Primer Express v3.0 Primers and Probe Design For Real-Time PCR
Primers/Probes Design Guideline
TaqMan Probe Primer Probe Primer 離 , PCR 50-150 bp
G/C % 30-80 %
列 4 G Tm : 68-70 (Quantification assay)
65-67 (Allelic Discrimination assay)
Tm : 58-60
Probe 度:
13~25 bases (TaqMan MGB probe) 13~30 bases (TaqMan probe)
Primer 度: 20 bases (Optimal)
連 6 A 列
5’ 列不 G
( FAM-dye 5’ 列 不 G)
C G strand probe b
3’ 4 列裡 3 G
(GGG-MGB-3’ or GGAG-MGB-3’) a
probe 2 CC di-nucleotides a
3’ 列裡不 2 C+G
a: TaqMan MGB probe
b: 參數
Primers & Probes for Quantification
Automatically Design
Primer Express 3.0
File→ New→ “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”→ OK
Tools → “Add DNA File” 列 ”Add” 列 ”Sequence” Tab Copy & Paste 列
* Primer Express Software .dan, .txt, .ab1, .abi , 列
” Double Strand “, double stranded DNA sequence
Tools
1. Exclude:不 列 利 ”Exclude Selected Bases” 列
- 不 列 “Exclude” 見
2. Junction: 列 junction 利 ”Junction”
- juction ( 2 bases) “Junction” 見
來
3. ”Parameters” Tab Primer/Probe Tm Primers/Probe
”Sequence” Tab Tools → Find Primers/Probes Primers/Probe pairs
Primer Express Candidate Primers & Probe pairs search 50 列 ”Primers / Probes” Tab ”Location”說 primers & probes 列 數
”Sequence” Tab ”Primers / Probes” Tab Primers/Probe: Probe 藍 Forward Primer Reverse Primer (* 不 )
”Primers / Probes” Tab Primers/Probe 列 來 2 primer/ probe design guideline MGB Probe ”Parameters” Tab ”C ” ” G ” 列 參數
primer/ probe set 行 File → Save As primer/ probe set 利 Export → Order Info… 50 Primers/Probes Export →Primers/Probes List… 兩 都 .txt Excel
Manually Design
Primer/Probe Primer/Probe Quantification Document 列 (參 3 )
1. Probe :
”Sequence” Tab Probe 列highlight 來( 25 bases 度 度 列 ) 利 Edit Copy (Ctrl+C) 列 Tools→ Primer Probe Test Tool document type ( “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”) Parameter ”Default” 利 Paste (Ctrl+V) 列 Probe 1欄 列 Tm, %GC 度
: probe 列不 G 列裡 C 數 G
若Tm (68 to 70 ) Probe 1欄 不 列 Tm, %GC 度 Probe ( 參 primer/ probe design guideline) 若 ”Trim” 列 留 Probe 列
Probe 列 ”Sequence” Tab Probe 列highlight 來 利 Edit →
Annotate → ” Probe” probe 列 來 probe 綠
利 Tools → Find Primers/Probes Probe Forward / Reverse Primers 若 Primers 行Forward / Reverse Primers
2. Forward Primer :
”Sequence” Tab Primer 列highlight 來( 25 bases 度 切 Probe 列 ) 利 Edit Copy (Ctrl+C) 列 Tools → Primer Probe Test Tool 利 Paste (Ctrl+V) 列 Fwd Primer欄 列 Tm, %GC 度
Forward Primer Tm 58-60 Tm 不 Fwd Primer 不 列 Tm, %GC 度 Primer ( 參 primer/ probe design guideline) 若 ”Trim” 列 留 列
Fwd Primer 列 ”Sequence” Tab 列highlight 來 利 ” Forward Primer” 來 Fwd Primer 藍
3. Reverse Primer
”Sequence” Tab Reverse 列highlight 來( 25 bases 度 切 Probe 列 ) 利 Edit →” Copy Complement ” 列 Tools → Primer Probe Test Tool Rev Primer欄
Reverse Primer Tm 58-60 Tm 不 Rev Primer 不 列 Tm, %GC 度 Primer ( 參 primer/ probe design guideline) 若 ”Trim” 列 留 列
Rev Primer 列 ”Sequence” Tab 列highlight 來 利 ” Reverse Primer” 來 Rev Primer
primer/ probe set 利 Copy & Paste text save 來 來參 料 document 行 File → Save As
SYBR Green I Primer for Quantification
Automatically Design
Primer Express 3.0
File→ New→ “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”→ OK
Tools → “Add DNA File” 列 ”Add” 列 ”Sequence” Tab Copy & Paste 列
* Primer Express Software .dan, .txt, .ab1, .abi , 列
” Double Strand “, double stranded DNA sequence
Tools
1. Exclude:不 列 利 ”Exclude Selected Bases” 列
- 不 列 “Exclude” 見
列 junction 利 ”Junction”
2. Junction:
- juction ( 2 bases) “Junction” 見
來
3. ”Parameters” Tab Primer Tm Primers
”Sequence” Tab Tools → Find Primers/Probes Primers/Probe pairs
Primer Express Candidate Primers & Probe pairs search 50 列 ”Primers / Probes” Tab 若 行SYBR Green primer 不 probe 列 參 primer 列 ”Location”說 primers & probes 列 數
”Sequence” Tab ”Primers / Probes” Tab Primers/Probe: Probe 藍 Forward Primer Reverse Primer (* 不 )
”Primers / Probes” Tab Primers/Probe 列 來 2 primer/ probe design guideline
* SYBR Green primer primer dimer
- ”Primers / Probes” Tab primer set 來 Primer Secondary Structure Hairpin, Self Dimers Cross Dimers 數 GC 例
primers set 行 File → Save As
primers set 利 Export → Order Info (50)
Primers/Probes Export →Primers/Probes List… 兩 都 .txt Excel
Manually Design
Primer Primer
Quantification Document 列 (參 13 )
1. Forward Primer :
”Sequence” Tab Primer 列highlight 來( 25 bases 度 度 列 ) 利 Edit Copy (Ctrl+C) 列 Tools → Primer Probe Test Tool document type ( “TaqMan MGB Quantification TaqMan Quantification”) Parameter ”Default” 利 Paste (Ctrl+V) 列 Fwd Primer欄 列 Tm, %GC 度
Forward Primer Tm 58-60 Tm 不 Fwd Primer 不 列 Tm, %GC 度 Primer ( 參 primer/ probe design guideline) 若 ”Trim” 列 留 列
2. Reverse Primer :
”Sequence” Tab Reverse 列highlight 來( 25 bases 度 度 列 ) 利 Edit →” Copy Complement ” 列 Tools → Primer Probe Test Tool Rev Primer欄
Reverse Primer Tm 58-60 Tm 不 Rev Primer 不 列 Tm, %GC 度 Primer ( 參 primer/ probe design guideline) 若 ”Trim” 列 留 列