类已经发现了６０多个ＴＲＩＭ家族的蛋白成员［１］，尽管对这些蛋白的功能还不是很清楚，但是从已有的报道中可以看出这个家族的重要性，例如ＲＦＰ、ＴＩＦ１α是原癌基因［２，３］，ＭＩＤ１基因的突变会导致先天性的Ｏｐｉｔｚ综合征［４］等。近年来又有文献报道ＴＲＩＭ家族的成员在调节细胞凋亡、细胞周期及阻止ＨＩＶ感染中也起重要作用［５－７］。我们对ＴＲＩＭ家族的结构与功能做简要综述。
１ＴＲＩＭ家族的结构特点
ＴＲＩＭ家族的显著特点是具有３个结构域（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅｍｏｔｉｆ），ＴＲＩＭ的名称也由此而来。这３个结构域从Ｎ端到Ｃ端依次是锌指结构域（ＲＩＮＧｆｉｎｇｅｒ）、１或２个Ｂ－ｂｏｘ、１个卷曲螺旋（ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ）结构域。其中，Ｂ－ｂｏｘ是ＴＲＩＭ家族的特征结构域［８］。
锌指结构由半胱氨酸和组氨酸有规律地排列组成，能结合２个锌原子。第一个锌原子结合于第１、２、５、６位的半胱氨酸，第二个锌原子结合于第３、４、７、８位的半胱氨酸或组氨酸［９，１０］。有少数的家族成员虽然没有锌指结构域，但是由于具有顺序和位置都保守的Ｂ－ｂｏｘ和卷曲螺旋结构域，仍把其列入ＴＲＩＭ家族。锌指结构域一般都始于Ｎ端的１０～２０个氨基酸残基［８］。在功能上，锌指结构域介导蛋白自身或不同底物的泛素转移，所以它成为许多Ｅ３泛素连接酶的特征性的标志［１１］。
Ｂ－ｂｏｘ也是一种锌离子结合结构域，可分为Ｂ－ｂｏｘ１和Ｂ－ｂｏｘ２等２种类型，二者的不同之处在于第二个结合位点Ｂ－ｂｏｘ１是半胱氨酸，而Ｂ－ｂｏｘ２是组氨酸。当Ｂ－ｂｏｘ１和Ｂ－ｂｏｘ２都存在时，Ｂ－ｂｏｘ１总是位于Ｂ－ｂｏｘ２之前；当只存在１个Ｂ－ｂｏｘ时，只可能是Ｂ－ｂｏｘ２。通过分析Ｂ－ｂｏｘ２的金属结合效价试验和核磁空间结构，发现它只结合１个锌原子［８，１２］。Ｂ－ｂｏｘ１由于具有相似的结构，可能也只结合１个锌原子。关于Ｂ－ｂｏｘ结构域的功能现在还不清楚。
卷曲螺旋结构域总是位于Ｂ－ｂｏｘ２之后，其编码基因长约１００个碱基［１３］。除了疏水性氨基酸外，其他序列并不保守，它的空间折叠通常需要亮氨酸的存在。ＴＲＩＭ家族的这个结构域主要参与同源二聚体的相互作用，促进大分子复合物的形成，以及决定蛋白的亚细胞定位［８］。
ＴＲＩＭ家族蛋白的Ｃ端结构并不特异，也存在于其他家族蛋白中。最常见的ＴＲＩＭ家族蛋白的Ｃ端结构是Ｂ３０．２结构域，也称ＲＦＰ样结构，大约存在于２／３的ＴＲＩＭ家族成员的Ｃ端，但在越来越多的非ＴＲＩＭ家族蛋白中也发现了这个结构，它长１７０个氨基酸残基，功能还不清楚。以较为保守的氨基酸划分，这个结构域可分为３个区域，分别为ＬＤＰ（也叫做ＰＲＹ结构）、ＷＥＶＥ和ＬＤＹＥ区（也叫做ＳＰＲＹ结构）［１４］。其次常见的Ｃ端结构有ＮＨＬ重复结构、ＰＨＤ－ＢＲＯＭＯ结构域及ＡＲＦ结构［１５］。也有不少ＴＲＩＭ家族成员，其Ｃ端结构与其他成员没有任何相似性或者不具有Ｃ端结构。
［收稿日期］２００６－０８－２２
［作者简介］田利源（１９７５－），男，博士研究生
［通讯作者］陈红星，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｈｏｎｇｘｉｎｇｃｈｅｎ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
ｉｎｓｉｌｉｃｏ分析显示，ＴＲＩＭ家族的基因常以不同的剪接方式表达，如ＰＭＬ有多达１０种不同的剪接方式［１６］。这些不同剪接方式的表达产物有的只有Ｎ端部分，有的只有Ｃ端部分，或者Ｃ端编码序列发生了改变。这表明生命体对该家族基因不同剪接体的需要，同时也使得阐明ＴＲＩＭ家族的功能变得更加复杂。同时还发现一些没有Ｂ－ｂｏｘ，但其他结构域与ＴＲＩＭ家族高度同源的蛋白，它们与ＴＲＩＭ家族蛋白的关系如何，在功能上有无关联，都有待进一步的探究。
２ＴＲＩＭ家族的进化
在ＴＲＩＭ家族中，锌指结构域、Ｂ－ｂｏｘ１、Ｂ－ｂｏｘ２和卷曲螺旋结构域从Ｎ端到Ｃ端依次排列，甚至相互比邻的２个结构域之间的距离也保守恒定，即使某个结构域发生了缺失，这种排列顺序依然保持不变［８，１３］。这是ＴＲＩＭ家族的一个显著特点，这种保守的结构可能对于执行某种功能来说是必须的，而且提示我们ＴＲＩＭ家族的结构域很可能是一个功能结构整体，而非几个功能结构的组合。
随着人类基因组测序的完成，在人类已经发现了６５个ＴＲＩＭ家族的基因，在无脊椎动物中发现的不到２０个，在单细胞的生物中则没有发现。在进化得越高等的生物中ＴＲＩＭ家族的成员越多见，这种现象说明ＴＲＩＭ家族是一个快速进化的家族。ＴＲＩＭ家族的基因往往都发挥着种属特异的功能，而且其基因在基因组中多呈分散分布，至少在人类是这样，在人类基因组中，除了少数ＴＲＩＭ家族的基因聚集分布于一个小的染色体区外，其他的家族基因都分散地分布于各个染色体上［８，１７］。以上这些现象说明尽管这些基因都由一个共同的祖先进化而来，但是它们的进化是各自独立发生的。除了少数家族基因在蛋白水平上具有较高的同源性外，大多数成员之间的同源性都比较低，只有形成ＲＩＮＧ和Ｂ－ｂｏｘ骨架的半胱氨酸和组氨酸以及形成卷曲螺旋结构域的疏水性氨基酸比较保守。在基本骨架保持不变的同时，保守的氨基酸之间的序列却迅速发生着进化，从而具备新的特性，发挥新的生理功能。有趣的是在原核生物中没有发现ＲＩＮＧ结构域，这与原核生物没有泛素化系统是相一致的。在原核生物中没有发现Ｂ－ｂｏｘ，在病毒和真菌中也没有发现，推测Ｂ－ｂｏｘ是多细胞生物的一个特征。
ＴＲＩＭ家族Ｃ端的结构域是非特异的，也存在于其他蛋白家族中。以最常见的Ｂ３０．２结构域为例，ＳＰＲＹ区出现得较早，在从低等到高等众多物种的１１个蛋白家族中都有发现，而ＰＲＹ区出现较晚，只在２个蛋白家族中发现［１８］。
３ＴＲＩＭ家族蛋白的功能
蛋白家族成员之间在结构上的相似性必然体现于它们在功能上的相似性，但前面提到ＴＲＩＭ家族成员参与调控凋亡、细胞周期、分化、代谢通路、细胞对病毒的反应等诸多重要的生命过程，那么这种功能多样性背后的共性是什么呢，目前还不很清楚，但从已有的研究中已经获得了一些提示。研究发现，一些ＴＲＩＭ家族的成员起着Ｅ３泛素连接酶的功能。如ＴＲＩＭ５δ在泛素和ＡＴＰ存在下与Ｅ１和Ｅ２在体外共孵育时，能够促进泛素化，尽管它的天然作用底物还不清楚，但可以肯定ＲＩＮＧ结构域参与了这种作用的发挥［１９，２０］。Ｅｃｔｏｄｅｒｍｉｎ是ＴＩＦ１亚家族的一个成员，它能够结合并促进ＴＧＦβ信号通路中Ｓｍａｄ４的泛素化，调节该信号通路，进而促进胚胎外胚层的发育。过表达Ｅｃｔｏｄｅｒｍｉｎ导致Ｓｍａｄ４降解加快，研究发现Ｅｃｔｏｄｅｒｍｉｎ的功能发挥也有赖于ＲＩＮＧ结构域［２１］。我们知道在泛素化过程中，Ｅ３泛素化连接酶介导Ｅ２结合的泛素和底物相互靠近，实现泛素向底物的转移。ＲＩＮＧ结构域是Ｅ３泛素连接酶的常见功能基团，含有ＲＩＮＧ结构域的ＴＲＩＭ家族很可能是一类新的Ｅ３锌指蛋白［２２］。对ＴＲＩＭ５δ、Ｅｆｐ、Ｍｉｄ１、ＭＵＲＦ这些ＴＲＩＭ家族成员的研究发现，ＲＩＮＧ结构域结合Ｅ２酶，其他结构域介导与底物的相互作用，但具体是由哪个结构域介导的，不同的ＴＲＩＭ蛋白也不相同，如Ｅｆｐ与底物的结合是通过Ｂ－ｂｏｘ和卷曲螺旋实现的［２３］，而Ｍｉｄ１是通过Ｂ－ｂｏｘ１［２４］，ＴＲＩＭ１１则是通过卷曲螺旋和ＳＰＲＹ结构域［２５］。
ＲＩＮＧ指蛋白与Ｅ２的相互作用已经在很多生化实验中得到了证实［２６］，对ＲＩＮＧ结构域进行突变或使用锌离子螯合剂竞争性地结合锌离子的实验，也从反面证明ＲＩＮＧ结构域是与Ｅ２连接酶结合的结构域［１９，２３，２５］，并且这种相互作用是以ｃ－Ｃｂｌ－ＵｂｃＨ７复合物的形式结合的。ＲＩＮＧ结构域是否只是与Ｅ２结合，还是同时起着催化的作用，还有待进一步的实验研究［２７］，但可以肯定ＲＩＮＧ结构域是这种相互作用的决定因素。
上面提到，Ｂ－ｂｏｘ和卷曲螺旋结构域介导与底物的结合，而且这２个结构域也参与同源分子的相互作用。Ｂ－ｂｏｘ与卷曲螺旋结构域的这种功能上的相关性，提示它们很可能组成一个功能结构来起作用。从它们的功能上推测Ｂ－ｂｏｘ中的半胱氨酸和组氨酸很可能并不与金属离子结合，而是与邻近的ＴＲＩＭ家族蛋白分子共同结合二价锌离子，形成同源或异源的大分子复合物［２８］。这种大分子复合物在空间上可能形成一个口袋样结构，而底物分子就嵌在其中，随着对ＴＲＩＭ家族蛋白分子研究的深入，将会破解ＴＲＩＭ家族分子形成大分子复合物的空间结构及其作用底物的结构，从而更加深入地认识ＴＲＩＭ家族蛋白分子的功能非特异的Ｃ端结构的功能也不很清楚，但一些研究发现与这一结构域相结合的蛋白参与了泛素化的过程，特别是Ｂ３０．２结构域，发现它能够与蛋白酶亚单位和泛素相互作用［２９］。另一个Ｃ端结构域ＰＨＤ也与泛素化相关［３０］。ＴＲＩＭ家族蛋白的Ｃ端结构域有可能决定着泛素化后靶蛋白的命运。
目前的研究表明，泛素依赖的蛋白酶降解途径并非ＴＲＩＭ家族的成员调控底物水平的惟一途径，有的是以非酶解方式进行的泛素样修饰［３１］。至于具体是通过哪种途径对底物进行调控，取决于泛素链的长度、结合的赖氨酸的位置以及共价结合的泛素复合物的类型［３２］。但是即便是非酶解的修饰途径，Ｅ３酶同样会识别并与底物相互作用，这一点两者是相同的。
目前研究较清楚的ＴＲＩＭ家族的蛋白是ＰＭＬ，它是构成核小体的主要部分。ＰＭＬ转录调控许多重要的分子，并能够与Ｐ５３和Ｒｂ等分子相互作用，参与许多重要的生命过程，如细胞凋亡、衰老、细胞对病毒的应答等［３３］。ＰＭＬ招募其他分子组成核小体，其中一个成分就是ＳＵＭＯ－１，它是第一个被发现的泛素样蛋白［３４］。ＳＵＭＯ参与靶蛋白的转运，调控转录因子的活性，抑制蛋白的酶解［３５］。核小体的许多成分包括ＰＭＬ都与ＳＵＭＯ相结合［３６］。这种特异而有效的结合需要Ｅ３连接酶的参与。目前已知有３种ＳＵＭＯＥ３连接酶，即ＰＩＡＳ、ＲａｎＢＰ２和Ｐｃ２［３５］。ＰＩＡＳＥ３连接酶就
是通过ＲＩＮＧ结构域与ＳＵＭＯ特异的Ｅ２－Ｕｂｃ９相互作用的。虽然还没有直接的实验证据显示ＰＭＬ就是ＳＵＭＯＥ３连接酶，但是它能够结合ＳＵＭＯ和Ｕｂ９［３７，３８］。ＳＵＭＯ与ＰＭＬ结合，形成了核小体结构，许多转录因子如Ｐ５３被招募到核小体上并被ＳＵＭＯ修饰、调控［３９］。上述这些进展表明ＰＭＬ不但与ＳＵＭＯ的结合，而且很可能参与了ＳＵＭＯ的修饰。
泛素依赖的非磷酸化的修饰在转录调控中也起着很重要的作用。研究发现，一些转录调控是通过组蛋白的泛素化、转录因子激活结构域的泛素化而实现的［４０］。ＰＭＬ并非ＴＲＩＭ家族中惟一的转录调控相关蛋白，其他ＴＲＩＭ家族成员，如ＴＩＦ１能够转录调控组蛋白和异染色质结合蛋白［４１］。ＴＲＩＭ家族蛋白可能就是以这种泛素依赖的途径调控转录的。
４结语
综上所述，ＴＲＩＭ家族蛋白具有保守的结构特征，参与了很多重要的生命过程，目前的一些研究显示ＴＲＩＭ家族蛋白很可能是一类锌指Ｅ３泛素连接酶，它们通过Ｂ－ｂｏｘ和卷曲螺旋结构域与底物结合，由ＲＩＮＧ结构域招募Ｅ２连接酶与底物接近而发挥作用。Ｃ端多变的结构域可能决定着底物分子接下来的命运。我们进而可以假设ＴＲＩＭ家族蛋白作用的底物分子也具有相似的结构特征，从而能够被ＴＲＩＭ家族蛋白识别并结合。
底物的泛素化可能要求更高级的结构，ＴＲＩＭ家族蛋白形成骨架，招募结合涉及泛素化、去泛素化以及泛素识别的蛋白。ＴＲＩＭ家族蛋白可能既是特殊的Ｅ３连接酶，又起着构成大分子蛋白复合体骨架的作用，泛素化或泛素样修饰就发生于此。而且ＴＲＩＭ蛋白大分子复合体处于“形成－解体”的不断变化之中，所以能够实时地对信号刺激做出反应［４２］。
有不少ＴＲＩＭ家族成员的功能还是未知的。它们在结构上的共性与其表达时剪切方式的多样性和参与生命活动的多样性是如何统一在一起的，还有待进一步的实验研究。作为一类泛素化连接酶参与底物蛋白的降解或修饰，可以作为目前对ＴＲＩＭ家族功能的解释。
参考文献
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泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所 识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90 种DUB 酶和20 种UBD ，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3 酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box 或PHD 结构域）的E3 酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是 如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游
泛素化修饰与人类疾病 泛素-蛋白酶体途径由泛素(ubiquitin，Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzymes，E2s)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligases，E3s)、26S蛋白酶体和泛素解离酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)等组成，其对靶蛋白的降解是一种级联反应过程。泛素首先在El催化下，其C末端甘氨酸残基与El的半胱氨酸残基间形成高能硫酯键而获得活性。El-泛素结合的中间体再将泛素转移给E2，形成E2-泛素中间体。最后靶蛋白的泛素化还需要另一个特异的泛素蛋白连接酶E3s。E3s可以直接或间接与底物结合，促使泛素从与E2s形成的硫酯中间产物转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε氨基基团上，形成异肽键(isopeptide bond)。当第一个泛素分子连接到靶蛋白上后，另外一些泛素分子在E3s的催化下相继与底物相连的泛素分子的第48位赖氨酸残基相连，形成一条多聚泛素链，作为底物被蛋白酶体识别和降解的靶向性信号。完成泛素化的蛋白质结构被展平进入26S蛋白酶体，在20S催化中心中被降解，泛素分子可被DUBs从底物上水解下来，重复利用。 一、泛素(Ub) 泛素是1975年由Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞高度保守的多肽，单个泛素分子由76个氨基酸组成，分子量约8.5kD。在不同生物体间组成泛素的氨基酸序列差别很小，如酵母和人的泛素仅有3个氨基酸序列的差别。泛素分子紧密折叠成球形，5股混合的β片
层形成一个腔样结构，部对角线位置有1个α螺旋，这个结构称为泛素折叠。这个小蛋白含有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的运行。从泛素折叠中突出来的是具有一定变形性的C 末端延伸部分，这个末端第76位含有一个必须的甘氨酸。泛素与其它蛋白都是通过C-末端第76位甘氨酸来连接的。 二、泛素活化酶(E1) El是泛素与底物蛋白结合所需要的第一个酶，但是对靶蛋白的特异性却几乎没有影响。El是一种广泛表达的多肽，大约1100个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。El有2个亚型，是由同一个mRNA 在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。酵母的El 基因失活后是致命的，说明这个蛋白对于细胞的生存是至关重要的(Stephen等．1996)。El可以水解ATP，与泛素的羧基末端形成高能硫酯键而激活泛素。在真核生物这个激活反应由两步构成：起始形成泛素-腺苷酸中间物，接下来这个中间物与El半胱氨酸残基发生反应形成E1-Ub硫酯键。通常一个泛素分子有一个单独的E1。E1具有高度的催化效能，在低浓度的情况下就能够激活泛素，满足下游的级联反应过程(Pickart．2001)。 三、泛素结合酶(E2s) 级联反应的第二步是泛素分子经过转硫醇反应从E1半胱氨酸残基转移给E2s活化的半胱氨酸位点。E2s在哺乳动物中至少有25个基因，所有的E2s都含有一个保守的大约150个氨基酸的核心结构域，在结构
蛋白质泛素化研究进展——探索蛋白修饰的秘密 泛素是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。被泛素标记的蛋白质在蛋白酶体中被降解。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 2004年，以色列科学家Aaron Ciechanover、Avram Hershko和美国科学家Irwin Rose就因发现泛素调节的蛋白质降解而被授予2004年诺贝尔化学奖。正是因为泛素调节的蛋白质降解在生物体中如此重要，因而对它的开创性研究也就具有了特殊意义。目前，在世界各地的很多实验室中，科学家不断发现和研究与这一降解过程相关的细胞新功能。现在，研究人员已发现泛素具有多种非蛋白水解功能，包括参与囊泡转运通路、调控组蛋白修饰以及参与病毒的出芽过程等。 鉴于蛋白质降解异常与许多疾病，例如癌症、神经退行性病变以及免疫功能紊乱的发生密切相关，而基因的功能是通过蛋白质的表达实现的，因此，泛素在蛋白质降解中的作用机制如能被阐明将对解释多种疾病的发生机制和遗传信息的调控表达有重要意义。 《生命奥秘》本月专题将介绍泛素系统的来源、研究进展，并重点介绍以“泛素-蛋白酶”为靶位的抗癌疗法，希望能给相关领域的研究人员带来崭新的思路。 一、泛素样蛋白的来源及功能 1. 泛素样蛋白及其相关蛋白结构域 2. 泛素样蛋白连接后的结果 3. 泛素样蛋白修饰途径的起源 4. 前景展望 二、泛素化途径与人体免疫系统调节 1. 泛素修饰途径与NF-κB信号通路的关系 2. 泛素蛋白在天然免疫中的作用 3. 泛素化修饰途径在获得性免疫机制中的作用
精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶7个赖氨蛋白链（位赖氨酸）将泛素E2酶、600种E3E3E3E3酶都● 影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1， A泛 。 SDS电
泛素化蛋白检测方法[精华] 泛素化蛋白检测方法 , 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链(polyubiquitin chain)。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解;如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶(DUB)将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域(UBD)所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域(比如U-box或PHD结构域)的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 , 蛋白质泛素化的检测方法
研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点:哪些蛋白发生了泛素化;发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化;进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么,或者说这一过程中的E3酶是什么, 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应,对下游的信号通路有什么影响, 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一:western blot and strip 通过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】方法二:western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三:in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A(被泛素化的那个蛋白)与UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin以及我们要研究的蛋白 B(引起蛋白A泛素化的蛋白)，共同进行孵育。将孵育后的产物进行IP和WB分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的E3连接酶。 方法四:in vitro ubiquitin-binding assay
泛素化蛋白检测方法 ●蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 ●蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样, 泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程, 它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽, 它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基, 因此它们之间也能够经过这些位点互相连接, 形成多泛素蛋白链( polyubiquitin chain) 。当前研究显示, 如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连, 会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解; 如果与被修饰蛋白上其它位点, 比如第63位赖氨酸残基相连, 则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样, 泛素化修饰途径也是可逆的, 即能够经过去泛素化酶( DUB) 将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后, 连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域( UBD) 所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD, 这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶, 它能够分
为两大类, 即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域( 比如U-box或PHD结构域) 的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点: 哪些蛋白发生了泛素化; 发生了泛素化的蛋白质, 具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化; 进行定量。 明确了上述几点后, 进一步需要弄清楚的是, 我们感兴趣的泛素化蛋白, 是如何发生泛素化的, 影响这一泛素化过程的关键分子是什么? 或者说这一过程中的E3酶是什么? 然后需要研究的是, 这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应? 对下游的信号通路有什么影响? 研究上述内容的实验方法和实验流程: 方法一: western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带, 拍照后, 将膜strip。 然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应, 显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二: western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和western blot分析。
仅作参考，如有抄袭，依法追究目录： 1.研究背景 2.泛素化降解途径 2.1泛素的基本结构 2.2泛素化的过程 2.3 E3酶对蛋白底物的识别 2.4 蛋白底物在26S蛋白酶体中的降解 3.研究的意义以及应用 4.研究展望
真核生物细胞中的蛋白质泛素化降解 摘要： 蛋白质是执行生命活动的基本分子,细胞中的蛋白质不断地处于合成、修饰与降解的代谢更新过程中。保持细胞正常的蛋白质代谢对于生命的正常功能至关重要。目前所知蛋白质的降解主要通过两种途径:溶酶体降解途径和泛素介导的蛋白酶体降解途径。溶酶体降解途径是一个非选择的蛋白质降解途径,主要降解通过摄粒作用或胞饮作用进入细胞内的外源蛋白质;而泛素介导的途径是一个受到严格的时空调控的特异性蛋白质降解途径。泛素系统广泛存在于真核生物中，是精细的特异性的蛋白质降解体系。泛素是一种序列保守的小分子蛋白质，蛋白质与泛素结合后，被蛋白酶体通过消耗ATP的方式降解。泛素系统由泛素、26S 蛋白酶体、多种酶（E1、E2、E3去泛素酶等）组成。其中E1和E2被称为泛素活化酶和泛素载体酶。泛素连接酶E3负责连接泛素与特异性底物，这样泛素化底物可以被26S蛋白酶体降解为若干肽段。泛素系统在真核生物中有非常重要的作用，通过降解蛋白质，调节细胞的分化、免疫，参与转录、分泌调控和细胞形成等，与人类的某些疾病有关。本文就泛素系统的组成、调控机制和研究进展做一介绍。 关键字：泛素系统；E3；26S蛋白酶体 正文： 1.研究背景 蛋白质在细胞内的降解是一个复杂的过程，但是又是一个高度有序的过程。真核生物中蛋白质的降解绝大多数都是由泛素系统完成。蛋白质首先是由泛素分子所特异性识别结合，在泛素分子的介导下，由泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2以及泛素连接酶E3特异性作用，与26S蛋白酶体作用，被切割成多肽。多聚泛素链可以还原成单体，循环使用。泛素与细胞的多种生命活动有关，例如细胞生长发育过程中组织抑制因子的选择性降解；细胞周期中，周期蛋白选择性降解等。许多疾病和泛素化的过程有关，利用泛素系统治疗疾病也成为了热点。 2.泛素蛋白酶系统 2.1泛素的基本结构 泛素是一种热稳定性蛋白，含有76个氨基酸，相对分子质量8.6kDa。结构保守，如图一是人和酵母细胞中泛素分子序列比对，我们可以看到，只有三个氨基酸的差别。 图一人和酵母的泛素分子序列比对
泛素化蛋白检测方法 LG GROUP system office room 【LGA16H-LGYY-LGUA8Q8-LGA162】
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应对下游的信号通路有什么影响
这是一般蛋白质降解的一般泛素化途径，首先，在ATP供能的情况下，泛素的C末端与非特异性泛素激活酶E1的半胱氨酸残基共价结合，形成E1-泛素复合体。E1泛素复合体再将泛素转移给另一个泛素结合酶E2。E2则可以直接将泛素转移到靶蛋白赖氨酸残基的ε-氨基团上，在通常情况下，靶蛋白泛素化需要一个特异的泛素蛋白连接酶E3。当第一个泛素分子在E3的催化下连接到靶蛋白上以后，另外一些泛素分子相继与前一个泛素分子的赖氨酸残基相连，逐渐形成一条多聚泛素链。然后，泛素化的靶蛋白被一个相对分子质量很大的称为proteasome的蛋白质复合体逐步降解。多聚泛素也将解聚为单个泛素分子，重新被利用。 细胞周期各个时相的过渡需要细胞周期蛋白（细胞周期蛋白cyclin、细胞周期依赖激酶CDK, 及CDKs抑制蛋白等）其他蛋白质的降解,而这些蛋白的降解又与泛素化途径密不可分，因此泛素化途径与细胞周期有着十分密切的关系。 泛素(ubiquitin)是一种存在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质，使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会将该蛋白质水解。泛素也可以标记跨膜蛋白，如受体，将其从细胞膜上除去。泛素76个氨基酸组成，分子量大约8500道尔顿。它在真核生物中具有高度保留性，人类和酵母的泛素有96%的相似性，只差三个氨基酸。C-terminal是GG β-Grasp 需要被蛋白酶体降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接。这一过程是一个三酶级联反应，即需要有由三个酶 闭锁小带（zonula occludens）又称紧密连接。它是由网格样的封闭索（sealing strand）连接而成的。封闭索是由相邻细胞膜内连接起来的膜蛋白构成。它是闭锁小带的封闭成分，由两排蛋白质颗粒紧密粘着、状似拉链，且不留细胞间隙。封闭索之间的细胞间隙约为 10-15nm。 闭锁小带具有封闭细胞间隙的作用，是阻碍物质扩散的屏障，使细胞和外部的体液分隔。闭锁小带在细胞层内具有透性屏障（permeability barrier）的功能，如小肠肠腔内保留大量的内含物，通过上皮细胞层选择性地输送营养物质，经过细胞间隙后再进入血液。经两组不同的特异性细胞膜进行运送，一组膜是位于上皮细胞的顶端表面，使分子泵入细胞内；另一组膜是位于细胞的基部和两侧，称基侧面，使分子从细胞的基侧面泵出。泵送过程有一定的方向，从细胞顶端泵入的分子不能扩散到细胞的基侧面，而从细胞的基侧面泵出的分子也不能扩散到细胞的顶端。这样，闭锁小带可以防止输送的分子漏出到肠腔，发挥透性障体的功能。 蛋白酶体(proteasomes) 是在真核生物和古菌中普遍存在的，在一些原核生物中也存在的一种巨型蛋白质复合物。在真核生物中，蛋白酶体位于细胞核和细胞质中。蛋白酶体的主要作用是降解细胞不需要的或受到损伤的蛋白质，这一作用是通过打断肽键的化学反应来实现。 从结构上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物，包括一个由四个堆积在一起的环所组成的“核心”（右图中蓝色部分），核心中空，形成一个空腔。其中，每一个环由七个蛋白质分子组成。中间的两个环各由七个β亚基组成，并含有六个蛋白酶的活性位点。这些位点位于环的内表面，所以蛋白质必须进入到蛋白酶体的“空腔”中才能够被降解。外部的两个环各含有七个α亚基，可以发挥“门”的作用，是蛋白质进入“空腔”中的必由之路。
泛素化内稳态及信号 一：背景 1.细胞内蛋白酶解：80%-90%通过蛋白酶体降解，10%-20%通过自噬。 2．泛素： 由70个左右的氨基酸组成，本身有7个赖氨酸可被泛素化。细胞内广泛存在的一种蛋白。占细胞总蛋白1-2%，真核生物中高度保守。泛素内稳态取决于不断的改变。泛素化和去泛素化是一个动态平衡过程。 3．细胞内泛素化-蛋白酶体系统（U P S） （1）E3连接酶亚家族：
E3连接酶的功能影响细胞每个方面的活性，它的改变可以导致疾病。 （2）E3连接酶（大约600种）可以作为o n c o g e n e或者t u m o r s u p p r e s s o r （3）泛素信号：分类及功能
功能：细胞凋亡、D N A转录和修复、分化和生长、免疫应答和炎症，细胞表面受体和离子通道，血管新生，核糖体生物合成等等泛素信号异常：肿瘤、病毒感染、神经退行性疾病、发育畸形、细菌感染等。蛋白质降解受到抑制后，正常细胞会出现生长抑制，而肿瘤细胞则出现凋亡。 二、泛素内稳态及应激 1.细胞内泛素内稳态（老师上课说过这是可能的考点）
泛素内稳态：泛素合成 聚泛素链形成 聚泛素链组装 泛素降解 泛素应激：泛素增加、泛素减少 泛素减少：损害减数分裂、组织生长缺陷、突触发育及功能、胎儿肝脏发育细胞周期及耐逆性、增殖缺陷、扰乱造血系统、神经退化和代谢紊乱、细胞分化异常 泛素增加：延迟衰老、改变基因表达、热击的应答方式、促进细胞增殖和应激耐受、改变蛋白酶体构成、激活自噬 三、泛素信号和主要信号通路 1、N-e n d r u l e通路 泛素化蛋白酶体系统中最简单的规则：及蛋白质N端的特点决定蛋白质的半衰期，若N端为精氨酸或者赖氨酸的蛋白质寿命就很
泛素化蛋白检测方 法
泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7个赖氨酸残基，因此它们之间也能够经过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。当前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63位赖氨酸残基相连，则靶蛋白能够发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即能够经过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体能够被各种泛素蛋白结合结构域（UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重
要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它能够分为两大类，即含有HECT结构域的E3酶和其它含有RING 结构域或RING样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后能够产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：western blot and strip 经过WB检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。经过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：western blot and immunoprecipitations 经过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分
精心整理 泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一 样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitinchain ）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第63 位赖氨酸残基相连，则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB ）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（UBD ）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种E1酶、50种E2 酶、600种E3酶、90种DUB 酶和20种UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类，即含有HECT 结构域的E3酶和其它含有RING 结构域或RING 样结构域（比如U-box或PHD结构域）的E3酶。这两种E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化；发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定
t o 精心整理 泛素化蛋白检测方法 ● 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活 性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由76个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在E1、E2、E3酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有 7（位赖氨种E2酶、600的作用。结 构域的E3酶。这 两种E3● 的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的E3酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路 有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程：方法一：westernblotandstrip 通过WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜strip 。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的
特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：westernblotandimmunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行SDS电泳和westernblot分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：invitroubiquitinationassay 将要研究的目的基因转染293细胞，使其大量表达。24h后提取并分离目的蛋白。在体外反应buffer中将我们要研究的蛋白A（被泛素化的那个蛋白）与UBE1，UbeH13- SDS