微生物的分类与鉴定
第一节通用分类单元
分类学：分类命名鉴定
分类(classification)：根据一定的原则对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；
命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有的名称；
鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。
培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长
物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。
菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。
型：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型
菌株与型的区别：
菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据，
不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。
种：物种，生物分类中基本的分类单元
微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其他类群的菌株有很明显的区别。
双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，
一般用斜体表示
属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写
种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写
若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，
第二节微生物在生物界的地位
三域学说：细菌域、古生菌域、真核生物域
. rRNA的顺序和进化：培养微生物→提取并纯化rRNA→rRNA序列测定→分析比较→微生物之间的系统发育关系
特征序列或序列印记：通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。（特征序列有助于迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。）
系统发育树：通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树，其特点是用一种树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系。建立16 S r RNA系统发育树的意义：
1使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群
2提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；
3对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；
4突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的分类理论5为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。
不可培养微生物：从环境中直接分离并克隆rRNA并分析其序列和在分子进化树上的位置等方法而发现的的目前尚不能在人工条件下获得培养的微生物。第三节各大类微生物的分类系统纲要
伯杰氏手册：是目前进行细菌分类、鉴定的最重要参考书，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。真菌Ainsworth et al(1973)
第四节微生物分类鉴定的方法
生物分类的传统指标：形态学特征生理学特征生态学特征
微型、简便、快速或自动化鉴定技术
1、API 细菌数值鉴定系统
2、Enterotube 系统
3、Biolog 全自动或手动细菌鉴定系统
分子生物学指标、
DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。
1、DNA的碱基组成(G+Cmol%) 每个生物种都有特定的GC%范围，因此可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定
GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系
G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定
但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们
之间具有近的亲缘关系。
2、核酸的分子杂交
3、其他血清学试验噬菌体分型
生态特性氨基酸顺序
蛋白质分析细胞壁等细胞成分
传染与免疫
第一节传染
疾病：生物体在一定条件下，由体内或体外致病因素引起的一系列复杂且有特征性的病理状态
病原体：病原微生物寄生于生物（包括人）机体并引起疾病的各种微生物和其他生物
传染：感染或侵染指外源或内源性病原体突破其宿主的三道免疫“防线”后，在宿主的特定位置定植、生长繁殖或产生酶和毒素，从而引起一系列病理生理的过程
三道免疫防线：机械免疫非特异性免疫特异性免疫
传染病：是一类由活病原体的大量繁殖所引起，可从某一宿主个体直接或间接传播到同种或异种宿主另一些个体的疾病。
特点：病原体传染性流行性地方性季节性免疫学
决定传染结局的主要因素：病原体的数量致病特征侵入方式（消化道：最常见的门径呼吸道、皮肤创口、泌尿生殖道、其他途径）
毒力：致病力表示病原体致病能力强弱
细菌性病原体的毒力 突破机体防御功能的能力 在机体中进行生长繁殖、蔓延扩散的能力 产毒素的能力
侵袭力：指病原菌突破宿主防御机能，以在其中进行生长繁殖和实现蔓延扩散的能力。
吸附和侵入能力：细菌通过具有粘附能力的结构如G －
菌的菌毛粘附于宿主的呼吸道、消化道及泌尿生殖道粘膜上皮细胞的相应受体，于局部繁殖，积聚毒力或继续侵入机体内部。
1在原处生长繁殖并引起疾病：霍乱弧菌（Vibrio ）
2侵入细胞内生长繁殖并产生毒素，使细胞死亡，造成溃疡： 痢疾志贺氏菌 3通过粘膜上皮细胞或细胞间质侵入表层下部组织或血液中 进一步扩散：溶血链球菌
繁殖与扩散能力：通过水解性酶类，使组织疏松、通透性增加，有利于病原菌扩散。
抵抗宿主防御功能的能力
a ）细菌的荚膜和微荚膜具有抗吞噬和体液杀菌物质的能力，有助于病原菌于在体内存活， 肺炎球菌的荚膜。
b ）致病性葡萄球菌产生的血浆凝固酶有抗吞噬作用；
c ）分泌一些活性物质如溶血素，抑制白细胞的趋化作用；
d ）具抵抗在吞噬细胞内被杀死的能力，能在吞噬细胞内寄生；
外毒素：指在病原细菌生长过程中不断向外界环境分泌的一类毒性蛋白质。
酶 酶原 毒蛋白
特点：通常为蛋白质，抗原性强，可选择作用于各自特定的组织器官，不同病原菌产生的外毒素不同，所引起的症状也不同。其毒性作用强，但毒性不稳定，对热和某些化学物质敏感。
类毒素：若用0.3%-0.4%甲醛溶液对外毒素进行脱毒处理，可获得失去毒性但保留其原有免疫原性（抗原性）的生物制品
内毒素： 是G －
细菌细胞壁外层的组分之一，其化学成分是脂多糖（LPS ）。
因它在活细胞中不分泌到体外，仅在细菌死亡后自溶或人工裂解时才释放
现代免疫概念认为，免疫是机体识别和排除抗原性异物的一种保护性功能。 在正常情况下，免疫对机体有利； 在异常情况下，可能对机体有害。
环境因素：良好的环境因素有助于提高机体的免疫力，也有助于限制、消灭自然疫源和控制病原体的传播，因而可以防止传染病的发生或流行。 病原体能否引起传染病 取决于 病原体的致病能力 机体抵抗力
病原菌侵入其宿主后，按病原菌、宿主和环境三方面力量的对比或影响大小决定着传染的结局。
如果宿主的免疫力很强，而病原菌的毒力相对较弱，数量又较少，传染后只引起宿主的轻微损害，且很快就将病原体彻底消灭，因而基本上不出现临床症状者，称为隐性传染。
如果病原菌与宿主双方都有一定的优势，但病原体仅被限制于某一局部且无法大量繁殖，两者长期处于相持的状态，就称带菌状态。这种长期处于带菌状态的宿主，称为带菌者
在隐性传染或传染病痊愈后，宿主常会成为带菌者，如不注意，就成为该传染病的传染源，十分危险。这种情况在伤寒、白喉等传染病中时有发生。 如果宿主的免疫力较低，或入侵病原菌的毒力较强、数量较多，病原菌很快在体内繁殖并产生大量有毒产物，使宿主的细胞和组织蒙受严重损害，生理功能异常，于是就出现了一系列临床症状，这就是显性传染或传染病。 按发病时间的长短 急性传染 慢性传染 按发病部位的不同 局部感染 全身感染 按性质和严重程度的不同
毒血症：病原菌限制在局部病灶，只有其所产的毒素进入全身血流而引起的全身性症状，常见的有白喉、破伤风等症。
菌血症：病原菌由局部的原发病灶侵入血流后传播至远处组织，但未在血流中繁殖的传染病， Eg.伤寒症的早期，就出现菌血症期。
败血症：病原菌侵入血流，并在其中大量繁殖，造成宿主严重损伤和全身性中毒症状者 铜绿假单胞菌，旧称“绿脓杆菌”等引起的败血症等。 脓毒血症：一些化脓性细菌在引起宿主的败血症的同时，又在其许多脏器（肺、肝、脑、肾、皮下组织等）中引起化脓性病灶者 金黄色葡萄球菌
第二节 非特异性免疫
凡在生物长期进化过程中形成，属于天生即有、相对稳定、无特殊针对性的对付病原体的天然抵抗力，称为非特异性免疫 1. 生理屏障 皮肤 粘膜及其附属物 共生菌群
2.细胞因素吞噬细胞自然杀伤细胞（释放穿孔素和颗粒酶造成靶细胞死亡
释放肿瘤坏死因子（TNF）杀伤靶细胞）
3. 体液因素溶酶菌补体干扰素
4.其他免疫的综合作用
血脑屏障主要由软脑膜、脉络丛、脑毛细血管壁及其外的脑星形细胞组成，具有细胞间连接紧密、胞饮作用弱的特点，可阻挡病原体及其有毒产物从血液透入脑组织或脑脊液，保护中枢神经系统的稳定。
血胎屏障由怀孕母体子宫内膜的基蜕膜和胎儿的绒毛膜滋养层细胞共同组成，当它发育成熟（一般在妊娠3个月）后，能阻挡病原微生物由母体通过胎盘感染胎儿，但并不妨碍母子间的物质交换。
补体实为一补体系统，是存在于正常人体或高等动物血清中的一组（11种）非特异性血清蛋白（主要成分是β球蛋白），在免疫反应中，由于它具有能扩大和增强抗体的“补助”功能，故称补体。
通常以无活性形式存在于正常血清和体液中。当在一定条件下促发补体系统的一系列酶促级联反应，使补体由无活性形式转变为对病原体具有杀灭作用的活性形式称补体激活。
补体不能单独与抗原或者抗体结合，必须在抗原与抗体结合后，补体才被激活发挥其生物学作用。
补体的生物学功能溶解和杀伤细胞趋化作用免疫粘附作用
中和病毒过敏毒素（促进炎症）作用
干扰素是高等动物细胞在病毒或dsRNA等诱生剂的刺激下，所产生的一种具有高活性、广谱抗病毒等功能的特异性糖蛋白，相对分子质量很小。
四类干扰素IFN-a IFN-b IFN-g IFN-ω
干扰素作用于宿主细胞，使之合成抗病毒蛋白、控制病毒蛋白质合成，影响病毒的组装释放，具有广谱抗病毒功能（但受宿主种属特异性限制）；同时，还有多方面的免疫调节作用。
炎症是机体受到有害刺激时所表现的一系列局部和全身性防御应答，可以看作是非特异免疫的综合作用结果，其作用于清除有害异物、修复受伤组织，保持自身稳定性。红、肿、痛、热和功能障碍
炎症既是一种病理过程，又是一种防御病原体的积极方式：
动员了大量的吞噬细胞聚集在炎症部位；
血液中的抗菌因子和抗体发生局部浓缩；
死亡宿主细胞的堆积可释放抗微生物物质；
炎症中心氧浓度下降和乳酸积累，进一步抑制病原菌的生长；
适度的体温升高可以加速免疫反应的进程；
第三节特异性免疫
特异性免疫其主要功能是识别非自身和自身抗原物质，并对它产生免疫应答，从而保证机体内环境的稳定状态。获得性高度特异性记忆性
免疫系统（获得性免疫的物质基础）：免疫器官免疫细胞免疫分子
【免疫活性细胞一类能接受抗原刺激，并引起特异性免疫反应的细胞
T细胞起源于骨髓，在胸腺中成熟，然后转移到外周淋巴器官，其功能是执行细胞免疫
B细胞骨髓中的多能干细胞分化成淋巴细胞，再分化成前B细胞，进一步发育成为成熟B细胞。当受抗原刺激后，B细胞先转化为浆母细胞，再分化为浆细胞，产生并分泌抗体，进行体液免疫】
【膜表面分子主要包括膜表面抗原受体、主要组织相容性抗原、白细胞分化抗原和粘附分子。B细胞和T细胞表面有各自的特异性膜表面抗原受体BCR 和TCR、能识别不同的抗原并与之结合，启动特异性免疫体液免疫分子包括抗体补体细胞因子
细胞因子具有对细胞功能的多方面调节作用，其中有些还具有细胞毒性（如肿瘤坏死因子）和抗病毒功能（如干扰素），直接参与免疫应答的效应过程。补体和抗体分别是非特异免疫和特异免疫的主要体液成分】
抗原Ag是一类能刺激人和动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞（免疫应答），并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的大分子物质。
特性（能力）：刺激机体产生免疫应答的能力，也称为抗原性或免疫原性
与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应，也称为反应原性
抗原：完全抗原（免疫原性反应原性）半抗原（反应原性）
抗原的性质：
异物性（指某抗原的理化性质与其所刺激的机体的自身物理性之间的差异程度）差异越大，对机体的刺激性也越大，即免疫原性越强。
相对分子质量大抗原物质一般都是分子量＞1万道尔顿的大分子。
结构复杂抗原物质需一定的化学组成和结构。不是所有的大分子物质均有抗原性，大分子中蛋白质（酪氨酸）的抗原性最强。
抗原决定簇抗原物质的分子表面要有特定的化学基团。它决定抗原的特异性，其分子很小，相当于相应抗体结合的部位。抗原结合价
细菌菌体称菌体抗原，也称O抗原；
细菌的鞭毛称鞭毛抗原，也称H抗原；
细胞表面的成分称表面抗原；
抗体Ab 是由抗原刺激人体或动物体内的B淋巴细胞，由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白Ig
凡具有抗体活性以及与抗体有关的各种球蛋白，统称为免疫球蛋白
五类IgG IgM IgA IgE IgD 人鼠有五种）
结构5种免疫球蛋白的结构相似的，都有一个四条肽链组成的基本结构四肽链结构所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。
两条重链（H）和两条轻链（L）每条重链和轻链分为氨基端和羧基端
肽链的C端是稳定区（V区），氨基酸顺序保守；（不同的抗体分子在这个区的氨基酸排列顺序基本上是相同的）补体的结合位点——抗体的稳定区
肽链的N端是可变区（C区），氨基酸顺序变化；（氨基酸排列顺序因抗体种类不同而变化）抗原的结合位点——抗体的的可变区
铰链区
一个Y形的抗体分子由两个抗原结合点，IgG可与两分子抗原结合。
功能在体内，抗体可与入侵的病原微生物结合，使其失去致病性。
IgG的功能：主要的抗传染抗体；唯一能通过胎盘的抗体；
IgA在血液中的含量仅次于IgG ，IgA不能通过胎，但婴儿可从初乳中获得IgM是抗原刺激后第一个产生的抗体，IgM可促进吞噬作用。
IgG的酶解和化学分解片段
抗体产生的规律
抗原第一次进入机体，要经过一个潜伏期才能产生抗体，而且抗体量较低，然后迅速下降，这种现象称初次应答（初次应答所产生的抗体主要是IgM，与抗体结合力低）
如果一定时间后，即抗体量下降时，机体再次接触同样的抗原，由于记忆细胞的存在，机体内的抗体量迅速上升，比初次应答高出百倍，而且在体内维持的时间延长，这种现象称再次应答。（再次应答所产生的抗体主要是IgG，与抗体亲和力强）
预防针的多次注射
例如，白白破疫苗，婴儿需要先后接种5次，目的就是使机体先后产生初次应答、再次应答，体内即可产生大量的记忆细胞，具有了较强的抵抗力。
血清：血液去除血细胞和造成血凝固的物质后剩下的液体部分。
抗血清：含抗体的血清，也称免疫血清。
免疫应答的基本过程：感应阶段→反应阶段→效应阶段
感应阶段：机体接受抗原刺激的阶段
反应阶段：淋巴细胞识别抗原后，即被活化进行增殖、分化
效应阶段：抗原成为被打击的对象
人工自动免疫类生物制品：常规疫苗新型疫苗（DNA疫苗）
人工被动免疫类生物制品：特异性免疫治疗剂（胎盘球蛋白）
非特异性免疫治疗剂（转移因子TF、白细胞介素-2 IL-2）干扰素IFN
微生物的遗传变异和育种
第二节基因突变和诱变育种
突变类型：选择性突变株（凡能用选择性培养基（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株）、非选择性突变株
突变率：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率
基因突变的7个共同点：
自发性不对应性稀有性独立性可诱变性稳定性可逆性
基因突变自发性和不对应性的实验证明
Luria等的变量实验Newcombe的涂布实验Lederberg等的影印平板实验（证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系）
诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合育种目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用
诱变是随机的，筛选是定向的（更重要）
诱变育种具有重大的实践意义：
可获得供工业和实验室应用的各种菌株；
提高有用代谢产物的产量；
减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等
诱变育种的特点
（1）提高突变率，扩大突变谱
（2）有效地改良个别、单一性状
（3）缩短育种年限
（4）定向变异和有益突变的频率低
诱变育种的基本环节
原则
（1）选择简便有效的诱变剂烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物NTG DES （2）挑选优良的出发菌株
【出发菌株：是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。
合适的出发菌株来源：
①由自然界直接分离获得的野生型菌株；
②在生产中经历生产条件考验的菌株；
③已经过诱变甚至多次改造的菌株；
④选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；】
（3）处理单细胞或单孢子悬液（菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果）（4）选用最适的诱变剂量通常采用低剂量、长时间处理。
（5）充分利用复合处理的协同效应
（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标
（7）设计高效筛选方案
（8）创造新型筛选方法
3类突变株的筛选方法
1产量突变株的筛选琼脂块培养法数据精确，效率高
2抗药性突变株的筛选梯度平板法定向筛选抗药性突变株的一种有效方法
3营养缺陷型突变株的筛选
基本培养基（MM，符号为［－］）
完全培养基（CM，符号为［＋］）
补充培养基（SM，符号为［A］或［B］等）
第一步，诱变剂处理第二步，淘汰野生型
第三步，检出缺陷型第四步，鉴定缺陷型
第五节菌种的衰退、复壮和保藏
衰退：是指由于自发突变的结果，而是某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。
菌种的衰退是发生在微生物细胞群中的一个由量变到质变的逐步演化过程。造成菌种退化的主要原因是基因突变。
衰退的防止：
（1）选育生产性能稳定的菌株作为生产菌株
（2）控制传代次数
（3）创造良好的培养条件
（4）利用不同类型的细胞进行接种传代
（5）采用有效的菌种保藏方法
复壮：
（狭义，消极措施）是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
（广义，积极措施）在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。菌种的保藏基本要求在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
用于长期保藏的原始菌种称为保藏菌种或原种
保藏方法
（1）定期移植保藏法优点：方便不受条件限制各类微生物均可
缺点：时间短、传代多、易退化
（2）液体石蜡法
（3）砂土保藏法优点：
低温、干燥、无氧、无营养，保藏效果好，时间可达几年至数十年。
缺点：只适用于产孢子的微生物，不能用于保藏营养细胞。
（4）冷冻干燥保藏法
优点：低温、干燥、无氧、有保护剂，可保藏各大类微生物，保藏时间可达几十年，是目前使用最广、最有效的保藏方法。一般专业机构大都使用此法保藏。
缺点：不能保藏真菌菌丝。
（5）液氮保藏法优点：保藏效果好缺点：价格昂贵。
中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）
世界菌种保藏联合会（WFCC）
美国典型菌种收藏馆（ATCC）
微生物的生长及其控制
微生物的生长：在一定时间和条件下细胞数量的增加（微生物群体生长）
个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖第一节微生物的纯培养的方法
纯培养：单个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。
对于微生物，由于其主要进行无性生殖，故纯培养即为克隆。
建立纯培养，证实其纯度无可置疑并保持不受污染是开展微生物学
研究最重要的任务之一。
获得纯培养的方法：平板分离法液体分离法
单细胞挑取分离法选择性培养基分离法
平板分离法：划线分离法：快速、方便
分段划线（适用于浓度较大的样品、连续划线（适用于浓度较小的样品）稀释倾注分离法：先取稀释液注入平皿，再注入45℃左右的培养基，将稀释液冲开培养基表面、中间均会出现菌落。
涂布平板法（培养基表面出现菌落）：简单易行，但易造成机械损伤
液体分离法：适用于细胞较大的微生物。用液体培养基对菌液做10倍系列稀释，使试管中只存在一个细胞，由此繁殖得到的后代必是纯培养。
选择性培养基分离：微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化分离原则：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快。第二节测定生长繁殖的方法
微生物的生长：单位时间里微生物数量或生物量的变化
微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定
测生长量直接法：
测体积法：粗放型，在刻度离心管中测沉降量
称干重法：精确型，离心法和过滤法获得菌体细胞，微生物的干重一般为其湿重的10％～20％。
测生长量间接法：
1.比浊法：用分光光度法对无色的微生物悬浮液进行测定，一般选用450～650nm波段。（若要连续跟踪某一培养物的生长动态，可用带有侧臂的三角烧瓶作原位测定，即不必取样。）
2.生理指标法：微生物的生理指标，如氮、碳、DNA、ATP（生物发光仪）等物质的含量，呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等与其群体的规模成正相关。
计繁殖数：测定繁殖，一定要一一计算各个体的数目。
计繁殖数直接法：计数板（细菌计数板或血球计数板）计算一定容积里样品
中微生物的数量
缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；
需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；染色后活菌计数法、比例计数法、过滤计数法
计繁殖数间接法：是一种活菌计数法，依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上（内）形成菌落的原理而设计。菌落计数法
第三节微生物的生长规律
细菌培养物在培养条件下度过的时间称为细菌的菌龄
同步培养技术：设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。
通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长
生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线
培养时间为横坐标菌数为纵坐标（一般用菌数的对数为纵坐标）
反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线
根据微生物的生长速率常数，即每小时的分裂次数（R）的不同，一般可把典
型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期
延滞期：指少量单细胞微生物接种到新鲜培养基后，在开始培养的一段时间内细胞数目不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零的一段时期——代谢系统是正在适应新环境。
特点：分裂迟缓、代谢活跃
①生长速率常数为零；
②细胞形态变大或增长，许多杆菌可长成丝状（一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大！）
③细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；
④合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP合成加速，易产生各种诱导酶；
⑤对外界不良条件如NaCI溶液浓度、温度和抗生素等理化因素反应敏感。出现的原因：（调整代谢）微生物接种到一个新的环境，暂时缺乏分解和催化有关底物的酶，或是缺乏充足的中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。
影响延滞期长短的因素：
（1）菌种的遗传性
（2）接种龄指接种物或种子的生长年龄。这里指某一群体的生理年龄。
以指数期接种龄的种子接种，则子代培养物的延滞期短；
稳定期居中；延滞期或衰亡期长
（3）接种量：接种量小，延滞期长；接种量大，延滞期短
在发酵工业上，为缩短延滞期以缩短生产周期，提高发酵效率，一般采用较大的接种量。种子：发酵培养基＝1：10，V/V
（4）培养基成分：天然培养基营养丰富延滞期短
组合培养基营养单调延滞期长
发酵生产中，发酵培养基成分与种子培养基成分尽量接近，且应适当丰富些生产实践中缩短延滞期的常用手段
1）通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短
2）利用对数生长期的细胞作为种子；
3）适当扩大接种量；
4）尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大；
指数生长期：指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期（群体生理特性较一致，是代谢、生理和酶学等研究的好材料）
特点：①生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间——代时（G）或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；
②细胞进行平衡生长，菌体各部分的成分十分均匀；
③酶系活跃，代谢旺盛；3个重要参数
（1）繁殖代数（n）
（2）生长速率常数（R）
（3）代时（G）: 在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需的时间
在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间
影响微生物增代时间（代时）的因素:菌种、营养成分、营养物浓度（凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率的营养物成分，就称为生长限制因子）、培养温度（在一定范围，生长速率与培养温度呈正相关）
稳定期：（最高生长期）特点是生长速率常数R等于0，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。
菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系，这一关系就是生长产量常数Y（或称生长得率）
x——稳定期时的细胞干重（g／ml培养液），
x0——刚接种时的细胞干重，
C0 ——限制性营养物的最初浓度（g／ml），
C ——稳定期时限制性营养物的浓度（由于计算Y时必须用限制性营养物，所以C应等于0）。
有的微生物在稳定期时还开始合成抗生素等次生代谢产物-----稳定期产物
到来的原因:①营养物尤其是生长限制因子的耗尽；
②营养物的比例失调，例如C／N比值不合适等；
③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的累积；
④pH、氧化还原势等理化条件越来越不适宜等。
对生产实践的指导意义
稳定期是产物的最佳收获期、最佳测定时期
还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。
生产上的措施：补充营养物质、取走代谢产物、调节pH、调节温度、对好氧菌增加通气、搅拌或振荡可延长稳定生长期，以获得更多的菌体物质或积累更多的代谢产物。
衰亡期：个体死亡的速度超过新生的速度，整个群体呈现负生长状态（R为负值）。
产生衰亡期的原因
外界环境对继续生长越来越不利，Eg.营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累等，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线。
连续培养：又称开放培养，在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。（长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率）
微生物连续培养的基本原则：
培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。
恒浊连续培养：不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定（光电控制系统）恒化连续培养：保持恒定的流速（微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖外控制式的连续培养）
优点：高效、自控、产品质量稳定、节约动力人力等
缩短发酵周期，提高设备利用率；便于自动控制；
降低动力消耗及体力劳动强度；产品质量较稳定；
缺点：杂菌污染和菌种退化
微生物的高密度培养（HCDC）也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。
第三节影响微生物生长的主要因素
微生物的六大类营养要素：碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐、水
物理因素：温度、pH和氧气（最主要）
生长温度三基点：最低生长温度、最适生长温度（指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度）、最高生长温度
宽温微生物：15-65℃
窄温微生物：36-40℃
专性好氧菌：必须在较高浓度分子氧（～0.2巴）的条件下才能生长，它们有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，含有超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶
兼性厌氧菌:(兼性好氧菌)是以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的微生物。它们能在有氧时靠呼吸产能；无氧时借发酵或无氧呼吸产能，细胞含SOD和过氧化氢酶。
微好氧菌:只能在较低的氧分压（0.01～0.03巴，正常大气中的氧分压为0.2巴）下才能正常生长的微生物。通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。耐氧菌（耐氧性厌氧菌）：是一类可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌。它们的生长不需要任何氧，但分子氧对它也无毒害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵和底物水平磷酸化而获得能量。耐氧机制是细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。
厌氧菌：一般厌氧菌、专性厌氧菌
特点：①分子氧对它们有毒，即使短期接触也会抑制甚至致死；
②在空气或含10％CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基的表面上
不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原势的环境下才能生长
③生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发
酵等提供；
④细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。
厌氧菌的氧毒害机制：超氧化物歧化酶（SOD）学说
SOD的功能：保护好氧菌免受超氧化物阴离子自由基的毒害，从而提出了缺乏SOD的微生物必然只能进行专性厌氧生活的学说。
最适生长pH值偏于碱性范围内的微生物：嗜碱微生物、耐碱微生物
最适生长pH值偏于酸性范围内的微生物：嗜酸微生物、耐酸微生物微生物外环境的pH变化很大，但细胞内环境中的pH却相当稳定，一般接近中性（可免除了DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性）
胞内酶的最适pH一般接近中性、周质空间内的酶及胞外酶最适pH接近环境的pH
pH对细胞有直接影响和间接影响（pH影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收、环境中有害物质对微生物的毒性、代谢反应中各种酶的活性等）
在一般培养过程中往往以变酸占优势，因此，随着培养时间的延长，一般培养基会变得较酸。pH变化与培养基的组分尤其是碳氮比有极大的关系，
碳氮比高的培养基经培养后pH值常会明显下降（培养各种真菌的培养基）
碳氮比低的培养基经培养后pH值常会明显上升（培养一般细菌的培养基）
第五节有害微生物的控制
抑制：生长停止，不一定死亡
防腐：防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长
是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，即通过制菌作用防止食品、生物制品等对象发生霉腐的措施（低温、缺氧、干燥、高渗、高酸度、高醇度、防腐剂）
化疗：杀死或抑制宿主体内的病原微生物
即化学治疗，指利用具有高度选择毒力，即对病原菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。（化学治疗剂）
死亡：生长能力不可逆丧失
消毒：（消除毒害，“毒害”就是指传染源或致病菌）杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）
是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌，而对被消毒的对象基本无害的措施
灭菌：（杀菌：菌体虽死，但形体尚存溶菌：菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象）杀死包括芽孢在内的所有微生物
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施
干热灭菌：灼烧、烘箱内热空气灭菌（150～170℃下维持1～2小时）
干热：细胞膜破坏、蛋白质变性、原生质干燥、各种细胞成分发生氧化
湿热灭菌法：湿热蒸气透射力强，更易于传递热量；更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构；
多数细菌和真菌的营养细胞：在60℃左右处理5-10分钟；
酵母菌和真菌的孢子：用80℃以上温度处理；
细菌的芽孢：121℃处理15分钟以上；
（1）常压法
1）巴斯德消毒（60～85℃处理15s～30min——低温湿热消毒法，专用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法，可杀灭物料中无芽孢的病原菌，而又不影响它们的风味）
低温维持法、高温瞬时法
2）煮沸消毒：100 ℃处理15～30min
3）间歇灭菌：适用于不耐热培养基的灭菌
（2）加压法
1）常规加压蒸汽灭菌法（高压蒸汽灭菌法）：利用高温（而非压力）进行湿热灭菌的方法优点：操作简便、效果可靠，广泛使用。121℃15-20min 2）连续加压蒸汽灭菌法
影响加压蒸汽灭菌效果的因素：杀菌物体含菌量、灭菌锅内空气排除程度（检验空气是否排尽最好的办法：灭菌锅上同时装有压力表和温度计）、灭菌对象的pH、灭菌对象的体积、加热与散热速度
高温对培养基成分的有害影响及其防止
高温，尤其是长时间的高温除对培养基中的淀粉成分有促进糊化和水解等少数有利影响外，一般对培养基成分产生很多不利的影响。
产生褐变的机制：由氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）与羰基化合物（糖类）间发生复杂的梅拉特反应
防止：采用特殊加热灭菌法（分别灭菌、低压灭菌）、过滤除菌法（不耐热的成分）、其他（螯合剂、气体灭菌剂）
评价表面活性剂、化学杀菌剂、防霉剂、农药或化学治疗剂等的药效和毒性的3种指标：
最低抑制浓度MIC：评定某化学药物药效强弱的指标，指在一定条件下，某化学药剂抑制特定微生物的最低浓度
半致死剂量LD50：评定某药物毒性强弱的指标，指在一定条件下，某化学药物能杀死50％试验动物时的剂量
最低致死剂量MLD：评定某药物毒性强弱的另一指标，指在一定条件下，某化学药物能引起试验动物群体100％死亡率的最低剂量
表面消毒剂：是指对一切活细胞都有毒性，不能用作活细胞或机体内治疗用的化学药剂
共同规律：当其处于低浓度时，常常会对微生物的生命活动起刺激作用，随着浓度逐渐增高，就相继出现制菌和杀菌作用，因而形成一个连续的作用谱石炭酸系数（P.C.）：指在一定时间内，被试药剂能杀死全部供试菌的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度的之比。一般规定处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）抗生素是一类微生物或其他生物生命活动过程中合成的或半合成的次级代谢产物或其人工衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或干扰它种生物（包括病原菌、病毒、癌细胞等）的生命活动，如杀死微生物或抑制其生长，是一种优良的化学治疗剂。
微生物的新陈代谢
新陈代谢：简称代谢，是推动生物一切生命活动的动力源，通常泛指发生在活细胞中的各种分解代谢和合成代谢的总和
分解代谢又称异化作用，是指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化产生简单分子、能量（一般以腺苷三磷酸即ATP形式存在）和还原力一般用[H]来表示）的作用。
合成代谢又称同化作用，是指在合成酶系的催化下，由简单分子、ATP形式的能量和还原力一起，共同合成复杂的生物大分子的过程。
一切生物，在其新陈代谢的本质上具有高度的统一性和明显的多样性。
初级代谢：把营养物质转变成细胞的结构物质，或对机体具生理活性的物质，或为机体生长提供能量的物质的一类代谢类型。
次级代谢：微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长时期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程。
第一节微生物的能量代谢
能量代谢就成了新陈代谢中的核心问题
最初能源：有机物、日光辐射能、还原态无机物通用能源：ATP
生物氧化：就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。
形式：某物质与氧结合、脱氢、失去电子
过程：脱氢（或电子）、递氢（或电子）、受氢（或电子）
功能：产能（ATP）、产还原力【H】、产小分子中间代谢物
类型：呼吸、无氧呼吸、发酵
底物脱氢的四条途径：以葡萄糖作为生物氧化的典型底物，它在脱氢阶段主要可通过4条途径完成其脱氢反应，并伴随还原力[H]和能量的产生。
EMP途径（糖酵解途径）
C6H12O6＋2NAD+＋2ADP＋2Pi→2CH3COCOOH＋2NADH＋2H+＋2ATP＋2H2O
在其终产物中，2NADH＋H+
在有氧条件下，可经呼吸链的氧化磷酸化反应产生6ATP；
在无氧条件下，则可还原丙酮酸产生乳酸或还原丙酮酸的脱羧产物——乙醛还原成乙醇。
EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径，其产能效率虽低，但其生理功能极其重要：①供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力；
②是连接其他几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸循环
（TCA）、HMP途径和ED途径等；
③微生物合成提供多种中间代谢物；
④通过逆向反应进行多糖合成。
HMP途径（戊糖磷酸途径）
6G6P＋12NADP+＋6H2O→5葡糖-6-磷酸＋12NADPH＋12H+＋12CO2＋Pi
HMP途径在微生物生命活动中有着极其重要的意义，具体表现在：
①供应合成原料：提供戊糖-磷酸
②产还原力：产生大量的NADPH2形式的还原力
③作为固定的CO2中介
④扩大碳源利用范围
⑤连接EMP途径
通过HMP途径可提供许多重要的发酵产物
ED 途径(2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG ）裂解途径) 特征性酶——KDPG 醛缩酶
TCA 循环（是指由丙酮酸经过一系列循环式反应而彻底氧化、脱羧、形成CO 2、H 2O 和NADH 2的过程）
真核微生物：TCA 循环的反应在线粒体内进行，其中的大多数酶定位在线粒体
的基质中；
原核微生物：例如细菌中，大多数酶都存在于细胞质内。只有琥珀酸脱氢酶
属于例外，它在线粒体或细菌中都是结合在膜上的。
丙酮酸＋4NAD +
＋FAD ＋GDP ＋Pi ＋3H 2O →3CO 2 ＋FADH 2 ＋GTP ＋4(NADH ＋H +
)
根据递氢特点尤其是氢受体性质的不同，可把生物氧化区分成3种类型：呼吸、无氧呼吸、发酵
呼吸（好氧呼吸）：特点是底物按常规方式脱氢后，脱下的氢（常以还原力[H]形式存在）经完整的呼吸链传递，最终被外源分子氧接受，产生了水并释放出ATP 形式的能量
这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物氧化作用，是一种高效产能方式
无氧呼吸：又称厌氧呼吸，是一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物（少数为有机氧化物）的生物氧化。特点是底物按常规途径脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物或有机物受氢，并完成氧化磷酸化产能反应。 这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸 【硝酸盐在微生物生命活动中具有两种功能
一是在有氧或无氧条件下所进行的利用硝酸盐作为氮源营养物，称为同化性硝酸盐还原作用
二在无氧条件下，某些兼性厌氧微生物利用硝酸盐作为呼吸链的最终氢受体，把它还原成亚硝酸、NO 、N 2O 直至N 2的过程，称为异化性硝酸盐还原作用又称硝酸盐呼吸，又称反硝化作用
两个还原过程的共同特点是硝酸盐都要经过一种含钼的硝酸盐还原酶将其还原为亚硝酸。】
发酵（广义）：泛指任何利用好氧或厌氧微生物来生产有用代谢产物或食品、饮料的一类生产方式
（狭义）指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交某一内源性中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应
EMP 途径中丙酮酸出发的发酵
乙醇发酵——酵母的第一型发酵：酵母菌只有在pH3.5～4.5（弱酸性）和厌氧条件下才能进行正常的酒精发酵 乙醇发酵对环境条件的变化十分敏感
A.O 2的作用：乙醇发酵需在厌氧条件下进行。如果变成好氧条件，乙醇形成就停止，葡萄糖分解的速度减慢——巴斯德效应 巴斯德效应产生的原因：在好氧条件下:
(1)丙酮酸脱羧酶失活，丙酮酸脱氢酶系作用，进入TCA 循环。
(2)高含量的ATP 及柠檬酸别构抑制磷酸果糖激酶活性，减慢葡萄糖酵解速度。 B.pH 的作用
乙醇发酵所需的pH 是弱酸性的，pH3.5～4.5
如果将发酵过程的pH 值控制在微碱性（pH7.6左右）和厌氧条件下，酵母的乙醇发酵－→甘油发酵，得到的产物主要是甘油、少量的乙醇、乙酸和CO 2 ——酵母菌的第三型发酵 在酵母菌的第三型发酵中没有ATP 产生，所以这种发酵是在静息细胞中进行 乙酸的产生会降低培养基的pH 值，使酵母菌的第三型发酵重新回到正常的乙醇发酵，所以，如果产品需要的是甘油，一定要控制好pH 。 C.培养基成分的作用
酵母菌在亚适量的NaHSO 3（3％）作用下可进行酵母菌的第二型发酵生成甘油和少量乙醇
这里有少量的乙醇产生是为了维持菌体正常生长提供能量 如果要利用酵母菌的第二型发酵来生产甘油，则培养基中的一定要亚适量NaHSO 3（3％），大量的NaHSO 3对酵母有毒害作用 酵母的酒精发酵（均在厌氧条件下） 第一型发酵 pH 3.5-4.5（弱酸性） 乙醇
第二型发酵 亚适量NaHSO 3(3%) 甘油和少量乙醇
第三型发酵 pH7.6左右（微碱性） 甘油、少量乙醇、乙酸和CO 2 乳酸发酵——是由乳酸菌在严格厌氧的条件下进行的。乳酸菌是耐氧型的厌氧菌
凡葡萄糖发酵后只产生2分子乳酸的发酵，称同型乳酸发酵
凡葡萄糖发酵后产生乳酸、乙醇（或乙酸）和CO 2等多种产物的发酵称异型乳酸
丙酸发酵 丙酸杆菌
混合酸发酵（大肠杆菌）与丁二醇发酵（产气杆菌、枯草杆菌） 丁酸发酵与丙酮、丁醇发酵(专性厌氧菌梭状芽孢杆菌)