目录
英汉缩略语名称对照 (4)
中文摘要 (6)
英文摘要 (8)
前言 (11)
第一部分PCOS大鼠模型的建立
前言 (14)
材料和方法 (14)
实验结果 (18)
讨论 (23)
第二部分血清TNF-a、IL-6在PCOS大鼠模型中的表
达及相关性研究，与二甲双胍的影响
前言 (25)
材料和方法 (25)
实验结果 (30)
讨论 (38)
第三部分二甲双胍对PCOS大鼠的排卵及对卵
巢中TNF-a、IL-6的影响
前言 (47)
材料和方法 (47)
实验结果 (52)
讨论 (57)
第四部分核因子κB在PCOS大鼠模型中的表达
及二甲双胍的干预研究
前言 (60)
材料和方法 (60)
实验结果 (65)
讨论 (70)
结论与展望 (73)
参考文献 (74)
综述 (83)
发表论文情况 (93)
致谢 (94)
英汉缩略语名称对照
英文缩写英文全称中文全称
AIs Aromatase inhibitions 芳香化酶抑制剂ACOG American college of obstetricians
and Gynecologists
美国妇产科医师协会Cyp450c17a Cytochrome p450 c17a enzyme 细胞色素P450 C17a酶SHBG Sex hormone binding globulin 性激素结合球蛋白
IGFBP-1 Insulin like growth factor binding
protein -1 胰岛素样生长因子结合蛋白-I
HOMA-IR Homeostasis model of assessment of
insulin resistance 胰岛素抵抗稳态评估模型
IGF Insulin-like Growth factor 胰岛素样生长因子MET metformin 二甲双胍
PCOS Polycystic ovarian syndrome 多囊卵巢综合症
OS Oxidative stress 氧化应激
HA Hyperandrogenemia 高雄激素血症
FPG Fasting plasma glucose 空腹血糖
FINS Fasting insulin 空腹胰岛素
mRNA Messenger RNA 信使RNA
cDNA Complementery DNA 互补DNA
OD optical density 光密度
HI Hyperinsunlinemia 高胰岛素血症
CVD Cardiovascular disease 心血管疾病
T Testoerone 睾酮
RT- PCR Reverse transcription polymerase
chain Reaction
逆转录聚合酶链反应ELISA Enzyme-linked immunosorbent 酶联免疫吸附试验
assay
IR Insulin resistance 胰岛素抵抗
NF-κB Nuclear Factor-kappa B 核因子κB
MS Metabolic syndrome 代谢综合征
TNF-a Tumor necrosis factor-a 肿瘤坏死因子-a IκB Inhibits factor of kappaB 抑制性κB
IKK I K B kinase I K B激酶
IL Interleukin 白介素
LE Letrozole 来曲唑
CMC Carboxymethylcellulose 羟甲基纤维素FSH Follicle-stimulating hormone 促卵泡激素
LH Luteotrophic hormone 促黄体激素
FFA Free fat acid 游离脂肪酸
IHC immunohistochemistry 免疫组织化学HE Hematoxylin and eosin 苏木素伊红
Min Minute 分钟
E2 Estradiol 雌二醇
DHEA Dehydroepiandrosterone 脱氢表雄酮
核因子κB、TNF-a、IL-6在PCOS大鼠模型中的达及二甲双胍的干预研究
摘要
[目的]1、建立可靠的PCOS大鼠模型，并设计二甲双胍的给药干预，研究NF-κB、IL-6、TNF-a在正常组、PCOS组、二甲双胍干预组大鼠的表达，及与终体质量、T、LH、HOMA-IR、E2表达的相关性，了解NF-κB及炎症因子在PCOS中的作用；2、研究二甲双胍对NF-κB、IL-6、TNF-a及终体质量、T、LH、HOMA-IR、E2表达的影响，为临床治疗提供实验依据；3、探讨二甲双胍对多囊卵巢大鼠的促排卵作用及可能的机制。
[方法] 将32只雌性S/D大鼠随机分为三组，正常对照组（A组，n=10）：自由摄取食物和水31 d；PCOS组(B组，n=12)：来曲唑1 mg/kg灌胃21 d 后予以2.6 mL/kg生理盐水灌胃10 d；二甲双胍干预组（C组，n=10）：来曲唑1 mg/kg灌胃21 d后予以6%的二甲双胍2.6 mL/kg灌胃10 d。每日阴道涂片及称重，测定各组大鼠血清E2、T、LH、FPG、FINS水平，通过HE 染色观察卵巢形态，通过免疫组化、荧光定量PCR方法监测各组大鼠卵巢NF-κB p65蛋白及mRNA的表达，通过Elisa测定各组大鼠循环中IL-6、TNF-a 的表达，通过RT-PCR测定各组大鼠卵巢IL-6、TNF-a mRNA的相对表达。[结果]
1.用来曲唑1mg/kg灌胃共21天，模型组大鼠于造模第9天均失去动情
周期，卵巢病理多囊改变，并具有高雄激素血症和胰岛素抵抗的特点，建立近似于人类PCOS的动物模型；
2.PCOS组大鼠血清TNF-a显著高于正常对照组（P<0.05），二甲双胍
干预组血清TNF-a较PCOS组显著下降（P<0.05）；血清IL-6水平在
三组大鼠间无显著性差异（P>0.05）；PCOS大鼠二甲双胍干预后血
清INS、T、LH显著下降；
3.各指标之间进行Pearson相关性分析，很多各指标之间存在相关，形
成恶性循环；在相关的基础上进行多元线性回归分析：TNF-a和体质
量是引起胰岛素抵抗的独立影响因素,可能是胰岛素抵抗的机制之
一；T和IL6对体质量具有显著性影响；IL-6是除HOMA-IR外，对T的独立影响因子；
4.在二甲双胍药物干预的第6天，二甲双胍组大鼠均出现动情周期，恢
复排卵；而PCOS组持续处于动情间期，提示无排卵，直到第10天12只中仅1只恢复动情周期。二甲双胍干预组大鼠的卵巢形态均恢复正常，而PCOS组大鼠的卵巢形态仍为多囊改变；
5.PCOS大鼠卵巢局部TNF-a、IL-6 mRNA的表达较正常对照组增高
（P<0.05），二甲双胍干预组大鼠卵巢局部炎症因子mRNA的表达较PCOS组显著减少（P<0.05）；
6.卵巢组织免疫组化显示：NF-κB P65均一致性的表达在卵巢颗粒细胞
的细胞核，但各组之间的表达无明显统计学差别（P>0.05），荧光定量PCR检测卵巢组织NF-κB P65 mRNA的表达，各组之间未发现显著性差别（P>0.05）。
[结论]
1.S/D大鼠来曲唑建模可作为研究PCOS的理想动物模型；
2.本PCOS大鼠模型存在慢性低度炎症，可能由于临床异质性，主要反映
在TNF-a水平的升高，二甲双胍的干预显示有益的作用；
3.TNF-a是引起PCOS胰岛素抵抗的独立影响因素，IL-6是PCOS体质量
的独立影响因素，可用于预测发生的风险性；
4.二甲双胍具有良好的促排卵作用，能恢复卵巢正常形态，卵巢局部炎症
因子的改变可能直接参与发病机制；
5.炎症因子的变化并不是通过NF-κB介导，可能存在其他信号通路，或者
与PCOS临床表现的异质性有关，具体机制有待进一步研究。
[关键词]NF-κB，二甲双胍，IL-6，TNF-a，PCOS
The expression of NF-κB and inflammation factors in PCOS rats model, and the study of metformin intervention
ABSTRACT
[Objective]
1.To establish a reliable PCOS rat model, and design drug intervention to metformin, to detect the level of NF-kB, IL-6, TNF-a in the normal group, PCOS group, and metformin treated group, To know their roles in PCOS，and to investigate the relationship between PCOS indicators（The final weight、T、LH、HOMA-IR、E2）with them.
2.To study the influence of metformin on NF-κB, IL-6, TNF-a and PCOS indicators, and provide a reliable experimental basis for clinical treatment.
3.To discuss the effect of Metformin on ovulation and to know the possible mechanism.
[Method]
The 32 female S / D rats were divided randomly into three groups：normal group（group A, n=10，allowed free access to water and standard rat diet）, PCOS group（group B, n=12, given an oral gavage dose of 1mg/kg letrozole for 21 days, then 2.6 mL/kg normal saline for 10 days）, metformin group（group C, n=10,administered through gavage letrozole with the dosage of 1 mg/kg for 21 days, then the dosage of 2.6 mL/kg of 6% Metformin for 10 days）.We take a vaginal smears and weighing in everyday. Histological changes in ovarian tissues were observed with H-E staining. serum T, LH, FPG, INS，level were Measured. the expression of NF-κB in ovaries of each group was Monitored by the way of immunohistochemistry and quantitative PCR. IL-6, TNF-a expression in circulatory system and ovarian were detected by the way of Elisa and RT-PCR. [Results]
https://www.doczj.com/doc/573474931.html,e letrozole to establish an animal model which is similar to human PCOS, and consistent with PCOS endocrine, histology, metabolic characteristics.
2. The serum TNF-α was significantly higher in the PCOS group than the control group (P <0.05). The circulating TNF-α was significantly decreased in metformin group (P <0.05). Serum IL-6 levels have no significant difference among three groups of rats (P> 0.05). serum INS，T, LH decreased significantly in PCOS rats after metformin intervention(P <0.05).
3. Analyze the indicators by Pearson correlation. Many indicators exist correlation with each other, creating a vicious cycle. The analysis on the basis of the relevant multiple linear regression:TNF-a and body quality are independent factors which cause insulin resistance. It may be the mechanisms of insulin resistance. There is a significant positive correlation between Body mass index and IL-6, TNF-a, HOMA-IR, T. The analysis of multiple regression shows that the T and IL6 have a significant impact on body mass index. IL-6 is another indepent impact factor to T,besides HOMA-IR.
4. By the sixth day of administration of metformin, all the rats appeared estrous cycle in metformin group, showing the ovulation to restore. The PCOS group continued in diestrus,displaying anovulation, Only one in 12 rats to restore the estrous cycle until the 10th day after a gavage of normal saline. Metformin groups were all returned to normal ovarian morphology, but the PCOS rats remained polycystic ovarian morphology changes.
5.The TNF-α, IL-6 mRNA expression increased in PCOS rat ovary compared with normal control group (P <0.05). The local inflammatory cytokine mRNA expression was significantly lower in metformin rat ovary (P <0.05).
6. Immunohistochemistry of ovarian tissue shows that : NF-κB P65 are consistent expression in the nucleus of ovarian granulosa cells. But there is no statistically significant difference among the three groups (P> 0.05). Detecting the ovarian NF-κB P65 mRNA by quantitative PCR shows no significant difference among the three groups (P> 0.05).
[Conclusion]
1. S / D rats with letrozole modeling can be used as an ideal animal model of PCOS.
2. PCOS presence in a state of chronic low-grade inflammation. May be due to clinical heterogeneity, mainly reflected in the increase of TNF - a,showing the beneficial effects of metformin intervention.
3. TNF-a is an independent impact factor which causes insulin resistance. IL-6 are independent impact factors of the body quality. These indicators can be used to predict the risk of insulin resistance and obesity.
4. Metformin has a good effect on ovulation, and it can restore normal ovarian morphology. Local factors changing in ovarian may be directly involved in the pathogenesis, besides changing in cycle.
5.The inflammatory cytokines change is not via NF-κB-mediated. There may be exsit other signaling pathways or relate with the heterogeneity of the clinical manifestations of PCOS, and the specific mechanism needs further study. [Key words]NF-κB;metformin;IL-6;TNF-a;PCOS
前言
多囊卵巢综合征(PCOS) 是一种起病于青春期，好发于育龄妇女的内分泌代谢紊乱综合征，其发生率占育龄妇女的5-10%，以高雄激素血症，胰岛素抵抗和长期无排卵为主要特征,同时可伴有肥胖、血脂异常等代谢紊乱，成为2型糖尿病、心脑血管疾病和子宫内膜癌发病的高危因素，严重影响患者的生活质量。PCOS的发病机制十分复杂，确切病因不清，肥胖、高胰岛素、高雄激素血症之间形成恶性循环，呈现病三角，但现今认为慢性低度炎症也是PCOS的基本特征之一。炎症学说已经成为又一个研究焦点。这里的炎症指的是亚临床炎症，非细菌、病毒急性感染出现红肿热痛等表现，是指人体免疫系统介导的一种低度、慢性、非特异性的炎症状态，主要是炎症指标的上升，大量临床资料表明PCOS病人炎症因子水平升高，但发现一直存在争议，结果不尽相同，需进一步研究证实。
核因子κB（Nuclear Factor-kappa B,NF-κB）是炎症信号中关键的炎性分子,是一种重要的核转录因子, NF-κB信号转导通路主要包括NF-κB,I κB(NFκB抑制蛋白),IKK(NF-κB抑制蛋白激酶)。NF-κB属于Rel蛋白家族，广泛存在各种组织细胞中，在细胞信号传导及基因表达调控中起重要作用。1986年Sen和Baltimore从B细胞检测到的一种蛋白因子，但随后在非B-细胞的细胞质中被发现，它能与免疫蛋白K轻链基因增强子KB序列(5’-GGGACTTTCC-3’)特异结合,并促进K链基因表达,将其命名为Neclear factor kappaB(NF-κB), NF-κB其家族的五位成员分别为：Rel A(P65)，RelB（P68），C- Rel， NF-κB1(P50),NF-KB2（P52）,它们都有一个N端Rel同源结构，负责结合其与DNA结合及二聚化 ,是一种DNA结合蛋白，分别由RelA、RelB、Rel、NF-κB1、NF-κB2基因进行编码，其激活后能调节各种炎症因子的基因转录活性，控制炎症因子的产生和表达。生理情况下核转录因子家族成员通常以同源或异源二聚体形式组成,如P50/P65，NF-κB 的单体中P65具有转录活性的，也是最常见的，通常讲的NF-κB就是指
P50/P65二聚体。NFκB与其抑制性蛋白(Inhibitory Kappa B,IκB)形成三聚体复合物，以静止形式存在于所有哺乳动物细胞胞质内， IκB是NF-κB 的重要调控蛋白，IκB的磷酸化是NF-κB 激活的关键步骤。激活IKK上游
的激酶而活化IKK，IKK是一种由IKK-a、IKK-β、IKK-γ3个亚基组成复合体，IKK-a、IKK-β可磷酸化底物，其中IKK-β磷酸化能力最高，激活活化的IKKβ通过磷酸化或泛素化激活IκB，使之与NF-κB 解离。解除抑制的活性NF-κB转位到细胞核内，结合到靶基因的DNA结合位点，从而启动靶基因转录，调节一系列炎性因子及炎症相关物质的基因转录和蛋白质合成，产生和放大炎症反应。虽然这些细胞外刺激所产生的细胞内早期信号途径各不相同，但一般认为大多数细胞受刺激信号传导反应将最终激活IKK复合物，在这过程中IKK上游的信号衔接蛋白起重要作用。当细胞受到各种应激性刺激，高糖，细菌脂多糖，病毒，游离脂肪酸、氧自由基和细胞因子等刺激时，均可以激活IKK上游的激酶而活化IKK，激活NF-κB信号通路，控制肿瘤坏死因子（TNF-a）、白细胞介素（IL）-1、IL-2、IL-6 、IL-8、PAI-1、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1、嗜酸细胞活化趋化因子等趋化因子，细胞间黏附分子（ICAM）、血管内皮细胞黏附分子（VCAM）、内皮细胞选择素等黏附分子，环氧化酶（COX）-2、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）等诱导酶类，一些急性期反应蛋白和免疫受体等基因编码的表达。导致炎症反应，炎症反应通常是对有害刺激的生理反应，但如果清除失败，体内持续低水平慢性炎性反应状态，会影响机体功能。
国内外关于PCOS与NF-κB的研究，2006年国外学者Gonzalez F对16个PCOS患者和16个正常妇女给予口服葡萄糖后发现外周血单核细胞中NF-κB在PCOS胖/瘦组的激活显著高于非PCOS者. (22.3± 3.2 ,17.0±5.0 vs.8.4±11.8, P＜ 0.02),认为高糖激活NFκB,促进炎症因子的释放。为研究PCOS患者炎症因子升高形成的分子机制，2009年国内朱洁萍、苏椿淋均体外实验显示睾酮能激活巨噬细胞、脂肪细胞NF-κB信号通路，促进炎症因子的生成。
国内外对于炎症因子是否在ＰＣＯＳ中发挥作用尚未完全定论，ＰＣＯＳ细胞因子的变化是否通过NF-κB的转录调控，目前研究甚少。有研究发现卵巢组织中可见大量的巨噬细胞和淋巴细胞浸润，证实PCOS卵巢中存在慢性炎症反应，并影响卵巢的内分泌和排卵功能, NFκB存在所有哺乳动物细胞细胞质内，不是分泌到胞外的因子，故取卵巢组织，多囊卵巢综合征病
人为慢性疾病，长期门诊治疗，组织标本不易获得，故本文基于已有的研究结果，建立稳定可靠动物模型，Elisa方法监测血清中IL-6，TNF-a含量，取大鼠模型中卵巢组织免疫组化检查NF-κB的表达情况，荧光定量PCR监测卵巢NF-κB mRNA的表达，RT-PCR监测卵巢组织TNF-a及IL-6的mRNA 表达情况,了解NF-κB及炎症因子在PCOS的表达,及与PCOS临床表现、各指标之间的相关性，并设计二甲双胍的给药干预，为临床治疗或监控PCOS 提供理论基础。
第一部分PCOS大鼠模型的构建
在PCOS的基础研究中，动物实验占有重要地位，建立稳定可行的动物模型是科学研究的基础，来曲唑造模是最常用的造模方法。国内外常把S/D 大鼠作为研究PCOS的动物，本研究采用来曲唑灌胃建立PCOS大鼠模型，并分析比较模型组与对照组的血清睾酮（T）、雌二醇（E2）、黄体生成素（LH）、胰岛素（INS）、空腹血糖（FPG）水平变化，及卵巢的形态学改变等。为下一步开展对该病发病机制和治疗的研究奠定基础。
材料和方法
1．实验材料
1.1实验动物：6周龄SD清洁级雌性大鼠30只，体重19
2.33±4.73克，由福建医科大学实验动物中心提供；[许可证号：SCXK（闽）2012-0001]，二级动物房饲养，恒温22℃，12小时光照12小时黑暗交替，自由摄取食物和水。每日对大鼠进行阴道涂片检查，连续观察2-3个动情周期（4-5天），有2个规则动情周期的大鼠用于实验。
1.2实验仪器
光学显微镜：日本Olympus公司
病理组织切片机：德国莱卡公司
病理组织包埋机：德国莱卡公司
病理切片照相系统：德国莱卡公司（LEICA DM 2500）
XH-6020γ放射免疫计数器：国营二六二厂
低温冰箱：美国REVCO公司
低温离心机：德国Eppendorf
精密电子天平：美国美特勒公司
另外：台式电子称、大鼠固定台、一次性无菌注射器（1ml，5ml）、无菌试管、试管架、铝盒、眼科剪、眼科镊、无菌纱布、载玻片、棉签、组织剪、镊子、口罩、帽子、无菌手套、1ml移液器、普通EP管、标记笔等。
1.3实验试剂
来曲唑：芙瑞，江苏恒瑞医药股份有限公司
1%CMC（羟甲基纤维素水溶液）:上海生工公司
INS，LH，T，E2放射免疫试剂盒（100T）：天津协和医药科技公司
另外：75%酒精、 10%水合氯醛、10%甲醛、健之素消毒药片、瑞士染色剂等
2、实验方法
2.1实验动物分组和给药方法：
将具有规律动情周期6周龄SD清洁级雌性大鼠30只 (体重为192.33±4.73克)，随机分为三组： LE溶解在1％羟甲基纤维素水溶液（CMC2mL ／kg）中，动情前期灌喂：
A组（10只）：（空白对照组）：自由摄取食物和水21天
B组（10只）：（溶剂对照组）：每日用1%羟甲基纤维素水溶液（CMC2ml/kg）灌胃21天
C组（10只）：（实验组）：每日用溶解在1%羟甲基纤维素水溶液（CMC2ml/kg）的来曲唑1mg/kg灌胃21天[94]。
2.2每日测量大鼠体质量，并记录。
2.3阴道脱落细胞涂片观察细胞形态变化了解大鼠动情周期变化
棉签蘸水后插入阴道，在阴道侧壁上1/3处顺时针转动，将带有阴道分泌物的棉签均匀涂抹在载玻片上，空气中自然干燥后，瑞氏染色干燥后光学显微镜检查。
雌鼠性成熟后，像其他哺乳动物一样，卵巢间断而周期性的产生卵细胞，并分泌雌激素，黄体细胞分泌孕激素，在激素的作用下出现明显的动情周期，雌鼠全年发情，动情周期4-5天，可分为动情前期、动情期、动情后期、动情间期，每个阶段阴道粘膜可发生典型变化，根据阴道涂片观察阴道上皮细胞变化，进一步推测卵巢周期性变化和激素变化[109]。
动情前期：随着卵泡发育，雌激素分泌开始升高，但血液中的雌激素含量还较低，对阴道上皮的刺激也小，所以阴道上皮细胞增殖速度缓慢，脱落到阴道的细胞为圆形或椭圆形的有核上皮细胞；
动情期：卵泡成熟、排卵，雌激素含量达高峰，刺激阴道上皮增厚，阴道上皮细胞迅速发育，细胞体积大而扁平，常呈大方块、多边形无核角化细胞，且细胞连接较松散，易于脱落；雌激素促进糖原合成，在阴道杆菌作用
下分解成乳酸，使阴道保持酸性，防止细菌入侵；
动情后期：为动情期向动情间期过渡，所以三种细胞白细胞、角化细胞、有核细胞都有；
动情间期：雌激素含量低，角化上皮细胞少，上皮变薄，糖原减少，白细胞浸润防止微生物繁殖感染，故以白细胞为主[98]。
2.4标本的采集和处理
末次给来曲唑24小时后，禁食12小时，称重，10%的水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，取下腔静脉肾静脉水平处进针抽吸4-5ml血于空白管中，室温静置30-60分钟，3000rpm离心5分钟，取血清分装后-20度保存备用。取出双侧卵巢，先肉眼观察各组模型卵巢外观形态变化，并予以称重，计算卵巢重量指数，10%甲醇固定、石蜡包埋各组大鼠卵巢组织。
2.4.1血清性激素、胰岛素测定
取大鼠血清用放射免疫分析法检测各项指标：LH、E2、T、FINS水平。（由我院免疫室监测）
2.4.2空腹血糖测定
葡萄糖氧化酶法测定（由我院生化室监测），计算Homa-IR=空腹血糖（mmol/L）×空腹胰岛素（mIU/L）/22.5。稳态模型评估HOMA-IR是评估胰岛素抵抗水平常用的指标。
2.4.3组织切片HE染色
（1）切片、展片、烤片
按4um厚度进行石蜡切片，用镊子夹住蜡片的一边提起，铺于恒温水中，待切片在恒温水内充分摊开展平后，将载玻片垂直插入水中以涂有多聚赖氨酸面的中间部分轻靠切片，随即将玻片直立提起，将附贴好的组织切片置于70℃烤箱内1个小时。
（2）脱蜡
①切片在二甲苯中脱蜡10分钟；②再依次经100%、95%、85%、70%的酒精各为5min；③自来水冲洗3min，再置于蒸馏水中泡3min。
（3）切片HE染色
①苏木素溶液中浸染10min；用水冲洗去残存的染液；
②用1％的盐酸酒精(70％的酒精配制)分化数秒；
③流水冲洗30min；
④经过充分洗涤后，移入O．5％伊红染液染色1-5min；
⑤依次经70%、85%、95%、100%酒精梯度脱水；
⑥二甲苯透明化处理，中性树胶封片。
2．统计学分析
采用SPSS17.0软件进行统计学处理。所有数据经单样本K-S法正态分
布检验，均符合正态分布，计量资料均以均数±标准差（
x±s）表示，两
组间比较采用t检验或t′检验，多组间相同指标的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
实验结果
1.阴道脱落细胞涂片观察大鼠动情周期：
模型组大鼠在应用来曲唑的第9天出现动情周期失去规律变化，阴道涂片持续处于动情间期，提示无排卵，对照组（空白对照组和溶剂对照组）大鼠仍然保持规律的动情周期（图1-1、2、3、4）。
图1-1动情前期图1-2动情期
（瑞氏染色）（瑞氏染色）
（瑞氏染色）
图1-3动情后期图1-4动情间期
（瑞氏染色） (瑞氏染色)
2.各组大鼠体质量情况的比较
建模前各组大鼠体质量无明显差别（P>0.05），建模结束后各组大鼠体质量比较：A组与B组之间差别无统计学意义（P>0.05）,C组大鼠明显高于A、B组（P<0.05）（表1-1，图1-5、6）。
)
表1-1 各组大鼠体质量的比较(x s
A组B组C组
建模前体质量 (g) 191.30±5.23 192.00±4.94 193.70±4.11 建模后体质量(g) 308.20±13.65 310.20±11.88* 319.70±11.70#Δ与A组比较， *P>0.05； #P＜0.05；
与B组比较，ΔP<0.05；
图1-5各组大鼠体质量比较的柱形图
图1-6各组大鼠体质量增长趋势的比较
3.各组卵巢重量的比较
建模结束后各组大鼠卵巢湿重及卵巢重量指数的比较：A组与B组之间差别无统计学意义(P>0.05)。C组显著高于A组、B组(P＜0.05)。
表1-2 各组大鼠新鲜卵巢重量的比较(x s )
指标 A 组 B 组 C 组 卵巢湿重 163.00±10.50 163.30±8.31 * 178.40±6.90﹟Δ 卵巢重量指数
52.87±1.96
52.55±3.44*
57.39±2.86﹟Δ
卵巢重量指数=两侧卵巢重量（mg ）/大鼠体重（g ）×100； 与A 组比较，*P>0.05，﹟P ＜0.05； 与B 比较，ΔP ＜0.05。 卵巢湿重单位：mg
图1-7 各组大鼠卵巢重量的比较
3． 卵巢大体形态学比较
A 、
B 组大鼠卵巢体积小，未见囊性扩张的卵泡（图1-8、9）。
C 组大鼠卵巢色泽苍白，体积增大，可见囊性扩张的卵泡（图1-10）。
图1-8 空白组卵巢大体观 图1-9 溶剂组卵巢大体观
2012年12月1日第12期No．12 1 Dec． 2012 中医学报 CHINA JOURNAL OF CHINESE MEDICINE 第27卷总第175期Vol．27 Serial No．175 *基金项目：北京中医药大学自主课题(编号:2011－JYBZZ － XS077) 通络救脑注射液对阿尔茨海默病模型大鼠学习 记忆及氧化应激反应的影响 * Effects of Tongluo Jiunao Injection on learning and memory and oxidative stress response for Alzheimer's Disease Rat Models 刘洋Liu Yang 1，李澎涛Li Pengtao 2，刘希伟Liu Xiwei 1，南一楠Nan Yinan 1，都文渊Du Wenyuan 1 1．北京中医药大学基础医学院中西医结合基础(病理)，北京110029 Integration of Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Subject (Pathology )in Basic Medical College of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ， Beijing ，China 1100292．北京中医药大学东直门医院，北京100700 Dongzhimen Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine ，Beijing ，China 100700 摘要：目的:探讨通络救脑注射液(Tong Luo Jiu Nao injection ， TLJN )对阿尔茨海默病(Alzheimer ’s Disease ，AD )模型大鼠的防治作用及其抗氧化机制。方法:采用脑内定位注射β淀粉样蛋白(βamyloid1-42)建立AD 大鼠模型，在模型建立成功的同时给予TLJN 治疗。采用Morris 水迷宫进行AD 大鼠的行为学检测，用化学比色法检测大脑皮质丙二醛(MDA )的含量。结果:与正常组比较，AD 模型组大鼠的逃避潜伏期明显延长(P ＜0．01)，目标象限停留时间明显缩短(P ＜0．01);TLJN 治疗组大鼠逃避潜伏期明显缩短(P ＜0．05)，目标象限停留时间明显增加(P ＜0．05)。AD 模型组大鼠脑皮质中MDA 含量增加(P ＜0.01);TLJN 治疗组，脑皮质MDA 含量显著减少(P ＜0．01)。结论:TLJN 具有改善学习记忆能力，对抗大鼠神经系统的退行性病变有一定的作用，可能通过抑制AD 模型大鼠脑皮质MDA 产生发挥其保护作用。 Abstract :Objective :To explore the preventive and therapeutic effect and anti-oxidation mechanism of Tong Luo Jiu Nao injection (TLJN )in Alzheimer's Disease (AD )rat models．Methods :The AD rat model was established by injecting β-amyloid1-42into the rat brain ，and successful model rats were given TLJN injection treatment at the same time．The behavioral changes of the AD rats were test-ed with Morris water maze．Chemical colorimetry was used to measure malondialdehyde (MDA )content in the cerebral cortex．Results :Compared with the control group ，the escape latent period of AD rats was significantly longer (P ＜0．01)，retention time of the target quadrant significantly obviously reduced (P ＜0．01);After TLJN treatment ，the escape latent period of AD rats was significantly shorter (P ＜0．05)，and retention time of the target quadrant was significantly increased (P ＜0．05)．In AD model group ，the MDA content in cerebral cortex was increased significantly (P ＜0．01);while after TLJN treatment ，the MDA content in cerebral cortex was decreased obviously (P ＜0．01)．Conclusions :TLJN treatment has certain effects on improving learning and memory ability of AD rats and resisting retrogression of rats nervous system ，and plays protective role in AD rats possibly via inhibiting the production of MDA．关键词：阿尔茨海默病;通络救脑注射液;Morris 水迷宫;学习记忆;氧化应激反应;大鼠 Key words :Alzheimer's Disease (AD );Tongluo Jiunao injection ;Morris water maze ;learning-memory ;oxidative stress response ;rat 中图分类号CLC number ：R285．5 文献标识码Document code ：A 文章编号Article ID ：1674－8999（2012）12－1614－03阿尔茨海默病（Alzheimer ’ s Disease ，AD ）是一种继心血管病、癌症、脑卒中后严重威胁人类健康的高发性神经退变性疾病。但目前临床上对于AD 的病因和发病机制尚不完全清楚， 对于其治疗仍旧是一个世界性的难题。近些年来，对于AD 的发病机制研究方面取得了很多进展，主要集中在遗传因素、环境因素、免疫-炎性机制、氧化应激和细胞凋亡等方面，而氧化应激在AD 中的作用越来越受到研究者的重视。结合本研究团队多年体内外实验研究， 发现AD 的中医病机关键为“毒损脑络”［1-2］ 。因此，本实验采用大鼠双侧海 马注射A β1-42这一致毒片段以模拟“毒损脑络”病证，观察“毒损脑络”病证下AD 大鼠学习记忆变化情况及氧化应激反应的改变，采用针对该中医病机关键具有解毒通络作用的中药复方通络救脑注射液进行干预， 通过Morris 水迷宫行为学检测方法观察药物干预后大鼠学习记忆的改善情况及通络救脑注射液的作用机制，为通络救脑注射液的临床应用提供体外实验依据。 1 材料与方法 1．1 动物分组 清洁级雄性SD 大鼠32只，体质量（250?20）g ，购自北 京维通利华实验动物中心。随机分成正常对照组（正常组）、 A β海马注射组（模型组）、A β海马注射+通络救脑注· 4161·
2型糖尿病大鼠模型研究概况 【摘要】目的：综述近年来2型糖尿病(T2DM)大鼠模型的研究进展及对其优缺点进行评价和未来同类模型的展望。方法：主要对T2DM大鼠模型的建立技术和方法进行综合性评价。结果：T2DM大鼠模型目前可以分为自发性T2DM 和实验性T2DM模型,且仍有较大发展空间。结论：经过综合评价研究，认为各种建模方法均有优缺点，目前较认可的是实验性T2DM大鼠模型，因价格低廉，造模方便而广受欢迎，但仍缺乏一定的造模标准。 【关键词】2型糖尿病；动物模型；研究概况 随着经济社会的发展，人们的饮食结构、生活方式等发生了很大改变，糖尿病发病率显著上升，尤其T2DM占了较高比例，大概占了糖尿病发病率的90%。T2DM是因人体胰岛素分泌相对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低继而引发糖、蛋白质、脂肪和水电解质等代谢紊乱所导致的疾病。患者典型表现为三多一少，即多饮、多食、多尿表现，同时还伴有身体消瘦、疲乏、烦躁、口渴等临床症状。 选择一些合适的动物模型进行动物试验成了我们研究糖尿病的良好途径，我们可以从中比较一些糖尿病药物的作用效果以及其药动学的特点，在临床用药上对评价某套治疗方案的可行性及预后等具有十分重要的参考意义。 目前研究的临床T2DM动物模型主要集中在大鼠上，这可能是由于大鼠作为T2DM动物模型相对较稳定且与人T2DM表现相似的优点。因此我们在下面综述近几年来国内外有关临床T2DM大鼠模型研究的情况。 总体上来说，目前临床T2DM研究的大鼠模型主要分为两类，一类是自发性T2DM大鼠模型，另一类则是实验性T2DM大鼠模型，考虑到成本及方便程度，目前以后者居多。 1 实验性T2DM大鼠模型 1.1 单纯高脂高糖引发的T2DM 在试验中，通过较长时间给予大鼠过量的高糖高脂饮食，发现能够诱导出较满意的T2DM大鼠模型，从而能为进一步研究奠定良好的基础。目前认为其机理可能是高糖高脂饲料会导致胰岛B细胞超负荷，进而使胰岛细胞发生损伤、萎缩甚至死亡，胰岛的功能因此下降，继而建立起伴胰岛素抵抗的T2DM模型。鲁瑾[1]等采用61%的高脂饮食，饲养大鼠7周后，大鼠就出现了高胰岛素血症，且形成了明显的胰岛素抵抗，是一个十分可靠的胰岛素抵抗模型。张丽锋[2]等给予W istar大鼠脂肪热比为59%的饲料, 喂养4周，均出现胰岛素抵抗，多项研究试验表明高脂饮食可以诱发产生可靠的糖尿病大鼠模型。 1.2 应用STZ药物诱导产生的大鼠模型由于高糖高脂饲料相对用时较长，且饲料成本相应较高，因此合理使用链脲菌素(STZ)是目前许多研究者所推崇的
骨质疏松常见模型 1. 概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致骨脆性 增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2. 临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3. 按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性骨折。依 次程度增加。 4. 现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原发性骨 质疏松症（primary osteoporosis ，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis ，POMP ）和Ⅱ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类 现代医学的研究 1. 发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素导致骨 吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2. 诊断与治疗：① 诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density ，BMD ）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD 测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD 的方法有双能X 线吸收测定法 （DXA ）、外周双能X 线吸收测定法（pDXA ）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA 测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准” 。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3 等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D 等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失单独使用钙剂是没有治疗骨质疏松症的作用，必须配合骨形成促进剂或骨吸抑制剂。
红景天对阿尔茨海默病大鼠行为学和脑组织 抗氧化能力的影响 作者：冀俊虎,董联玲,曹娟,杨发明,王健 【摘要】目的探讨红景天对阿尔茨海默病(AD)模型大鼠的干预效果和作用机理。方法采用腹腔注射D-半乳糖(用生理盐水配成浓度为10 mg/mL)和灌胃AlCl3(用蒸馏水配成浓度为20 mg/mL),并一次性注射东莨菪碱建立AD动物模型。通过Morris水迷宫测试系统检测大鼠学习记忆能力变化,抗超氧阴离子和总抗氧化能力测定检测各组大鼠脑组织抗氧化水平,常规HE染色和免疫组化测Aβ1-40的表达,观察大鼠海马及皮质的形态学改变。用红景天以灌胃方式对实验大鼠进行干预,并以喜得镇做对照观察其干预效果。结果模型组大鼠记忆功能明显减退,神经细胞破坏明显,海马和皮质出现β-淀粉样蛋白沉积及老年斑。中药组、西药组及空白组大鼠在水迷宫测试中,逃避潜伏期明显缩短,原平台象限比、跨平台次数明显增加,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；模型组抗超氧阴离子和总抗氧化能力活性较其他组明显降低(P＜0.05)。结论红景天可以有效改善AD大鼠空间学习记忆能力损害,同时在清除自由基和抗氧化损伤方面有显著功效,具有神经保护作用。 【关键词】红景天；阿尔茨海默病；行为学；抗氧化能力；大鼠
Abstract：Objective To study the intervention effect and mechanism of integripetal rhodiola herb (IRH) on Alzheimer’s disease model rats. Methods Alzheimer’s disease model was made by injecting D-galactose (10 mg/mL) in abdominal cavity and taking AlCl3 (20 mg/mL) by intragastric administration, and injecting scopolamine. Morris water maze testing system was undertaken to observe the change of learning and memory ability in rats, biochemical indicator tested was to contrast the state of oxidative stress, common HE staining and immunohistchemistry staining were to observe the morphology change of the hippcampus and cortex cell. The model rats were administrated IRH by means of intragastric administration contrasting with hydergine to compare the effect. Results The memory ability of model group was obviously decreased, cellula nervosa were damaged badly. A β and senile plaques appeared on hippcampus and cortex. All of the test indexes in Morris water maze showed that the abilities of space search, learning and memory in different groups remarkably improved compared with that of the model group (P ＜0.05). The anti-02·- and T-AC activity of the model group was lower than other groups obviously (P＜0.05). Conclusion IRH has significant relieving effect on the lesion of the abilities of
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
骨质疏松的动物模型 骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微观结构为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨的脆性增加、易于发生骨折。骨质疏松症是目前世界上发病率、死亡率和医疗保健消耗较大的疾病之一。骨质疏松起病隐袭，一旦发现，多已发展到一定程度。随年龄增加，骨丢失和骨折发生率明显增加。骨质疏松性骨折可发生在任何部位，但以椎骨、腕部和髋部多见。髋部骨折最为严重，多需手术处理，且患者常合并慢性疾病，如高血压、心血管、慢性呼吸道阻塞疾病及糖尿病等，导致医疗费用和死亡率增加，一部分患者日常生活不能完全独立，年平均生活质量下降。女性由于峰骨量较低及绝经后雌激素水平下降，发病率较男性为高。近年来随着社会老龄化，人口寿命的延长，女性绝经后生存年限约占一生的1/3，据估计，从1990－2025，欧洲50岁以上妇女将增加30％－40％。男性预计增加更快，可达50％。在同一时期内，北美预期将增加83％。亚非绝对增加数将为更为明显。在1990年全世界仅髋部骨折达130－170万，预期到2025年为200万，甚至更多［1］。骨质疏松症已成为全世界范围的严重的社会和经济问题。 骨质疏松症的预防和治疗已成为一个多学科的、当前研究最活跃的课题之一。建立理想的骨质疏松症的动物模型是对治疗和预防骨质疏松症新药的体内过程、药物代谢动力学、药效学和影响药物作用因素的基础。随着对骨质疏松症的研究的不断深入，认为骨质疏松症的发生与遗传、营养、生活习惯、激素、运动、机械负荷和多种细胞因子有关。对骨质疏松症的动物模型提出了严格的要求。Rodgers等指出理想的动物模型应有三个特点：（1）方便性（Convenience）：动物购来容易，价格低廉，实验操作易行。（2）关联性（Relevance）：与人体条件比较相似，得到的信息能转化为人体的规律。（3）适宜性（Appropriateness）：为研究某一特定问题，最好用特定的动物模型模拟人体［2］。骨质疏松症的动物模型涉及动物的选择和复制的方法等方面，本文就此将国内外的有关进展进行综述。 复制骨质疏松模型的动物选择 用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型［3］。灵
阿尔茨海默病大鼠自噬相关蛋白Beclin—1和凋亡相关蛋白p53表达 变化及电针的调控作用 目的观察电针对大鼠海马自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53表达的影响，探讨电针治疗阿尔茨海默病（AD）的作用机制。方法将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和电针组。电针组取“百会”和“涌泉”进行电针治疗，每日1次，7 d为1个疗程，共治疗4个疗程。疗程结束后尼氏染色观察各组海马CA1区组织形态的变化并计数尼氏体阳性细胞，Western blot检测Beclin-1和p53蛋白的表达。结果模型组CA1区尼氏体阳性的细胞数目较正常组显著减少（P＜0.01），电针组锥体细胞和尼氏体表达较模型组明显增多（P＜0.05）。与正常组比较，模型组海马组织中Beclin-1蛋白表达降低、p53蛋白表达升高（P＜0.05）；与模型组比较，电针组Beclin-1蛋白表达明显升高（P＜0.01），p53蛋白表达降低（P＜0.05）。结论电针治疗可对抗β-淀粉样蛋白诱导的神经元凋亡，改善AD海马组织形态变化。 标签：电针；阿尔茨海默病；凋亡；自噬；Beclin-1蛋白；p53蛋白；大鼠 上海中医药大学名师传承研究工程项目（2009120） 阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种慢性进行性的中枢神经系统退行性变性病，β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑、神经原纤维缠结和神经元及其突触的缺失是其典型特征。目前AD的临床药物只能对症治疗，无法逆转其病理进程。自噬是细胞长寿命蛋白、变性或衰老细胞器的主要降解途径[1]。研究表明，自噬功能障碍与多种错折叠蛋白聚集体导致的神经变性疾病有关[2-3]。自噬障碍可能影响Aβ的清除和增加神经细胞死亡[4]，表明自噬可以保护神经元免受Aβ诱导的凋亡[5]，与AD的病理生理学密切相关。针灸治疗AD具有诸多的优势，且疗效明确[6-7]。本研究在构建AD大鼠模型的基础上，通过检测自噬相关蛋白Beclin-1和凋亡相关蛋白p53的表达变化，探讨电针治疗AD的作用机制。 1 实验材料 1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体质量（200±50）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验室符合国家动物实验设施屏障系统标准。 1.2 主要试剂与仪器 Aβ1-40，美国Sigma公司；Beclin-1兔抗大鼠多克隆抗体和HRP标记山羊抗兔二抗，美国cell signaling technology公司；p53山羊抗大鼠多克隆抗体，美
骨质疏松常见模型 1.概念：骨质疏松症是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降，导致 骨脆性增加，易发生骨折（骨折风险性增加）为特征的全身性骨骼疾病。 2.临床表现：腰背部疼痛，体长缩短，驼背及发生骨折。 3.按严重程度分：骨质疏松的发生程度包括低骨量、骨质疏松症和骨质疏松性 骨折。依次程度增加。 4.现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原 发性骨质疏松症（primary osteoporosis，POP），因年龄所致的体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，POMP）和Ⅰ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症，由疾病或药物因素诱发，疾病如内分泌代谢病（糖尿病、甲状腺功能亢进症）、肾脏疾病、肝脏疾病等，药物诱发如长期大剂量的肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素的应用。而特发性骨质疏松症，一般伴有遗传疾病史，女性多见，妇女哺乳期和妊娠期的骨质疏松症往往也列为此类 现代医学的研究 1.发病机制：主要机制是因为衰老、体内性激素减少、药物和某些疾病等因素 导致骨吸收和骨形成平衡失调，骨矿物质和有机质等比例丢失，导致骨量减少和骨质疏松，进而引发骨折，为全身性代谢性骨病。总的来说，是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响的结果。 2.诊断与治疗：①诊断：依靠临床表现、骨量的测定、骨密度（bone mineral density， BMD）及骨转化生化指标等，其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效的最佳定量指标。临床上测量BMD的方法有双能X线吸收测定法（DXA）、外周双能X线吸收测定法（pDXA）、定量计算机断层照相术（QCT）及定量骨超声（QUS）等，其中DXA测量值是目前国际学术界公认的临床骨质疏松症诊断的“金标准”。②治疗：除了加强锻炼、改变不良生活习惯等，主要还是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞和成骨细胞的功能，防止骨丢失，增加骨量。1.骨吸收抑制剂，常见的有二膦酸盐、雌激素类药物和降钙素等。 此类药物对已经丢失骨量的恢复的作用不明显，雌激素类药物有诱发子宫内膜癌的危险。2.骨形成促进剂，常见的有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素D3等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟，促进骨基质分泌和矿化，增加骨量。目前公认的骨形成促进剂是甲状旁腺激素。3.骨矿化促进剂，钙剂和维生素D等，这类药物科促进骨基质矿化，减少矿物质流失。单独使用钙剂是没
骨质疏松动物模型研究进展 骨质疏松症（osteoporosis，OP）是老年人群的多发疾病，预防和治疗骨质疏松无疑成了当下医疗卫生组织函待解决的问题之一。近年来，随着对骨质疏松症的研究，其动物模型自然成为至关重要的基础，为进一步加深对骨质疏松症的认识，本文就国内外近几年对骨质疏松症的动物模型做一综述。 标签：骨质疏松；动物模型；综述 骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织微结构异常为特征，致使骨骼脆性增加、极易发生骨折的一种全身性代谢性骨骼系统疾病[1]。其所引发的骨折一方面给患病家庭带来严重的经济负担，另一方面也给患者带来了疼痛、不便，甚至带来了一定的致残率和致死率[2]。所以，当下探索骨质疏松动物模型为研究骨质疏松发病机制及其预防和治疗这一使命至关重要。 1 手术法 1.1去势法去势法通常指采取手术的方法摘除雌性动物双侧卵巢或者摘除雄性动物双侧睾丸，一段时间后构建OP模型。其中，摘除雌性动物双侧卵巢通常用于模拟女性绝经所导致的OP，是绝经后OP模型的“金标准”。杜一飞等[3]，通过摘除雌性大鼠双侧卵巢3个月后，结果显示0VX组大鼠血清中碱性磷酸酶水平明显增高，且取大鼠股骨进行X线观察得到大鼠股骨骨密度下降，骨小梁形成减少。任小娟和夏拉夫[4]在研究骨松汤时，同样以摘除雌性小鼠双侧卵巢为方法构建OP模型，12 w后模型组组小鼠骨密度与其他组比较，骨密度明显降低。众所周知，骨吸收大于骨形成是导致OP的一大因素，伍楊等[5]在研究中药王不留行对去势大鼠影响时，去势一段时间后，取大鼠血清进行检测，发现模型组大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α含量明显升高，而这些指标恰好是强有力的骨吸收诱导剂。由此可知，无论从动物骨形态学或是骨生化指标均可知去势法是OP动物模型的可行性方法。 1.2甲状旁腺切除法甲状旁腺切除可直接导致甲状旁腺激素的分泌不足，而PTH可以抑制成骨细胞的凋亡和促进成骨细胞的分化，无疑表明切除甲状旁腺必定导致骨吸收与骨形成不平衡，从而导致OP的发生。且有研究表明小剂量PTH 对OP动物可以增加骨量，提高骨强度，减少骨折的风险[6]。但造模方法在手术过程中，操作需谨慎，因稍不注意易损伤返喉神经，对实验造成不必要的影响，故目前一般不采用该种方法。 1.3下丘脑-垂体切断法下丘脑-垂体是人类重要的内分泌部位，其功能的正常与否直接影响着人类甲状腺、肾上腺和性腺的分泌功能。有研究表明，垂体疾病是继发性OP的重要原因之一。下丘脑垂体功能的缺乏或丧失，可直接导致人体生长激素缺乏症，从而进一步导致患者骨密度降低，最终导致患者OP[7]。Pogoda[8]等第一次在绵羊身上进行了下丘脑垂体断开手术，证实该模型比较适合于研究牙骨质疏松。
科研实践论文 骨质疏松症动物模型构建的研究进展 系（院）：生物科学与工程学院 专业年级：食品质量与安全专业1102班 学生姓名：王晓乐 学号：1112034033 指导老师：郑红星 完成时间：2013年5月21日
骨质疏松症动物模型构建的研究进展 作者：王晓乐 所在单位：（陕理工生物科学与工程学院食品质量与安全专业1102班，陕西汉中723000）指导老师：郑红星 [摘要] 近年常用于骨质疏松的模型动物有大鼠、小鼠、兔、犬、羊、猪等。以大鼠最为常用。用于制模的方法有年龄相关的骨丢失，去势模型,药物类模型，废用性骨质疏松模型，营养类模型等。其中以去势模型，特别是去卵巢动物模型最常用。骨质疏松动物模型的建立有手术切除卵巢、药物诱导、饮食限制和制动术等几种方法。也有将卵巢切除与其他方法结合应用以加快失骨的报道。 [关键字] 骨质疏松；动物模型；研究进展 引言骨质疏松症是可能由于多种原因导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性骨病。用于骨质疏松症模型动物模型首先应该考虑的是模型应与人类骨质疏松的临床症状及组织行为相似，但某些动物模型在各个方面完全与人类骨质疏松症的临床表现一致是很困难的，因此动物模型侧重与表现其某一阶段、某些症状或一些病理生理变化，作为观察特定阶段和指征的病理模型。美国骨质疏松药物研究指南（美国－FDA）认为目前没有一种动物模型能模拟人类骨质疏松的所有特征。已有报道用小鼠，大鼠、兔、羊、猴等复制骨质疏松模型。 1实验动物 1.1 大鼠 啮齿类动物如大鼠是迄今为止在OP研究中使用最广泛的实验动物，并且美国食品与药品管理局（FDA）也要求治疗OP的药物实验研究采用去卵巢大鼠和另一种非啮齿类动物模型（如狗、猪、羊、灵长目）进行实验。大鼠用于OP研究的优点是：（1）分布广，繁殖快，花费低，体积小，易于饲养和管理。（2）有明显的生长期和成年期，容易观察年龄对骨组织的影响。（3）骨骼系统解剖与人类有众多相似之处。（4）成年大鼠多个部位的松质骨骨量可在一段较长时期内保持稳定，这是研究松质骨重建的合适条件。（5）与人类相似的松质骨分
7 摘要：目的探讨链脲佐菌素（STZ ）建成可靠、稳定的1型大鼠糖尿病模型情况。方法选取 SDF 级雄性Wistar 大鼠70只，分成3个实验组，各20只和对照组10只，实验组大鼠一次性腹腔注射STZ 30、65、100mg /kg ，对照组10只大鼠腹腔注射枸橼酸缓冲液，用拜安易血糖仪检测血糖，7d 后血糖＞16．65mmol /L 判定为1型糖尿病动物模型。观察大鼠的血糖、体质量、饮水量、胰岛素和C 肽等指标。结果大鼠注射STZ 65mg /kg 7d 后，大部分血糖值达到成模标准，并出现糖尿病表现，持续观察7周，有18只大鼠成模，未见糖尿病转复，糖尿病症状明显。结论腹腔一次性注射STZ 65mg /kg 剂量可成功制备1型糖尿病大鼠模型。 关键词：链尿佐菌素；1型糖尿病模型；大鼠 Establishment and Observation of Type I Diabetic Rat Models ZHANG Ju-biao 1， SU Xiu-lan 2，OUY-ANG Xiao-hui 1 ．（1．Department of Tumor Surger ， Inner Mongolia Autonomous Region People's Hospital ，Hohhot 010010，China ；2．Central Lab of Inner Mongolia Medical University ，Hohhot 010010，China ） Abstract ：Objective To establish type I diabetic rat models by intraperitoneal injection of streptozoto-cin and observe the stability of diabetic changes in rats．Methods 70male Wistar rats were divided into 3experiment groups of 20rats each and 1control group of 10rats．The experiment groups were intraperitoneally injected by 30mg /kg ，65mg /kg ，and 100mg /kg STZ respectively ，while the control group was injected cit-rate buffer．Bayer blood glucose meter was adopted to test the blood glucose ，setting ＞16．65mmol /L after 7d as the type 1diabetic animal model．The fasting blood glucose level ，body weight ，water intake ，insulin and C-peptide of the rats at different time points were observed /measured．Results In the group of injection by 65mg /kg STZ ，after 7days most rats reached the model blood glucose standard and had diabetic manifes-tation ，after continuous observation of 7weeks ，18rats were qualified as the model with obvious symptoms and without conversion．Conclusion With the dose of 65mg /kg of STZ through one intraperitoneal injection ，type 1diabetic rat models can successfully established． Key words ：Streptozotocin ；Type 1diabetic models ；Rat 糖尿病已成为严重威胁人类身体健康和生命的 疾病。它是一种以持续性高血糖为特征的内分泌障碍疾病，可导致全身性代谢紊乱并继发眼、肾、神经和心血管等器官的慢性进行性病变，最终引起功能损伤及衰竭。1型糖尿病及其并发症的病因、发病机制尚未完全阐明，预防和治疗仍不完善，干细胞（stem cells ）是体内存在的一类特殊细胞，有自我更新和不断增生的能力，又具有多向分化的潜能，只要掌握了胰腺干细胞的特异标志、转化调控机制、培养及分离技术，就可以体外操纵干细胞，进行大量扩增和定向诱导分化，最后将得到能分泌胰岛素的胰岛 样细胞［1-2］，用于治疗1型糖尿病。因此，建立较理 想的动物模型研究该病的发病机制和治疗具有重要意义。目前，国内外普遍使用STZ 制备糖尿病大鼠 动物模型。该项实验根据吴清洪报道的方法［3］ ，采用简单的腹腔一次注射的方法制备稳定并且可靠的动物模型。1材料与方法 1．1实验动物的选择和喂养SDF 级成熟Wistar 雄性大鼠70只（体质量220 280g ），购自内蒙古大学实验动物中心，饲养室内氨浓 度＜20g /L ， 相对湿度40% 70%，室温18 25℃，保证良好的通风，避免增加造模后大鼠的感染概率，普通饲料喂养，饮水自由。 1．2主要仪器和试剂拜安易血糖检测仪及试纸（美国Bayer 公司）；STZ （美国Sigma 公司）；胰岛素、C 肽放射免疫分析药盒（均购自内蒙古泽生耗材）。 1．3主要实验试剂的配制STZ 液称取STZ 粉剂0．2g ，溶于pH 4．5，浓度为0．1mmol/L 的枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液20mL 中，制成1%溶 液，经0．22μm 滤器过滤除菌，要求5min 内配制完成，配好后，10min 内用完，STZ 和枸橼酸缓冲溶液低温保存，新鲜配制。 1．4实验分组和大鼠糖尿病模型的制备采取国内外普遍使用的STZ 制备糖尿病大鼠模型，根据徐 华等［4］ 报道， 雄性大鼠易于成模，且成模后血糖稳定性好，故选取成熟雄性大鼠用于实验。将所有大鼠（70只）使用代谢笼单只喂养，适应性喂养1周， 1周内注意观察大鼠的饮食情况、体质量等健康状况， 1周后，选取空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠为实验对象。将空腹血糖介于2．92 6．92mmol /L 的大鼠随机分为4组，实验组（60只）分别接受STZ 液一次性腹腔注射，剂量为30、65、100mg /kg ，对照组（10只）注射枸橼酸三钠-枸橼酸缓冲液。实验前 大鼠禁食、水12h 。分别于注射后3、 7、14、28d 采用剪尾法采集血样，用拜安易血糖仪检测空腹血糖，7d 后空腹血糖＞16．65mmol /L ，出现多饮、多食、多尿 · 533·医学综述2013年1月第19卷第2期Medical Recapitulate ， Jan．2013，Vol．19，No．2
骨质疏松常见模型 1.概念:骨质疏松症就是一种以骨量降低、骨微细结构破坏、骨强度下降,导致骨 脆性增加,易发生骨折(骨折风险性增加)为特征得全身性骨骼疾病、 2.临床表现:腰背部疼痛,体长缩短,驼背及发生骨折。 3.按严重程度分:骨质疏松得发生程度包括低骨量、骨质疏松症与骨质疏松性骨 折。依次程度增加。 4.现代医学将骨质疏松症分为原发性、继发性、特发性骨质疏松症三大类。原 发性骨质疏松症(ｐｒimaｒy ｏstｅoporｏｓis,PＯP),因年龄所致得体内性激素突然减少及生理性退行性改变所致。分为Ⅰ型绝经后骨质疏松症(ｐoｓtｍenopausaｌｏｓteoporosiｓ,POMP)与Ⅱ型老年性骨质疏松症。继发性骨质疏松症,由疾病或药物因素诱发,疾病如内分泌代谢病(糖尿病、甲状腺功能亢进症)、肾脏疾病、肝脏疾病等,药物诱发如长期大剂量得肝素、免疫抑制剂、抗癫痫病药、糖皮质激素得应用。而特发性骨质疏松症,一般伴有遗传疾病史,女性多见,妇女哺乳期与妊娠期得骨质疏松症往往也列为此类 现代医学得研究 1.发病机制:主要机制就是因为衰老、体内性激素减少、药物与某些疾病等因素 导致骨吸收与骨形成平衡失调,骨矿物质与有机质等比例丢失,导致骨量减少与骨质疏松,进而引发骨折,为全身性代谢性骨病。总得来说,就是由遗传、激素、营养、失用、年龄、生活习惯及免疫学等方面多种因素交互影响得结果。 2.诊断与治疗:①诊断:依靠临床表现、骨量得测定、骨密度(boｎe mineｒａｌ deｎsity,BMD)及骨转化生化指标等,其中以骨量测定最为重要。临床上采用采用BMD测量作为诊断、与测量骨质疏松症骨折风险、监测自然病程以及评价药物干预疗效得最佳定量指标。临床上测量BMＤ得方法有双能Ｘ线吸收测定法(DXA)、外周双能X线吸收测定法(pDXA)、定量计算机断层照相术(QCT)及定量骨超声(QUS)等,其中DＸA测量值就是目前国际学术界公认得临床骨质疏松症诊断得“金标准”。②治疗:除了加强锻炼、改变不良生活习惯等,主要还就是要依靠药物治疗。药物干预破骨细胞与成骨细胞得功能,防止骨丢失,增加骨量。１。骨吸收抑制剂,常见得有二膦酸盐、雌激素类药物与降钙素等。此类药物对已经丢失骨量得恢复得作用不明显,雌激素类药物有诱发子宫内膜癌得危险、2、骨形成促进剂,常见得有氟化物、甲状旁腺激素、活性维生素Ｄ3等。这些药物可刺激成骨细胞分化成熟,促进骨基质分泌与矿化,增加骨量、目前公认得骨形成促进剂就是甲状旁腺激素。3。骨矿化促进剂,钙剂与维生素Ｄ等,这类药物科促进骨基质矿化,减少矿物质流失、单独使用钙剂就是没有治疗骨质疏松症得作用,必须配合骨形成促进剂或骨吸抑制剂、
2型糖尿病大鼠模型的建立及其验证论著 燕娟1 郭巍伟1 梁执群1 李志国1 郭永昌2 (山西医科大学1人文社会科学学院;2实验动物中心 山西 太原 030001) 【摘要】 目的 制备一种发病过程类似人类2型糖尿病的动物模型。方法 雄性S D成年大鼠高糖高脂饲料喂养 1个月,诱发出胰岛素抵抗,给予小剂量链脲佐菌素(STZ)25mg/kg,腹腔注射,建立2型糖尿病大鼠模型。结果 试验 组大鼠血糖升高,对胰岛素敏感性下降,从生化指标和形态学方面证实造模成功。结论 本实验2型糖尿病大鼠模型 造模成功,它具有中度高血糖、胰岛素抵抗、成功率高等特点,是人类2型糖尿病及其药物研究的理想动物模型。 【关键词】 糖尿病 动物模型 大鼠 Type2d i a betes ra t m odel and its ver i f i ca ti on.YAN Juan,G UO W ei-w ei,L I ANG Zhi-qun,et al.ShanxiM edical U niversity,College O f Hu2 m anities A nd Social Science,Taiyuan Shanxi030001,China. 【Abstract】 O bjecti ve Preparati on of a disease si m ilar t o human type2diabetes ani m al model.M ethods Male S D adult rats fed high- fat high-sugar a month,induced insulin resistance,given l ow-dose strep t ozot ocin(STZ,25mg/kg,intraperit oneal injecti on),set up in type2 diabetic rat model.Results Test gr oup of rats increased bl ood glucose,insulin sensitivity decreased,fr om the bi oche m ical indices and mor phol ogy confir med the successful model.Conclusi on The experi m ental rat model of type2diabetes model successfully,it has moderately high bl ood sug2 ar,insulin resistance,the success rate is high,are of human type2diabetes and its drug research ideal ani m al model. 【Key words】 D iabetes;Ani m al model;Rat 糖尿病与心脑血管疾病、肿瘤是当前威胁人类健康的三大非传染性疾病,已成为全球性的卫生问题。随着我国人民生活水平的提高、人口老化、生活方式的改变以及诊断技术的进步,糖尿病的发病率呈现迅速上升趋势,2型糖尿病是糖尿病人群的主体,占糖尿病发病率的90%以上。因此,研制2型糖尿病动物模型具有重要的医学研究意义。在国外2型糖尿病的研究中,采用的动物模型多为遗传相关模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠及肥胖型Zucker大鼠等,其特点是遗传因素在发病过程中占主导作用,不完全与临床相符,且十分昂贵,不利于国内研究的开展[1]。本研究结合前人经验,应用高糖高脂饲料结合小剂量链脲佐菌素(STZ)建立了2型糖尿病大鼠模型,较符合人类普通型2型糖尿病发病机制,有利于进行2型糖尿病及其并发症的相关研究[2,3]。1 材料和方法 1.1 动物和材料 清洁级雄性S D大鼠40只,体质量(180±20)g,由山西医科大学实验动物中心提供,每笼4～5只,饲以普通饲料,自由摄食摄水,除实验应激外无其他不良刺激。STZ由美国Sig m a公司生产。胰岛素、胰高血糖素放射免疫分析药盒为解放军总医院科技开发中心放免所产品,购自北京普尔伟业生物科技有限公司。 1.2 2型糖尿病大鼠模型的建立 在大鼠适应期后,随机取10只作为正常对照组,其余30只给予高糖高脂饲料(在标准全价混合饲料的基础上添加蔗糖、炼猪油和蛋黄,热能含量21.6kJ/kg)。高糖高脂饲料组喂养4周后,腹腔注射STZ(临用前溶解在pH=4.0的0.1mmol/L柠檬酸缓冲液内,25mg/kg,1次/d,连续2d),正常对照组普通饲料喂养4周,再注射等量柠檬酸缓冲液,1次/d,连续2d。注射药物两天后间隔1d血糖测试仪测查大鼠空腹血糖(测试前禁食12h)即注射后血糖,以血糖含量16.7mmol/L为2型糖尿病大鼠模型判定标准,随机选取10只糖尿病大鼠为模型组。继续普通饲料喂养4周。 1.3 指标测定 1.3.1 一般状况观察 包括大鼠的精神状态、体质量、饮水量、食量、大小便。 1.3.2 血糖测定 腹腔注射STZ或柠檬酸缓冲液2 d后及实验结束时分别进行空腹状态下剪尾取血,测其血糖值,为注射后血糖。4周后处死大鼠测其血糖为终血糖。 1.3.3 血清胰岛素、胰高血糖素水平测定 实验结束时禁食12h,20%的乌拉坦腹腔麻醉大鼠,腹主动脉取血,分离血清后放射免疫分析法测定。 1.3.4 胰岛素敏感指数(I SI)的计算 参照李光伟等[4,5]的方法,I SI=ln[1/F BG×F I N S],F BG为空腹血糖,F I N S为空腹胰岛素。 1.4 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理,数据以均数±标准差( x±s)的形式表示,用t检验分析。 2 结果 2.1 两组大鼠一般状况 对照组大鼠生长良好,体质量持续增加,无其他症状。模型组大鼠在注射STZ后体质量呈缓慢增长、逐步较前下降、消瘦走势,观察发现有 ? 5 ? 临床和实验医学杂志 2009年4月 第8卷 第4期