45卷 2期2005年4月
微生物学报
Acta Microbiologica Sinica
V ol.45April
N o.2
2005
基金项目:国家自然科学基金(30170008)
3
通讯作者。T el :86-531-8365128;Fax :86-531-8565610;E -mail :m inxiao @https://www.doczj.com/doc/5d12612401.html,
作者简介:陆 宇(1980-),男,河南省开封市人,硕士研究生,从事双歧杆菌糖苷酶及其基因研究。E -mail :luyu @https://www.doczj.com/doc/5d12612401.html, 其他作者:陈忠民,钱新民
收稿日期:2004-07-12,修回日期:2004-10-12
短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga 1在大肠杆菌中的高效表达
陆 宇 赵 晗 王勤鹏 刘巍峰 肖 敏
3
(山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100)
摘 要:短双歧杆菌(Bifidobacterium breve 203)α-D -半乳糖苷酶基因(aga 1)被克隆到大肠杆菌温度诱导表达质粒pBV220中,构建重组质粒pBVaga1,转入大肠杆菌进行温度诱导表达,得到的重组酶Aga1在大肠杆菌DH5α、DH10B 和BL21中的比活分别为28108、19144和13185U Πmg ,均高于短双歧杆菌α-D -半乳糖苷酶的比活1176U Πmg 。重组质粒pBVaga1在E .coli BL21中稳定性较好。重组酶Aga1蛋白亚基分子量约67kD ,最适反应温度为45℃,酶在40℃以下稳定,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活;最适反应pH 为410～414,酶在pH 316～610范围内稳定;酶对p -硝基苯酚-α-半乳糖苷的K m =1143mm ol ΠL ,V max =35171μm ol Π(L ?min ),对蜜二糖的K m =261mm ol ΠL ,V max =63169μm ol Π(L ?min );酶在蜜二糖、棉子糖水解体系中不显示转糖基活性。结果说明Aga1与已经报道的一种短双歧杆菌的α-D -半乳糖苷酶不同,是新发现的一种短双歧杆菌的α-D -半乳糖苷酶。关键词:双歧杆菌,α-D -半乳糖苷酶,温度诱导表达
中图分类号:Q786 文献标识码:A 文章编号:000126209(2005)022*******
双歧杆菌是人和动物肠道的重要生理性益生
菌[1～3],大量研究证实,从婴儿到成年至老年,年龄、食品结构和疾病都会导致人体肠道中双歧杆菌的数量大幅度减少。双歧杆菌益生菌或低聚糖益生元均可以用于提高人体肠道中双歧杆菌的数量,而低聚糖的稳定性和高效性明显优于益生菌,因此,近年来低聚糖类物质的研究开发成为国内外的研究热点[4]
。
目前已经研究和开发了多种低聚糖,如低聚半乳糖、低聚果糖、低聚甘露糖、低聚木糖、低聚乳果糖、乳酮糖、低聚异麦芽糖、龙胆低聚糖等。双歧杆菌产生的多种糖苷酶,可水解利用这些不可降解性低聚糖,而且其胞外糖苷酶还可降解病原菌表面的
复杂多糖,阻止病原菌在肠腔内的定植[5]
。双歧杆菌的多种糖苷酶性质已得到研究,如α或β-半乳糖
苷酶、
α或β-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、甘露糖苷酶、D-木聚糖苷酶、D-木糖异构酶等[6]
,并且发现了某些糖苷酶具有转糖基活性,为酶法合成低聚糖或糖基缀合物的加工提供了新的酶源[7～9]
。
α-半乳糖苷低聚糖是各类低聚糖中最为有效的
双歧因子[10,11]
,可用来筛选肠道细菌中的双歧杆菌[12]
。α-D-半乳糖苷酶(α2D 2galactosidase ,EC3.2.1.22)也可以作为有效的双歧杆菌的鉴定依据之
一[13,14]。目前双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因的报道只有3种:青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis )的AF124596、长双歧杆菌(Bi .longum )的AE014784及短双歧杆菌(Bi .breve )的AF406640,其中研究工
作较全面的是青春双歧杆菌,包括基因克隆、序列分
析及酶功能等各个方面[9,15,16]
,长双歧杆菌的α-D-半乳糖苷酶基因只在其基因组序列中推测,没有见到其它方面的研究报道,短双歧杆菌的α-D-半乳糖苷酶基因由本研究室报道,同时我们还研究了短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶的产生、纯化及性质研究[17～19]。本文研究短双歧杆菌(Bi .breve )α-D-半乳糖苷酶基因(aga 1)在大肠杆菌中的温度诱导高效表达及重组酶性质,为双歧杆菌糖苷酶资源的开发和利用奠定基础。
1 材料和方法
111 材料
11111 菌株、质粒和培养基:大肠杆菌(E scherichia
coli )DH5α、DH10B 、BL21均为本实验室保存,质粒pBV220为中国预防医学科学院馈赠。Bi .breve 203
及其培养、保存方法参照文献[19],E .coli 培养基为
LB 培养基,重组E .coli 的培养和保存均使用含有
氨苄青霉素(100μg Πm L )的LB 培养基。温度诱导表
达采用30℃培养,42℃诱导表达[20]。
11112 主要试剂:Bam HⅠ、Eco RⅠ、T4DNA Ligase 购自T aK aRa公司;p f u DNA聚合酶购自Sang on公司;p-硝基苯酚-α-D-半乳糖苷(p NPG al)和4-甲基伞形酮-α-D-半乳糖苷(4-MUG al)购自Sigma;DE AE Sepharose Fast Flow和Sephadex G-150购自Amershm Pharmacia Biotech;G igapite K-100S购自日本东亚合成株式会社;Amicon ultra P L-10购自Millipore;牛血清白蛋白购自PIERCE;T LC层析板(Silica gel60,N o. 533)购自Merck。其它试剂均为分析纯。
112 Bi.breve203α-D-半乳糖苷酶基因(aga1)的获得
根据本室报道的Bi.breve203α-D-半乳糖苷酶基因序列(AF406640),aga1基因的理论ORF大小为2101kb,位于nt350～2359。引物设计采用PRI MER 210版。上游引物F的位置在nt250～268,序列为:5′-AA T AG AA TT C A TG TTGG CGG CCTG CT CT-3′,引入Eco RⅠ酶切位点;下游引物R的位置在nt2377～2393,序列为:5′-AAT AGG AT CC ATT CG CTG TG CG CTG TG-3′,引入Bam HⅠ酶切位点。从Bi.breve203提取染色体DNA为模板,进行PCR扩增,扩增的DNA片段大小应为211kb。PCR反应体系(50μL):终浓度为10ngΠμL的模板、1μm olΠL的引物、200μm olΠL的dNTP, p f u DNA聚合酶215U,1×PCR缓冲液。反应条件: 94℃5min;94℃1min;50℃1min,72℃3min,28个循环;72℃10min。
113 α-D-半乳糖苷酶基因温度诱导表达重组质粒的构建
PCR扩增片段经Eco RⅠ和Bam HⅠ双酶切,定向连接到同样双酶切后的pBV220质粒上,构建成重组质粒pBVaga1。感受态细胞的制备、重组质粒的转化和重组子的筛选以及质粒的提取方法,按分子克隆进行[21]。
114 重组酶的纯化
粗酶液的制备:收集新鲜培养细菌细胞, 10mm olΠL磷酸缓冲液(pH710)洗涤并重悬,0～15℃超声波破碎细胞,10000rΠmin离心30min,上清液为粗酶液。重组酶纯化的所有过程在4℃下操作。重组大肠杆菌的粗酶液来源于1L培养物。除了特别提出外,所有步骤采用10mm olΠL,pH710的磷酸钾缓冲液。
11411 硫酸铵沉淀:重组大肠杆菌的粗酶液用20%～40%饱和度的硫酸铵沉淀,4℃过夜后,沉淀溶于适量缓冲液中,透析备用。11412 DE AE Sepharose Fast Flow柱层析:将上述样品上柱(115cm×15cm),以0～2m olΠL NaCl的缓冲液
梯度洗脱,酶活出现在大约115m olΠL NaCl的洗脱缓冲液中,合并具有酶活的洗脱液,80%饱和度的硫酸铵沉淀后,溶于少量缓冲液中,透析备用。
11413 G igapite K-100S柱层析:将上述样品上柱(115cm×30cm),以0～200mm olΠL,pH710的磷酸钾缓冲液梯度洗脱,酶活出现在大约150mm olΠL的磷酸钾洗脱缓冲液中,合并具有酶活的洗脱液,用Amicon ultra P L-10浓缩并除盐,为部分纯化样品。11414 Sephadex G-150柱层析:将部分纯化样品上柱(115cm×90cm),以含有100mm olΠL NaCl的缓冲液洗脱。本实验中没有得到具有酶活的蛋白质峰。115 α-D-半乳糖苷酶活力测定
2mm olΠL p NPG al、50mm olΠL醋酸钠缓冲液(pH515)和适当稀释的酶液共0118m L,37℃反应10min后,加入1105m L012m olΠL pH1015硼酸钠缓冲液终止反应,测定OD
400
(对硝基苯酚的摩尔消光系数17700)。活力单位定义:每分钟从p NPG al底物中水解释放1μm ol的硝基苯酚的糖苷酶为一个酶活单位(U)。
116 蛋白质含量的测定
采用Bradford测定法[21],以牛血清蛋白为标准蛋白。
117 T LC薄板层析
糖样品(10～30μg)点样T LC层析板,展层剂(正丁醇:乙醇:水=5∶3∶2)展开后,雾喷显色剂(20% H2S O4、015%3,5-二羟基甲苯水溶液),140℃加热烘烤约10min至糖斑点显色。
2 结果
211 重组质粒pBV aga1的构建
PCR扩增得到的DNA片段长度约为211kb,与预计的大小相符。双酶切后与载体pBV220(316kb)连接,得到质粒pBVaga1。对pBVaga1进行酶切验证,结果证明质粒构建成功。
212 α-D-半乳糖苷酶基因在E.coli中的表达将重组质粒pBVaga1分别转化E.coli DH5α、E.coli DH10B和E.coli BL21。将重组菌株过夜培养物,按1%接种量接于含Am p100μgΠm L的LB液
体培养基,30℃培养至OD
600
=015时,42℃诱导5h,收集细胞后制备粗酶液并测定α-D-半乳糖苷酶活力和蛋白含量,计算酶的比活。表1结果显示重组质
242微 生 物 学 报45卷
粒pBVaga1在3株大肠杆菌中均得到温度诱导高效表达,粗酶液中α-D-半乳糖苷酶的比活均高于Bi. breve203,其中在E.coli DH5αΠpBVaga1中的比活为28108UΠmg,是Bi.breve203酶比活的16倍。
表1 不同大肠杆菌中重组α-D-半乳糖苷酶的比活
T able1 S pecific activity of recombinantα-galactosidase in various strains
S trains Bi.breve203
E.coli
BL21
ΠpB Vaga1
E.coli
DH5α
ΠpB Vaga1
E.coli
DH10B
ΠpBV aga1
S pecific
activity of
α-galactosidase
Π(UΠmg)
1176131852810819144
213 质粒稳定性的研究
参照文献[22]方法,对重组质粒pBVaga1在E. coli DH5α、E.coli DH10B和E.coli BL21中的稳定性进行研究。
从平皿中挑一重组菌单菌落接入2m L LB培养基(Am p100μgΠm L)中,30℃过夜培养后,取20μL接种不含Am p的LB培养基中,30℃培养12h,如此转接3次,即使菌体在无Am p的LB培养基中持续生长48h。最后在细菌生长到OD600=015时,42℃热诱导5h,诱导前后分别取样,涂于不含Am p的LB平板上,再分别从每个平板中取100个菌落点种于含Am p的LB抗性平板上,计算每份样品中的菌落对Am p的抗性百分数。
表2结果显示重组质粒pBVaga1在E.coli DH5α和E.coli DH10B中稳定性较差,无Am p的LB培养4代共48h后温度诱导5h,抗性菌落分别只有4%和44%;而在E.coli BL21中稳定性较好,同样实验条件下抗性菌落占80%,可以满足无抗生素选择压力下大规模生产的要求。
表2 重组质粒pBV aga1在不同宿主菌中的稳定性(%)
T able2 Recombinant plasm id stability of various E.coli strains
S trains T ime of inducementΠh 05
E.coli BL21ΠpBVaga1 E.coli DH5αΠpBVaga1 E.coli DH10BΠpBVaga192
80
86
80
4
44
214 重组酶的纯化
本实验采用E.coli BL21ΠpBVaga1进行重组酶纯化的研究。粗酶液经硫酸铵沉淀、DE AE Sepharose Fast Flow柱层析、G igapite K-100S柱层析及Amicon ultra P L-10浓缩分离后,部分纯化样品进一步进行Sephadex G-150凝胶过滤层析时,没有得到具有酶活性的蛋白峰,结果说明重组酶的活性状态分子量大小不均一。部分纯化样品S DS-PAGE结果(图1)显示样品还没有得到完全的纯化,有一条蛋白主带,相应于温度诱导高效表达的蛋白带,分子量约为67kD。部分纯化过程中酶的比活、蛋白含量的变化以及酶的得率见表3
。
图1 重组酶的SDS2PAGE图谱
Fig.1 S DS-PAGE of recombinantα-D-galactosidase from recombinant E.coli BL21ΠpBVaga1
11Partial purified recombinant enzyme;21Cell-free extract of E.coli BL21ΠpBVaga1induced;31Cell-free extract of E.coli BL21ΠpBVaga1 non-induced;M.M olecular marker.
表3 重组α-D-半乳糖苷酶的纯化过程
T able3 Purification of recombinantα-D-galactosidase from
E.coli BL21ΠpBVaga1
S tep
T otal
protein
Πmg
S pecific
activity
Π(UΠmg)
T otal
activity
ΠU
Y ield
Π% Cell-free extract95105131851316144100100 (NH4)2S O4(20-40%)fractionation161463217553913441115 DE AE Sepharose Fast Flow column
chromatography
21247217416311412138 G igapite K-100S column
chromatography
011896152171341132 215 重组酶酶学性质
S DS-PAGE结果显示图1,分子量约67kD的蛋白质温度诱导得到高效表达,其占粗酶液总蛋白含量由诱导前的810%提高到2317%,在部分纯化样品中该蛋白质是一条主带,其含量占样品总蛋白的6715%,因此可以认为是重组酶蛋白。重组酶粗酶液和部分纯化样品37℃与4-MUG al反应10min后, 365nm下观察到强烈荧光。Native gradient PAGE后进行4-MUG al活性染色,胶中没有显示出集中的活性染色荧光带,荧光有弥散分布的现象。部分纯化样品Native gradient PAGE后考马斯亮蓝染色,也没有显示出相应于67kD整数倍数的蛋白带。结果说明重组酶的活性状态分子量大小不均一。
342
2期陆 宇等:短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因aga1在大肠杆菌中的高效表达
以p NPG al 为酶反应底物,于不同的温度下(20
～70℃
)用常规方法测定相对酶活,求得酶反应的最适温度是45℃。于不同的温度下将酶保温30min 后,再用常规方法测定并计算相对酶活,显示酶在40℃以下稳定,50℃时剩余约80%的酶活,温度大于50℃后酶活急剧下降,60℃仅剩余约5%的酶活性,70℃时酶全部失活。
用pH 2125～318柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH
315～610醋酸-醋酸钠缓冲液,pH 515～810磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液,pH 810～10硼酸-氢氧化钠缓冲液分别配制酶反应体系,用常规方法测定并计算相对酶活,结果显示酶反应的最适pH 为410～414;酶在不同pH 的缓冲液中4℃过夜后,用常规方法测定相对酶活,结果表明酶在pH 316～610范围内稳定。
Hg +、Cu 2+、Ag +
(各1mm ol ΠL )和PC M B (0101mm ol ΠL )强烈抑制酶活性,C o 2+、Mg 2+、Ca 2+
、Mn 2+、Z n 2+(各1mm ol ΠL )、E DT A 和DTT (各10mm ol ΠL )对酶活性无抑制,酶对p NPG al 的K m =1143mm ol ΠL ,V max =35171μm ol Π(L ?min );酶对蜜二糖的K m =261mm ol ΠL ,V max =63169μm ol Π(L ?min )。
将重组酶分别与棉子糖和蜜二糖37℃混合进行反应,取不同时间的反应样品进行T LC 薄板层析分析酶反应产物。图2结果显示,重组酶的水解产物随时间增加而逐渐增多,在24h 反应过程中没有发现转糖基产物,说明该酶在水解α-D-半乳糖苷键的过程中不存在转糖基活性
。
图2 重组酶水解蜜二糖、棉子糖的反应产物
Fig.2 Reaction products after hydrolysis of melibiose or raffinose by recombinant α-D-galactosidase
1.G lucose ;21G alactose ;31Sucrose ;41Raffinose ;51M elibiose ;6～131Raffinose with the enzyme for 2h ,4h ,6h ,8h ,10h ,12h ,18h and 24h ,respectively ;14～211M elibiose with the enzyme for 2h ,4h ,6h ,8h ,10h ,12h ,18h and 24h ,respectively.
3 讨论
低聚糖类物质在肠道细菌中可选择性刺激双歧
杆菌的生长,其中分子中含有α-D-半乳糖苷键的α-
D-半乳糖苷低聚糖如蜜二糖(Melibiose )、棉子糖
(Raffinose )和水苏糖(Stachy ose )最为有效。这类低
聚糖分子中的α-半乳糖苷键专一性地为α-半乳糖苷酶水解。研究发现人源双歧杆菌中广泛存在α-半乳糖苷酶,但目前见报道的只有青春双歧杆菌(Bi .adolescentis )和短双歧杆菌(Bi .breve )的α-半乳糖苷酶得到研究。1999年Leder S 等提纯了Bi .adolescentis DS M20083的α-半乳糖苷酶,是一个分子量为344kD 的均一四聚体。4-MUG al 活性染色的结果证明,分子量为145kD 酶的二聚体也具有酶的活性[15]。同年Van Laere 等[7]
报道了该酶在蜜二糖、棉子糖和水苏糖的水解体系中具有转糖基活性,并对蜜二糖水解体系中合成的三糖和四糖进行了结构分析,说明新生成的半乳糖苷键是α-D-G al-(1→6)键,且合成的三糖能特异性的刺激双歧杆菌的生长。同年Broek 等人进一步克隆了Bi .adolescentis 的α-半乳糖苷酶基因,在大肠杆菌中得到了高效表达,重组酶在水解蜜二糖和水苏糖的反应体系中仍具有转糖
基活性[9]
。2000至2001年,本室详细报道了Bi .breve 203的α-半乳糖苷酶的产生、纯化及性质,Bi .
breve 203的粗酶液在Native gradient PAGE 电泳后,
活性染色观察只有一条活性荧光带,分子量约为
156kD ,粗酶液纯化后的酶蛋白单亚基分子量约为
79kD [19]
。
本文研究短双歧杆菌α-D-半乳糖苷酶基因
aga 1在大肠杆菌中的温度诱导高效表达。根据基
因aga1的核苷酸序列分析,Aga1酶蛋白的理论ORF 为2101kb ,由669个氨基酸残基组成,理论分子量为7412kD 。本文结果表明,基因aga 1在大肠杆菌中温度诱导高效表达后的重组酶Aga1的亚基分子量约为67kD ,不是理论值7412kD 。用SignalP
310Server (http :ΠΠw w w.cbs.dtu.dk Πservices ΠSignalP Π
)分析Aga1氨基酸序列,在N-端没有发现可能存在的信号短肽序列,因此我们推测基因aga 1的真正起始位点不是在理论ORF 的第一个ATG,而是在第三个ATG,其理论分子量是67195kD 。该推测已经通过其它的实验得到了证明:在大肠杆菌中采用基因aga 1的C -端6His-tag 标记表达,利用亲合层析提纯了重组酶,其分子量大小与本论文的结果一致,而且标记表达的纯酶其N-端氨基酸序列分析结果与理论ORF 中第三个ATG 开始的氨基酸序列完全相符(结果未在本论文显示)。
E .coli BL21ΠpBVaga1温度诱导后,粗酶液的比活为13185U Πmg ,该样品和部分纯化样品(比活
442微 生 物 学 报45卷
96152UΠmg)37℃与4-MUG al反应10min后,365nm下都显示出强烈荧光,但是在Native gradient PAGE电泳后的活性染色中,胶中却没有显示出集中的活性染色荧光带,荧光有弥散分布的现象。部分纯化样品在Sephadex G-150分子筛柱层析过程中,也没有对应于酶活的蛋白质峰出现。这些结果都说明重组酶Aga1的活性状态分子量大小不均一,蛋白质亚基似没有一种稳定的聚合状态。根据Bi.breve203粗酶液的活性染色,只能观察到一种分子量为156kD的双亚基α-D-半乳糖苷酶的结果[18,19]可以推断,Aga1酶蛋白或者不存在粗酶液中,或者其活性状态的分子量不均一,在Bi.breve203中可能是一个不溶性的细胞蛋白质,存在于细胞膜或者细胞壁等位置。
重组酶Aga1和已经报道的Bi.breve203的双亚基α-D-半乳糖苷酶(以下记为Aga2)除了活性状态和亚基分子量大小的不同,在其它性质上也表现出不同。转糖基活性方面,在棉子糖、蜜二糖的水解体系中,重组酶Aga1只表现出水解活性,没有转糖基活性,24h反应过程中没有转糖基产物出现。但是同样反应条件下,Aga2却在蜜二糖或棉子糖的水解体系中显示出转糖基活性,其反应体系中存在新
的转糖基寡糖产物(图3)。在温度稳定性和pH
对
图3 Bi.breve203的α-D-半乳糖苷酶在蜜二糖、棉子糖反应体系中的转糖基活性
Fig.3 Reaction products formed after transgalactosylation of melibiose or raffinose byα-D-galactosidase from Bi.breve203
11G alactose;21G lucose;31M elibiose;41Raffinose;5and71 M elibiose with enzyme for12h and24h,respectively;6and81 Raffinose with enzyme for12h and24h,respectively.
酶的影响等方面,Aga1在60℃仅剩余约5%的酶活性,而Aga2在60℃还具有80%的酶活性;Aga1最适反应pH(410～414)和pH稳定性(316～610)均在酸性范围内,明显较Aga2的最适反应pH(515～615)和pH稳定性(515～915)偏向酸性;Aga1对天然底物蜜二糖的亲合性较差,其K
m
为261mm olΠL,
远远大于Aga2的K
m (2mm olΠL)[18,19]。
综合以上分析和比较我们可以看出,本文研究
的Bi.breve203α-D-半乳糖苷酶基因aga1所对应
的α-D-半乳糖苷酶Aga1与已经报道的同一种菌的
一种α-D-半乳糖苷酶(Aga2)在分子量、转糖基活性
以及其它部分酶性质上都不同,是新发现的一种
Bi.breve203的α-D-半乳糖苷酶,因此Bi.breve203
中至少存在2种α-D-半乳糖苷酶。有关Aga2的基
因克隆和进一步的研究工作目前正在积极开展。
致谢 感谢Hidehiro K umagai教授(Laboratory of
Applied M olecular Microbiology,K y oto University)提供
短双歧杆菌(Bi.breve203)。
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H igh expression ofα-D-galactosidase gene(aga1)of Bifidobacterium
breve203in Escherichia coli
LU Y u ZH AO Han W ANG Qin-peng LI U Wei-feng XI AO Min3
(State K ey Laboratory o f Microbial Technology,Shandong Univer sity,Jinan250100,China)
Abstract:α-D-galactosidase gene(aga1)of Bifidobacterium breve203was cloned into tem perature expression vector pBV220and trans formed into E.coli.The recombinant plasmid pBVaga1was induced to express with tem perature.The specific activities of recombinant enzyme Aga1in E.coli DH5α,E.coli DH10B and E.coli BL21were28108UΠmg, 19144UΠmg and13185UΠmg,respectively.The recombinant plasmid pBVaga1is m ore stable in E.coli BL211The m olecular weight of Aga1as determined by S DS-PAGE was about67kD.The optimum pH of Aga1was pH410～414, and it was stable between pH316and610(kept at4℃overnight).The optimum tem perature of Aga1was45℃,and it was stable below40℃(incubated for30min).K m-values for p-nitrophenyl-α-galactopyranoside(p NPG al)and melibiose were calculated with1143mm olΠL and261mm olΠL,respectively.N o transgalactosylation activity was found when Aga1hydrolyzed melibiose or raffinose.The results suggest that Aga1is much different from reportedα-D-galactosidase from Bi.breve2031Aga1is another kind ofα-D-galactosidase in the same bifidobacteria strain.
K ey w ords:Bifidobacteria,α-D-galactosidase,T em perature inducible expression
F oundation item:Chinese National Natural Science F oundation(30170008)
3C orresponding author.T el:86-531-8365128;Fax:86-531-8565610;E-mail:m inxiao@https://www.doczj.com/doc/5d12612401.html,
Other authors:CHE N Zhong-m in,QIAN X in-m in
Received date:07-12-2004
642微 生 物 学 报45卷
Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal?broblast by p66Shc down-regulation Yi Na Wang a,1,Wei Wu b,1,Hong Chao Chen a,Hong Fang a,* a Department of Dermatology,1st Af?liated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,79#Qing Chun Road,Hangzhou310003,China b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Af?liated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China 1.Introduction It has been noticed that the appearance of facial wrinkling in the Asian population is delayed for about10years when compared to the Caucasian population.The pattern and degree of facial wrinkling is different as well.There are many factors contributing to this difference,such as lifestyle,genetic background,and nutrition.The Asian diet is well known for being rich in soy or soy- containing products and the estrogen-like compounds in soy protein,along with their antioxidant activities,are regarded as potential weapons against the aging process. Iso?avones,a group of polyphenolic compounds found in and isolated from a number of plants,with soybeans and soy products like tofu and textured vegetable protein being the primary food source,have attracted a great deal of interest,especially for possible properties in the prevention and treatment of cancer and chronic disease including cardiovascular diseases and diabetes mellitus[1,2].Recent studies further suggested that iso?avones might act as a photoprotection and inhibit the initiation and promotion of skin carcinomas[3]. One of the main iso?avones is genistein.Genistein has been reported to modulate molecular functions mainly by acting as a tyrosine kinase inhibitor[4].Also genistein has anti-oxidation and anti-angiogenesis effects as well as estrogenic activities[5].Previous evidences have suggested that genistein down-regulates UVB- induced signal transduction cascades in carcinogenesis and confers photo-protective effect in SKH-1murine skin and in human reconstituted skin[6,7].Recent studies revealed that genistein prevent UV-induced photoaging and photodamage in human skin[8].However,although studies have been reported on the Journal of Dermatological Science58(2010)19–27 A R T I C L E I N F O Article history: Received4July2009 Received in revised form9February2010 Accepted10February2010 Keywords: Genistein Photoaging UVB p66Shc FKHRL1 A B S T R A C T Background:Genistein,as an active compound of dietary antioxidants,has shown considerable promise as an effective agent against aging process.However,the effect of genistein on skin photoaging and the associated mechanism remain unclear. Objective:To delineate the effect of genistein on UVB-induced senescence in human dermal?broblasts (HDFs)with emphasis on the mechanism of oxidative pathway regulated by p66Shc involved in the events. Methods:HDFs were induced to premature senescence by repetitive subcytotoxic doses of UVB irradiation.Cellular apoptosis and DNA cell cycle were analyzed using?ow cytometry.Intracellular levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA.Mutation levels of two large deletions of mitochondrial DNA,4977bp and3895bp deletion,were determined by quantitative PCR.Western blot was applied to detect the expression and activation of p66Shc(the66- kilodalton isoform of the growth factor adapter Shc)and FKHRL1(a forkhead protein that is intimately linked with intracellular oxidation). Results:Strong activity of senescence-associated beta-galactosidase(SA-b-gal),high percent of cell apoptosis as well as cell cycle arrest in G0/G1phase,and increased intracellular oxidative stress were observed in HDFs irradiated by UVB.Genistein exerted dramatically protective effects on HDFs in a dose- dependent manner.Elevated copy numbers of large deletions in mitochondrial DNA were also inhibited by genistein.Down-regulation of total and phosphorylated p66Shc on Ser36,as well as FKHRL1and its phosphorylation on Thr32,were observed after genistein treatment. Conclusion:The results indicate that genistein protects UVB-induced senescence-like characteristics in HDFs via maintenance of antioxidant enzyme activities and modulation of mitochondrial oxidative stress through down-regulation of a p66Shc-dependent signaling pathway,which may provide potential prevention against skin aging and even photoaging. ?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. *Corresponding author.Tel.:+8657187236340;fax:+8657187236385. E-mail addresses:hongfangzy@https://www.doczj.com/doc/5d12612401.html,,tango654321@https://www.doczj.com/doc/5d12612401.html, (H.Fang). 1These authors contributed equally to this work. Contents lists available at ScienceDirect Journal of Dermatological Science j o u r n a l h o m e p a g e:w ww.e l s e v i e r.c o m/j d s 0923-1811/$36.00?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. doi:10.1016/j.jdermsci.2010.02.002
第一天 1、配置LB培养基： 酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台） 加40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰 水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天
1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2L透析液1中，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换为透析液2。胶的回收：用3M氯化钠溶液（用1×PBS溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液1：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT 透析液2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS
pET-32b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5030 pET--‐32b(+) pET32b载体基本信息 别名: pET32b, p et 32b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5899bp 5' 测序引物: T7或者Trx--‐F 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5' T TCCTCGACGCTAACCTG 3' 载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin 备注: Production of soluble, active target proteins; N--‐term thrombin cleavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET32b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET32b载体简介 The pET--‐32a--‐c series is designed for cloning and high--‐level expression of peptide sequences fused with the 109aa Trx?Tag? thioredoxin protein (1). Cloning sites are available for producing fusion proteins also containing cleavable His?Tag? and S?Tag? sequences for detection and purification. Unique sites are shown on the circle map. Note that t he s equence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer . pET32b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGATATCG CCATGGCCTT GTCGTCGTCG TCGGTACCCA 241 GATCTGGGCT GTCCATGTGC TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTCATACCAG 301 AACCGCGTGG CACCAGACCA GAAGAATGAT GATGATGATG GTGCATATGG CCAGAACCAG 361 AACCGGCCAG GTTAGCGTCG AGGAACTCTT TCAACTGACC TTTAGACAGT GCACCCACTT 421 TGGTTGCCGC CACTTCACCG TTTTTGAACA GCAGCAGAGT CGGGATACCA CGGATGCCAT 481 ATTTCGGCGC AGTGCCAGGG TTTTGATCGA TGTTCAGTTT TGCAACGGTC AGTTTGCCCT 541 GATATTCGTC AGCGATTTCA TCCAGAATCG GGGCGATCAT TTTGCACGGA CCGCACCACT 601 CTGCCCAGAA ATCGACGAGG ATCGCCCCGT CCGCTTTGAG TACATCCGTG TCAAAACTGT 661 CGTCAGTCAG GTGAATAATT TTATCGCTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA 721 AATTATTTCT AGAGGGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA 781 TTTCGCGGGA TCGAGATCGA TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC 841 CGGCGCCACA GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 901 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT 961 GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT 1021 CAACGGCCTC AACCTACTAC TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG 1081 TCGAGATCCC GGACACCATC GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC 1141 CGGAAGAGAG TCAATTCAGG GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG 1201 AGTATGCCGG TGTCTCTTAT CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT 1261 CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC 1321 GCGTGGCACA ACAACTGGCG GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC 1381 TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG 1441 GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG 1501 TGCACAATCT TCTCGCGCAA CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC 1561 AGGATGCCAT TGCTGTGGAA GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT 1621 CTGACCAGAC ACCCATCAAC AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG 1681 TGGAGCATCT GGTCGCATTG GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT 1741 CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
货号：QS2614 规格：50管/24样α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-GAL）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 测定原理： α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化 一可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50 ml 离心管；冷冻高速离心机 2.方法 2.1反复冻融 2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。 2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。 2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 2.2超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用) 2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20min），进行超声破碎，超声条件：400W，工作5秒，间隔5秒，重复一定次数，（根据我们的仪器找出一个比较好的工作条件）。直至菌体溶液变清澈为止，大约花费时间。 2.2.2 取少量经超声破碎后的菌液，10000rpm离心10分钟，分别对上清和沉淀进行检测，并用全菌作为阳性对照，检测菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 注意事项： （1）超声破碎具体条件可根据实验情况而定，要掌握好功率和每次超声时间，降低蛋白被降解的可能。 （2）功率大时，每次超声时间可缩短，不能让温度升高，应保持在4度左右，超声时保持冰浴。 （3）菌体破碎后总蛋白浓度的测定可用Bradford法或者紫外吸收法。 （4）可通过SDS-PAGE 电泳观察菌体破碎程度及目标条带占总蛋白的含量。 二包涵体蛋白的纯化 1菌体的破碎（加溶菌酶处理包涵体效果可能不好，包涵体中总是有残留的溶菌酶，你看看有没有不加溶菌酶的，这个先保留好了） 1.1仪器与材料：超声波细胞破碎仪；20mM PBS或20mM Tris-HCl pH 7.5；裂解液buffer A；溶菌酶10mg/ml；50ml ，15ml离心管；冷冻离心机 1.2 方法 (1) 收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
1.酵母表达系统的特点大肠杆菌表达系统是常用的外源基因表达系统，人们已利用该系统表达了多种蛋白。大肠杆菌基因结构简单，易于进行基因操作，而且它生长迅速，周期短，营养需求简单，适于工业化生产。但同时该系统还存在很多缺陷。它是原核表达系统，缺少真核生物的翻译后加工过程，产生的外源基因产物往往无活性，它表达的蛋白多以包含体形式存在，需要经过复性，过程复杂，它产生的杂蛋白较多，不易纯化，所以产物中有可能会含有原核细胞中的有毒蛋白或有抗原性的蛋白。昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是真核细胞表达系统，它们可以进行多种蛋白的转录后加工，很适合于真核基因的表达。但是，它们遗传背景复杂，操作困难，易污染，生产成本高，所以并不利于实际应用[2,3] 2.核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化[4]。所以近年来，酵母表达系统已广泛应用于工业生产，为社会创造了极大的经济效益 3.酵母一般可分成三大类：(1) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母；(2) 粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；(3) 非常规酵母(Nonconventional yeast)，是指除酿酒酵母和粟酒裂殖酵母外的酵母统称 4.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）又名面包酵母，它是单细胞真核微生物，一直以来酿酒酵母被称为真核生物中的―大肠杆菌‖。它是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌。自1981年Hitzemom等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功后，人们还用酿酒酵母表达了多种原核和真核蛋白，目前科学家对酿酒酵母表达系统的研究已非常深入。 5.2.1.2 用于基因表达的宿主菌——酿酒酵母在遗传学方面，人们对酿酒酵母进行了广泛的研究，酿酒酵母基因组序列（约1.2×107bp）早在1996年就完成，它有16条染色体，约6000个ORF，仅4%的酵母基因有内含子。由于人们对酿酒酵母的遗传背景十分清楚，因此酿酒酵母是很理想的真核表达宿主菌。
β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，10μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
高中组 11年级 生物化学 3人项目 重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化
重组蛋白IFNGA在大肠杆菌中的表达与纯化 摘要： 干扰素γ（Interferon gamma，IFN-γ）是体内重要的细胞因子，能够通过调控免疫相关基因的转录协调机体的免疫反应，具有抗病毒、抗肿瘤、增强免疫力能功能。目前对于IFN-α、IFN-β重组表达的较多，而关于IFN-γ 蛋白的纯化表达较少.因此,本研究使用PCR方法扩增IFN-γ基因，将IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30--IFN-γ，转化大肠杆菌BL21和Rosetta菌株，在IPTG诱导下表达IFN-γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果表明：成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-γ；表达产物主要以包涵体形式存在；经Ni2+-NTA亲和层析纯化，获得高纯度重组蛋白。本实验纯化的蛋白有望在今后用于医学和生物学研究中。 关键词：干扰素；IFN-γ 蛋白；大肠杆菌表达系统；重组表达；蛋白纯化； 一、研究背景 干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒（比如：乙肝病毒）的复制。其类型分为三类，α-（白细胞）型、β-（成纤维细胞）型，γ-（淋巴细胞）型；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。 其中，IFN-γ是体内重要的免疫调节因子，能通过与细胞表面受体结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用。在诱导效应因子表达的同时，由于IFN-γ能够提高细胞表面MHC分子的表达，增强免疫活性细胞对病原体的杀伤作用，从而协同促进了机体对病毒感染细胞的杀灭，而使机体处于抗病毒状态。虽然各种类型的干扰素均能介导细胞对病毒感染的反应，但IFN-γ 的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用。其作用可大致总结为以下几点：①
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达 前言 基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。 基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。 第一节基因的表达系统与表达策略 一、最佳的基因表达体系： ⑴目的基因的表达产量高; ⑵表达产物稳定; ⑶生物活性高; ⑷表达产物容易分离纯化。 二、宿主细胞的选择 （一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求: 1、容易获得较高浓度的细胞； 2、能利用易得廉价原料； 3、不致病、不产生内毒素； 4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 5、容易进行代谢调控； 6、容易进行DNA重组技术操作； 7、产物的产量、产率高， 8、产物容易提取纯化。 （二）宿主细胞分为两大类： 1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等； 2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。