高频电刺激对细胞中泛素-蛋白酶体的影响
邱毓祯夏蓉*
（上海交通大学医学院2005法文班，*上海交通大学医学院解剖学教研室，上海，200025）
【摘要】目的研究电刺激对类神经细胞内泛素-蛋白酶系统的作用,以期了解细胞外电刺激对类神经细胞引起的细胞及分子作用机制。
方法：①细胞试验：对PC12细胞株分0uA，500uA，2mA，8mA进行不同电流强度电刺激每天3h，连续4d；分0Hz、10Hz、130Hz进行不同电流频率电刺激每天3h，连续3d。之后采用噻唑兰（MTT）检测存活率、酪氨酸羟化酶(TH-16)免疫组化检测细胞的新陈代谢以及western blot检测细胞内泛素化蛋白数量的改变。②动物试验：8只雄性SD大鼠随机分为3组：电刺激组、6-OHDA组、电刺激+6-OHDA组，每组2只。电刺激组，刺激1次，3h；6-OHDA组,注射6-OHDA；电刺激+6-OHDA组，注射6-OHDA后电刺激1次，3h。手术后观察一周、进行灌注固定、取脑作石蜡切片、应用免疫组化技术染色，镜下观察细胞内泛素化蛋白的变化。
结果: ①随着电流的增强，电刺激对PC12细胞的生长有抑制趋势。②高频电刺激对PC12细胞生长有抑制作用，对PC12细胞的酪氨酸羟化酶的合成代谢有抑制作用。③高频电刺激使细胞内泛素化蛋白数量发生改变。
【关键字】电刺激；PC12细胞；泛素-蛋白酶体；帕金森氏病
Influence of the High-frequency Stimulation in the Ubiquitin-Proteasome System of Cells
【Abstract】Objective：To investigate the effect of electrical stimulation in the Ubiquitin-Proteasome System of the neuron-like cells，to find out the cell and molecular mechanism of the effect of extracellular electrical stimulation in the cells.
Methods：Cell experiment: We stimulate the PC12 cells with different intensity(0uA,500uA,2mA,8mA)for 4 days,3 hours per day; and with different frequency(0Hz,10Hz,130Hz) for 3 days,3 hours per day. Then, the cellular viability was examined by MTT assey, the cellular metabolism was examined by the
immunohistochemistry of TH-16, and the cellular ubiquitinated proteins were detected by Western Blot. Animal experiment(in vivo):Six male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: Group 1 (stimulate for 3 hours,once)；Group 2 (inject 6-OHDA)；Group 3 (inject 6-OHDA and stimulate for 3 hours once). Then, they were observed for a week after the operation, then perfused and fixed; the brains were taken out for making the paraffined slices. We use the immunohistochemistry technique to do the frozen piece stain and observe the change of ubiquitinated proteins of the cells.
Results: Electrical stimulation tends to inhibit the growth of PC12 cell with growth of the current
High frequency stimulation inhibits the growth of PC12 cell, obstruct the anabolism of tyrosine hydroxylase of PC12 cell, influence the amount of the ubiquitinated proteins.
【Key words】 Electrical stimulation;PC12 cells; Ubiquitin-proteasome system; Parkinson’s disease
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是常见于老年人的一种神经系统退行性疾病，主要病理机制在于黑质纹状体多巴胺能神经元变性以及残存神经元细胞生物合成能力下降，从而导致黑质纹状体通路多巴胺释放减少，抑制乙酰胆碱的功能降低，导致其下游神经传导通路功能的紊乱。
高频电刺激（high frequency stimulation，HFS）大脑基底核(deep brain stimulation,DBS)是最近二十年来发展起来的一种外科临床治疗PD的有效手段，它的特定频率大于100Hz （130Hz-185Hz），通过电流1-3mA，脉冲幅度60-100μs。
PC12 细胞株来源于大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（Pheochromocytoma cell PC12），在形态、生理、生化等方面接近神经元，同时具有神经内分泌细胞和神经元的特性[4]，经常被用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害的研究。以往用HFS对PC12细胞的基础研究提示，高频电刺激对离体的PC12类神经细胞的新陈代谢有抑制的作用。
泛素广泛存在于真核细胞中，可选择性地与细胞内蛋白质结合，使蛋白质被蛋白酶体降解，是细胞内重要的非溶酶体蛋白降解途径，故多称泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway)，在许多与细胞周期性增殖和凋亡相关的蛋白降解中起重要作用[1-2]。泛素-蛋白酶系统(ubiquitin–proteasome system,UPS)对于细胞的蛋白质代谢起到至关重要的作用。UPS的异常是导致细胞功能抑制甚至细胞异常死亡的重要原因之一[3]。
本实验采用DBS的参数，对离体的PC12细胞株及在体的大鼠脑部进行电刺激，观察其生长情况，检测其代谢情况及细胞内泛素含量的变化，以间接推测DBS在治疗PD中可能的作用机理。
材料与方法
一、材料
1.PC12细胞株
2、动物：雄性SD大鼠，200g左右
3．试剂：DMEM高糖培养基、马血清、青/链霉素、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（trypsine-EDTA）购自GIBCO公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料公
司；二甲基噻唑二苯基四唑溴盐（MTT）、6-OHDA购自Sigma公司；Ubiquitin
小鼠单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司；β-actin兔单克隆抗体购自Biolegend公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠的二抗购自上海长岛生物技
术有限公司；羊抗兔二抗购自KPL公司；10CM培养皿、24孔培养板、96孔培
养板购自GRENIER BIO-ONE公司；电刺激器、隔离器、钛丝购自WPI公司。
二、方法
1．细胞培养：
PC12细胞株采用含有10%马血清、5%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM高糖培
养基，置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。
2．电刺激：
细胞以104/孔种于24孔板，钛丝串联各孔，两端钛丝连接正负极，按不同的电
流强度（500uA/2mA/8mA）相同的频率130Hz,相同的刺激持续时间60us,以及不
同的电流频率（130Hz/10Hz）相同的电流500uA,相同的刺激持续时间60us进行
刺激，每天三小时，前者持续四天，后者持续三天。
3．MTT检测细胞活率：
将实验后的24孔板中细胞移入96孔板培养，常规培养，次日每孔加终浓度为
0.5mg/ml的MTT，在培养箱中孵育3h后吸去上清。取50%DMSO和50%纯酒
精混合液100ul，加入每孔，摇床2h，至结晶完全溶解，在酶联检测仪上测定光密度（OD），检测波长570nm，参考波长630nm，读数。（计算细胞活率=实验组A/对照组A×100%）
4．酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化：
实验后细胞经4%多聚甲醇固定后，加入双氧水作用10min，然后加入BSA在室温下作用30min ,加入TH16 I抗（1：4000）4℃，18h，回收I抗，加II抗（HRP 标记的羊抗鼠）37℃，1h。加入DAB进行呈色反应，2-3min后终止反应。过100%酒精及50%酒精+50%二甲苯，纯二甲苯两次后，中性树胶封片。用RS IMAGE Pro 软件在光镜下处理分析结果。
5．Western blot检测细胞内泛素化蛋白：
将细胞以106/孔种入10厘米的培养皿，待进入对数增长期后进行130Hz和10Hz 电刺激，每日3h，持续3天。抽提总蛋白，测定蛋白浓度。取13.95ug进行SDS-PAGE蛋白电泳（90V，40min；然后140V～160V，1.5h），蛋白转膜（25V，过夜）后进行western blot检测：一抗为Ubiquitin小鼠单克隆抗体（1：2000）振荡孵育1h，β-actin单克隆抗体（1：2000）振荡孵育1h，清洗后加入HRP标记的羊抗鼠和羊抗兔二抗，振荡孵育1h，曝光，显影。
6．动物在体实验：
将大鼠分为三组：I电刺激组，电刺激(130Hz,500μA,60μs)尾壳核3h。II 6-OHDA 组，在该核团内注入5μl 6-OHDA(100umol/L)。III电刺激+ 6-OHDA组，先在该核团内注入5μl 6-OHDA，再电刺激3h(130Hz,500μA,60μs)。麻醉大鼠，头部做矢状位切口，暴露至骨膜。参照图谱定位刺激点（尾壳核，前囟向后0.26mm、向外3mm，电刺激针向下5mm，加药针向下4mm），电刺激组将负极置于颅内，正极置于颈部皮下。实验后缝合切口，饲养一周后，4%多聚甲醛灌注固定、取脑，做石蜡切片、进行抗泛素抗体免疫组化。观察两侧尾壳核，在高倍镜(×400)下随机各取6个视野，分别计数其中被泛素标记、未被泛素标记及细胞形态不完整的细胞，计算各类细胞百分数，用RS IMAGE Pro软件在光镜下处理分析结果。
进行统计分析。
三、统计学分析
实验所得数据应用SPSS10进行单因素方差分析，以表示。
P〈0.05有统计学意义。
结果
1、随着电流强度的增高，细胞外电刺激对PC12细胞的生长有抑制趋势
以1.5×104cell/ml接种于24孔板，加入NGF诱导PC12细胞分化，按照不同的电流强度（500uA/2mA/8mA）相同的频率130Hz, 相同的刺激持续时间60us进行刺激，每日3h，连续三天。发现随着电流强度的增长，细胞生长有被抑制的趋势。由于实验数据不足，未做统计学分析，见图1。
2、高频电刺激对PC12细胞生长有抑制作用
以1.5×104cell/ml接种于24孔板，加入NGF诱导PC12细胞分化，按照不同的频率（高频130Hz/低频10Hz），相同的刺激持续时间60us，相同的电流强度500uA 进行刺激，每日3h，连续三天。之后用MTT法测细胞增殖率，发现高频电刺激对细胞的生长有抑制作用，与对照组（未刺激）相比，差异有显著意义（P=0.009），见图2。
3、高频电刺激对PC12细胞的酪氨酸羟化酶的合成代谢有抑制作用
TH-16免疫组化实验用于检测细胞内酪氨酸羟化酶（TH）的合成水平：经过高频电刺激3d的细胞，经过固定，I抗、II抗，DAB呈色反应，封片，拍照，图像经RS IMAGE Pro软件处理分析后，经高频电刺激过的PC12细胞的灰度比对照组下降了-31.56% （P=0.028），TH在PC12细胞中的合成水平被抑制了，见图3。
00.0050.010.0150.020.025Control HFS 灰度值(A )
图1 不同强度电流对PC12细胞生长影响
Fig 1 Cell growth of PC12 cells treated with
图3 HFS 后PC12细胞TH-16免疫组化后灰
图4 抗泛素抗体免疫组化后脑细胞计数 Fig 4 Number of rat brain cells after the * ** *
图5 高频电刺激对PC12细胞内泛素化蛋白的影响
Fig 5 Effect of HFS on the amount of ubiquitinated proteins in PC12 cells
A: control; B: 10Hz; C: 130Hz
A B
图6 鼠脑尾壳核切片经抗泛素抗体免疫组化：高频电刺激组A、对照组B
Fig 6 Rat’s caudate-putamen nucleus treated with HFS in experimental group (A) and control group (B) detected by immunohistochemistry of anti-ubiquitin anticorps
讨论
泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内重要的非溶
酶体蛋白降解途径。其中，泛素是作为重要的标记分子，是由76个氨基酸组成的高度保守的多肽链。通过泛素活化酶(E1)、泛素偶联酶(E2s)、泛素－蛋白连接酶(E3s)，将泛素分子结合到需要降解的蛋白质上，这个过程往往反复多次，使要降解的蛋白多泛素化，之后被26S蛋白酶体特异性识别降解[5]。因此，UPS功能异常会引起蛋白质在细胞内的异常堆积，而堆积的蛋白也反过来损伤UPS系统[6]。有证据表明散发PD患者的蛋白酶体功能不良，蛋白水解作用不足，对
α-synuclein、泛素等的降解与清除减弱[7-8]。也有人对PC12细胞应用蛋白酶体抑
制剂，结果细胞内多泛素化蛋白堆积，诱导细胞死亡，促进细胞内包涵体形成[9-10]。
自从发现高频电刺激(high frequency stimulation, HFS)可使PD症状改善，DBS逐渐被应用于PD的外科治疗。临床上主要以苍白球内侧核(Globus Pallidus internus，GPi)或丘脑底核(subthalamic nucleus，STN)为靶核，控制震颤，强直和行走困难等症状[11]，而其机制尚不明了。人们普遍认为可能是HFS降低刺了激部位的神经元的兴奋性，神经传导受抑制[12-13]，切断了导致PD震颤的神经传导环路，抑制了PD症状。
酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴、肾上腺素等物质合成过程中的关键酶，所以TH能在一定程度上反映了多巴、肾上腺素的合成水平和细胞新陈代谢的水平，有文献表明HFS能够抑制PC12细胞分泌神经递质[14]。本实验用DBS的参数刺激PC12细胞[15]，通过其增殖情况及胞内TH含量的检测，观察其代谢及生长情况。通过MTT检测发现细胞的生长受到抑制，并有电流依赖趋势（图1），同时TH-16免疫组化结果显示PC12细胞内酪氨酸羟化酶的含量减少（图2、3）这与文献中所述相一致。
另外，在western blot结果中显示，高频电刺激后PC12细胞内的泛素含量减少（图5），我们推测，在细胞功能受到抑制的同时，泛素的量的发生改变，也提示UPS系统出现变化。并且，在体动物实验的结果也显示核团中被泛素标记的细胞较对照侧少，形态不完整的细胞数目增多（图6），细胞的死亡增加，此与离体细胞实验结果相一致。
因而我们猜想，DBS治疗PD时，HFS使核团内神经元的兴奋性降低，代谢活动降低，递质的分泌减少。HFS也影响了细胞内UPS功能。但两者关系如何，神经元兴奋性降低与UPS功能受损谁是始动环节，我们的实验结果目前尚不能提供一个确切的答案，还有待进一步的研究。
致谢：我们衷心感谢上海交通大学基础医学院给我们这次学习的机会，感谢解剖学教研室对本研究课题的大力支持，感谢夏蓉老师给我们的指点和教诲，感谢沃雁老师，朱浩老师，王文进博士研究生的指点和帮助以及其他所有给我们提供帮
助和支持的人们。同时我们还要感谢上海交通大学基础医学院大学生自然基金、上海交通大学PRP创新性实验项目和医学院创新性实验项目给予我们的资金支持。
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泛素-蛋白酶体通路与癌症关系的研究进展 张海满 （山东农业大学生命科学学院山东泰安201018） 摘要：泛素化过程是真核细胞内重要的蛋白质质控系统，参与细胞的多种生理活动过程，对维持细胞正常的生理功能具有十分重要的意义。泛素-蛋白酶体途径（UPP）的异常改变不仅与癌症的病因学有着直接关素，并且与癌症的发展和预后有着密切的关系。本文综述了泛素的构成、泛素链的形成过程、UPP的生理和病理功能及UPP与癌症的关系的研究进展。 关键词：泛素-蛋白酶体通路；UPP；癌症；研究 细胞内蛋白质的产生和降解必须保持着动态平衡，才能维持细胞的稳态和正常功能。泛素-蛋白酶体途径( ubiquitin-pro-teasome pathway, UPP)是细胞内蛋白质选择性降解的重要途径，泛素分子主要通过泛素活化酶、泛素结合酶和泛素-蛋白连接酶与靶蛋白结合形成一条多泛素链，将底物蛋白泛素化，使靶蛋白被26S蛋白酶体所识别和降解。UPP可高效并高选择性地降解细胞内蛋白质，尤其是一些短寿命的细胞周期调节蛋白、癌基因和抑癌基因产物以及变性变构蛋白等。 1.泛素-蛋白酶体途径（UPP）的构成 UPP成分十分复杂，主要包括泛素( ubiquitin, Ub)、泛素活化酶( ubiquitin-activatingenzyme, E1)、泛素连接酶( ubiquitin-conjugatingenzyme, E2)、泛素蛋白连接酶( ubiquitin-protein ligating enzyme, E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶( deubiquitinating enzyme, DUBs)等。UPP存在于所有真核生物的细胞内，是蛋白质选择性降解的主要方式。 1.1泛素( ubiquitin, Ub) 泛素是一种广泛分布在真核细胞中的高度保守的小分子球状蛋白质。1975年由Goldstein首次提出，此后不断出现有关报道[1]。单个泛素分子由76个氨基酸残基组成，相对分子质量约8.5×103，有一个明显的疏水核心和大量的氢键，表现出特殊的稳定性，能够防止其自身在结合和靶向性降解循环中变性失活，从而保证泛素循环的进行。依赖于ATP的酶促反应，E1通过在Ub的羧基末端和E1自身激活位点半胱氨酸之间形成一个硫酯键而激活Ub，激活的Ub被转到E2结合酶上，然后E2在E3作用下共价结合到需要降解的胞质或胞核的蛋白上，使底物蛋白发生泛素化，形成Ub单体，多个Ub单体通过异肽键连接形成多聚Ub链，每个多聚Ub链至少含有4个Ub单体。 1.2泛素活化酶( ubiquitin-activating enzymes, E1) 泛素活化酶是单基因编码的相对分子质量分别为110×103和117×103的2个亚基，存在于细胞核
泛素-蛋白酶体及其抑制剂 沈子珒许啸声李稻审校 上海交通大学医学院病理生理学教研室 摘要：蛋白酶体与泛素化信号系统一起构成的泛素—蛋白酶体（UPP）是哺乳动物细胞内主要的蛋白水解酶体系，参与和调控细胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶体是一个由20S 催化颗粒、11S调控因子和2个19S调节颗粒组成的ATP依赖性蛋白水解酶复合体。蛋白酶体的活性状态对细胞功能正常维持是非常重要的。26S蛋白酶体对蛋白的降解依赖于靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白识别。蛋白酶体抑制剂能通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，尤其对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用。同时，利用蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性也成为免疫、炎症等研究的热点。蛋白酶体的抑制剂可分为天然化合物和合成化合物两类，其中Bonezomib（Velcade，PS-341）是近年研究较多的一种蛋白酶体抑制剂。 关键词：肿瘤蛋白酶体泛素蛋白酶体抑制剂PS-341 泛素—蛋白酶体通路（Ubiquitin–proteasome pathway，UPP）的蛋白酶体（proteasome）是一种具有多个亚单位组成的蛋白酶复合体，蛋白酶体沉降系数为26S，故又称26S蛋白酶体。蛋白酶体水解蛋白的前提是靶蛋白的泛素化。在UPP中，各种靶蛋白质泛素化后，先被26S蛋白酶体的19S亚单位识别，随后泛素化靶蛋白脱泛素链和变性，进入20S亚单位的筒状结构内被降解成3~22个多肽。由于蛋白酶体具有精确降解细胞内各种目的靶蛋白，进而参与基因转录和细胞周期调节，以及受体胞吞、抗原呈递等各种细胞生理过程[1]。因此，应用蛋白酶体抑制剂改变其酶切位点活性已成为抗肿瘤治疗的研究热点，蛋白酶体是影响和改变细胞功能重要的目的靶标。 1．蛋白酶体组成 1979年，Goldberg等首先报道在大鼠肝脏和网织红细胞中存在一种分子质量为700 kD的受A TP激活的中性蛋白水解酶。此后，一些在形态、功能及免疫学特征上与之相同的颗粒通过不同途径被分离出来，被统一命名为蛋白酶体[2]。在真核生物进化中，蛋白酶体具有高度的保守性，其简单形式甚至存在于古细菌和真细菌中。真核细胞内的蛋白酶体分布于胞质与胞核内，有的与内质网或细胞骨架相结合，约占细胞蛋白质总量的1％。有功能的26S蛋白酶体是由20S催化颗粒（catalytic particle, CP）、11S调控因子（11S regulator）和2个19S调节颗粒（regulatory particle, RP）组成，其分子量为2.4MD，是ATP依赖性蛋白水解酶复合体。 1．120S催化颗粒（20S CP） 人类蛋白酶体CP的沉降系数为20S，分子量700~750kD。它由α环和β环组成，每个环各有7个相同的亚单位，分别以α1-7β1-7β1-7α1-7顺序排列成圆桶状结构，20S CP中间由两个β亚单位环组成。几乎所有β亚单位都含有一个N 端前导序列，尽管此序列在20S CP装配过程中被切除，但在引导真核生物β亚单位的正确折叠以及β与α亚单位的组装中有重要作用[3]。当β亚单位的N端前导序列被切除后，Thr残基被暴露出来，Thr是酶的活性位点，分别存在于β环的内表面，使β亚单位具有类似的丝氨酸蛋白酶的催化作用[4]。例如，β亚单位N端的折叠方式允许Thr的-OH对底物发动亲核反应形成半缩醛，而Thr的α-NH3可代替丝氨酸蛋白酶中His的咪唑基作为质子受体。此外，活性位点附近的一个Lys残基与特定的丝氨酸蛋白酶中一样，也起着催化剂的作用。目前认为，在20S CP内起催化作用的亚单位主要是β1、β2、β5。不同的β亚单位的催化活性尽管不同，但能互相协调使蛋白酶体具有多种蛋白酶活性，如类糜蛋白酶活性(chymotrypsin-like, ChTL)、类胰蛋白酶活性（trypsin-like，TL）、肽-谷氨酰肽水解酶活性（post-glutamyl-peptide hydrolyzing，PGPH）、支链氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性。在20S CP圆桶状的两端由α亚单位环组形成，环口的中央被α亚单位(α
蛋白质降解的泛素—蛋白酶体途径 泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸相连。蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。泛素化在A TP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段(图8—15A)。此为生物大分子在胞质中降解的泛素—蛋白酶体途径(ubiquitim proteosome pathway)。泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象。例如第一章提到NF-~B激活中抑制成分I-~cB的降解，以及免疫调节一章中将提到细胞因子信号转导抑制蛋白(SOCS)对底物的作用，皆涉及这一泛素—蛋白酶体途径。 蛋白质泛素化系统由3个组分构成，一个称为泛素激活酶n，它可利用水解A TP释放的能量以其胱氨酸残基(Cys)的巯基与泛素C端的甘氨酸残基(Gly)形成高能硫酯键。然后连接在殿上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合(图8—15A)。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白赖氨酸残基(Lys)—NH2基团形成异肽键(isopeptidebond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。 内源性抗原在胞内的降解 A．泛素蛋白酶体降解途径；B．泛素化的内源性被28S免疫蛋白酶体降解成肽段。 单个连接的泛素残基尚不足以引起底物降解，活细胞中有一系列的泛素残基可加到前一个泛素赖氨酸残基上，形成泛素聚合链(polyUb)，这一过程受细胞活性的调控。连接到降解蛋白质底物上的多聚泛素链可为蛋白酶体提供识别的信号，也是调控蛋白质降解的环节之一。 内源性抗原肽依据该途径实施降解，具体涉及两个作用环路。其一是泛素与底物结合，然后在分解酶(deconjugatmg enzyme)DUB的作用下重新游离，已如上述；二是结合有调节复合物的28S免疫蛋白酶体，对带有泛素聚合链的内源性抗原肽实施降解，然后再回复到19S 调节复合物及20S蛋白酶体，构成第二个环路。两者共同作用的结果是，泛素化的内源性抗原进入免疫蛋白酶体的孔道后，在蛋白水解酶的作用下降解成为5～15个氨基酸残基的短肽。
蛋白酶体 蛋白酶体(Proteasome)是一种巨型蛋白质复合物，主要作用是通过打断肽键来实现降解 细胞不需要的或受到损伤的蛋白质。 简介
蛋白酶体在真核生物和古菌中普遍存在，在一些原核生物中也存在。在真核生物中，它位于细胞核和细胞质中。[1] 能够发挥这一作用的酶被称为蛋白酶。蛋白酶体是细胞用来调控特定蛋白质的浓度和除去错误折叠蛋白质的主要机制。经过蛋白酶体的降解，蛋白质被切割为约7-8个氨基酸长的肽段；这些肽段可以被进一步降解为单个氨基酸分子，然后被用于合成新的蛋白质。[2] 反应过程 需要被降解的蛋白质会先被一个称为泛素的小型蛋白质所标记（即连接上）。这一标记反应是被泛素连接酶所催化。一旦一个蛋白质被标记上一个泛素分子，就会引发其它连接酶加上更多的泛素分子；这就形成了可以与蛋白酶体结合的“多泛素链”，从而将蛋白酶体带到这一标记的蛋白质上，开始其降解过程。[2] 分子结构 从蛋白质结构上看，蛋白酶体是一个桶状的复合物，[3] 包括一个由四个堆积在一起的环所组成的“核心”（右图中蓝色部分），核心中空，形成一个空腔。其中，每一个环由七个蛋白质分子组成。中间的两个环各由七个β亚基组成，并含有六个蛋白酶的活性位点。这些位点位于环的内表面，所以蛋白质必须进入到蛋白酶体的“空腔”中才能够被降解。外部的两个环各含有七个α亚基，可以发挥“门”的作用，是蛋白质进入“空腔”中的必由之路。这些α亚基，或者说“门”，是由结合在它们上的“帽”状结构（即调节颗粒，右图中红色部分）进行控制；调节颗粒可以识别连接在蛋白质上的多泛素链标签，并启动降解过程。包括泛素化和蛋白酶体降解的整个系统被称为“泛素-蛋白酶体系统”。 作用 蛋白酶体降解途径对于许多细胞进程，包括细胞周期、基因表达的调控、氧化应激反应等，都是必不可少的。2004年诺贝尔化学奖的获奖主题就是蛋白质酶解在细胞中的重要性和泛素在酶解途径的作用，而三位获奖者为阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和欧文·罗斯。 [4] 发现 在发现泛素-蛋白酶体系统之前，细胞中的蛋白质降解被认为主要依赖于溶酶体，一种膜包裹的囊状细胞器，内部为酸性环境且充满了蛋白酶，可以降解并回收外源蛋白质以及衰老或损伤的细胞器。[2] 然而，在对网织红血球的研究中发现，在缺少溶酶体的情况下，ATP依赖的蛋白质降解依然能够发生；这一结果提示，细胞中存在另一种蛋白质降解机制。1978年，一些研究者发现这一新的降解机制有多种不同的蛋白质参与，在当时被认为是新的蛋白酶。[5] 随后在对组蛋白修饰的研究工作中发现，组蛋白发生了意外的共价修饰：组蛋白上的一个赖氨酸残基与泛素蛋白C-端的甘氨酸残基之间形成了共价连接，但其对应的功能未知。[6] 而后又发现先前鉴定的一个参与新的降解机制的蛋白质，ATP依赖的蛋白质水解因子1（ATP-dependent proteolysis factor 1，APF-1），实际上就是泛素。[7]
泛素—蛋白酶体途径代谢异常与2型糖尿病发生的关系 随着社会的进步发展，人们生活水平的提高，糖尿病(diabetes mellitus,DM) 的发病率逐年增高。据统计2011年全球糖尿病患者总数约 3.66 亿[1]，到2030 年患病人数预计将达到 5.52 亿，这其中 85%～90%为 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)，而中国、印度和美国为世界糖尿病三大国[2]。T2DM以及其相应带来的并发症已成为严重威胁人类机体健康的主要慢性病之一，不仅给患者身心带来巨大困扰，而且增加了患者家庭乃至社会的医疗负担。T2DM主要表现为胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷而非胰岛B细胞自身免疫破坏。然而其确切发病机制尚未明确。近年来，人们发现在肥胖、糖尿病等众多机体代谢紊乱情况下，胰岛素靶器官中泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）活性明显上调，并且表现出相应的病理表现[3]，UPS在T2DM及其并发症的发生、发展过程中起了重要作用。现将其机制作一综述。 1. 泛素—蛋白酶体系统的组成 UPS由泛素（ubiquitin, Ub）、泛素活化酶（ubiquitin—activating enzyme, E1 ）、泛素结合酶（ubiquitin—conjugating enzyme, E2）、泛素蛋白连接酶（ubiquitin—protein ligase, E3 ）、蛋白酶体及其底物（蛋白质）构成，其对靶蛋白的降解是一种三级酶联反应过程。通过UPS，细胞几乎可以对其内在的任何一种蛋白质进行高度特异性的降解，整个过程由底物蛋白的泛素化和蛋白酶体降解两个部分组成[4]【4】。泛素化是对特异的靶蛋白进行泛素修饰的过程，泛素化修饰涉及泛素激活酶 E1、泛素结合酶 E2 和泛素连接酶 E3 的一系列反应。首先在 ATP 供能的情况下，泛素分子 C 端的 Gly 残基与 E1 激活酶上的 Cys 残基结合，将泛素激活；接着，激活酶将活化的泛素分子通过转酰基作用转移到 E2 结合酶的 Cys 残基上，二者以硫酯键连接；之后，随着泛素连接酶识别靶蛋白，E3 连接酶分别结合着携带着泛素分子的 E2 结合酶和待泛素化修饰的底物蛋白，在连接酶的作用下，泛素分子从结合酶上转移到底物蛋白上，完成泛素化修饰。在此过程中，E3 连接酶尤其重要，它决定着泛素化修饰的时间性和特异性。根据连接在靶蛋白上的泛素分子的连接方式和数目，可以将泛素化修饰分为单泛素化修饰和多聚泛素化【5】。由泛素控制的蛋白质降解具有重要的生理意义，它不仅能够清除错误的蛋白质，还对细胞周期调控、DNA修复、细胞生长、免疫功能等都有重要的调控作用。 1.1泛素(Ub) Ub是1975 年由 Goldstein首先发现的一种在真核生物细胞内高度保守的多肽，单个泛素分子是由76个氨基酸组成，分子量约85kD , 泛素以共价键与底物蛋白连接，它的主要功能是标记待降解的蛋白质，使其被转运至蛋白酶体，进而发生降解【6】。泛素也可以标记跨膜蛋白，比如受体，将其从细胞膜上除去。泛素分子中散布着7个赖氨酸残基，这些残基可以作为其他泛素共价结合的位点。经过几轮结合后，泛素链将会变得很长，这样有助于对“标记”蛋白的识别【7】。泛素化蛋白可被泛素解离酶识别，而将泛素分子从底物蛋白上水解下来，重复利用【8】。 1.2 参与泛素化降解的酶 E1是一种广泛表达的多肽，大约1100 个氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸残基。有2个亚型，是由同一个mRNA 在不同的起始位点翻译而成的，存在于细胞浆和细胞核中。目前在脊椎动物中已发现的E1只有一个，有数目不等的E2和大量的E3；E1酶可以激活所有的E2酶，每个E2酶又可以与多个E3酶相互作用【9】。E1首先与ATP结合，然后与泛素相互作用，催化泛素C端腺嘌呤化并释放焦磷酸，使其C端甘氨酸残基与E1的半胱氨酸残基形成高能硫酯键而获得活性，E1—泛素结合的中间体再将泛素转移给E2s，形成E2-泛素中间体。
生物电现象的发现及心肌细胞的生物电现象 一、关于生物电现象的研究 人类发现生物电现象，可追溯到公元前三世纪有关地中海电鳐等具有强烈震击。直到十八世纪三十年代，才真正开始对生物电现象进行观察和研究。 1731年，英国人Gray.S.首先提出人体是可以带电的。但在当时的条件下无法用实验来证明。十八世纪末，意大利的医生和生理学家Galvani.A.在实验中发现，用金属导体连接蛙腿的神经和肌肉，肌肉就会收缩。科学家们开始研究探讨，然而直接证明生物组织本身是否带电，是在使用了电流计之后才有可能。电流计的发明使用，加速了生物电研究的进程，很快在肌肉、神经、甚至感官上都已证明确有生物电存在，并且在兴奋时这种电位会有波动。 对生物电现象的研究，是在研究生命的基本特征——兴奋性的过程中逐步展开的。早在十九世纪中后期生理学家应用离体青蛙或蟾蜍的神经肌肉标本进行实验时，施加机械性或适当的电刺激后，肌肉则随之表现机械收缩。人们就将这种能的记载力称为兴奋性。实际上，几乎所有生物的活组织或细胞都具有某种程度的对外界刺激发生反应的能力，并将其广泛称为应激性。兴奋性与应激性相比，使用范围就比较狭窄了，一般仅用于生理学中。 随着实验技术的发展，大量的实验表明：细胞处于兴奋状态时，尽管有不同的外部表现，但都有一个共同的、最先出现的反应，即受到刺激的细胞膜部分，膜两侧出现了一个特殊形式的电变化——动作电位，肌肉收缩、分泌活动等外部反应实为细胞膜动作电位进一步触发后产生，并且产生于受刺激部位的动作电位可沿着整个细胞膜扩散。故而兴奋性重新被认为是细胞受到刺激时产生动作电位的能力。 动作电位就是生物电的表现形式之一，另外还有静息电位、局部电位等。经前人研究总结，所谓静息电位就是细胞处于安静状态下（未受刺激时）膜内外的电位差。 表现为膜外相对为正而膜内相对为负；所谓动作电位就是可兴奋组织或细胞受到
生物的兴奋性和生物电现象 一、兴奋地兴奋性和刺激引起兴奋地条件 兴奋：由相对静止状态变为显著活动状态，或由活动弱变为活动强 抑制：由显著活动状态变为相对静止状态，或由活动强边为活动弱 组织产生了动作电位就是产生了兴奋 二、细胞的生物电现象及其产生机制 1、静息电位：细胞未受刺激时存在膜两侧的电位差 极化状态：膜两侧电位维持在內负外正的稳定状态 膜电位负值加大——超极化 膜电位负值减少——去极化 去极后恢复——复极化 膜内侧变正值——反极化 2、动作电位或峰电位：可兴奋细胞受到有效刺激时在膜两侧产生快速，可逆，扩布性 电位变化 包括：①去极化或除计划 ②反极化或超射 ③复极化 后电位：在峰电位之后还会出现一个较长的、微弱的电位变化时期后除极化和后超极化：由缓慢的复极化过程或低幅超极化过程组成的 3、生物电现象产生的机制 ①膜两侧离子分布不对称——细胞生物电现象基础
②膜两侧离子受浓度梯度和电位梯度（跨膜电场）制约浓度梯度 （1）静息电位和K+平衡电位 ①【K+】i>【K+】o——非对称分布 ②安静状态下膜对K+通透 ③K+外流→內负外正电势阻止 K+外流→达动态平衡→K+不移动，即K+平衡电位Ek ④【K+】i向膜外扩散-钾漏通道→电化学梯度平衡 （2）G(Na)和Gk变化特点 ①电压依从性：由去极化激活，G（Na）——AP上升支基础，Gk——AP下降 支基础 ②G（Na）有失活状态，Gk无此特性。 ③Na通道状态：关闭、激活、失活。钾通道无失活状态。 （3）AP过程中膜通透（膜电导α）变化：电压钳技术：人工控制电位于某一水平，测定细胞，AP时跨膜离子电流变化——电压钳法 三、动作电位的引起和他在同一个细胞上的传导 1、兴奋和兴奋性的概念 共同特征——膜两侧发生动作电位变化 ①兴奋：可兴奋细胞受到刺激后产生动作电位的过程 ②兴奋性：可兴奋细胞受到刺激后产生动作电位的能力 2、刺激：能引起细胞、组织／机体发生反应的环境变化因子 刺激三要素：①刺激强度：最小的刺激强度——阈强度（阈刺激）：引起兴奋所需 的最小刺激强度。阈下刺激<阈刺激<阈上刺激