湿热灭菌
湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比(表2-1)；②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物：③蒸汽存在潜热．当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，酵母菌和真菌的胞子要耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。
表2-1蛋白质含水量与其凝固温度的关系
蛋白质含水量/% 蛋白质凝固点/℃
50 56
25 74-80
18 80-90
6 145
(一)常压蒸汽灭菌
(1)常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100℃，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全灭菌。
1)巴氏消毒法是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌(如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌)，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85℃下处理15-30min。具体的方
法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体--伯氏考克斯氏体(一种立克次氏体)。
2)间歇灭菌法又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30-60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20-30℃下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌(12l℃)后会发生熔化，而在100℃的温度下则呈结晶状。
3)蒸汽持续灭菌法微生物制品的土法生产或食用菌菌种制备时常用这种方法。在容量较大的蒸锅中进行。从蒸汽大量产生开始，继续加大火力保持充足蒸汽，待锅内温度达到100℃时，持续加热3-6h，杀死绝大部分芽胞和全部营养体，达到灭菌目的。
以上三种方法通常是在无高压蒸汽灭菌条件的地方(如农村)使用。
(2)灭菌过程中应注意
1)使用间歇法或持续法灭菌时必须在灭菌物里外都达到100℃后开始计算灭菌时间，此时锅顶上应有大量蒸汽冒出。
2)为利于蒸汽穿透灭菌物，锅内或蒸笼上堆放物品不宜过满过挤，应留有空隙。固体曲料大量灭菌时，每袋以1.5-2.0kg为宜，料袋在锅内用蓖子分层隔开，不能堆压在一起。
3)火大水足才能保证蒸汽足，蒸锅里应先把水加足。一次持续灭菌时，如锅内盛水量不能维持到底．应在蒸锅侧面安装加水口，以便在蒸煮过程中添水。添水应用开水，以防骤然降温。
4)间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速降温，然后在室温放置24h，再第二次加热。如果降温慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反面导致灭菌物变质，特别是固体曲料包装过大时，靠近中心部分更易发生这种情况。
5)从使用效果看，分装试管、三角瓶或其他容器的培养基，因其体积小，透热快以用间歇法为佳。固体曲料，因其包装较大，透热慢，用间歇法容易滋生杂菌变质或者水分蒸发过多，曲料变得不新鲜，影响培养效果，因此使用一次持续灭菌法较好。
(二)高压蒸汽灭菌
高压蒸汽灭菌法是微生物学研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌方法。
(1)灭菌原理
高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸汽灭菌器(锅)中进行的。其原理是：将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随之上升到100℃以上。为达到良好的灭菌效果，一般要求温度应达到121℃(压力为0.1MPa)，时间维持15-30min。也可采用在较低的温度(115℃，即0.075MPa)下维持35min的方法。此法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器材、物品的灭菌。蒸汽压力与温度的关系如表2-2所示。
在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压；所以当水蒸汽中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和部分空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力．它所相当的温度与高压灭菌周内的温度是不一致的。这是因为在同一压力下的实际温度，含空气的蒸汽低于饱和蒸汽。见表2-3所示。
表2-2蒸汽压力与温度的关系
由上表看出：如不将灭菌锅中的空气排除干净，即达不到灭菌所需的实际温度。因此，必须将灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全灭菌的目的。
在空气完全排除的情况下，一般培养基只需在0.1MPa下灭菌30min即可。但对某些物体较大或蒸汽不易穿透的灭菌物品，如固体曲料、土壤和草炭等，则应适当延长灭菌时间，或将蒸汽压力升到0.15MPa 保持1-2h。
(2)灭菌设备
高压蒸汽灭菌的主要设备是高压蒸汽灭菌锅，有立式、卧式(图2-5)及手提式(图2-6)等不同类型。实验室中以手提式最为常用。卧式灭菌锅常用于大批量物品的灭菌。不同类型的灭菌锅，虽大小外形各异。但其主要结构基本相同。
表2-3空气排除程度与温度的关系
压力表读数
/Pa
灭菌器内温度/℃
未排除空气排除1/3空气排除1/2空气排除2/3空气完全排除空气
35 72 90 94 100 109
70 90 100 105 109 115
105 100 109 112 115 121
140 109 115 118 121 126
175 115 121 124 126 130
210 121 126 128 130 135
高压蒸汽灭菌器的基本构造如下：
1)外锅或称“套层”，供贮存蒸汽用，连有用电加热的蒸汽发生器，并有水位玻管以标志盛水量。外锅的外侧一般包有石棉或玻璃棉绝缘层以防止散热。如直接使用由锅炉接入的高压蒸汽，则外锅在使用时充满蒸汽，作为内锅保温之内锅或称灭菌室，是放置灭菌物的空间．可配制铁蓖架以分放灭菌物
3)压力表内外锅各装一只，老式的压力表上标明三种单位：公斤压力单位(kg/cm2)，英制压力单位(1b/in2)和温度单位(℃)，便于灭菌时参照。现在的压力表用MPa表示。
4)温度计可分为两种，一种是直接插入式的水银温度计，装在密闭的铜管内，焊插在内锅中．另一种是感应式仪表温度计，其感应部分安装在内锅的排气管内，仪表安装于锅外顶部．便于观察。
5)排气阀一般外锅、内锅各一个，用于排除空气。新型的灭菌器多在排气阀外装有汽液分离器(或称疏水阀)．内有由膨胀盒控制的活塞。利用空气、冷凝水与蒸汽之间的温差控制开关，在灭菌过程中，可不断地自动排出空气和冷凝水。
6)安全阀或称保险阀．利用可调弹簧控制活塞，超过额定压力即自动放气减压。通常调在额定压力之下，略高于使用压力。安全阀只供超压时安全报警之用，不可在保温时用作自动减压装置。
7)热源除直接引入锅炉蒸汽灭菌外，都具有加热装置。近年来的产品以电热为主，即底部装有调控电热管，使用比较方便。有些产品无电热装置，则附有打气煤油炉等。手提式灭菌器也可用煤炭炉作为热源。
(3)几种常用高压蒸汽灭菌锅的使用方法
1)立式灭菌锅使用要点：
①加水由漏斗处加水，加水量应在标定水位线以上，可在水位玻管刻度处观察。
⑦装锅将待灭菌物品装入锅内时，不要太紧太满，应留有间隙，以利蒸汽流通。盖好锅盖后。即可将螺旋柄旋紧。
③加热和排冷空气如果是电热高压蒸汽灭菌锅，则合上电闸通电加热。如届非电热装置，可点燃煤气炉或煤油喷灯加温。同时打开排气阀及下部排冷气余水阀，继续加热到锅中水沸腾，待排气阀冒出大量蒸汽后，关闭盖顶排气活塞，使冷空气由下部疏水阀排出。此时如有少量冷凝水排出是正常现象。待下部疏水阀有大量蒸汽冒出时，证明锅中已充满蒸汽，应继续排汽，使锅中及灭菌容器中的冷空气完全排除干净。一般不应少于5min。
④升压保压排气完毕后．关小下部疏水阀，锅内压力即逐渐升高，注意升压不要过猛。当压力升高到0.lMPa时，调节火力，使压力保持稳定。压力选择应视具体灭菌物品而定，如草炭、土壤等则可在压力升至0.14MPa-0.15MPa后定时保压。
⑤降压与排汽保压时间(一般为30min)结束后，即应停止加热，使其自然冷却。此时切勿急于打开排气塞，因为压力骤然降低，将导致培养基剧烈沸腾而冲掉或污染棉塞。待压力降至0.025MPa以下可打开排气阀使余汽排出，同时打开下部疏水阀，排出锅内冷凝水。
⑧出锅排气完毕后，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。先将锅盖打开5-10cm，不必完全推开锅盖，目的是借锅中余热将棉塞及包装纸烘干。烘烤30min后，即可推开锅盖，取出已灭菌的物品。
2)卧式灭菌锅使用要点：
①加水先将排水阀关闭，调整总阀至“全排”。然后，开启进水阀，放蒸馏水至蒸汽发生器内，待水进至距水表顶端大约1-2cm处时，关闭进水阀，并将总阀调至“关闭”。
⑦装锅将待灭菌物品装入锅内，注意不要塞得过紧过满，盛有培养基的三角瓶和试管应立放或适度倾斜．以免灭菌过程中培养基污染棉塞。
②关门按顺时针方向转动紧锁手柄至红箭头处，使撑挡进入门圈内。然后旋动八角转盘，使门和垫圈密合，以灭菌时不漏气为度，不宜太紧，以免损坏垫圈。
④通电加温待电源控制开关的旋钮旋至“开”处，电源指示灯亮，表示已通电，然后再按灭菌物品所需灭菌汽压将旋切旋至0.07MPa、0.1mPa或0.14MPs处。此时电热指示灯亮，表示已通电加热。
⑤保温保压当蒸汽套层内的蒸汽随加热达到自动控制压力时，电热指示灯会白动熄灭，表示停止加热。随着热力散发压力降低，电热指示灯再亮，表示继续加热，这表明压力控制器工作正常。当套层内的蒸汽加热到所选择的控制压力时，即可将套层内的蒸汽导入消毒室进行灭菌。此时应先将汽液分离器前的冷凝阀开放少许，然后将总阀调至“消毒”，套层内的蒸汽即通过总阀进入消毒室进行消毒，冷凝水则通过汽液分离器自动排出。这时蒸汽套层内蒸汽压力迅速下降，而消毒室内的蒸汽压力逐渐上升，消毒室内的温度表也随着物品被蒸汽加热而上升。当表卜温度升到所需消毒温度(一般为121℃)时，开始计算灭菌时间，维持温度至灭菌完毕。
⑧出锅灭菌完毕后，立即切断电源，按灭菌物品性质和要求，决定消毒室内的蒸汽是自然冷却还是采取“慢排”或“快排”，例如，器械、器皿、固体曲料、土壤、草炭等不致因压力骤然下降而受影响的物品，可直接将总阀调至“慢排”和“快排”，使消毒室内蒸汽迅速排出。当消毒室内压力下降至“0”时，方可缓慢转动锅门转盘并拨动紧锁手柄将门开启5-10 cm。20一30min后将灭菌物品取出，此时灭菌物品即较干燥。溶液及培养基等物品灭菌完毕时，只能将总阀调至“慢排”，使消毒室内蒸汽慢慢排出，以免突然降低压力导致培养基剧烈沸腾。也可在灭菌完毕后，关闭总阀，让灭菌物品自然冷却。消毒宝压力表降至“0”时、再将总阀调至“慢排”数分钟取出灭菌物品。
⑦连续操作如灭菌物品较多需连续操作时，应先检查水位。有足够水量时，可连续使用。如需加水、应把总阀调至“全排”，打开进水阀加水后继续操作。⑧保养每次灭菌完毕后，关闭电源，停止加热，随后将总阀调至“全排”，排出套层内的蒸汽。开启铂门少许，散发剩余蒸汽，使消毒室内壁经常保持干燥，同时排除蒸汽发生器内的余水。
3)手提式灭菌锅使用要点：
①加水使用前在锅内加入适量的水，加水不可过少，以防将灭菌锅烧干，引起炸裂事故。加水过多有可能引起灭菌物积水。
②装锅将灭菌物品放在灭菌捅中，不要装得过满。盖好锅盖，按对称方法旋紧四周固定螺旋，打开排气阀。
③加热排汽加热后待锅内沸腾并有大量蒸汽自排气阀冒出时．维持2-3min以排除冷空气。如灭菌物品较大或不易透气，应适当延长排气时间，务必使空气充分排除，然后将排气阀关闭。
④保温保压当压力升至0.1MPa时，温度达12l℃，此时应控制热源。保持压力，维持30min后，切断热源。
⑤出锅当压力表降至“0”处，稍停，使温度继续降至100℃以下后，打开排气阀，旋开固定螺旋．开盖，取出灭菌物。注意：切勿在锅内压力尚在“0”点以上，温度也在100℃以上时开启排气阀，否则会因压力骤然降低，而造成培养基剧烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。
⑥保养灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及内胆干燥，盖好锅盖。
培养基的湿热灭菌原理 由于培养基灭菌大多数用湿热灭菌，在这里我主要介绍湿热灭菌。衡量热灭菌的指标很多，最常用的是“热死时间”，即在限定的温度下杀死原有微生物中一定比例所需的持续时间。影响热灭菌的温度和时间的因素很多，包括：微生物种类、性质、浓度和培养基的性质、浓度等。 （一）热灭菌的原理 1、微生物的热阻 在这里先讲几个概念： ①致死温度：杀死微生物的极限温度。 ②致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。 ③微生物的热阻：表示微生物对热的抵抗能力，即指微生物在某一特定条件下（主要是温度）的致死时间。其对热的抵抗能力越大，可以理解为热阻越大，衡量不同的微生物对热的抵抗能力的大小，可以使用相对热阻的概念。 ④相对热阻：某一微生物在某一特定条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。例如：芽孢/大肠杆菌=3000000/1；病毒/大肠杆菌=1—5/1等。 2、对数残存定律 微生物的湿热灭菌过程，其本质上就是微生物细胞内蛋白质的变性的过程。因此，可以把灭菌过程看成是蛋白质的变性的过程，从这个意义上讲，灭菌过程应遵循单分子反应的速度理论，那么，则有下列方程： -dN/dt = k * N 式中，N—残存的活菌数；t—灭菌时间（s）；K—灭菌速度常数（s-1），也称反应速度常数或比死亡速度常数，此常数的大小与微生物的种类与加热温度有关；dN/dt—活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。该方程称为对数残存定律，表示微生物的死亡速率与任一瞬时残存的活菌数成正比。 3、理论灭菌时间的计算 将上式积分，转换得： t=1/k×lnN 0/N t =2.303/K×lgN /N t 式中：N —开始灭菌（t=0）时原有活菌数； Nt----经时间t后残存活菌数。 k：意义同上；t ：表示理论灭菌时间 k=（2.303/t）logN t /N ；比死亡速率常数K，K值大，表明微生物容易死亡。 理论灭菌时间的计算需要注意以下几个问题： （1）K值因不同的微生物种类不同、不同的生理状态、不同的外界环境，差别很大，实质上，它是微生物热阻的一种表示形式，微生物的热阻越大，K值也越小。可以取耐热性芽孢杆菌的K进行计算。 (2)在计算过程中，N 0，N t 如何取值？ N 为灭菌开始时培养基中活微生物数，可以参考一般培养基中的活微生物数为（1-2）×107个/ml； Nt 通常取 0.001个，既灭菌失败的概率为千分之一。
湿热灭菌法和干热灭菌法 湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法。湿热灭菌法可分为： 煮沸灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法、流通蒸汽灭菌法、和间歇蒸汽灭菌法。 影响湿热灭菌的主要因素有： 微生物的种类与数量、蒸汽的性质、药品性质和灭菌时间等。 （1）煮沸灭菌法： 将水煮沸至100摄氏度，保持5-10分钟可杀死细菌繁殖体，保持1-3小时可杀死芽胞。在水中加入百分之一至百分之二的碳酸氢钠时沸点可达105摄氏度，能增强杀菌作用，还可去污防锈。此法适用于食具、刀箭、载玻片及注射器等。 （2）xx消毒法： 一种低温消毒法，因巴斯德首创而得名。有两种具体方法，一是低温维持法：62摄氏度维持30分钟；二是高温瞬时法：75摄氏度作用15-30秒。该法适用于食品的消毒。 （3）流通蒸气灭菌法： 利用常压下的流通蒸汽进行灭菌。 （4）间歇蒸汽灭菌法 （5）高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3摄氏度，维持15-20分钟。 湿热灭菌法湿热法可在较低的温度下达到与干热法相同的灭菌效果，因为：
①湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性；②水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能；③蒸汽有潜热存在，每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。 湿热灭菌法一般采用121摄氏度，灭菌20-30min，如果是产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时，再灭菌一次，以用于杀死刚刚萌发的孢子。 干热灭菌法是指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。一般有火焰灭菌法和干热空气灭菌法。本法适用于干燥粉末、凡士林、油脂的灭菌，也适用于玻璃器皿(如试管、平皿、吸管、注射器)和金属器具(如测定效价的钢管、针头、摄子、剪刀等)的灭菌。干热空气灭菌法： 是指用高温干热空气灭菌的方法。该法适用于耐高温的玻璃和金属制品以及不允许湿热气体穿透的油脂（如油性软膏机制、注射用油等）和耐高温的粉末化学药品的灭菌，不适合橡胶、塑料及大部分药品的灭菌。在干热状态下，由于热穿透力较差，微生物的耐热性较强，必须长时间受高温的作用才能达到灭菌的目的。因此。干热空气灭菌法采用的温度一般比湿热灭菌法高。 为了保证灭菌效果，一般规定：135-140摄氏度灭菌3-5h；160-170摄氏度灭菌2-4h；180-200摄氏度灭菌0.5-1h。 干热灭菌法： 细菌的繁殖体在干燥状态下，80℃～100℃1小时可被杀死；芽胞需要加热至160℃～170℃2小时才杀灭。干热灭菌的方法有①焚烧： 用火焚烧是一种彻底的灭菌方法，破坏性大，仅适用于废弃物品或动物尸体等；②烧灼： 直接用火焰灭菌，适用于实验室的金属器械（镊、剪、接种环等）、玻璃试管口和瓶口等的灭菌；③干烤： 在干烤箱（hot air sterilizer）内进行，加热至160℃～170℃维持2小时，可杀灭包括芽胞在内的所有微生物。适用于耐高温的玻璃器皿、瓷器、玻质注射器等；④红外线（infrared）：
标题YXQ、EAK-1.2湿热灭菌柜操作、维护保养规程 编号版本页数共2页 起草人签名审 核 人 签名批 准 人 签名日期日期日期 起草部门颁发部门生效日期年月日发送部门份数 1.目的：规范安瓿检漏灭菌柜的操作管理，确保操作者能正确操作。 2.范围：适用于制药行业安瓿瓶装液体进行湿热灭菌。 3.责任者：操作者、车间设备员。 4.操作规程： 4.1 准备： 4.1.1气源：启动空气压缩机，使压缩空气储罐内充盈额定工作压力。 4.1.2汽源：打开蒸汽阀门，并排放管路路冷凝水及确认汽源压力正常。 4.1.3水源：打开进水阀，并确认其压力正常。 4.1.4电源：相继打开进线电源开关、控制电源开关。 4.2 开门： 4.2.1启动面板上人机界面（触摸屏）至工作状态显示嘉瑞商标，进 入程序界面，按“门操作”界面，显示前门操作状态，按“门真空”健，门圈抽真空系统启动，抽排门圈内密封用压缩空气。 4.2.3 约15秒钟以后，按一下进柜端开门键“开前门”，门圈抽真 空系统复位，前门电机旋转，前门向右移开。
4.3 装载：将灭菌物品装入灭菌车，利用搬运车移至柜门，送入灭菌腔。 4.4 关门：装载完毕，同样在“门操作”界面下，按“关前门”键，前门向左关闭。 4.5 密封：如果此时前后门均为关闭位，准备进行灭菌操作，即可将门圈密封。 4.6 自控运行：在界面选择画面中按下“自动界面”将转入“自动控制”,此时按下“启动”操作键，设备将按预设程序自动运行，画面将同时动态显示实时工况。 4.6.1 抽真空：抽一次真空，把柜内空气排出柜外。 4.6.2 升温：打开进汽阀，向柜内进蒸汽柜内温度逐渐升高。 4.6.3 灭菌：当温度、压力稳定在设定值，至设定灭菌时间。 4.6.4 排汽：打开排汽阀，表压为零。 4.6.5 真空检漏：抽真空，计时到真空系统停止。 4.6.6 清洗：打开进水阀喷淋清洗。 4.6.7 排放：打开排水阀。 4.6.8 程序结束：当内室压力为零，整个程序自动终了。 4.7 手控运行： 当有特殊的灭菌需求，或自控程序出现无法满足灭菌需要时，任何时刻均可经“界面选择”画面进入“手动界面”操作，利用手控操作键继续完成灭菌操作。
湿热灭菌柜验证实例 实例1： 湿热灭菌设备的温度验证 1温度验证程序设计基本要求 湿热灭菌的基本程序设计基本要求源于US.FDA在上世纪70年代中期提出的，且在80年代施行的：“关于大容量注射剂GMP技术性原则”五个方面要求： (1)在灭菌工序应能确保产品达到F0≥ 8； (2)灭菌前，待实验的容器中有最高带菌量，污染菌应具有最强的耐热性； (3)每一个灭菌釜的每种装载方式及每种规格容器的验证实验均至少使用10支热电偶进行热分布实验； (4)用待实验容器灌注粘度相类似的产品进行热穿透实验，找出容器中升温最慢点的位置，至少使用10个容器，每个均加入适当的生物指示剂并且插有热电偶。当灭菌釜的参数已经达到热分布实验已经证实的可重现状态，温度达到设定的灭菌温度时，开始测定F0 值，直到开始冷却止； (5)当产品达到灭菌温度直到开始冷却的过程，温度变化必须保持在±0.5℃以内。 2温度验证的功能测试步骤 由此技术设计要求出发，演化成为目前国内广泛采用的湿热温度验证的大容量注射剂实验方法和实验器具,也是温度验证程序设计的基本要求。使用其作功能测试步骤及参考设备如下： 前提：湿热灭菌设备的安装测试合格，现场和公用工程外接条件完备。即通常讲（DQ，IQ）已经结束后，位置在OQ运行确认。 2.1热分布测试 目的：找出最冷点位置，检验重现性。步骤：(1)设备仪器校正；(2)热电偶分布图；(3)空载热分布实验，3次以上；(4)热电偶插入图；(5)装载（模拟生产装载最大，最小量）热分布实验，各3次以上。 2.2热穿透测试 目的：肯定灭菌过程中被测试各点获得无菌保证值，特别是最冷点位置的F0值,监测检验重现性。步骤：(1)设备校正；(2)模拟生产灭菌装载；(3)热电偶装载图；(4)同品同规产品最大与最小装载热穿透实验，每状态3次以上。 2.3 生物指示剂测试 目的：挑战性模拟生产可能因素造成的微生物污染程度来检验灭菌可靠性，对验证设计进行检验。步骤：(1)方案的设计制定；(2)生物指示剂菌株的选择，测定D值；(3)标定浓度和制定样品；(4)接种，装载；(5)低限灭菌(每产品，每规格每种灭菌程序至少3次以上）；(6)样品的培养与鉴别；(7)评价结论（数据，样品分析）。 2.4 偏差与调整 重新设计后，重复上面步骤。 2.5 填写验证实验报告书
灭菌与湿热灭菌的基本概念 撰稿人：田耀华发布时间：2009年9月30日阅读次数：512 1几个专用名词的导入 (1)无菌：指物体或任何给定的介质中，没有任何活的微生物存在。 无菌操作：指在整个工艺操作过程中，利用和控制在一定条件下，尽量使产品避免微生物污染的一种操作方法，其所用一切器具原辅材料及环境应预先灭菌，操作必须在无菌操作室进行，操作人员必须按卫生要求程序进入。 (2)除菌：指用特殊滤材将微生物(死与活的)全部阻留而滤除（原已染有的微量可溶性代射物外），以防止热原产生。 (3)消毒：用物理或化学方法杀灭物体上或介质中的病原微生物。 (4热原：是微生物的代谢物，是细菌的一种内毒素，存在于细菌的细胞膜与固体膜之间。 (5)灭菌：应用物理或化学等方法把物体上或介质中所有微生物及芽胞全部杀灭，以获得无菌状态的总过程。灭菌大体可分3大类，即化学药物灭菌，生物药物灭菌和物理法灭菌。其中，物理灭菌法采用加热、光波、辐射、电磁场等物理方法杀有害微生物。物理方法的湿热灭菌更多适用于液体制剂，物理方法灭菌在药品及食品中应用最普遍，湿热灭菌，过滤除菌在可最终灭菌的大、小容量注射剂生产中应用最为广泛。 (6)杀灭时间(KT)：用于生物指示物抗力鉴定时，指受试示物样本，经杀菌因子作用后全部样本无菌生长最短作用时间（min）。 (7)衡量灭菌程度的几个参数：(1)D值（D），杀灭微生物量达90%所需的时间(min)，杀灭对数值，当微生物数量以对数表示时，指消毒前后微生物减少的对数值；(2)杀灭率（KR），在微生物杀灭试验中，用百分率表示微生物数量减少的值；(3)灭菌保证水平(SAL)，指灭菌处理后单位产品上存在活微生物的概率。 2热力灭菌的意义 在制药工业生产中，常用到消毒灭菌设备对有关物品进行消毒灭菌处理。对药品而言，在达到消毒灭菌效果可靠的同时，还要保证药品不受破坏，确保其药效的安全性、有效性和稳定性。就目前而言，在所有可利用的消毒灭菌方法中，热是一种应用最早、效果最可靠、使用最广泛的方法，它可以杀灭一切微生物，包括细菌繁殖体、真菌、原虫、藻类，因此热力灭菌在工业消毒灭菌上深受重视。 压力蒸汽法是所有湿热法、热力法、物理法及所有消毒灭菌方法中的首选方法，因此广泛使用的压力蒸汽消毒灭菌柜是湿热消毒灭菌的经典设备，虽然近年来有关湿热灭菌设备，为适应各种需要，开发了不少新型设备，但其均是在压力蒸汽消毒灭菌柜的基础上发展起来的。 3湿热与干热的根本区别 湿热法和干热法均是利用热力因子杀灭微生物的物理消毒灭菌方法。但它们的杀菌机理有所不同，湿热法主要是通过凝固微生物的蛋白质致其死亡，干热法则是通过脱水干燥使蛋白质氧化、变性、碳化和电解质浓缩中毒而使微生物死亡。它们的操作特点也各异，其根本
湿热灭菌 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效。湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好的原因是：①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强。水分子的存在有助于破坏维持蛋白质三维结构的氢键和其他相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比(表2-1)；②热蒸汽比热空气穿透力强，能更加有效地杀灭微生物：③蒸汽存在潜热．当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。 多数细菌和真菌的营养细胞在60℃左右处理15min后即可杀死，酵母菌和真菌的胞子要耐热些，要用80℃以上的温度处理才能杀死，而细菌的芽胞更耐热，一般要在120℃下处理15min才能杀死。湿热灭菌常用的方法有常压蒸汽灭菌和高压蒸汽灭菌。 表2-1蛋白质含水量与其凝固温度的关系 蛋白质含水量/% 蛋白质凝固点/℃ 50 56 25 74-80 18 80-90 6 145 (一)常压蒸汽灭菌 (1)常压蒸汽灭菌是湿热灭菌的方法之一，在不能密闭的容器里产生蒸汽进行灭菌。在不具备高压蒸汽灭菌的情况下，常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法。此外，不宜用高压蒸煮的物质如糖液、牛奶、明胶等，可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法所用的灭菌器有阿诺氏(Aruokd)灭菌器或特制的蒸锅，也可用普通的蒸笼。由于常压蒸汽的温度不超过100℃，压力为常压，大多数微生物的营养细胞能被杀死，但芽胞细菌却不能在短时间内死亡，因此必须采取间歇灭菌或持续灭菌的方法，以杀死芽胞细菌，达到完全灭菌。 1)巴氏消毒法是用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，其主要目的是杀死其中的无芽胞病原菌(如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌)，而又不影响其特有风味。巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各有不同，一般在60-85℃下处理15-30min。具体的方 法可分两类，第一类是较老式的，称为低温维持法，例如在63℃下保持30min可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在85℃下保持5min即可。但是巴氏消毒法不能杀灭引起Q热的病原体--伯氏考克斯氏体(一种立克次氏体)。 2)间歇灭菌法又称分段灭菌法。适用于不耐热培养基的灭菌。方法是：将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30-60min，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或20-30℃下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的含硫培养基就应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元素硫经常规的高压灭菌(12l℃)后会发生熔化，而在100℃的温度下则呈结晶状。
题库1： 《湿热灭菌程序的验证：灭菌程序的设计、开发、确认以及日常控制》2007年增补，第一卷N0.S-1美国注射剂协会制药科学及技术杂志 1．填空题： （1）在恒定的热力灭菌条件下，E微生物的死亡遵循D动力学规则（也叫存活曲线）。微生物死亡速率是微生物的B和C的函数，它与灭菌程序的 A 无关。 A微生物数量，B杀灭时间，C耐热参数D，D一级，E同一种 （2）．请选择对应划线并在括号内填写单位（5分）：P7 D T（），F值（），Z（），L（），SAL，F0值（），PUSU。 非无菌概率、无菌保证水平、灭菌率、耐热参数、累计杀灭时间、标准灭菌时间。 （3）．灭菌程序设计方法主要有哪两种？请填写以下英文的汉语。（P30）Overkill design approach —— Product specific design approach —— 按产品特性设计灭菌程序的方法。 过杀灭法 （4）温度系数（Z值）反映孢子耐热性随温度变化而变化的特性。Z值是D T值变更一个对数单位时，温度需调节的度数。P15 （5）杀灭时间是灭菌程序中灭菌率的累计值（积分值）。P16 （6）F0是指蒸汽灭菌程序赋予一个容器或产品121℃下标准灭菌时间（灭菌效力）。P19 （7）F BIO生物杀灭力表示生物指示剂系统测得的实际杀灭效果。P20 （8）生物指示剂（BIS）的选择，取决于所用的灭菌方法和所选择的灭菌程序。P20 （9）所选用的生物指示剂的孢子浓度应高于灭菌前药品的生物负荷，耐热性应
强于最耐热的污染菌孢子的耐热性。P20 （10）生物指示剂计数的稳定性和耐热参数（D T值）的测试应在其有效期内进行。P21 （11）能量传递的方式有传导、对流和辐射，他们可以单独或同时发生。P28 （12）蒸汽的质量属性有干燥度、洁净度、潜热。P28-29 （13）过热蒸汽对微生物的灭菌率（L）小于该温度下的预期的灭菌率。P29 （14）很少发现自然生成的微生物的D121℃大于0.5分钟。P32 （15）不耐热产品/物品不能使用过热杀灭法。P32 （16）灭菌程序的设计和确认需要研究产品的生物负荷和耐热性。P32 （17）D T值的选择应将生物负荷试验中最耐热菌的安全余地考虑在内。P32 （18）多孔/坚硬装载是指以直接接触饱和蒸汽来实现灭菌目的的物品。P34 （19）制药工业中使用的多孔/坚硬装载不管装载物内容是什么，通常不采用对每类物品建立特定灭菌程序的做法，而是建立标准化的、能够获得最低无菌保证的灭菌程序。P34 （20）饱和蒸汽灭菌程序主要有两种类型：预真空和重力置换。P35-37 （21）常用的两种空气加压灭菌程序指蒸汽-空气混合物灭菌程序和过热水灭菌程序。P38-39 （22）与其他蒸汽灭菌法相比，循环水喷淋法最大的优点是加热和冷却的速率容易控制，若设定得当，不受产品装载方式和其他公用设施的影响。P39 （23）水循环为最终灭菌产品提供了有效的冷却方法，提高了灭菌器的效率。为了保证产品的稳定性，有必要采取这种快速冷却的方法。P40 （24）过热水灭菌所用水（包括冷却用水）的微生物水平是最重要的质量特性，另其质量标准应符合工艺用水-纯化水标准。P40 （25）灭菌程序的开发是确立灭菌程序物理参数的过程。P40 （26）建立灭菌程序的目的是鉴别出关键和重要的参数，以致产品和材料在灭菌后能够达到无菌保证要求并保持其质量属性。P40 （27）灭菌程序的开发需要形成正式的文件，应包括计划、方案、记录、总结等，并应形成档案妥善保存。P40 （28）装载的最难加热点的确认应在腔室热穿透实验之前完成，并应画出装载分
一、湿热灭菌条件 湿热灭菌设备的灭菌条件设计有如下要求：①确立灭菌釜内具有均一热分布所需要的各种规程，要求从产品达到灭菌温度时起，直至加热结束整个过程中温度都能够保持在±0．5℃的波动范围以内；②检查每种灭菌物装载方式的热分布是否一致，是否都能够获得良好的热分布状态；③灭菌釜内部及灭菌物的温度不得低于预定的灭菌工序所规定的温度；④确定灭菌釜抽真空所需的时间，满足热分布的要求；⑤确定灭菌物达到灭菌温度的时间；⑥确定灭菌后可以将设备冷却至40℃以下所需的时间。 由于无菌保证值与污染菌耐热性以及污染量有关，因此在药品生产的各个环节均应采取各种有效的手段(包括除菌过滤等措施)来降低待灭菌产品的微生物污染。湿热灭菌的标准灭菌时间F0不小于8。 二、热压灭菌法及设备 热压灭菌是在密闭高压灭菌器内，利用大于常压的饱和水蒸气杀灭微生物的方法。本法是最可靠的湿热灭菌法。湿热灭菌法一般要求F0在8～12之间。热压灭菌所需的温度及与温度对应的压力及时间见表。 表热压灭菌所需温度、压力与时间关系 蒸汽温度（℃）表压力kPa(kg/cm2) 时间（min）适用灭菌范围 100 115.5 0 40～60 耐热而不宜热压灭菌者68.6（0.7）30 溶液剂、橡胶制品 121.5 98.0（1.0）20 金属制品 126.5 137.3（1.4）15 不常用 热压灭菌所用的设备较多，其原理基本相似。热源以直接通入饱和高压蒸汽为主，也有灭菌设备本身可以加水，再以煤气、电热等加热水成为蒸汽。使用热压灭菌设备时必须严格按照操作规程检查各部件的可靠安全性，灭菌时先排尽器内冷空气使压力同温度相符，如果冷空气没有排尽，则压力表上所示压力是蒸汽同残留空气二者的总和，而不是单纯的蒸汽压力，结果表上压力虽然达到而温度并未达到单纯蒸汽在该压力下应有的温度，灭菌就不完全。此外，由于水蒸气被空气稀释，可妨碍水蒸气同被灭菌物品接触，而降低了热压灭菌效果。 1．卧式热压灭菌柜构造如图所示，它是我国制剂工业生产使用最普遍的一种灭菌设备。该设备全部用坚固的合金制成并带有夹套，用具有一定压力的饱和蒸汽作为加热介质。卧式热压灭菌柜结构简单，操作维护容易，价格低廉。但由于设计上的缺陷，
湿热灭菌验证与干热灭菌验证的对比 1、概念： （1）湿热灭菌验证:主要是对产品、灭菌设备和装载方式的验证。验证活动包括：对照灭菌设备设计的灭菌参数来校核灭菌器的性能、建立某产品灭菌程序及装载方式的有效性和重现性、估计灭菌过程中产品可能发生的变化。（湿热灭菌（118-134℃）——蒸汽、过热水）（2）干热灭菌验证：主要用于内包装用的玻璃容器或金属制品的灭菌和去热源，所使用的灭菌程序应通过验证试验。(干热灭菌（160-320 ℃）——热空气) 2、验证目的： （1）湿热：通过一系列验证试验提供足够的数据和文件依据，从而找到最有效最合理的灭菌参数，并把已经验证过的饱和蒸汽灭菌设备和灭菌工艺参数应用到产品生产的除菌过程中去，以证明用于药品生产过程中的每一台饱和蒸汽灭菌设备过程和灭菌效果具有可靠性和重现性。主要适用于能耐受高温、高压饱和蒸汽的产品。 （2）干热：间歇式或隧道式热空气灭菌常用来处理可耐受较高温度而不适宜用湿热灭菌法的物品，如玻璃瓶、粉末、油类、玻璃器皿、不锈钢设备等。 3、灭菌原理： （1）湿热灭菌—导致细胞内关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固，湿度对该破坏性过程起促进作用。 （2）干热灭菌—使微生物氧化而不是蛋白质变性。
4、灭菌工艺： （1）湿热：采用附加排气系统的饱和蒸汽灭菌工艺、采用附加真空系统的饱和蒸汽灭菌工艺、采用附加空气加压系统的饱和蒸汽灭菌工艺。 （2）干热： 1）残存几率法：该法以灭菌为目的。通常适用于热不稳定性物质。灭菌程序应保证在灭菌后物品的微生物残存几率为10 -6，即在一百万个已灭菌单元中，染菌单元的数目不得超过 1 个。 2）过度杀灭法：该法也以灭菌为目的。通常适用于耐热性能较好的物质。灭菌程序应保证在灭菌后物品的微生物的残存几率小于10 -6，“ 过度杀灭” 的灭菌程序所获得干热灭菌值F H 可使耐干热灭菌生物指示剂的总量下降 12 个对数单位。 3）无菌无热原法：该法的目的是达到无菌和无热原。鉴于要达到去热原的目的，通常采用较高的温度和较长的灭菌时间，因此灭菌程序完成后，物品的微生物残存几率将远远小于10 -6。热原下降 3 个对数单位。 5、常用的灭菌设备： （1）湿热：蒸汽灭菌器、快冷式灭菌器、脉动真空灭菌器、水浴式灭菌器等。 （2）干热：对流间歇式，即干热灭菌烘箱、对流连续式，即隧道式干热灭菌器。
Validation of Moist Heat Sterilization Processes: Cycle Design, Development, Qualification and Ongoing Control Technical Report N01 (Revised 2007) Supplement Vol. 61, N0 S-1 c 2007 by PDA P D A Parenteral Drug Association 湿热灭菌的验证： 灭菌程序的设计，开发，确认和日常监控 2007年增补，第一卷N0.S-1 美国注射剂协会 制药科学及技术杂志 编写委员：中国医药设备工程协会技术委员会 发行单位：中国医药设备工程协会
湿热灭菌程序的验证：灭菌程序的设计、开发、确认以及日常监控 目录 1.0引言 (4) 1.1范围 (4) 2.0术语 (5) 3.0灭菌科学 (11) 3.1 灭菌模式 (12) 3.1.1 耐热参数（D T） (13) 3.1.2 温度系数（z值） (15) 3.1.3 灭菌率（Lethal Rate）和累计杀灭时间（lethality，F） (16) 3.2灭菌指示剂 (20) 3.2.1 生物指示剂（BIs） (20) 3.2.2 化学监测器 (21) 3.3热力学和蒸汽质量 (22) 3.3.1 温度和热量 (22) 3.3.2 蒸汽 (28) 3.3.3 纯蒸汽质量的测试 (28) 4.0 灭菌程序的开发 (30) 4.1 设计方法 (30) 4.1.1 灭菌程序设计方法中残存曲线的应用 (31) 4.2 装载类型 (34) 4.2.1 多孔/坚硬装载的定义 (34) 4.2.2 液体装载的定义 (34) 4.3 灭菌程序 (35) 4.3.1 饱和蒸汽灭菌程序 (35) 4.3.2 空气加压程序 (38) 4.4 灭菌程序的开发 (40) 4.4.1 多孔/坚硬装载灭菌程序的开发 (40) 4.4.2 液体装载灭菌程序的建立 (45) 4.5 稳定性研究 (48) 5.0 灭菌程序的性能确认 (48) 5.1 物理确认 (49) 5.1.1 热分布 (49) 5.1.2 热穿透 (49) 5.2 生物指示剂确认 (50) 5.2.1 生物指示剂挑战系统 (50) 5.2.2 生物指示剂的使用和放置 (51) 5.3 灭菌程序性能确认合格标准 (52) 5.4等效灭菌器 (53) 5.5 分组法 (54) 5.5.1 典型产品法 (54) 5.5.2 典型容器规格/装量法 (54)
灭菌 灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。依此观点，无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，如整个消化道、呼吸道，即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体（当然这些方法必须已经证明是有效的），高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出：在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。 灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒，它指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间（接种、超净台等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。 植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的，甚至超过微生物的培养要求，这是因为培养基含有丰富的营养，稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的，必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌，才能保证培养时不受杂菌的影响，使试管苗能正常生长。 常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
培养基湿热灭菌 湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高。 一、方法 煮沸灭菌法；巴氏灭菌；间歇灭菌；高压蒸汽灭菌等。 （1）煮沸灭菌法：是指将待灭菌物置于沸水中灭菌的方法。煮沸时间通常为30-60分钟。该法灭菌效果较差，常用于注射器、注射针等器皿的消毒。 （2）巴氏灭菌：利用病原体不是很耐热的特点，用适当的温度和保温时间处理，将其全部杀灭。但经巴氏消毒后，仍保留了小部分无害或有益、较耐热的细菌或细菌芽孢。 （3）间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。 （4）高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。 二、对培养基的影响 1、形成沉淀物：有机物，如多肽类沉淀；无机物，如磷酸盐、碳酸盐等沉 淀。 2、破坏营养，提高色泽：褐变，产生氨基酸、焦糖或黑色素。 3、改变培养基的PH，一般为降低PH 4、降低培养基浓度，气温低时会增加冷凝水 三、解决方法
温度的选择 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸及维生素等受破坏。在生产中必需选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程微生物死亡是属于一级反应动力学类型，在其它条件不变时，反应速度常数κ与温度的关系可用阿累尼乌斯方程式表示： lnk=lnk0-Ea/RT 达到相同的灭菌效果，提高灭菌温度可以明显缩短灭菌时间，并可减少培养基因受热时间长使营养成分遭到破坏的损失。
湿热灭菌柜的选用要点 1湿热灭菌柜的选用原则 一般来说，选用设备时需考虑的综合因素很多，但基本因素不外乎是：灭菌效果的可靠性、设备投资的可行性、灭菌操作运行的经济性、对灭菌物品的适用性及灭菌后物品质量的有效性。 1.1综合考虑要素 对设备投资而言，回转水浴式灭菌柜较水浴式贵，水浴式灭菌柜比蒸汽式贵，专用型灭菌柜较通用型贵，脉动真空式蒸汽灭菌柜比普通压力蒸汽灭菌柜贵；对操作运行的经济性而言，会因灭菌柜室有效容积而在使用设备数量、由于灭菌温度均匀性产生的成品率、由于整个灭菌周期长短不同引起的动力消耗、设备维修费、折旧费及人工费等因素而变，这需要进行详细比较与测算才能确定。 (1)当受设备投资限制，或受到灭菌物品的通用性、多品种小批量产品灭菌的考虑因素时，一般可选用通用的压力蒸汽灭菌柜，其中尤以脉动真空蒸汽灭菌柜为佳。 (2)考虑到规模生产的经济性、灭菌物品单一且大批量等因素，对压力蒸汽灭菌柜而言，应优先选用专用型的湿热灭菌柜，如检漏灭菌柜、大输液快冷灭菌柜、多功能中药灭菌柜、软包装灭菌柜、强制通风干燥式软包装灭菌柜等。 (3)当考虑到灭菌后物品质量的有效性与成品率，对封装液体的灭菌当推水浴式灭菌，其中对混悬剂、乳剂等易沉淀分层、热敏性药液、粘稠性药液的灭菌尤以回转式水浴灭菌为好，其次再是考虑选用专用型的压力蒸汽灭菌柜。 (4)当采用含有杂质或其它化学物质的普通锅炉蒸汽作为灭菌介质，对未经包装的物品灭菌可能带来二次污染等不利影响时，则应选用纯蒸汽灭菌柜(或称卫生级灭菌柜)。 1.2结构与控制考虑要素 1.2.1柜门：(1)柜门的数量，柜门的数量一般有单扉和双扉二种。当消毒灭菌前后的物品分别处于二个不同的结净区域、或当要求消毒灭菌前后的物品需要利用灭菌柜严格分隔、以防止已消毒灭菌物品与未消毒灭菌物品混杂时，常选用双扉型湿热灭菌柜，双扉门的启闭设置联锁保护。(2)柜门的开启方式包括手动门和电动门，开启方向有旋转门和平移门。(3)柜门的锁紧装置有辐射状撑档型、平移门的插销锁紧型、嵌齿锁紧型、横向撑档型和挤压锁紧型；小型灭菌柜常用螺栓螺母型、旋合式和横担式锁紧结构，锁紧方式可以手动、电动和气动。 1.2.2物品的搁置方式：待消毒灭菌物品在灭菌柜室内搁置方式可有搁板或搁栅置放式、搬运车及框架灭菌车置放式、灭菌车地面、半地面手推置放式和折叠导轨与框架灭菌车置放式。 1.2.3物品的搬运方式：物品的搬运有灭菌车驳接至搬运车的间接搬运和落地轨道灭菌车直接搬运二种型式。 1.2.3控制方式：消毒灭菌的操作过程，根据用户具体要求，有手动式、自动控制式和过程参数自动记录三种可供选择。 1.2.4柜身：一般柜身有圆筒形和矩形二种。无论何种形状，柜身设计均应符合压力容器设计规定并加装安全装置。柜身结构除满足产量要求外，还要满足传热迅速、温度均匀、制造工艺简单经济等要求。一般来说，矩形柜身外形壮观、高雅、有效利用空间大，但制造工艺复杂，循环水用量比圆形多且不便保存，柜壁与灭菌车间的间隙小，对测温探头线的摆放带
湿热灭菌的原理和D值、Z、F0、SAL的名词解释 湿热灭菌的原理是使微生物的蛋白质及核酸变形导致其死亡。这种变形首先是分子中的氢键分裂，当氢键断裂时，蛋白质及核酸内部结构被破坏，进而丧失了原有功能。蛋白质及核酸的这种变形可以是可逆的，也可以是不可逆的。若氢键破裂的数量未达到微生物死亡的临界值，则其分子很可能恢复到它原有的形式，微生物就没有被杀死。为有效地使蛋白质变形，如采用高压蒸汽灭菌时，就需要水蒸气有足够的温度和持续时间，这对灭菌效果十分重要。高温饱和水蒸气可迅速使蛋白质变形，在规定操作条件下，蛋白质发生变形的过程即微生物死亡的过程，是可预见和重复的。 据科学实验证明微生物的灭活符合阿伦尼乌斯方程Arrhenius formula： LgN0-lgN t =kt/2.303 N0 :为灭菌初始时的微生物数量; N t :为灭菌时间为t 时的残存微生物数, K为灭菌常数,; t为灭菌时间。 1、D值定义： 当在温度T时, 90%的微生物被杀灭的时间：Lg100-lg10=kt/2.303; t=2.303/k=D,称为微生物的D值。是与微生物的种类, 环境, 灭菌温度有关系的指标。如嗜热脂肪芽孢杆菌在注射用水中的D121=3；
在氨基酸中D121=0.8；在葡萄糖D121=2.1。D值与溶液的活度系数有关。 2、Z值定义： 如在某种微生物在温度T1时对应D1 T2时对应D2； 设(T2-T1)/ ( lgD1-lgD2)=Z; 当lgD1-lgD2=1时, Z值=T2-T1含义为在T2，T1二个不同温度下杀灭相同数量的微生物，所用的时间的差10倍时，需要增加的灭菌温度值称Z值，因此Z值是体现微生物对温度的敏感性的指标。 3、F0值： F0值为一定灭菌温度（T）下，Z为10℃时所产生的灭菌效果与121℃，Z值为10℃所产生的灭菌效果相同时所相当的时间（min）。也就是说，不管温度如何变化，t分钟内的灭菌效果相当于在121℃下灭菌F0分钟的效果。 在湿热灭菌时，参比温度定为121℃，以嗜热脂肪芽孢杆菌作为微生物指示菌，该菌在121℃时，Z值为10℃。显然，即把各温度下灭菌效果都转化成121℃下灭菌的等效值。因此称F0为标准灭菌时间（min）。F0目前仅应用于热压灭菌。 温度T时相对应的F0计算公式为： F0=Δt?10（T-121）/10
湿热灭菌柜灭菌的原理是通过饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌，由于前者潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是药物制剂生产过程中常用的灭菌方法。 在使用湿热灭菌柜前，我们首先需要确定自己手头的湿热灭菌柜的质量安全性，这需要我们提前对其进行一次验证检测。也就是湿热灭菌柜验证检测。 进行一次专业的湿热灭菌柜验证检测，需要准备很多设备。其中主要的仪器包括了这些：ATI气溶胶光度计和发生器、64路温度验证系统、现场计量炉、臭氧浓度检测仪、大流量粒子计数器、Dragger压缩空气检测仪、TSI风量罩、气流流型检测仪等大中型检测仪器。 其具体的检测方法有这些： 1)温度探头比对及探头布置 ①探头校正 试验开始前将测试用湿热探头放到校验炉内进行温度校准，低温探头设置为低点、高点、测量点。 试验结束后，将所有的湿热探头进行“低点”和“高点”温度复核，确认试验后温度仪表的误差不大于0.5℃。 ②探头布置
将腔内按三个方向分别切为4个平面，其余温度探头均匀地放在腔内各处。各温度探头均悬空放置，不与金属表面接触。 2）空载热分布试验 ①布点 将经过校验的温度探头编号（一般为16根探头），通过设备的验证接口放入灭菌室内。 加热介质进口处于设备自身温度探头处必须各放一根探头。 将腔内按三个方向分别切为4个平面，其余温度探头其余温度探头均匀地放在腔内各处。各温度探头均悬空放置，不与金属表面接触。 ②程序运行 按预定的灭菌程序如℃×min进行灭菌，设定采样间隔，采样时间不小于灭菌柜的工作周期，包括升、灭菌、降温过程，启动灭菌柜，在空载运行状态下进行热分布测定，连续运行3次，以确认灭菌过程中的重现性。 ③结果评价 “冷点”确定：试验中，标准探头得的温度至低的区域，即灭菌器内“冷点”的位置。予以特别标注，作为热穿透试验和生物指示剂试验重点监控的位置。 温度均匀度：每次灭菌程序运行过程中，灭菌器腔室内“冷点”及“热点”的温度，与其平均温度之差应≤±1℃（或符合该设备说明书中标注的设计要求）。 3)满载热穿透试验 ①探头校正：同上。 ②物品装载
湿热灭菌法 常用的灭菌方法有湿热灭菌法、干热灭菌法、气体灭菌法、辐射灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性采用一种或多种方法组合灭菌。只要产品允许，应尽可能选用最终灭菌法（即产品分装至包装容器后再灭菌）灭菌。若产品不适合采用最终灭菌法，可选用过滤除菌法或无菌生产工艺达到无菌保证要求，只要可能，应对非最终灭菌的产品作补充性灭菌处理（如流通蒸汽灭菌）。 （一）湿热灭菌法 本法系指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。该法灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法。药品、容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可用本法灭菌。流通蒸汽不能完全杀灭细菌孢子，一般可作为不耐热无菌产品的辅助灭菌手段。 湿热灭菌条件通常采用121℃*15min、121℃*15min或116℃*40min的程序，也可采用其他温度和时间参数。总之，必须保证对热稳定的物品，可采用过度杀灭法，其SAL应<=10(-12)。热稳定性较差产品的标准灭菌时间F。［指当灭菌温度为121℃，生物指示菌的耐热参数D值为1min，灭菌温度系数Z值为10.0℃时的标准灭菌时间（121℃下计算的微生物等效灭活率）］一般不低于8min，如产品的热稳定性很差时，可允许湿热灭菌的F。低于8min，此情况下，应在生产全过程中，对产品中污染的微生物严加监控，并采取各种措施降低微生物污染水平，确保被灭菌产品达到无菌保证要求。 采用湿热灭菌时，被灭菌物品应有适当的包装和装载方式，不能排列过密，以保证灭菌的有效性和均一性。 湿热灭菌工艺验证时，应进行热分布试验、热穿透试验和生物指示剂验证试验。以确定灭菌柜空载及不同装载时腔室中的热分布状况及可能存在的冷点；在空载条件下，确认121℃时腔室各点的温度差值应<1℃；使用插入实际物品或模拟物品内的温度探头，确认灭菌柜在不同装载时，最冷点物品的标准灭菌时间（F。）达到设定的标准；用生物指示剂进一步确认在不同装载时冷点处的灭菌物品达到无菌保证水平。本法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。 1、热分布试验的操作：空载状态下的热分布试验：①整个灭菌腔室内的温度探头应均匀分布，将水平和垂直区均覆盖在内；②说明温度探头在腔室内的数量及位置，并有图示；③在排水口处，在靠近设备本身的温度传感/控制器的位置，应再放置一支探头；④在灭菌温度稳定期，各处温度应基本保持一致（如各点之间的温度差在1℃范围内）；⑤重复试验至少3次，以证明在该工艺条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符；⑥每种装载方式下的热分布试验；⑦在产品容器内以及腔室均匀放置测温探头以确定在装载状态下升温缓慢的位置。此试验应在最大和最小装载方式下分别进行。 测定不同装载方式对产品的热力学效果的影响，通过实验应得到以下参数： ①保温阶段的最高和最低温度（温度范围）及平均温度；②最小和最大F。值；③保温时间。复试验装载3次，以证明在该工艺条件下的温度均一性、重现性、并且与规定标准相符。 2、热穿透试验：通过在产品容器内均匀分布测温探头以确定在灭菌时相应装载方式下的冷点。应分别在最大和最小装载方式下进行此试验，以确定不同装载方式对被灭菌物品的热力学效果的影响，通过实验应能获得如下数据：各点间的最大和最低温度（温度范围）保温阶段各点的平均温度、各点的最小及最大F。值、以及各点的保温时间。 通过热穿透试验应达到以下目的：①测试数据应证明，在灭菌保温阶段整个腔室内各容器内的温度应不超过士1℃，各容器内温度之间的最大温差应不超过2℃；②根据灭菌参数确定合适的产品灭菌程序；
湿热灭菌法的具体方法有哪些 细菌在我们生活中无处不在，给我们的生活造成了极大的影响。因此，在生活中接触到了不少灭菌的方法，其中比较典型的就是湿热灭菌法，很多时候都需要采用湿热灭菌法进行杀毒。所以，湿热灭菌法的具体方法是大家关心的事项。那么，湿热灭菌法的具体方法有哪些?下面咱们就来详细了解一下吧。 影响湿热灭菌的主要因素有：微生物的种类与数量、蒸汽的性质、药品性质和灭菌时间等。 (1)流通蒸气灭菌法：是指在常压条件下，采用100摄氏度流通蒸气加热杀灭微生物的方法，灭菌时间通常为30-60分钟。该法适用于消毒以及不耐高热制剂的灭菌，但不能保证杀灭所有芽孢，是非可靠的灭菌方法。 (2)间歇蒸汽灭菌法：利用反复多次的流通蒸汽加热，杀灭所有微生物，包括芽胞。方法同流通蒸汽灭菌法，但要重复3次以上，每次间歇是将要灭菌的物体放到37℃孵箱过夜，目的是
使芽胞发育成繁殖体。若被灭菌物不耐100℃高温，可将温度降至75℃～80℃，加热延长为30～60分钟，并增加次数。适用于不耐高热的含糖或牛奶的培养基。 (3)高压蒸汽灭菌法：103.4千帕蒸汽压温度达121.3℃，维持15-20分钟。 湿热灭菌法湿热法可在较低的温度下达到与干热法相同的灭菌效果，因为：①湿热中蛋白吸收水份，更易凝固变性;②水分子的穿透力比空气大，更易均匀传递热能;③蒸汽有潜热存在，每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能，可迅速提高物体的温度。 湿热灭菌法一般采用121℃，灭菌20-30min，如果是产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时，再灭菌一次，以用于杀死刚刚萌发的孢子。 上面就是对湿热灭菌法的具体方法有哪些的介绍，希望对大家的认识有帮助。湿热灭菌法的方法还是很多的，都是比较简单的一些措施，我们可以详细的进行了解，在平时的生活中就能够用到了，不过其中不少方法都是需要专业设备的，可以选择自己合适的。