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色谱柱常见问题与维护保养

"Better Surface Chemistry for Better Separation."
https://www.doczj.com/doc/587847428.html,

色谱柱常见故障与排除
1. 柱压问题 2. 峰形异常 3. 保留时间
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正常的色谱柱柱压升高:
1. 色谱柱老化
2. 使用了更小填料粒径、更细内径或更长的色谱柱 3. 使用了粘度更高的流动相 4. 多相系统混合梯度会带来更高的柱压。
*选择合适的流速和色谱柱温度,保证色谱柱在正常操作的压力范围之内。
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系统或操作不当引起的柱压升高:
1.色谱柱过滤筛板堵塞 2.色谱柱污染 3.保护柱或在线过滤器堵塞
*请选择合适的流动相并尽可能除去流动相或被测样品带入的杂质。
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开始
洗脱剂中 盐析出 No 断开C压 力还是高 Yes 断开B压 力还是高 Yes No
Yes Yes No
冲洗后压力还是高
No
盐洗出 ?重新考虑洗脱剂的组分 ?下一次进样前冲洗系统
检测器管路被堵
?清洗检测器 ?更换新的管线
柱子堵
压力低于柱子可 承受的最大压力 Yes Yes
No
柱子老化 ?替换新柱子 ?考察柱子是否 是好的
柱子堵 替换新柱子 断开A压 力还是高 Yes 是否使用 在线过滤器 Yes 在线过滤器堵了 No 泵管路被堵 No 进样器堵
No
过滤流动相 和样品
?清洗进样阀 ?替换新的进样阀 ?替换泵里的过滤器 ?清洗泵 ?替换泵里的管线
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?清洗在线过滤器 ?替换新的在线过滤器
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色谱柱柱压升高的原因及解决:
(1)色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染 解决方法:如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染,可以将色谱柱反方向用甲醇冲 洗至正常压力,或者卸下色谱柱头,将其放在10%的稀硝酸内超声清洗10分钟,后 再用纯水超声10分钟,重新装入色谱柱。 (2)色谱柱头的填料被样品污染 解决方法:如确定色谱柱头的填料被污染,将柱头螺丝卸下,挖出柱内前段被污 染的填料,用相同的柱填料重新填入,仔细修复后,重新安装上柱头螺丝。 (3)色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂,形成结晶析出 解决方法:如确定是盐结晶,用10%的甲醇/水冲洗使柱内盐全部溶解,再换高浓 度甲醇。 (4)流动相PH值过大或过小使固定相结构破坏或溶解 解决方法:如果因pH值使用不当,很难恢复。
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色谱峰峰形异常:
1.峰分裂 2.峰前伸、峰拖尾、峰展宽 3.鬼峰 4.倒峰 5.未出峰
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峰 裂 分
? ? ? ? ?
柱污染 部分阻塞滤片 柱头塌陷 溶剂效应 检测器气泡
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裂峰——柱污染
Column: C8, 4.6 × 250 mm, 5 μm Mobile Phase:25 mM Na2HPO4 (pH3.0):MeOH=60:40(v/v) Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35 oC Detection: UV 254 nm Sample: Filtered OTC Cold Medication: 1.伪麻黄碱 2.扑热息痛 3. 未知物 4.扑尔敏
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裂峰——柱塌陷,部分滤片堵塞
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Column: Polar Phenyl (5 μm, 120 ?, 4.6x250 mm) Mobile phase: CH3OH:0.092%H3PO4(0.04%triethylamine ,0.02% di-n-butylamine )=1.5:98.5 (v/v) Flow rate:1.0 mL/min Detector: 210 nm Column temperature: room temperature Injection volume:20 μL
MWD1 A, Sig=210,8 Ref=off (CAY\POLAR-PHENYL-23055-MAHUANG-MIX-2.D) mAU Sample: 麻黄碱、伪麻黄碱对照品40 μ g/mL in CH OH 140 3 120 100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 MWD1 A, Sig=210,8 Ref=off (CAY\POLAR-PHENYL-23055-MAHUANG-MIX-1.D) mAU Sample: 麻黄碱、伪麻黄碱对照品40 μ g/mL in mobile phase 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 min
裂峰——溶剂化效应
16
min
溶剂效应引起的峰前伸——用流动相溶解或减小进样量
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裂峰产生原因的确定
? 样品基质复杂或分析多种样品——柱污染或部分 阻塞滤片 ? 流动相 pH>=7——由于硅胶溶解导致柱塌陷(除非 使用专门的柱子) ? 溶剂比流动相的强度大——可能产生裂峰或宽峰, 由样品量决定 (溶剂化效应)
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峰峰峰 拖展前 尾宽伸
? ? ? ? ? ?
柱“次级效应” 柱塌陷 柱污染 柱老化 柱负荷超载 柱外效应
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峰拖尾——次级效应
Si OH
硅胶表面残留的硅醇基和硅胶 基质中的的金属杂质对极性溶 质的非特异性吸附造成拖尾
O Si O
O O Chelation HO HO
Al
3+
Si O O Si O "Better Surface Chemistry for Better Separation ." Si OH
COOH HOOC
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峰拖尾——次级效应
? 用流动相减尾剂(三乙胺)在pH 7 消除峰拖尾 ? 降低流动相的pH ,减小与硅醇基作用引起的峰拖尾
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峰拖尾——柱污染
QC方向
QC反方向
100%异丙醇冲洗后
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峰拖尾/展宽—样品过载效应
? ? ? ? ? Column: C8,4.6 × 150 mm, 5 μm Mobile Phase:25mM Na2HPO4(pH7.0) : ACN = 40:60 (v/v) Flow Rate: 1.5 mL/min Temperature: 40oC; Sample: 1.地昔帕明 2.去甲替林 3.多塞平 4.丙米嗪 5.阿米替 6.曲米帕明
USP TF High Load / 10 Low Load 1. 1.60 1.70 2. 2.00 1.90 3. 1.56 1.56 4. 2.13 1.70 5. 2.15 1.86 6. 1.25 1.25
Plates High Load / 10 Low Load 850 5941 815 7842 2776 6231 2539 8359 2735 10022 5189 10725
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峰拖尾——柱外死体积效应
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峰拖尾原因的确定
? 评价柱选择——使用高纯度硅胶柱或不同键合技术柱 ? 评价流动相效果——改变流动相pH和添加剂消除次级 效应(流动相中组份与柱子相互作用) ? 减小进样量 ? 消除柱外效应 ? 冲洗柱子——检查柱子老化/塌陷
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液相色谱柱的选择

液相色谱柱的选择、使用、维护和常见故障及排除液相色谱的柱子通常分为正相柱和反相柱。正相柱大多以硅胶为柱,或是在硅胶表面键合 -CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱;反相柱填料主要以硅胶为基质,在其表面键合非极性的十八烷基官能团(ODS)称为C18柱,其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。另外还有离子交换柱,GPC柱,聚合物填料柱等。本文重点介绍反相色谱柱的选择和使用: 一、反相色谱柱的选择 1.柱子的PH值使用范围 反相柱优点是固定相稳定,应用广泛,可使用多种溶剂。但硅胶为基质的填料,使用时一定要注意流动相的PH范围。一般的C18柱PH值范围都在2-8,流动相的PH值小于2时,会导致键合相的水解;当PH值大于7时硅胶易溶解;经常使用缓冲液固定相要降解。一旦发生上述情况,色谱柱人口处会塌陷。同样填料各种不同牌号的色谱柱不尽相同。如果流动相PH较高或经常使用缓冲液时,建议选择PH范围大的柱子,例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11. 5的柱子。 2.填料的端基封尾(或称封口) 把填料的残余硅羟基采用封口技术进行端基封尾,可改善对极性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,有利于不易保留化合物的分离;填料稳定性好了,组分的保留时间重现性就好。如果待分析的样品属酸性或碱性的化合物,最好选用填料经端基封尾的色谱柱。 3.戴安公司Acclaim柱子介绍—极性封尾C16固定相柱 戴安公司有28种类型的柱子,Acclaim反相柱填料高纯,金属含量极低,完全封尾。PH 2-9范围内兼容,低流失,高柱效。尤其是2003年推出的Acclaim极性封尾C16柱,是最先商品化的磺酰氨-O链接键的色谱柱,具极低的硅羟基活性,能在极性溶剂甚至100%水的条件下长期使用。对酸

色谱柱常见问题(活动za)

高效液相色谱常见问题与解答 何谓反相柱、正相柱? 答:;反相;和;正相;的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相色谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动相极性与固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。 由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动相极性。(硅胶键合十八烷基硅烷)、(硅胶键合辛基硅烷)、(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱,由于固定相极性极低,比目前已知的任何流动相的极性都要低,因而是标准的反相柱。(硅胶)、(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些固定相,因而是标准的正相柱。(硅胶键合腈丙基)的极性适中,当流动相极性超过时,它属于反相柱,反之则是正相柱。 色谱柱规格对分析结果会产生何种影响? 答:色谱柱内径决定载样量,载样量与内径的平方成正比。色谱柱长度与塔板数成正比,与柱压成正比。粒径影响涡流扩散相,粒径越小涡流扩散相越小,柱效越高,粒径与柱效近似成反比。粒径越小,压力也越大,压力与粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制,当孔径为分析物尺寸的倍以上时,分析物才能顺利通过孔隙,孔径处于;的色谱柱适用于相对分子量小于的分析物,孔径为;的色谱柱可以满足分子量处于以上的大分子化合物分析。 液相色谱分析中如何才能提高分离度? 答:下式为分离度计算公式 :柱效()反映色谱柱性能,柱效越高,分离度越好。在其他条件恒定的情况下,塔板数增加一倍,分离度仅提高。操作中,可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度:其一,使用长柱或双柱串联,但也会使分离进度大大延长。其二,使用细粒径填料的色谱柱,但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下后者更为可取。 ;:选择性()是指色谱柱流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关,与保留值也密切相关,其中固定相和流动相组成影响较大。以最常见的反相模式为例,反相柱(包括、、等)是以分配作用对化合物进行保留的,不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异,如果两种化合物的水溶性、在烷烃水体系的分配系数等方面存在明显差异,那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离。柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下,硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用,对化合物的基团具有选择性,常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面,降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度。而有机溶剂类型也会影响分离,比如反相条件下,乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异,这种差异需要在实践中摸索,但无论如何,多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。 :随着容量因子的增大,分离度也随之增加,这种影响在值较低时非常明显,当值大于时,值增加对分离度的影响就不再显著,这就告诫无原则地提高值以增大分离度是没有意义的。增加键合相密度能够提高值。另外改变键合基团类型也能改变值,比如在反相色谱中,随着键合相碳链长度的增加,值逐渐增大。 色谱峰的峰形是怎样衡量的?有何要求?

色谱柱常见问题

高效液相色谱常见问题和解答 1 何谓反相柱、正相柱? 答:“反相”和“正相”的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相色谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动相极性和固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。 由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动相极性。C18(硅胶键合十八烷基硅烷)、C8(硅胶键合辛基硅烷)、PH(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱,由于固定相极性极低,比目前已知的任何流动相的极性都要低,因而是标准的反相柱;Silica(硅胶)、NH2(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些固定相,因而是标准的正相柱。CN(硅胶键合腈丙基)的极性适中,当流动相极性超过CN时,它属于反相柱,反之则是正相柱。 2 色谱柱规格对分析结果会产生何种影响? 答:色谱柱内径决定载样量,载样量和内径的平方成正比;色谱柱长度和塔板数成正比,和柱压成正比;粒径影响涡流扩散相,粒径越小涡流扩散相越小,柱效越高,粒径和柱效近似成反比;粒径越小,压力也越大,压力和粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制,当孔径为分析物尺寸的5倍以上时,分析物才能顺利通过孔隙,孔径处于60~120 Å的色谱柱适用于相对分子量小于10000的分析物,孔径为300 Å的色谱柱可以满足分子量处于10000以上的大分子化合物分析。 3 液相色谱分析中如何才能提高分离度? 答:下式为分离度计算公式 N:柱效(Efficiency)反映色谱柱性能,柱效越高,分离度越好。在其他条件恒定的情况下,塔板数增加一倍,分离度仅提高40%。操作中,可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度:其一,使用长柱或双柱串联,但也会使分离时间大大延长;其二,使用细粒径填料的色谱柱,但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下后者更为可取。 α:选择性(selectivity)是指色谱柱-流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要和固定相、流动相组成以及柱温等因素有关,和保留值也密切相关,其中固定相和流动相组成影响较大。以最常见的反相模式为例,反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用对化合物进行保留的,不同化合物的分离是基于它们在键合相和流动相中分配系数的差异,如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异,那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离;PH柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下,硅胶柱、胺基柱、氰基柱和带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用,对化合物的基团具有选择性,常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面,降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度;而有机溶剂类型也会影响分离,比如反相条件下,乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异,这种差异需要在实践中摸索,但无论如何,多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。

高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法_徐红

高效液相色谱的色谱柱的类型和流动相的选择方法The Choicing W ays of Chromatographic Colum n and Mobil Phase about HPLC 徐 红 侯 健 (新疆昌吉州产品质量检验所,新疆昌吉831100) 摘 要:高效液相色谱仪的核心是色谱柱。另外,流动相对改善分离效果也有重要的辅助效应。色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。现代高效液相色谱填料多使用键合固定相。色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。 关键词:高效液相色谱;色谱柱;填料;流动相;溶剂 色谱柱的关键内容是制备出高效的填料。这些填料装成的色谱柱既要有好的选择性,又要有高的柱效。要提高柱效是现代高效液相色谱的又一重要问题。所以填料和装柱技术是关键问题。 现代高效液相色谱填料多使用键合固定相,其固定相膜很薄,因而大大提高了柱效。高效液相色谱填料的基质有以下几种:(1)全多孔硅胶。现代高效液相色谱填料绝大多数用键合的方法把活性基团接枝到基质上,全多孔硅胶是使用最为普遍的基质。全多孔硅胶的孔径有三种类型:①微孔全多孔硅胶,孔径<2nm;(2)中孔全多孔硅胶,孔径<50nm,>2nm;(3)大孔全多孔硅胶,孔径>50nm。高效液相色谱填料使用中孔和大孔全多孔硅胶,在分离低分子量的混合物时,选择(6~15)nm孔径的全多孔硅胶,其比表面相当于(500~200)m2/g。在分离合成聚合物或生物大分子时,要使用(15~100)nm的全多孔硅胶。如果使用<2nm的全多孔硅胶,色谱峰就会拖尾。(2)其他金属氧化物基质。由于硅胶有一些缺点:在碱性介质中(pH>8)不稳定;在孔隙中大分子扩散困难,降低柱效;硅胶表面上的剩余硅羟基有离子交换作用。为此近年来用氧化铝、氧化锆、氧化钍和氧化钛作为高效液相色谱填料的基质有很大的H PLC应用前景。高效液相色谱固定相有以下几种:(1)硅胶表面键合或涂渍各种聚合物。(2)其他氧化物表面上涂渍聚合物。(3)无孔单分散填料。(4)有机高聚填料。(5)灌注色谱填料。(6)手性固定相填料。 色谱柱的填充技术直接影响柱效的发挥。如果色谱柱填充不好,如填料颗粒之间不均匀、不密实,就会使涡流扩散项增加,导致柱效下降。高效液相色谱柱的性能主要决定于固定相填料,但是色谱柱的填充好坏也有很大的影响。填充色谱柱的方法有干法和湿法两种,一般大颗粒的(如外径>20nm)可以用干法填充;一般小粒径的填料宜用湿法填充。湿法填充也称作匀浆法,即用密度和填料相近的液体或混合液作分散介质,用超声波处理此浆液,然后用高压泵快速压入色谱柱管中,这样就可以制备出高效的色谱柱。 在研究制定一个高效液相色谱方法时,选择适宜的流动相也很重要。在选择流动相溶剂时,首先要考虑的是溶剂的物理性质,其次要考虑溶剂对所要分离样品的容量因子,最后是所使用的溶剂要有分离能力。用作高效液相色谱流动相溶剂,首先要满足以下几点要求:(1)容易得到;(2)适合于所用的检测器;(3)纯净、有一定的惰性;(4)无毒、使用安全;(5)对所分离的样品有一定的溶解性能。 下面介绍选择流动相的要点: (1)首先要考虑溶剂对检测器的适应性。 高效液相色谱在多数情况下要使用紫外检测器,所以必须考虑所用溶剂在紫外波段的吸收。如使用示差折光检测器,要考虑溶剂的折光率。 (2)溶剂的活性 有许多溶剂可能与样品发生反应,或在某些固定相的存在下产生聚合,他们就不能作为流动相使用。 (3)溶剂的沸点和粘度 溶剂的沸点和粘度密切相关,低沸点的溶剂通常其粘度也低。通常选用沸点高于柱温(20~50)℃、粘度不大于5×10-4Pa.S的流动相。 (4)高效液相色谱流动相溶剂的极性 在分配色谱和吸附色谱中,溶剂的极性是用混合溶剂的比例来调节的,一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂经过适当的混合可以得到一定极性的混合溶剂。 (5)溶剂的选择性和溶剂的分类 选择流动相的极性能使被分离样品的分配容量在1~5之间,这时如果有两个或几个色谱峰重叠,可以通过调节溶剂的选择性来解决。 选择合适的色谱柱和流动相是高效液相色谱的关键。 参考文献 [1]富玉,陈能武.高温液相色谱的原理及研究进展.中国测试技术, 2006(3)36. 作者简介:徐红,女,副高级工程师,所长。工作单位:新疆昌吉州产品质量检验所。通讯地址:831100新疆昌吉市健康西路17号。 侯健,新疆昌吉州产品质量检验所(昌吉831100)。 收稿时间:2009-10-16   10 《计量与测试技术》2010年第37卷第2期

气相色谱常见问题及处理方法

问题解答:气相色谱常见问题及处理方法 一、气相色谱系统的基本组成是什么? 气相色谱系统的基本组成有: 1.气源:常用的有N2、H2、Air、Ar、He等高压气体钢瓶,也可采用氢气发生器、氮气发生器、无油空气泵; 2.气路控制系统:由开关阀、稳定阀、针形(调节)阀、切换阀和气阻、压力表、流量计等组成; 3.进样系统:即汽化室,可以根据不同的分析要求,装置不同的进样器内衬。对于气体样品,最好采用六通阀定体积进样,可获好的重复性,对液体样品,一般采用微量注射器进样,对固体样品,多用裂解器或脉冲炉配合; 4.色谱分离系统:色谱柱是解决样品组份分离的关键,有填充柱和毛细柱二大类,根据不同的分析要求来具体配置; 5.检测器:是将样品中的化学组份转化为电讯号,灵敏度和稳定性是关系到整个仪器性能的心脏部件,常用有TCD、FID、ECD、FPD、NPD; 6.色谱工作站 7.温度控制器:有恒温控制和程序升温控制二种方式; 8.检测器电路;每种类型检测器都必须配置一个控制和测量的电路,从而实现非电量转换。例如,配合高灵敏度TCD,就要配置一个热导池恒流电源,对FID就需配置一个微电流发大器。 二、气体为什么要净化? 气体纯度要影响灵敏度、稳定性。净化工作主要是脱除水份、氧(TCD、ECD)和碳氢化合物,碳氢化合物将影响基线稳定性。对于高纯气体分析,要求载气纯度要比被测气体纯度高一个数量级才能正常工作,否则要出倒峰,例如分析高纯Ar(O2≤2PPm,N2≤5PPm),就要求高纯Ar载气中O2、N2都要小于1 PPm才行。应用ECD时,载气中内的H2O和O2将严重影响灵敏度。 三、对进样的五点基本要求是什么? 为保证定性定量精度,进样的基本要求是: 1.快速:是指取样要快,取样后送进仪器要快,样品应进入汽化室中载气流速的区域; 2.重复:是指取样要重复、送入仪器的操作也要重复,对气体样品,要控制住气体样品的流量和压力恒定,以便保证进样和进被测气体的进样量一致性; 3.进样器温度要正确设置;对液体样品,进样汽化温度要设置正确,要高于试样的平均沸点,温度太低会造成高沸点组份汽化不完全,温度太高,可能会引起某些组份的分解; 4.进样死体积要尽量小;指汽化室到色谱柱的连接气路体积要尽可能小,气体进样阀到色谱柱的连接管尽量短,从而减少死体积对峰变宽的影响; 5.对不同柱型要配置不同的进样器结构,以便获得理想的柱效和好的峰形。例如:对填充柱和细口径毛细柱分流进样,衬管内径要适当大些,而对大口径毛细柱柱头进样,衬管内径要适当小些(中间有窄小收口)。 四、填充柱的基本要素是什么? 对一个具体的被测样品,就必需应用一根适用的色谱柱,要考虑到组份的全部分离,也要考虑分析速度和检测器灵敏度。分离、速度、灵敏度是与填充柱的基本要素有关: 1.柱长:柱子越长,分离越好,但分析周期会很长,检测灵敏度也会降低; 2.柱内径:柱的内径越细,分离越好,但制备会困难,柱容量也会减少,造成高含量组份定量偏低; 3.固定液:根据具体样品来选择,“相似性原理”是选择固定液的基本原则,特殊的、复杂的样品也可采用混合型固定液。例如,分离二甲苯,采用DNP+有机皂土;分离白酒,常用DNP+吐温; 4.担体:担体目数大,颗粒细小,分离效果好,但柱压会太高,造成进样压力波动大,对有极性较强的组份,就必须应用硅烷化处理的担体,以利减小峰形拖尾; 5.固定液与担体的配比:固定液配比越高,分离越好,柱容量也会提高,但分析周期会加长,基流会增加,从而增加噪音和基线漂流,柱子老化时间要很长。 五、气相色谱柱的安装 色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。正确的安装请参考以下步骤:

色谱柱的维护及注意事项

色谱柱的维护 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱) 注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧 3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网 4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平 6.照(左图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7.柱芯顶端套上2,然后参照(左图)将滤网放入 8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉,因此在用流动相分析样品之前,应使用10-20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱;如果您所使用的流动相中含有缓冲盐,应注意用纯水"过渡"。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相,请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡 如何平衡色谱柱? 平衡过程中,将流速缓慢地提高 用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线(缓冲盐或离子对试剂度如果较低,则需要较长的时间来平衡) 色谱柱的再生进行色谱柱再生时,应使用一个谦价的泵,我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。 表1 建议用来冲洗的溶剂体积 色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积 125-4 1.6ml 30ml 250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 请根据下表选择您的再生方法: 极性固定相(如Si,NH2*,DIOL基色谱填料)的再生: 正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水** 非极性固定相(如反相色谱填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:

高效液相色谱柱的选择、使用与维护

高效液相色谱柱的选择、使用与维护 辛金菲 天津大沽化工股份有限公司,天津塘沽区300457 摘要:随着社会的进步,色谱分析理论和技术也得到了较大的发展,高效液相色谱现已广泛应用于分析的各个领域,聚集了检测与分离双重性能。其中的色谱柱是样品组分分离的场所,更是高效液相色谱的核心部件,并且属于仪器的耗材,费用比较高。正确的使用方式,才能使其保持良好的性能,而错误的操作方式,可能会导致报废。所以,正确的使用和维护才能保证检测的准确性,而且还能延长使用寿命,降低检测的成本。色谱柱的选择、使用与维护方面的研究在现实中具有非常重要的意义,同时也是色谱工作者和仪器厂商所关注的热点。 关键词:高效液相色谱柱;选择;使用;维护 1前言 高效液相色谱属于色谱法中的一个分支,其流动相为液体,运用的是高压输液系统,将单一或是混合的溶剂和缓冲液流动相泵入装后有固定相的色谱柱,待各成分被分离,再进入检测器,以此实现对试件的分析。由于要分析的样品种类比较多,并且样品的基质都比较复杂,色谱柱很容易被污染,这也是导致分离能力下降和柱压升高的原因之一。通常来说,样品中都会含有一定的不利于分析的物质,其中保留值相对比较弱的物质,一般情况下能快速地从色谱柱中洗脱出

来,才不会对分析产生干扰,对于基质复杂的样品来说,一根色谱柱可能只能使用百余次,并且每一种色谱柱只能适用有限的样品,一次错误进样有时候甚至能导致色谱柱失效。 2高效液相色谱柱的选择 一般情况下,选择保护柱的首先考虑因素是样品的清洁程度,对于大部分相关研究者来说,最合适的保护柱的选择是2cm或3cm,自然所装填的色谱填料随着保护柱的增长而增多,同时它也更能减少污染物进入分析色谱柱。样品的保留时间也会随着保护柱的增长而增长。 保护柱的内径应与分析色谱柱的内径相同或相当,现如今薄膜装填过的保护柱,使用起来也比较简单方便,而且可以干装,但是比较的不经济,一次性使用相对费用较高。另外,薄膜装填法的保护柱所装填的色谱填料是有限的,提供的保护作用有限,但是因为装填了较少的色谱料,保护柱也比较短,所以对分析样品的保留时间的影响小。另外一种保护柱结构的实质是缩短色谱分析柱,设计方式上有整体式、手紧式或直连式;从保护柱的结构可分为是否可以更换保护柱柱芯,以此降低保护柱的成本。 3高效液相色谱柱的正确使用 3.1加装保护柱 加装保护柱的作用比较大,特别是在分析中成药、中药等生物样品和复杂混合物之时,更是保护分析柱的重要措施,保护柱填料与分析柱应该保持一致,保护柱属消耗品,在经过大量的样品分析(50~100次)之后,当峰形变坏或柱压显著升高或基线漂移之时,应考虑

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用及 维护 Prepared on 22 November 2020

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得最大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做! 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装(不加预柱) 1.将卡套架套入柱芯 2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见左图) 3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片 4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧 5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装(加预柱) 1.将卡套架套入柱芯 2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见左图) 3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片 4.将"子弹头"预柱放入卡套片内

5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧 6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱) 注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧 3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网 4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平 6.照(左图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7.柱芯顶端套上2,然后参照(左图)将滤网放入 8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

液相色谱仪色谱柱使用及维护

液相色谱仪色谱柱使用 及维护 Document number:PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998

液相色谱仪色谱柱使用及维护 每天用足够的时间来平衡色谱柱,您就会在处理问题方面获得最大的"补偿",而且您的色谱柱的寿命也会变得更长!------ 一定得做! 新的色谱柱在使用之前应该在您自己的液相色谱仪上进行性能测试,即使用色谱柱附带的检验报告上测试条件和样品来测定该色谱柱的柱效。并且,在以后的使用中,应时常对色谱柱进行测试。 卡套柱的安装(不加预柱) 1.将卡套架套入柱芯 2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使柱芯高于夹套(见左图) 3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片 4.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧 5.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意:使用卡套柱时,两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗,任何时候都不能将卡套取下来,否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装(加预柱) 1.将卡套架套入柱芯 2.将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽,使夹套高于柱芯(见左图) 3.将已套到柱芯上的卡套架向上推,直至高过夹套片 4.将"子弹头"预柱放入卡套片内

5.将卡套帽和卡套架旋在一起,然后用手拧紧 6.然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7.连接到液相色谱仪,PEEK接头手拧即可;若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片(同时可以修补色谱柱) 注意:在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前,应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲洗,而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈,以避免在取出滤网和玻璃棉滤片时带出柱子内的填料。 1.将修补工具中的2套入柱芯的顶端 2.将修补工具中的3轻轻地旋入已套着2的柱芯中,并顺时针方向旋转到旋紧 3.一手握柱芯,另一只手轻轻地向外拉3,取出柱芯顶端的滤网 4.用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5.将新的填料用甲醇润湿,然后填入挖去的部位,压平 6.照(左图)装上新的玻璃棉滤网,并用修补工具中的4将玻璃棉压入柱芯顶端 7.柱芯顶端套上2,然后参照(左图)将滤网放入 8.压紧,然后取下2,再用4将滤网的边缘压平 平衡色谱柱反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会

色谱常见问题解答

色谱常见问题解答 问题1:为什么有些峰出现拖尾 答:①这可能是由于进样口或色谱柱不干净,或色谱柱切割不正确.冷却进样口,关闭气流并更换或清洁进样口部件,包括进样口衬管和金密封垫.取出色谱柱.切掉一段色谱柱以清除不挥发性残留物,隔垫碎屑和密封圈碎片.这段色谱柱的长度可以是 1 英寸到 1 米,如果需要的话,可以更长.使用正确的切割工具来切割色谱柱.如果切割不好,则可能导致样品吸收.使用黄铜刷子或氧化铝粉末等软质研磨剂擦洗进样口钢质内壁.在重新安装其他部件前,要确保已将进样口清洗干净.对于5890,卸下分流出口管路并用溶剂清洗是比较好的方式. ②在不分流方式下进行分析时,不分流时间过长可能导致拖尾.通常时间应在0.5 至 1 分钟范围内. ③未吹扫(死)体积也可能导致拖尾.确保在进样器和检测器中色谱柱安装正确. ④如果考虑色谱柱部分流失,则可以使用色谱柱前的保留间隙(制备色谱柱).如果没有降低色谱柱效率,则可以将其切割掉或更换掉,并可延长色谱柱的寿命.但要注意保留间隙和分析色谱柱的连接可能引起泄漏和样品吸收. 问题2:如何改善峰形(前伸峰,拖尾峰) 答:前伸峰是由于色谱柱过载.当一种或多种化合物的进样量超过色谱柱固定相容量时,可能发生这种情况.液相膜越薄,色谱柱中保留的每种化合物就越少. 这涉及到进样体积和进样中每个峰的化合物浓度.通过减少进样量,分流样品或进样浓度较低的样品,可减小进样体积. 问题3:什么原因导致峰比原来大,而且出现的早 答:过快,过大的峰通常是由于从分流口和隔垫吹扫口排出的载气减少,而更多的进入色谱柱;因此增加柱头压力,可降低分流比.检查分流出品的气体流量,如需调整分流比则对调整此流量.如果问题依然存在,可卸下并清洁分流口.这个问题也可能由于柱头压调节阀有问题而引起. 问题4:何时需更换隔垫或衬管 答:通常比较好的隔垫至少能保证100 次进样不发生问题. 当色谱特征说明衬管有问题时,需要更换衬管.影响隔垫寿命的因素有注射器尺寸,进样口温度和压力,当然受压力影响的程度比较小.影响衬管寿命的因素通常是样品的清洁度.应该根据仪器维护历史记录来选择色谱需要的特定程序. 问题5:随着进样室温度升高,对分析物分解有影响吗 答:如果化合物热稳定性差,分析物分解可能会带来一些问题.这在制药工业中比较常见.如果药物或中间体热分解温度低于进样口温度,则分析结果中将出现特殊的峰或与目标分析物发生反应. 问题6:排除色谱柱流失问题的最佳方法是什么 答:诊断色谱柱是否存在流失问题的最佳方法是第一次在方法条件下安装色谱柱时,做一次空白色谱图,然后将最近的运行和空白运行色谱图对比.如果在空白运行中产生了很多峰,则色谱柱性能改变,这可能是由于载气中含有氧气,也可能是由于样品残留.如果有GC-MS,则低极性色谱柱的典型流失离子(例如DB/HP-1 或5)质/荷比m/z 将为207,73,281,355 等,大多数为环硅氧烷. 问题7:如何得知分流/不分流进样口的进样体积不超过进样口衬管反应室的容积 答:如果不是多次重复进样引起精度问题,则不会经常发生这个问题.精度问题经常是由于不合适的进样体积引起.因为分流进样的进样口流速比较高,样品进出进样口比不分流快得多.同样地,由于溶剂没有时间扩散到衬管外,因此分流模式进样体积要求没有那么严格.实际上,1 微升是比较合适的,由于降低分流比对增大峰面积比增加进样量更有效.然而,不分流进样要求要严格的多,建议使用蒸汽体积计算器估算最终的扩散体积.

C18色谱柱维护与保养

C18色谱柱的维护与保养 1、新柱的处理: 我们每次新买的柱子虽然是经厂家测试过并密封好的,可是有的柱子到达手中时已经过很长的时间了,因此,我们每拿到一根新的色谱柱都必须要对柱子进行处理。首先,是配制好65%的乙腈/水,再把色谱柱正确的连接在色谱仪上,出口放空(注意:出口端切不可连上检测器,以免污染了检测器),以低流速0.1ml/min~0.5ml/min(如果是LC/MC柱子,则应以0.3ml/min进行)均可,不可以高流速进行,等看见柱子出口有液体流出后,过20分钟后再接上检测器,以循序渐进的方法将流速调至1.0ml/min(如果是LC/MC柱子则应以0.3ml/min进行),继续冲洗2~8小时。 2、新柱的使用: 首先我们确认所分析样品流动相的PH是不是在色谱柱PH的耐受范围(2~8)之内,以免损伤柱子!如果,确认在柱子的使用范围之内,就用做样品的流动相平衡柱子(如果流动相中含用缓冲盐溶液,在平衡柱子之前务必要先用5%甲醇或5%乙腈去过渡30分钟以上。再用带盐的流动相去平衡色谱柱。)当色谱柱平衡了足够时间,基线非常平稳的时候,方可进样分析。不管是分析什么样的产品,由于各种各样的因素,样品中总有杂质。因此,最好在色谱柱前端加上保护柱。以增加色谱柱的使用寿命! 3、色谱柱清洗: ①如果样品分析中只用到一般的乙腈、甲醇和水的流动相,在做完样品之后可直接用55%~65%乙腈/水或者用55%~65%甲醇/水冲洗色谱柱40~80分钟,然后以纯甲醇或乙腈冲洗30分钟,即可保存;②如果样品分中流动相里含用

缓冲液或酸或离子对试剂的流动相,在做完样品之后的清洗必须按照如下步骤进行清洗柱子:先用5%的甲醇/水或5%的乙腈/水,以1ml/min,冲洗1.5小时以上(如果色谱柱更长,则还需要增加适当时间);然后用55%~65%甲醇//水冲洗色谱柱30~60分钟.最后用甲醇或乙腈以1ml/min冲洗30分钟。 4、色谱柱的再生: 当色谱柱用过很长的时间之后,就可能发生柱压力升高、分离度不好、柱效降低、峰形不好等等情况,这时我样就需要对色谱柱进行再生,以延长色谱柱的使用寿命。具体方法有如下:先用5%甲醇/水或者是5%乙腈/水,把色谱柱反向以1ml/min,冲洗60分钟以上.然后用四氢呋喃以1ml/min冲洗30分钟以上;再用65%甲醇/水或者65%乙腈/水,以流速1ml/min冲洗60分钟。最后用纯甲醇或乙腈冲洗30分钟保存即可。 备注:甲醇、乙腈、四氢呋喃均要用质量好色谱纯。水用是重蒸留水。

(完整版)色谱柱的使用及维护

前言 液相色谱的分离原理是,在色谱柱流动相中样品的不同组分与固定相发生吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和等作用,由于作用力的大小、强弱不同,各种组分在固定相中滞留的时间也不同,因而先后从以 固定相中流出而得到分离。因此液相色谱分离的关键之一是色谱柱中的固定相。柱效的好坏直接影响目标化合物的分析和检测。但在液相色谱运行过程中,色谱柱极易发生问题,因此掌握正确使用和维护 色谱柱的知识非常必要。色谱柱使用过程中容易发生柱堵塞引起系统压力过高;柱效低引起峰拖尾、变宽;柱污染、损坏导致鬼峰等问题。引起这些问题的内在原因有: (1) 硅羟基的死吸附。色谱柱的基材硅胶粒子表面存在硅胶羟基。任何物质在色谱柱中都存在双分配效应,即在流动相与固定相之间进行分配,又在流动相与硅羟基之间进行分配。被分析物质被硅羟基吸附称为非特异性吸附,或称死吸附。当硅羟基对被分析物质的吸附趋近于饱和状态时,色谱柱柱效下降,峰形出现拖尾、变宽。 (2) 重金属。色谱柱的基材硅胶粒子无论纯度多高,无论怎样处理,都会有不少于5 ×10- 6 的重金属以金属氧化物的形式残存在硅胶粒子的表面,这些金属氧化物很容易与其它化合物形成螯合物,使其被氧化,产生不对称峰或拖尾峰。例如儿茶素和大多数中药,因含有多酚结构,极易被金属氧化物氧化,影响其分离效果。 (3) 碳流失。固定相经长期使用,会有部分碳链被流动相洗脱下来,随流动相一起流出色谱柱外, 造成碳流失。 (4) 缓冲液中盐的析出。在做色谱分析时,有时流动相中会含有缓冲盐溶液。分析结束后,如果没有先用含一定配比的水相流动相冲洗,而直接用纯有机相冲洗,瞬间柱子中的微环境是高有机相、低水相。这时流动相中的缓冲盐溶液极易析出盐,将柱子堵塞,使柱压升高,柱效下降。 (5) 色谱柱变干。如果对色谱柱保存不当,使色谱柱中的保存液全部挥发,柱子内部变干,造成色谱柱的损伤,影响分离效果。 2 色谱柱的使用 新柱使用前应先检查产品包装、外观是否完好。认真阅读说明书及性能测试报告,了解新柱子的最佳性能指标,如某色谱条件下的柱压、柱效等。有时分析用的流动相与柱子的保存试剂不同,故在分析样品之前,应使用合适的试剂将柱子中的保存试剂清洗出来。要注意清洗用的流动相与保存溶剂的相溶性。反相C18 柱通过出厂测试后多保存在乙腈中,可用10~20 倍柱体积的甲醇或乙腈来平衡色谱柱。流速要缓慢提高,如开始0. 3~0. 5mL/ min , 10~15min 后可慢慢加快。 硅胶柱和极性色谱柱通过出厂测试后一般保存在正庚烷中。如果分析时需要使用含水的流动相,则使用前须用乙醇或异丙醇冲洗,流速0. 1~0. 3mL/ min ,将正庚烷冲洗干净后,再用流动相平衡。 实验过程中可以记录色谱柱的一些性能指标,如柱效、柱压等,供今后参考。每次分析样品前,要用流动相对色谱柱进行平衡,待基线平稳后再进样分析。梯度洗脱用初始流动相平衡。一次样品分离完成后,要有足够的时间使系统恢复平衡,再进行下一次分析。一般流动相平衡时间为30min ,若系统中有盐或水,平衡时间应延长。 3 色谱柱的清洗与保存 色谱柱清洗是日常的重要维护工作。如果样品分子残留在柱子、接头、流通池中,会污染系统,影响对其它样品的分析,降低柱效。因此分析工作结束后,要用适当的溶剂清洗系统中残留的样品。在反相系统中, 若流动相中无酸、碱、盐类物质, 可用90 %甲醇冲洗30~60min ,若含酸、碱、盐类物质,则要先用10 %甲醇或乙腈,或用与分析用流动相相同的

色谱柱使用维护保养操作规程

目的:建立色谱柱使用维护保养操作规程,规范色谱柱的使用、维护行为。 范围:适用于色谱柱的使用、维护和保养。 依据: 责任:药分部 内容: 1.操作规程 一般要求是一根柱子用于同一个系列的产品,稳定性试验用专用柱。 1.1.新色谱柱在使用之前,首先应查看说明书,检查柱子的pH值范围是否与待验产品的要求相一致,确认柱子和仪器的接头以及管路是否相匹配,并注意柱子上标示的流向箭头,一切确认无误后,编上编号,在《色谱柱启用、报废台帐》上登记开始使用时间、生产厂家、型号规格等。 1.2.使用时,应按各色谱柱的要求进行色谱柱的维护保养,并在色谱柱使用登记表中登记使用日期、所测产品的名称及批次、使用前后维护保养的具体内容; 1.3使用后,及时填写《色谱柱使用台帐》。 2.维护规程 2.1.液相色谱柱的维护 2.1.1. 色谱柱使用时,确认柱子的编号、型号规格与待验产品的要求相一致,流动相的pH值应与柱子说明书上规定的pH值相适应,然后旋开两端的封头,接到高效液相色谱仪上,使色谱柱的箭头指向与流动相流向一致。 2.1.2.流动相应经过0.45um滤膜过滤并脱气后使用,柱压不要超过300bar(3000psig),最高操作温度不得超过60℃。 2.1. 3.流动相如果是非盐类的,用流动相冲洗约30min,按《高效液相色谱仪操作规程》进行操作,然后进行样品的检验。如果是盐类的,用有机相:水=10:90的溶液冲洗约10min,再换上相对应的流动相,按《高效液相色谱仪操作规程》进行操作,然后进行样品的检验。 2.1.4.检验完毕,如流动相中含有盐类物质,应先用有机相:水=10:90的溶液以1ml/min的流速冲洗约40min,然后用HPLC级的乙腈或甲醇以1ml/min的流速冲洗约30min,关闭液相色谱仪,取下色谱柱,在柱两端旋上封头,以防止柱内的有机溶剂流失而使柱内填料发干变松,柱效下降。不用的色谱柱放入液相色谱分析室的专用贮存柜中。 2.1.5.拿用时要轻拿轻放,避免剧烈震动。 2.1.6.不允许反向连接和冲洗柱子。 2.1.7.柱子的再生:每使用二十次,就按以下程序进行再生一次,以延长柱子的使用寿命。冲洗程序:按柱子上所示箭头方向,依次用高纯水-甲醇-氯仿-甲醇以1ml/min的流速分别冲洗约

色谱柱常见问题

高效液相色谱常见问题与解答 1 何谓反相柱、正相柱? 答:“反相”和“正相”的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相色谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动相极性与固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。 由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动相极性。C18(硅胶键合十八烷基硅烷)、C8(硅胶键合辛基硅烷)、PH(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱,由于固定相极性极低,比目前已知的任何流动相的极性都要低,因而是标准的反相柱;Silica(硅胶)、NH2(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些固定相,因而是标准的正相柱。CN(硅胶键合腈丙基)的极性适中,当流动相极性超过CN时,它属于反相柱,反之则是正相柱。 2 色谱柱规格对分析结果会产生何种影响? 答:色谱柱内径决定载样量,载样量与内径的平方成正比;色谱柱长度与塔板数成正比,与柱压成正比;粒径影响涡流扩散相,粒径越小涡流扩散相越小,柱效越高,粒径与柱效近似成反比;粒径越小,压力也越大,压力与粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制,当孔径为分析物尺寸的5倍以上时,分析物才能顺利通过孔隙,孔径处于60~120 Å的色谱柱适用于相对分子量小于10000的分析物,孔径为300 Å的色谱柱可以满足分子量处于10000以上的大分子化合物分析。 3 液相色谱分析中如何才能提高分离度? 答:下式为分离度计算公式 N:柱效(Efficiency)反映色谱柱性能,柱效越高,分离度越好。在其他条件恒定的情况下,塔板数增加一倍,分离度仅提高40%。操作中,可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度:其一,使用长柱或双柱串联,但也会使分离时间大大延长;其二,使用细粒径填料的色谱柱,但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下后者更为可取。 α:选择性(selectivity)是指色谱柱-流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关,与保留值也密切相关,其中固定相和流动相组成影响较大。以最常见的反相模式为例,反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用对化合物进行保留的,不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异,如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异,那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离;PH柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下,硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用,对化合物的基团具有选择性,常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面,降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度;而有机溶剂类型也会影响分离,比如反相条件下,乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异,这种差异需要在实践中摸索,但无论如何,多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。

色谱柱的使用和维护

一.安装、启用和维护中重点注意事项 色谱柱既是液相色谱仪的最核心部件,价格相对昂贵,请牢记它是高档仪器中的高档部件,给它以足够的尊重和关怀。如避免强烈的碰撞和震动,尽管色谱柱从1米高的实验台掉落到水泥地上不至于100%会损坏,但50%的可能损坏你也承受不起。另外不要让柱床变干,避免在严寒环境受冻等。 1. 柱头类型和不锈钢毛细管接头的匹配 色谱柱是消耗品,不是仪器原配的情况很多。上图表明柱连接的6种不同方式(数字单位是英寸),如果两者类型不匹配将会产生漏液或者死体积过大的现象。接头比柱头深度长,不易拧紧而漏液;接头比柱头深度短,柱头内留有空隙而产生死体积,使谱带展宽和峰拖尾。

2. 溶剂的匹配转换 色谱柱内保存溶剂和仪器系统内存留溶剂,如果和流动相不匹配,使用前需进行转换。特别是流动相含缓冲盐时,如保存溶剂是纯有机相或有机相比例高,直接将新柱接入使用,会导致缓冲盐在柱内结晶析出,最严重会将新柱永久不可逆地损坏。正相柱保存溶剂一般为正己烷,如果要转换成HILIC柱模式使用,由于正己烷和甲醇乙腈的互溶性不好,转换中间需用二氯甲烷或乙酸乙酯过渡。 3. 新柱使用前的平衡和老化 厂家出厂检验时一般都已进行过平衡,但色谱柱到最终用户时间不一,用户正式测定前最好对色谱柱再次平衡。最好的平衡兼老化一起进行的方法是运行几次完整的分析程序(包括进样),直到观察到峰形、保留时间和峰面积稳定为止。所谓“老化”是借用了气相的术语,目的是达到分析物在色谱柱以及整个液相系统流路中的吸附饱和。对某些特定的待测物,如分子量大于1000的,因扩散速度慢,老化时间相应要长,可采取大浓度进样或在同一个洗脱周期内连续进样多针的方式加快老化。 4. pH使用范围 一般认为硅胶基质柱子的pH使用范围是2-8,这是很粗略的。硅胶类型、使用温度、硅胶表面所键合的固定相类型以及缓冲盐的不同,对此均有影响。硅胶比孔容小、键合密度大的填料pH耐受范围要大

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