二硫键是稳定生物分子高级结构，维持正确的折叠构象及保持生物活性的最重要的因素之一[1－2]，如果二硫键出现错位，将导致活性下降，甚至完全失去活性。研究二硫键的连接方式，有助于我们揭示蛋白的高级结构及其生物功能，也是生物技术药物的质量的重要控制标准。
红细胞生长刺激蛋白（erythropoiesis stimulating protein，ESP）是重组人红细胞生成素（EPO）的高糖基化类似物，其作用机理与重组EPO一样，和EPO 受体结合后促进红细胞生成。但它的半衰期延长，体内生物活性增加[3－4]。主要用于治疗慢性肾功能衰竭、骨髓衰竭产生的贫血，免疫疾病伴随的贫血，及自体输血的血液储备等病症，已经成为一种广泛应用的生物工程药物。作为生物技术工程药物，其一级结构的确证，如二硫键连接方式，对于生物工程药物的质量控制有着重要意义。理论上ESP有4个半胱氨酸，形成2对二硫键。常用的二硫键定位方法有X线衍射晶体结构解析法、多维核磁共振波谱法、酶切法、化学裂解法、部分还原测序法、氰化半胱氨酸裂解法等[5－7]，这些方法各有优缺点。在本研究中，我们采用酶切结合质谱法定位二硫键的连接方式。ESP是高糖基化的糖蛋白，须先将其糖链切除，然后将切除糖链的ESP与还原烷基化的ESP分别用胰蛋白酶酶切，用基质辅助激光解吸附电离质谱（MALDI－MS）检测肽质量指纹图谱，比较还原烷基
［收稿日期］2011－02－17
［作者简介］桑志红（1970－），女，助理研究员
［通信作者］何昆，（E－mail）hk＠proteomics．cn
doi:10．3969／j．issn．1009－0002．2011．05．023研究报告红细胞生长刺激蛋白二硫键定位连接方式的测定
桑志红，薛燕，赵永强，刘炳玉，王鸿丽，李萍，杨松成，何昆
国家生物医学分析中心，北京100850
［摘要］目的：建立红细胞生长刺激蛋白（ESP）的二硫键连接方式的测定方法。方法：先将红细胞生长刺激蛋白的糖链用糖苷酶切除，再分别对ESP和还原烷基化后ESP用胰蛋白酶进行酶切，然后用MALDI－TOF测得该蛋白质的肽质量指纹图谱，通过比较还原烷基化前后各肽质量指纹图谱，找到差异肽段的分子离子峰［M＋H］＋，通过比对该蛋白理论酶切肽的［M＋H］＋，确定二硫键的连接方式。结果：ESP有4个半胱氨酸，通过比较还原烷基化前后的肽质量指纹图谱定位二硫键的位置为Cys7－Cys161和Cys29－Cys33，与理论上的二硫键连接相符。结论：建立了酶切结合质谱法测定蛋白质二硫键定位的方法，为今后生物技术产品的二硫键连接方式的质量控制提供了有效的方法。
［关键词］红细胞生长刺激蛋白；基质辅助激光解吸附电离质谱；肽质量指纹图谱；二硫键
［中图分类号］Q502［文献标识码］A［文章编号］1009－0002(2011)05－0700－05
Determination of Disulfide Bond Linking Mode for Rrythropoiesis Stimulating Protein
SANG Zhi－Hong,XUE Yan,ZHAO Yong－Qiang,LIU Bing－Yu,
WANG Hong－Li,LI Ping,YANG Song－Cheng,HE Kun
National Central of Biomedical Analysis,Beijing100850,China
［Abstract］Objective:To establish a method for disulfide bonding determination of erythropoiesis stimulating pro-tein（ESP）．Methods:ESP,removal of sugar chain by peptide－N－glycosidase,was reduced and alkylated,then di-gested by trypsion．By comparing before and after reductive alkylation peptide mass fingerprinting,to find different peptides in the molecular ion peak［M＋H］＋and determine the disulfide bond linking mode．Results:Our results demonstrated there were two disulfide bond in the ESP．One is disulfide Cys7－Cys161and another is Cys29－Cys33．Conclusion:The method to determinate disulfide bonding was successfully established,which combined digest method and mass spectrometry analysis and would be used for quality control for recombinant protein．
［Key words］erythropoiesis stimulating protein;MALDI－MS;peptide mass fingerprint;disulfide bond
化前后的肽质量指纹图谱的变化，确定二硫键的连接方式及位点。这种简便易行的测定二硫键连接方式的方法为生物工程产品的质量控制提供了有效途径。
1材料与方法
1．1材料
红细胞生长刺激蛋白（送检样品）；9．4T混合型四级杆－傅立叶变换离子回旋共振质谱仪（9．4T Q－FT－ICR－MS，Bruker公司）；ReflexIII基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI－TOF－MS，Bruker公司）；真空离心干燥仪UVS400A（Savant公司）；二硫苏糖醇（DDT，Promega公司）；碘乙酰胺（IAA，ACROS公司）；三氟乙酸（TFA，Fluka公司）；α－氰基－4－羟基肉桂酸（CCA，Bruker公司）；乙腈（CAN，Fisher Scientifics公司），肽N糖苷酶F（PNGase F，SIGMA公司）；巯基乙醇（SDS，Amresco公司）；胰蛋白酶（Roche公司）；碳酸氢铵（国产试剂）；超纯水（Millipore公司纯水系统制备）；ziptip C18（Millipore 公司）。
1．2仪器实验条件
1．2．19．4T Q－FT－ICR－MS检测条件N2激光源，波长337nm；正离子；扫描范围m／z：300～6000；MCP检测器电压2300V；基质：CCA。
1．2．2ReflexIII MALDI－TOF－MS检测条件N2激光源，波长337nm；正离子；线性模式（飞行管长1．5 m，加速电压20kV）；扫描范围m／z：10000～100000；基质：CCA。
1．3ESP的N－糖链切除
取样品100μg溶于20μL超纯水中，加入5μL250mmol／L磷酸盐缓冲液（pH7．5）和2μL2％SDS（含1mol／L巯基乙醇），100℃5min，冷却至室温，加入2μL15％Triton－X100，加入1μL肽－N－聚糖酶，37℃3h。
1．4凝胶电泳分离蛋白
制备不连续SDS－PAGE凝胶，下层分离胶浓度为12％,上层浓缩胶浓度为5％，取样品2μg上样。电泳时采用恒流法，浓缩胶电流为每胶10mA，分离胶电流为每胶20mA。固定、考马斯亮蓝R250染色、脱色同其他常规操作。
1．5胰蛋白酶酶切样品的制备
1．5．1不经还原烷基化直接酶解样品的制备取经肽－N－聚糖酶切除糖链的样品，进行SDS－PAGE 分离，切取脱糖后的目的条带置于EP管中，加入含50％乙腈的100mmol／L NH4HCO3，置37℃孵箱中30min脱色，重复2～3次，至胶中蓝色退尽，加乙腈振荡，使胶粒完全脱水，真空离心干燥后加入胰酶，37℃过夜，吸取溶液进行肽质量指纹图谱的鉴定。1．5．2经还原烷基化再酶解样品的制备取经肽－N－聚糖酶切除糖链的样品进行SDS－PAGE分离，切取脱糖后的目的条带置于EP管中，加入含50％乙腈的100mmol／L NH4HCO3，置37℃孵箱中30min 脱色，重复2～3次，至胶中蓝色退尽，加乙腈振荡，使胶粒完全脱水，真空离心干燥后，用10mmol／L DTT－NH4HCO3（50mmol／L）于56℃孵育1h，吸除DTT，再加入乙腈脱水，真空干燥后加入55mmol／L IAA室温避光30min，用乙腈脱水后加入胰酶，37℃过夜，吸取溶液进行肽质量指纹图谱鉴定。1．6质谱样品的制备
用含有0．1％TFA的乙腈∶水（1∶1）溶液将CCA 配制成饱和溶液，离心后与样品等体积混合，取混合液2μL加于靶上，在空气中自然干燥后待测。
2结果与讨论
2．1ESP的相对分子质量测定
用ReflexIII MALDI－TOF－MS测定送检样品ESP的相对分子质量（图1）。ESP是高糖基化的蛋白，由于糖链的微不均一性导致相对分子质量峰型变宽，所以质谱图中显示的是质量分布，约36000。凝胶电泳分离鉴定ESP切除糖链后的相对分子质量约为20000（图2）。
2．2序列覆盖率
切取脱糖后的目的条带进行胶内胰酶酶切，并经10mmol／L DTT还原、55mmol／L碘乙酰胺烷基
图1MALDI－TOF－MS测定ESP
的相对分子质量
化后,取原液进行肽质量指纹图测定与理论酶切肽段对比，序列覆盖率大于98％（图3），说明送检的
ESP 序列与理论值相同。2．3二硫键定位
由于二硫键不能被胰蛋白酶酶切，因此在蛋白质未经过还原二硫键直接胰酶酶切的肽质量指纹图谱中，含有半胱氨酸的酶切肽段将包含二硫键连接的酶切肽段；而经过还原烷基化后的胰酶酶切肽质量指纹图谱中，由于二硫键断裂，2个半胱氨酸形成自由巯基结合烷基化试剂，原有的二硫键连接的肽段将消失，并产生新的结合了烷基化的肽段，从而可以判断二硫键的位点及连接方式。烷基化方法
很多，我们选用的烷基化试剂是IAA ，因此在还原烷基化后的胰酶酶切肽图中，含有n 个自由巯基的酶切肽段中将形成比理论分子质量多n 个75的实测分子质量。
根据ESP 的理论氨基酸序列结合胰酶酶切位点，利用软件可以得到ESP 的理论酶切肽段分子质量。将理论酶切肽段分子质量与肽质量指纹图中的肽段分子质量相比，可以确定二硫键的连接方式及位点。
ESP 理论上含有4个半胱氨酸，分别位于7、29、33、161位，可以形成2对二硫键，可能有3种组
合，即Cys 7－Cys 29／Cys 33－Cys 161、Cys 7－Cys 33／Cys 29－Cys 161或Cys 7－Cys 161／Cys 29－Cys 33。对于不同的二硫键连接方式，有二硫键连接的肽段会在质谱图上形成不同的肽段，从而可以从实际测定到的肽段质量数据与可能的二硫键异构体的理论肽段相比较，二者能够吻合的，说明存在此种二硫键连接方式。表1列出了可能的3种连接方式含二硫键的未还原烷基化二硫键胰酶酶切肽段理论［M＋H ］＋值。对照图4A ，我
表13种二硫键连接方式可能形成的肽段的理论［M＋H ］＋
连接方式
肽段
理论［M＋H ］＋
A B C
Ｔ１（１－１０）－Ｓ－Ｓ－Ｔ４（２１－４５）－Ｓ－Ｓ－Ｔ１９（１５５－１６２）Ｔ１（１－１０）－Ｓ－Ｓ－Ｔ４（２１－４５）－Ｓ－Ｓ－Ｔ１９（１５５－１６２）
Ｔ１（１－１０）－Ｓ－Ｓ－Ｔ１９（１５５－１６２）Ｔ４（２１－４５）（Ｓ－Ｓ）
4736．064736．061959．892777．18
图3去除糖链后还原烷基化的ESP 经胰蛋白酶酶切后肽质量指纹图谱肽段匹配图
图2ESP 切除糖链后的变性还原SDS－PAGE M ：标准蛋白；1，2：ESP 切除糖链后；3，4：
EPO
们可以看到信号较强的C 连接方式的2个肽段实测值分别为1959．87和2777．16。虽然也有A 和B 连接方式的肽段实测值为4736．02，但在图中信号较弱。由此我们可以判定ESP 存在C 连接方式，即
7位和161位为一对二硫键，29位和33位为一对二硫键，还有少量的A 、B 连接方式。
为了进一步验证二硫键的C 连接方式，我们比
较了还原烷基化二硫键后的胰酶酶切肽质量指纹
图4样品的肽质量指纹图谱
A ：去除糖链后的ESP 经胰蛋白酶酶切后的肽质量指纹图谱；
B ：去除糖链后还原烷基化的ESP
经胰蛋白酶酶切后的肽质量指纹图谱
图谱。理论上，还原烷基化后的肽图，T1（1－10）－S－S－T19（155－162）M／Z1959．87和T4（21－45）（S－S）M／Z2777．16会消失，出现T1（1－10）、T19（155－162）和T4（21－45）的烷基化肽段1107．49、969．42和2893．16的肽段，如图4所示与理论完全吻合，进一步说明送检样品ESP的二硫键连接方式为Cys7－Cys161／Cys29－Cys33，具有与理论相同的二硫键连接方式和位点。
我们用酶切法结合质谱分析，准确测定了ESP 的二硫键连接方式。相对于传统的二硫键连接方式测定方法，本方法具有快速、简便、灵敏度高等优点，这为生物工程药物的二硫键连接方式的测定提供了一种快速灵敏的选择。
参考文献
[1]Creighton T E．Disulphide bonds and protein stability[J]．
Bioessays,1988,8:57－63．
[2]Matsumura M,Signor G,Matthews B W．Substantial increase
of protein stability by multiple disulphide bonds[J]．Nature, 1989,342:291－193．
[3]Nissenson A R．Novel erythropoiesis stimulating protein for man-
aging the anemia of chronic kidney disease[J]．Am J Kidney Dis,2001,38(6):1390－1397．
[4]Egrie J C,Browne J K．Development and characterization of
novel erythropoiesis stimulating protein(NESP)[J]．Br J Cance, 2001,84(suppl3):3－13．
[5]Smith D L,Zhou Z．Strategies for locating disulfide bonds in
proteins[J]．Methods Enzymol,1990,193:374－389．
[6]Wu J,Gage D A,Watson J T．A strategy to locate cystein
residues of protein by specific chemical cleavage followed by matrix－assisted laser desorption／ionization time－of－flight mass spectrometry[J]．Anal Biochem,1996,235(2):161－174．
[7]Gorman J J,Wallis T P,Pitt J J．Protein disulfide bond de-
termination by mass spectrometry[J]．Mass Spectrom Rev,2002, 21(3):183－216．
1，基因组：一个细胞或病毒所包含的全部基因。 2，蛋白质组(Proteome)的概念最先由Marc Wilkins提出。定义：蛋白质组是由一个细胞，一个组织或一个机体的基因组所表达的全部相应的蛋白质。是一个整体概念。 3，蛋白质组学：是一门以全面的蛋白质性质研究(如表达水平、转录修饰、相互作用等)为基础，在蛋白质水平对疾 病机理、细胞模式、功能联系等方面进行探索的科学，包括表达蛋白质组学，细胞谱蛋白质组学以 3，等电聚焦：分离两性分子，特别是分离蛋白质的一种技术。根据在一个电场的影响下这些两性分子在ph梯度上的分布情况进行分离 等电聚焦技术：在一个pH梯度和外加电场下，蛋白质有移向pH梯度中使其净电荷为零的点的倾向。（带正电荷移向阴极，带负电荷移向阳极）。IEF可以基于极微小的电荷差异而分离蛋白，具有高分辨率。4，负染就是用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果（图2-15），分辨力可达1.5nm左右 5，质谱（又叫质谱法）是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。 质谱分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带正电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。 7，分子离子峰：子受电子束轰击后失去一个电子而生成的离子M+成为分子离子。在质谱图中，由M+所形成的峰称为分子离子峰。 7.碎片离子峰当电子轰击的能量超过分子离子电离所需要的能量（50~70eV）时，可能使分子离子的化 学键进一步断裂，产生质量数较低的碎片，称为碎片离子。在质谱图上出现相应的峰，称为碎片离子峰。 碎片离子峰在质谱图上位于分子离子峰的左侧。研究最大丰度的离子断裂过程，能提供被分析化合物的结构信息。 8.软电离技术在质谱分析中，离子源是将分子离解成离子或解离成碎片，在这里分子失去电子， 生成带正电荷的分子离子。分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法，后一种方法适用于易破裂或易电离的样品。 9.源内衰变技术（insource-decay，ISD）源内衰变发生在离子源区域内，时间为激光撞击之后几 百纳秒之内，是离子的“即可片段化”。这些片段离子通过衰减离子取出，能在线性飞行时间质谱中被发现，许多蛋白质和大的肽常在MOLDI-TOF-MS的离子源区域内变成肽离子片段。主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子，通过分析这些片段离子谱可鉴定蛋白质。 10.肽质量指纹图谱是指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于 每种蛋白质的氨基酸序列都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数据也具特征性，这种特征就像指纹一样，所以称为指纹谱。肽质量指纹图谱可用于蛋白质的鉴定，用实验测得的PMF与蛋白数据库中的蛋白质理论PMF比对，就可以鉴定该蛋白质 肽序列标签是由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。
6种方法测定蛋白质含量 [ 文章来源： | 文章作者： | 发布时间：2006-12-25| 字体： [大 中 小] 一、微量凯氏（kjeldahl ）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： nh 2ch 2cooh+3h 2so 4——2co 2+3so 2+4h 2o+nh 3 (1) 2nh 3+h 2so 4——(nh 4)2so 4 (2) (nh 4)2so 4+2naoh ——2h 2o+na 2so 4+2nh 3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret 法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质组学期末作业
1、一、常用的样品制备技术： 1、高丰度蛋白去除技术（抗体亲和法：通过抗原抗体反应原理，用针对样品中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除样品中的高丰度蛋白；染料亲和法：通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除样品中的高丰度蛋白，其特异性相对较低。） 2、自由流电泳技术（FFE）（FFE分离原理－IEF （等电聚焦）条件下：根据等电点的不同进行样品分离，主要用于分离蛋白质。ZE（区带电泳）条件下：根据样品表面电荷密度不同进行分离，主要用于分离细胞器。FFE的特点：1、是基于液体的样品分离/制备技术，与所有下游分离技术兼容；2、分离非常快； 3、液相分离保证初始样品具有很高的回收率； 4、采用连续模式，上样和分离连续同时进行； 5、分析对象广泛； 6、分离条件温和，适合活性生物材料的分离纯化。 二、2－DE技术，即双向电泳，是当前蛋白质组学研究中分辨率最高、信息量最大的分离技术。它的优点有：1. 可以将上千种不同的蛋白质分离开来，并得到每种蛋白质的等电点、表观
质膜的纯度鉴定方法 11、形态学方法（常规透射电镜、免疫电镜观察其切片，纯细胞膜成空的膜泡或片状结构）2免疫印迹法（常用抗体:抗caveolin、Na+--K+--ATPase、flotillin、5`-nucleotidase 等） 3、酶活测定法（测 AP、ADP、Na+-K+-ATPase、5`-nucleotidase的活性） 4、膜组分分析法（分析脂质与蛋白质的比例） 由于细胞器在细胞内结构上与许多其他亚细胞组分相关联，和细胞器组成的动态性，所以分离得到的细胞器很难达到100% 的纯度。所以，亚细胞组分的纯度问题和亚细胞组分生物学功能的深入挖掘是亚细胞蛋白质组研究所面临的挑战。现在已经有一些研究策略来解决这一难点问题，如Schirmer等提出的差减蛋白质组学方法来解决核膜的内质网污染问题；Andersen 等提出的蛋白质校正谱图分析法(protein correlation profiling，PCP)来分析可能定位
食品中蛋白质的测定方法 蛋白质的测定方法分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量，肽链和折射率测定蛋白质含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定蛋白质含量。但是食品种类很多，食品中蛋白质含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此蛋白质的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸 液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出蛋白质的含量。由于食品中蛋白质含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的。 一凯氏定氮法 我们在检验食品中蛋白质时，往往只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质核算系数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗蛋白质。 (一) 、常量凯氏定氮法 衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l6 ％，即1份氮素相当于6.25 分蛋白质,以此为换算系数6.25 ，不同类的食物其蛋白质的换算系数不同. 如玉米、高梁、荞麦, 肉与肉制品取6.25 ，大米取 5.95 、小麦粉取 5.7, 乳制品取 6.38 、大豆及其制品取5.17 ，动物胶 5.55 。 测定原理： 食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素以氨的形式与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收形成硼酸铵，再用盐酸标准溶液或硫酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出总氮量，再乘以一定的数值即为蛋白质含量，其化学反应式如下。 ⑴消化反应：有机物(含C、N、H、0、P、S等元素)+H2S04 -T(NH4)2SO4+CO0 +S02f +S03+H3PO4+C02 (2) 蒸馏反应：(NH4)2SO4+2NAOH—2NH3T +2H2O+NA2SO4 2NH3+4H3B04 (NH4)2B4O7+5H2O (3) 滴定反应：(NH4)2B4O7+2HCH+5H2O T2NH4CH+4H3BC或(NH4)2B407+H2S04+5H20- (NH4)9SO4+4H2BO2 试剂与仪器： 1、硫酸钾； 2、硫酸铜；
线粒体蛋白质组学的研究进展(一) 【摘要】线粒体是真核细胞重要的细胞器，随着蛋白质组技术的发展和完善，一些新方法也被应用于线粒体蛋白质的研究，线粒体蛋白质组研究虽然已取得了一些成果，但线粒体蛋白质组数据库中的数据仍较匮乏，并且还有一些问题亟待解决和改善。 【关键词】线粒体；蛋白质组学 人类体细胞中除了红细胞，其他所有细胞均含有线粒体。线粒体是真核细胞重要的细胞器，它不仅是机体的能量代谢中心，而且还参与多种重要的细胞病理过程。线粒体拥有自己的DNA（mtDNA），可以进行转录、翻译蛋白质合成。线粒体含有500～2000种蛋白质，约占整个细胞蛋白质种类的5%~10%。线粒体的蛋白质参与机体许多生理、病理过程，如参与电子传递和ATP合成、三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等过程。线粒体蛋白质结构与功能的改变与人类许多疾病相关，如退行性疾病、心脏病、衰老和癌症。运用蛋白质组研究技术，从整体上研究这些蛋白质在生理及病理状态下的变化趋势及相互关系，可以为线粒体作用机制的探索提供新的有力的支持。 1线粒体的超微结构和功能 线粒体是机体细胞中重要的亚细胞器，它具有独特的超微结构和多种重要的生物学功能。线粒体由两层膜包被，外膜平滑，内膜向内折叠形成嵴，两层膜之间有腔，线粒体中央是基质。基质内含有与三羧酸循环所需的全部酶类，内膜上具有呼吸链酶系及ATP酶复合体。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞“动力工厂”之称。线粒体合成的ATP供给几乎所有的细胞生理过程：从骨骼肌和心肌的收缩，到细胞膜跨膜离子梯度的维持、甚至激素和神经递质的分泌等。另外，线粒体有自身的DNA和遗传体系，但线粒体基因组的基因数量有限，因此，线粒体只是一种半自主性的细胞器。线粒体的主要化学成分是蛋白质和脂类，其中蛋白质占线粒体干重的65%~70%，脂类占25%~30%。在肝细胞线粒体中外膜、内膜、膜间隙和基质四个功能区，各蛋白质的含量依次为：基质67%，内膜21%，外膜8%，膜间隙4%。内膜含有三类功能性蛋白：（1）呼吸链中进行氧化反应的酶。（2）ATP合成酶复合物。（3）一些特殊的运输蛋白，调节基质中代谢物的输出和输入。细胞线粒体的功能，不仅限于生物学功能。它们在氨基酸和血脂新陈代谢、血红素和铁硫群生物合成、细胞信号与细胞凋亡发挥关键作用。 2线粒体蛋白质组学概述 2.1蛋白质组学的概念蛋白质组学（proteome）一词，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。 2.2蛋白质组学的研究内容蛋白质组学的研究内容主要有两个方面：即结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。结构蛋白质组学主要是蛋白质表达模式的研究，包括蛋白质氨基酸序列分析及空间结构的解析、种类分析及数量确定。功能蛋白质组学主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质的功能及蛋白质间的相互作用。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为多种疾病机制的阐明及攻克，提供理论根据和解决途径。 2.3线粒体蛋白质组的分析对蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中与基因组学相对应的主要内容。目前线粒体蛋白质组的分析工作主要有:（1）通过双向电泳等技术得到正常生理条件下的蛋白质的图谱，建立相应的数据库。（2）比较病理组织细胞蛋白质组发生的变化，如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的类型和程度,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上定位的改变等。 2.4线粒体蛋白质组研究技术线粒体蛋白质组研究常用的技术有：（1）用于蛋白质相互作用
举例说明蛋白质结构和功能的关系 答： 1.蛋白质的一级结构与功能的关系 蛋白质的一级机构指：肽链中氨基酸残基（包括二硫键的位置）的排列顺序。一级结构是蛋白质空间机构的基础，包含分子所有的信息，且决定蛋白质高级结构与功能。 ①一级结构的变异与分子病 蛋白质一级结构是空间结构的基础，与蛋白质的功能密切相关，一级机构的改变，往往引起蛋白质功能的改变。 例如：镰刀形细胞贫血病 镰刀形细胞贫血病的血红蛋白（HbS）与正常人的血红蛋白（HbA）相比，发现，两种血红蛋白的差异仅仅来源于一个肽段的位置发生了变化，这个差异肽段是位于β链N端的一个八肽。在这个八肽中，β链N端第6位氨基酸发生了置换，HbA中的带电荷的谷氨酸残基在HbS中被置换成了非极性缬氨酸残基，即蛋白质的一级机构发生了变化。 ②序列的同源性 不同生物中执行相同或相似功能的蛋白质称为同源蛋白质，同源蛋白质的一级机构具有相似性，称为序列的同源性。最为典型的例子， 例如：细胞色素C（Cyt c） Cyt c是古老的蛋白质，是线粒体电子传递链中的组分，存在于从细菌到人的所有需氧生物中。通过比较Cyt c的序列可以反映不同种属生物的进化关系。亲缘越近的物种，Cyt c中氨基酸残基的差异越小。如人与黑猩猩的Cyt c完全一致，人与绵羊的Cyt c有10个残基不同，与植物之间相差更多。蛋白质的进化反映了生物的进化。 2.蛋白质空间结构与功能的关系 天然状态下，蛋白质的多肽链紧密折叠形成蛋白质特定的空间结构，称为蛋白质的天然构象或三维构象。三维构象与蛋白质的功能密切相关。 ①一级结构与高级结构的关系： 一级结构决定高级机构，当特定构象存在时，蛋白质表现出生物功能；当特定构象被破坏时，即使一级构象没有发生改变，蛋白质的生物学活性丧失。例如：牛胰核糖核苷酸酶A（RNase A）的变性与复性 当RNase A处于天然构象是，具有催化活性； 当RNase A处于去折叠状态时，二硫键被还原不具有催化活性；当RNase A恢复天然构象时，二硫键重新形成，活性恢复。 ②变构效应 变构效应：是寡聚蛋白质分子中亚基之间存在相互作用，这种相互作用通过亚基构象的改变来实现。蛋白质在执行功能是时，构象发生一定变化。 例如：肌红蛋白、血红蛋白与氧的结合 两种蛋白质有很多相同之处，结构相似表现出相似功能。这两钟蛋白质都含有血红素 辅基，都能与氧进行可逆结合，因此存在着氧合与脱氧的两种结构形式。但是肌红蛋白几乎在任何氧分压情况下都保持对氧分子的高亲和性。血红蛋白则不同，在氧分压较高时，血红蛋白几乎被氧完全饱和；而在氧分压较低时，血红蛋白与氧的亲和力降低，释放出携带的氧并转移给肌红蛋白。
蛋白质含量测定法（一） 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩脲法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 五种蛋白质测定方法比较
值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。 一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下： NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1) 2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2) (NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（Biuret法） （一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材
蛋白质组学关键技术研究进展 摘要：蛋白质组学是对蛋白质特别是其结构和功能的大规模研究，是在90年代初期，由Marc Wikins 和学者们首先提出的新名词。蛋白质组的研究不仅能为生命活动规律提供物质基础，也能为众多种疾病机理的阐明及攻克提供理论根据和解决途径。本文综述了蛋白质组学的一些关键技术的应用研究进展。 关键词：蛋白质组学；蛋白质组技术；研究方法 蛋白质组学的概念[1]最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。近年来，高通量蛋白质分离与鉴定技术，如双向电泳、生物质谱、蛋白质芯片、酵母双杂交系统、生物信息学等相继建立并日趋完善，加速了蛋白质组学的发展。 1蛋白质组学概述 随着人类基因组计划的完成和功能基因组时代的到来，蛋白质结构与功能研究越来越重要，蛋白质组学、生物信息学等相关学科已逐渐成为生命科学的前沿。 随着人类基因组计划的实施和推进，生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代，生命科学的主要研究对象是功能基因组学，包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。尽管现在已有多个物种的基因组被测序，但在这些基因组中通常有一半以上基因的功能是未知的。 目前功能基因组中所采用的策略，如基因芯片、基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression, SAGE)等，都是从细胞中mRNA的角度来考虑的，其前提是细胞中mRNA的水平反映了蛋白质表达的水平。但事实并不完全如此，从DNA、mRNA、蛋白质，存在三个层次的调控，即转录水平调控(Transcriptional control)，翻译水平调控(Translational control)，翻译后水平调控(Post-translational control)。从mRNA 角度考虑，实际上仅包括了转录水平调控，并不能全面代表蛋白质表达水平。实验也证明，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度的相关性并不好，尤其对于低丰度蛋白质来说，相
第２０卷第６期２００８年６月 化 学进展 ＰＲＯＧＲＥＳＳＩＮＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｖ０１．２０Ｎｏ．６Ｊｕｎｅ，２００８ 蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析＊ 仇晓燕１’２ 崔 勐１ （１．中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心 刘志强１ 刘淑莹Ｈ‘ 长春１３００２２；２．中国科学院研究生院 北京１０００３９） 摘 要 二硫键是一种常见的蛋白质翻译后修饰，对稳定蛋白质的空间结构，保持及调节其生物活性有
着非常重要的作用。因此，确定二硫键在蛋白质中的位置是全面了解含二硫键蛋白化学结构的重要方面。在众多实验方法中，现代质谱技术因其操作简单、快速、灵敏等优点而成为分析二硫键的重要手段。本文介绍了目前主要的定位二硫键的方法以及质谱在二硫键定位分析中的应用与进展。 关键词 二硫键定位质谱串联质谱三羧乙基膦稳定同位素标记 中图分类号：０６５７．６３；Ｑ５１ 文献标识码：Ａ文章编号：１００５．２８１Ｘ（２００８）０６．０９７５—０９ ＰｒｏｔｅｉｎＤｉｓｕｌｆｉｄｅＢｏｎｄＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｎｄＩｔｓＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｑｉｕ Ｘｉａｏｙａｎｌ＇２ ＣｕｉＭｅｎ９１Ｌｉｕ劢ｉｑｉａｎ９１ＬｉｕＳｈｕ乒ｎ９１‘‘ （１．ＣｈａｎｇｃｈｕｎＣｅｎｔｅｒｏｆＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ＣｈａｎｇｃｈｕｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｐｐｌｉｅｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２２，Ｃｈｉｎａ；２．ＧｒａｄｕａｔｅＳｃｈｏｏｌｏｆｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００３９，Ｃｈｉｎａ） ＡｂｓｔｒａｃｔＤｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓ
实验七蛋白质含量测定 测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。 [目的要求] 1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。 2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。 一、染料法 [实验原理] 在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。 该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。 [器材] 吸量管；试管；721型分光光度计 [试剂] 1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。 2.待测蛋白质溶液。 3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-250 0.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤] 1．标准曲线的绘制： 按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。 2．样品测定： 取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。 二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量 [实验原理] 在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基(—CO-NH2)，或与此相似的基团[如—CH2-NH2，—CS-NH2，—C(NH)NH2]的任何化合物，无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连，均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量
蛋白质组学相关试题及答案 解释 1． Proteome(蛋白质组)：由一个细胞或者组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质，称为蛋白质组。 2. Proteomics(蛋白质组学)：指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，即研究细胞在不同生理或病理条件下蛋白质表达的异同，对相关蛋白质进行分类和鉴定。更重要的是蛋白质组学的研究要分析蛋白质间相互作用和蛋白质的功能. 3. Mass Spectrometer（质谱仪）：质谱仪是一个用来测量单个分子质量的仪器，但实际上质谱仪提供的是分子的质量与电荷比（m/z or m/e）。分离和检测不同同位素的仪器。即根据带电粒子在电磁场中能够偏转的原理，按物质原子、分子或分子碎片的质量差异进行分离和检测物质组成的一类仪器。质谱仪最重要的应用是分离同位素并测定它们的原子质量及相对丰度。 4. Proteome sample holographic preparation（蛋白组样品的全息制备）：（1）keep protein information （2）adapted to separation and identification methods （3）different samples,different extraction. 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，也是最关键的一步。因为这一步会影响蛋白质产量、生物学活性、结构完整性。因此要用最小的力量使细胞达到最大破坏程度同时保持蛋白质的完整性。原则是，保持蛋白质的所有信息；选择合适的分离和鉴定方法；对于不同的样品要用不同的提取方法。 5. Post translational modification(蛋白质翻译后修饰) 肽链合成的结束，并不一定意味着具有正常生理功能的蛋白质分子已经生成。已知很多蛋白质在肽链合成后还需经过一定的加工（processing）或修饰，由几条肽链构成的蛋白质和带有辅基的蛋白质，其各个亚单位必须互相聚合才能成为完整的蛋白质分子。 6. De novo sequencing(从头测序) 从头测序为蛋白质组研究提供了一种不用借助于任何蛋白质序列数据库信息，直接解读串联质谱数据的方法。其基本算法主要由4个部分组成：质谱图的构建、
蛋白质结构与功能 一级要求单选题 1 组成蛋白质的氨基酸基本上有多少种 A 300 B 30 C 20 D 10 E 5 C 2 蛋白质元素组成的特点是含有的16%相对恒定量的是什么元素 A C B N C H D O E S B 3 组成蛋白质的氨基酸之间分子结构的不同在于其 A Cα B Cα-H C Cα-COOH D Cα-R E Cα-NH2 D 4 氨基酸的平均分子量是 A 1000 B 500 C 110 D 100 E 80 C 5 组成蛋白质的酸性氨基酸有几种 A 2 B 3 C 5 D 10 E 20 A 6 组成蛋白质的碱性氨基酸有几种 A 2 B 3 C 5 D 10 E 20 B 7 组成蛋白质中的含巯基氨基酸是 A 酪氨酸 B 缬氨酸 C 谷氨酸 D 胱氨酸 E 半胱氨酸 E 8 蛋白质分子中属于亚氨基酸的是 A 脯氨酸 B 甘氨酸 C 丙氨酸 D 组氨酸 E 天冬氨酸 A 9 组成蛋白质的氨基酸在自然界存在什么差异 A 种族差异 B 个体差异 C 组织差异 D 器官差异 E 无差异 E 10 体内蛋白质分子中的胱氨酸是由什么氨基酸转变生成 A 谷氨酸 B 精氨酸 C 组氨酸 D 半胱氨酸 E 丙氨酸 D 11 精氨酸与赖氨酸属于哪一类氨基酸 A 酸性 B 碱性 C 中性极性 D 中性非极性 E 芳香族 B 12 下列那种氨基酸无遗传密码子编码 A 谷氨酰氨 B 天冬酰胺 C 对羟苯丙氨酸 D 异亮氨酸 E 羟脯氨酸 E 13 氨基酸间脱水的产物首先产生小分子化合物为 A 蛋白质 B 肽 C 核酸 D 多糖 E 脂肪 B 14 人体内的肽大多是 A 开链 B 环状 C 分支 D 多末端 E 单末端链,余为环状 A 15 谷胱甘肽是由几个氨基酸残基组成的小肽 A 2 B 3 C 9 D 10 E 39 B 16 氨基酸排列顺序属于蛋白质的几级结构
Nucleic Acids Research,2007,Vol.35,Web Server issue W585–W587 doi:10.1093/nar/gkm259 WoLF PSORT:protein localization predictor Paul Horton1,Keun-Joon Park1,2,Takeshi Obayashi3,Naoya Fujita1,3, Hajime Harada1,C.J.Adams-Collier4and Kenta Nakai3,* 1Computational Biology Research Center,AIST,Tokyo,Japan,2Center for Genome Science,National Institute of Health,Korea Center for Disease Control&Prevention,5Nokbeon-Dong,Eunpyung-Gu, Seoul122-701Korea,3Human Genome Center,Institute of Medical Science,University of Tokyo,Tokyo,Japan and4Collier Technologies,Everett,WA,USA Received January30,2007;Revised March26,2007;Accepted April8,2007 ABSTRACT WoLF PSORT is an extension of the PSORT II program for protein subcellular location prediction. WoLF PSORT converts protein amino acid sequences into numerical localization features; based on sorting signals,amino acid composition and functional motifs such as DNA-binding motifs. After conversion,a simple k-nearest neighbor classifier is used for https://www.doczj.com/doc/505371684.html,ing html,the evidence for each prediction is shown in two ways: (i)a list of proteins of known localization with the most similar localization features to the query,and (ii)tables with detailed information about individual localization features.For convenience,sequence alignments of the query to similar proteins and links to UniProt and Gene Ontology are provided. Taken together,this information allows a user to understand the evidence(or lack thereof)behind the predictions made for particular proteins. WoLF PSORT is available at https://www.doczj.com/doc/505371684.html, INTRODUCTION Bilipid membranes divide eukaryotic cells into various types of organelles containing characteristic proteins and performing specialized functions.Thus,subcellular localization information gives an important clue to a protein’s function.Although localization signals in mRNA appear to play some role(1),the main determi-nant of a protein’s localization residues in the protein’s amino acid sequence.(We recommend https://www.doczj.com/doc/505371684.html,/wiki/ Protein_targeting for a brief overview and Alberts et al. (2)for a textbook description.) Numerous experiments to determine protein localiza-tion have been performed to date.These can broadly be classi?ed as:small-scale experiments—the results of which continue to accumulate in public databases,such as UniProt(3)and Gene Ontology(4);and large-scale experiments using epitope(5)or green?uorescent protein (GFP)(6)tagging,or by separation of organelles by centrifugation combined with protein identi?cation by mass spectrometry(7,8). Although they provide invaluable information,the coverage of experimental data is only high for model organisms,particularly yeast.Moreover,the agreement amongst large-scale experimental data is only75–80% (6–9).Thus,computational prediction of localization from amino acid remains an important topic. Numerous computational methods are available [reviewed in(10,11)].Some(including WoLF PSORT) have recently been benchmarked by Sprenger et al.(12), who found the computational methods to be useful for sites,such as the nucleus,for which many training examples can be easily obtained from UniProt(which is the source of most or all of the training data for most prediction methods—including WoLF PSORT).The di?erent methods they benchmarked were found to have di?erent strengths.Here,we describe the public server for our WoLF PSORT method. PREDICTION METHOD WoLF PSORT is an extension of PSORT II(13,14)and also uses the PSORT(15)localization features for prediction.In addition,WoLF PSORT uses some features from iPSORT(16)and amino acid composition.Those features are used to convert amino acid sequences into numerical vectors,which are then classi?ed with a weighted k-nearest neighbor classi?er.WoLF PSORT uses a wrapper method to select and use only the most relevant features.This reduces the amount of information which needs to be considered(and displayed)for the user to interpret individual predictions and may also make the predictor less prone to over learning.The prediction method has described in more detail elsewhere(17). *To whom correspondence should be addressed.Tel:t81-3-5449-5131;Fax:t81-3-5449-5133;Email:knakai@ims.u-tokyo.ac.jp ?2007The Author(s) This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License(https://www.doczj.com/doc/505371684.html,/licenses/ by-nc/2.0/uk/)which permits unrestricted non-commercial use,distribution,and reproduction in any medium,provided the original work is properly cited.
一）实验原理 双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1.试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。 （2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 2.器材： 可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。 （三）操作方法 1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。 2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。 三、Folin—酚试剂法（Lowry法） （一）实验原理
蛋白质组学在肿瘤研究的应用 姓名：学号 专业：病理学与病理生理学导师： 摘要随着人类全基因组计划（HGP）测序工作的完成, 对基因功能即基因表达产物蛋白的研究已经拉开了序幕。蛋白质组学研究直接定位于蛋白质水平, 大规模地分析组织细胞的蛋白质表达水平、翻译后修饰以及蛋白质间相互作用, 是后基因组计划的重要组成部分。肿瘤的发生涉及一系列复杂的分子事件, 蛋白质组学研究手段可以大规模地定量分析细胞内的蛋白质表达水平、翻译后修饰等性质以及定义信号网络中的蛋白质间相互作用, 从而有希望发现控制肿瘤进程的关键分子, 为肿瘤的诊断、分型、药物研制带来新的思路和途径。蛋白质组学为肿瘤的研究提供了新的平台。本文就蛋白质组学研究的技术方法和在肿瘤研究方面的应用做一个综述。 关键词蛋白质组学肿瘤应用 蛋白质组学（Proteomics）是研究一种细胞或一种生物中全部蛋白质的表达、结构、功能等的新兴学科，与基因组学、代谢组学等一起构成了当代生命科学的组学( -omics) 系列。蛋白质组学一般分为表达蛋白质组学( expression proteomics)、结构蛋白质组学( structural proteomics) 和功能蛋白质组学( functional proteomics) 3 个方面。表达蛋白质组学也叫差异蛋白质组学，主要对正常、疾病或药物处理细胞或亚细胞中的所有蛋白质进行定性或定量的研究; 结构蛋白质组学主要研究特定细胞或细胞器中蛋白质及蛋白质复合体的组成，确定其定位并了解蛋白质间相互作用; 功能蛋白质组学是一个较为广义的概念，主要研究蛋白质转录后修饰，为细胞信号转导、疾病机制等提供重要信息。恶性肿瘤的发生是一个涉及多因素、多基因的多阶段病理过程. 以往的研究主要集中在基因组和转录组分析. 随着人类基因组计划的完成, 肿瘤研究开始进入“后基因组时代”, 肿瘤蛋白质组学应运而生. 蛋白质作为基因功能的主要执行者, 一方面在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色, 另一方面在很大程度上决定正常细胞和肿瘤细胞之间的差异(如异型性、恶性特征等).李国庆[1]等参考了他人的研究成果，通过对肿瘤发生与蛋白质表达（谱）的改变、肿瘤与翻译后修饰蛋白质