文章编号:10012764X(2006)0520363203 中图分类号:Q52 文献标识码:A?研究生园地?4种血浆游离DNA提取方法的比较3
严子禾1,潘世扬2,陈丹2,魏源华2,高丽2,谢而付2,
黄2,戎国栋2,胡宜蘅2,童明庆2(1.无锡市第二人民医院
检验科,江苏无锡214002;2.南京医科大学第一附属医院医学检验中心,江苏南京210029)
摘要:目的 比较4种方法对血浆游离结核分枝杆菌(M ycobacterium tuberculosis,MT B)DNA和质粒DNA的提取效率。方法 MT B DNA和重组质粒DNA经紫外分光光度法准确定量并梯度稀释,建立标准品。构建含有一定浓度M T B DNA和质粒DNA 的血浆,分别采用4种方法提取血浆游离DNA,采用实时荧光PCR技术定量检测模拟血浆中MT B DNA和质粒DNA的含量,比较各种方法的提取效率。结果 4种方法中,磁珠法对M T B DNA和质粒DNA的提取效率最高,分别为52.8%和69.2%;相对丢失率最低,分别为40.1%和31.8%;重复性最好,其变异系数分别为26.7%和26.0%。结论 在4种方法中,磁珠法对血浆游离DNA的提取效率最高,尤其适合于小片段DNA的提取。
关键词:血浆游离DNA;荧光定量PCR;提取效率
血浆游离DNA具有微量及小片段的特征[1],在提取过程中容易丢失,使检测灵敏度降低。本研究构建含有一定浓度结核分支杆菌DNA(M ycobacteri2 um tuberculosis DNA,MT B DNA)和质粒DNA的血浆,分别采用4种方法提取其DNA片段,采用实时荧光PCR技术和标准曲线方法定量检测其中DNA 的含量,比较各种方法的提取效率,为血浆DNA定量研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 仪器 Bact/A lert3D全自动细菌快速培养和药敏检测系统、JY922ⅡD超声波细胞粉碎机、Jouan 温控高速离心机、Gene Quant p r o紫外分光光度计(Amersha m B i oscience)、7500荧光定量PCR扩增仪(App lied B i osystem s)、琼脂糖凝胶电泳仪(B i o2 Rad)、凝胶成像分析系统(Kodak)、PTC100PCR扩增仪(MJ)。
1.2 试剂 Q I A a mp DNA M ini Kit(Q iagen),EZ NA.
B l ood DNA Kit、EZ NA.Plas m id M ini p rep Kit I(Ome2 ga),磁珠法血浆DNA提取试剂盒,饱和酚、氯仿(Sig ma),p MD182T Vect or、热启动Taq DNA聚合酶、
H incⅡ内切酶(TaKaRa公司)。
1.3 引物和探针的设计与合成 MT B Taq Man荧光探针和引物合成参照文献[1],序列如下:上游引物:5′2GGCTGTGGGT AGCAG ACC23′,18bp;下游引物:5′2CGGGT CCAG ATGGCTTGC23′,18bp;探针:5′2 F AM2TGT CG ACCTGGGCAGGGTTCG2T AMRA23′,21 bp;预期产物长度163bp,由上海英骏(invitr ogen)公司合成。重组质粒Taq Man荧光探针和引物采用Pri m er Exp ress软件设计,序列如下:上游引物:5′2 AAACAGCT ATG ACCATG ATT ACG AA23′,25bp;下游引物:5′2CTT AATGTCACGCACG ATTTCC23′,22bp,由英骏(invitr ogen)公司合成;探针:5′2F AM2 TGT CG ACCTGGGCAGGGTT CG2ECL I PSE23′,26bp,由TaKaRa公司合成;预期产物长度99bp,引物浓度均为5μmol/L。
1.4 人工寡核苷酸序列的设计与合成 设计两条互补的寡核苷酸,序列如下:5′2ACGGG AGCGGTTG2 GTGGTGG AAATCGTGCGTG ACATT AAG A23′,5′2CT2 T AATGT CACGCACG ATTTCCACCACCAACCGCT CCC GT A23′。由英骏(invitr ogen)公司合成。
1.5 方法
1.5.1 MT B DNA的提取 取培养7～14d的T B 菌液3m l,4℃条件下10000×g离心5m in回收细菌,加200μl TE2100g/L S DS,液氮冷冻15m in后置冰水浴,再超声10个循环,每个循环按120w工作10s,间隔30s进行[2]。常规酚2氯仿法提取DNA,最终溶解于25μl TE中。
1.5.2 质粒的重组及其DNA制备
2.7kb的P MD182T质粒载体与人工合成的DNA重组,经提取、纯化(EZ NA.Plas m id M ini p rep KitⅠ),并经H inc Ⅱ内切酶酶切为线性。
1.5.3 质粒DNA和MT B DNA标准品的制备 经紫外分光光度法定量,稀释获得104、103、102、101、100copy/μl的MT B DNA和重组质粒DNA标准品。
3作者简介:严子禾,1969年生,女,副主任技师,在职硕士研究生。
通讯作者:潘世扬,南京医科大学第一附属医院临床检验中心,210029,E-mail:labmed@s https://www.doczj.com/doc/5a11220007.html,。
1.6 4种血浆DNA 提取方法的比较
1.6.1 含有一定浓度MT B DNA 和质粒DNA 血浆的制备及其DNA 的提取 按图1所示构建含有6
×102
copy/
μl MT B DNA 和2×102copy /μl 质粒DNA 的模拟血浆,采用传统酚2氯仿法、Q I A gene 、O 2mega 和磁珠法4种不同的方法提取上述模拟血浆
及空白血浆DNA 。其中,Q I A gene 、Omega 和磁珠法
完全按试剂盒操作说明书进行。酚2氯仿法在200μl 血浆中加入600μl 裂解液(130g/L S DS,130mmol/L Tris 2HCl,13mmol/L EDT A )和8μl 10mg/m l 蛋白酶K,50℃水浴4h,用饱和酚、酚2氯仿
和氯仿3次抽提上层水相,经NaCl 沉淀,用75%乙
醇洗涤后,室温风干,最终溶解于40μl TE 中
。
图1 实验流程
1.6.2 PCR 反应体系及条件 反应体系:模板
DNA 5μl,5×buffer (无Mg 2+
)10μl,10mmol/L d NTP 1.5μl,250mmol/L MgCl 20.7μl,上游引物2
μl,下游引物2μl,探针1μl,热启动DNA 聚合酶
0.25μl 。MT B DNA 扩增条件:95℃5m in;94℃30s,60℃1m in,40个循环;质粒DNA 扩增条件:95℃5m in;94℃30s,56℃30s,72℃40s 共45个
循环。
1.6.3 血浆DNA 提取方法的提取效率、相对丢失
率和相对抑制率[3]
采用荧光定量PCR 检测,计算提取效率=C 提取管/C 系统管;相对丢失率=(C 对照管-C 提取管)/C 对照管;相对抑制率=(C 系统管2C 对照管)/C 系统管1.7 统计学分析 采用Stata 7.0统计软件进行分
析。各组间数据的比较依据资料的性质,采用t 检验和单因素方差分析。2 结果2.1 MT B DNA 和重组质粒DNA 的定量 紫外分光光度法检测提取的MT B DNA 和重组质粒DNA 浓度分别为8.03μg/m l 和12.7μg/m l,根据结核杆菌基因组和重组质粒DNA 分子量大小,计算其浓度
为1.66×109copy /m l 和4.52×1012
copy/m l 。10倍梯度稀释,建立各自的标准品。
2.2 MT B DNA 和质粒DNA 标准曲线 荧光定量PCR 扩增曲线的基线平整,指数扩增区明显,MT B DNA 标准曲线回归方程为Ct =-
3.37l og C 0+3
4.56,相关系数(r )为0.9997;质粒DNA 标准曲线
回归方程为Ct =-3.55l og C 0+39.31,r 达0.9995。
线性范围均为100～104
copy/
μl 。2.3 不同方法提取血浆MT B DNA 和质粒DNA 的
结果比较 见表1。
2.3.1 不同方法对血浆DNA 提取效率的比较 4种方法对血浆MT B DNA 和质粒DNA 的提取管与系统管都有显著性差异,单因素方差分析结果显示,磁珠法提取后的MT B DNA 平均浓度显著高于酚2氯仿法(P =0.003),磁珠法提取后的质粒DNA 平均浓度显著高于Q I A gene 法(P =0.004)、酚2氯仿法(P =0.0000)和Omega 法(P =0.0000),而其他方法之间的差异无统计学意义,表明磁珠法对MT B DNA 和质粒DNA 的提取效率最高。磁珠法和酚2氯
仿法对质粒DNA 的提取效率高于对MT B DNA 的提取效率(P =0.0004、0.02)2.3.2 不同方法提取血浆DNA 的相对丢失率的比
较 除磁珠法外,余3种方法对血浆MT B DNA 和质粒DNA 的提取管与对照管都有显著性差异,单因素方差分析表明,磁珠法对MT B DNA 的相对丢失率低于Q I A gene 法(P =0.019)和酚2氯仿法(P =
0.001),对质粒DNA的相对丢失率低于Q I A gene法(P=0.000)、酚2氯仿法(P=0.002)和Omega法,说明磁珠法的相对丢失最少,更适合于定量检测的血浆DNA提取。
2.3.3 不同方法对血浆DNA相对抑制率的比较 OMEG A B l ood DNA Kit对MT B DNA的对照管与系统管之间有显著性差异(P=0.04),而其他方法对血浆MT B DNA和质粒DNA的对照管与系统管无显著性差异。
2.3.4 不同方法对血浆DNA提取重复性的比较 重复10次提取,磁珠法和OMEG A法的变异系数明显小于Q I A gene和酚2氯仿法。说明磁珠法和OME2 G A法对血浆DNA的提取重复性较好,而酚2氯仿法较差。
表1 4种方法提取血浆MT B DNA和质粒DNA的结果比较
Q I A gene法
MT B DNA质粒DNA
磁珠法
MT B DNA质粒DNA
酚2氯仿法
MT B DNA质粒DNA
Omega法
MT B DNA质粒DNA
提取管平均浓度
(copy/μl)
1197.8423.61483.1714.2704.5310.0946.7316.7
(95%可信区间)(795.52
1600.0)(309.82
537.3)
(1199.32
1766.8)
(581.32
847.2)
(391.12
1017.9)
(180.52
439.5)
(794.12
1099.3)
(232.52
401.0)
提取效率42.7%41.0%52.8%69.2%25.1%30.0%33.7%30.7%
(95%可信区间)(28.3%2
57.0%)(30.0%2
52.0%)
(42.7%2
62.9%)
(56.3%2
82.0%)
(13.9%2
36.3%)
(17.5%2
42.6%)
(28.3%2
39.2%)
(22.5%2
38.8%)
对照管平均浓度
(copy/μl)
3228.41326.92451.61047.92399.1806.64199.51686.4
(95%可信区间)(1750.12
4706.6)
(291.72
2362.0)
(1515.62
3387.6)
(713.22
1382.6)
(1959.32
2838.8)
(651.72
961.5)
(2890.92
5508.1)
(8340.02
2532.9)
相对丢失率63.2%68.1%40.1%31.8%70.6%61.6%66.3%81.2%
(95%可信区间)(50.9%2
75.5%)(59.5%2
76.6%)
(28.7%2
51.6%)
(19.2%2
44.5%)
(57.6%2
83.7%)
(45.5%2
77.6%)
(60.8%2
71.7%)
(76.2%2
86.2%)
相对抑制率-15.0%-28.5%12.7%-1.48%14.5%21.9%-49.7%-63.3%变异系数(CV)46.9%37.5%26.7%26.0%62.2%58.4%22.5%37.2%
3 讨论
研究结果表明,对于MT B DNA,磁珠法的提取效率仅优于酚2氯仿法,相对丢失率低于Q I A gene法和酚2氯仿法。而对于质粒小片段DNA,磁珠法的提取效率显著高于其他3种方法,相对丢失率明显低于其他3种方法,提示磁珠法在血浆小片段游离DNA提取上的优势。
Q I A gene和Omega方法对MT B DNA和质粒DNA的抑制率均小于0,表明此两种方法能够有效的消除血浆中各种成分(如血浆蛋白、血红蛋白、细胞碎片等)对PCR反应的抑制作用,特别是Omega 法。然而,鉴于血浆DNA微量的特性,Q I A gene和Omega方法提取时高达60%～80%的DNA丢失率将会严重影响定量检测的灵敏度。
4种血浆DNA提取方法中,Q I A gene和Omega 方法均采用微柱吸附原理,简便快速,能有效的去除样本中的各种PCR抑制物,获得较纯的DNA,但是,其对小片段DNA提取效率低于磁珠法,且成本较高,需要高速离心,不适合于临床常规使用。传统的酚2氯仿DNA抽提方法成本低,但操作繁琐,耗时长,所使用的有机溶剂对人体伤害大,提取效率低,重复性差,不适于血浆微量DNA的提取。磁珠法采用磁珠吸附,磁场分离的原理,操作简便、快速,获得的DNA纯度高,产量大,对血浆游离DNA的提取效率最高,相对丢失率最小,重复性好,尤其适合于小片段DNA的提取。
参考文献:
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(收稿日期:2006205220)
(本文编辑:陈维忠)