第23卷第4期2008年12月安 徽 工 程 科 技 学 院 学 报
Journal of Anhui University of Technology and Science Vol.23.No.4Dec.,2008
收稿日期:2008-08-26
作者简介:危勤涛(1983—
),男,湖北仙桃人,硕士研究生.通讯作者:张庆庆(1954—
),女,安徽怀宁人,副教授,硕导.文章编号:1672-2477(2008)04-0040-04
红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究
危勤涛,张庆庆3,刘 辉,黄 鹏
(安徽工程科技学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心,安徽芜湖 241000)
摘要:对红曲霉GM026产洛伐他汀的液态发酵培养基成分和发酵条件进行了研究,结果表明,最佳培养基组成:甘油9%,大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%;最佳发酵条件:培养温度26℃,初始p H =5.0,接种量7%,250mL 三角瓶装液量为50mL ,摇床转速170rad/min 。在上述条件下,发酵培养14d ,洛伐他汀产量达到375.853mg/L.关 键 词:红曲霉;洛伐他汀;液态发酵中图分类号:Q815 文献标识码:A
洛伐他汀是胆固醇合成限制酶———3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A 还原酶的抑制剂,是目前世界上
销售额最大的治疗心血管疾病的药物之一.1979年,日本远腾章教授[1,2]等从红色红曲霉(M onascus ru 2
ber )培养物中发现.目前,能产洛伐他汀或者其类似物的微生物已见报道[3]
,如曲霉菌(A s pergill us )、红曲霉菌(M onascus )、诺卡菌(N ocardi a )、拟无枝菌酸菌(A m ycol atopsis )、毛霉菌(M ucor )和青霉菌(Penicil 2
li um ).
目前,我国多采用红曲霉固态发酵生产洛伐他汀,涉及洛伐他汀液态发酵的报道相对较少,这主要是由于液态发酵的产量比固态发酵要低数倍[4].与传统的固态发酵法相比,液态发酵法具有规模大,自动化程度高,人力成本低,生产过程易控制等显著优点[5].本研究利用红曲霉GM026进行液态发酵,对其产洛伐他汀的发酵培养基和发酵工艺条件进行探讨.
1 材料和方法
1.1 菌种
红曲霉GM026.1.2 培养基
斜面培养基:马铃薯蔗糖琼脂培养基;种子培养基:米粉3%,葡萄糖2%,蛋白胨1.5%,NaNO 3
0.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H 自然;液体基本发酵培养基:米粉7%,蛋白胨1.5%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H 自然.1.3 培养方法
斜面培养:26℃斜面培养7d ,平板培养5d.液体种子制备:用500mL 三角瓶装液量100mL ,26℃,150rad/min 恒温培养48h.液体发酵培养:用250mL 三角瓶装液量50mL ,接种量7%,26℃,170rad/min 恒温培养14d.1.4 发酵液中洛伐他汀含量的测定
采用毛细管区带电泳法(CZE )[6],熔融石英毛细管柱50μm ×60cm (有效长度50cm ),缓冲体系为60mmol/L 甘氨酸含16%乙醇(p H =10.5),进样压力0.5p si ,进样时间5s ,分离电压16kV ,柱温22℃.
2 结果与分析
2.1 碳源对洛伐他汀产量的影响
本试验首先考察碳源物质对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.以蛋白胨1.5%,NaNO 30.2%,
MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%为基本培养基,选择葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘油、可溶性淀
粉、大米粉等7种碳源进行试验,碳源质量分数为3%.经液态摇瓶发酵培养14d 后,结果如表1所示.
表1 不同碳源对洛伐他汀产量的影响
碳源洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
碳源洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
葡萄糖27.211甘油59.473蔗糖10.352可溶性淀粉35.047麦芽糖7.234大米粉
41.182
乳糖
12.035
由表1可以看出,以甘油为碳源时,洛伐他汀的产量高于采用其他碳源时的产量,这说明甘油不仅促进微生物菌体的生长,也促进次级代谢产物洛伐他汀的形成,因此确定甘油为最佳碳源.2.2 碳量对洛伐他汀产量的影响本试验考察碳量对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.分别选取3%、6%、9%、12%、15%甘油5个质量分数水平,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表2所示.
表2 碳量对洛伐他汀产量的影响
甘油质量分数/%
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
甘油质量分数/%
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
357.25712100.869675.40415
99.142
9
95.256
由表2可以看出,甘油质量分数为9%和12%时,洛伐他汀产量相差不大,综合考虑洛伐他汀产量和
原料利用率,选择碳量为9%.2.3 氮源对洛伐他汀产量的影响
本试验考察氮源物质对红曲霉GM026产洛伐他汀的影响.以甘油9%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%为基本培养基,选取硝酸钠、氯化铵、硫酸铵、谷氨酸钠、硝酸铵、大豆粉、蛋
白胨、酵母膏等8种氮源进行试验,氮源质量分数为1.5%.经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表3所示.
表3 氮源对洛伐他汀产量的影响
氮源洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
氮源洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
硝酸钠96.980硝酸钠67.811氯化铵37.125大豆粉187.087硫酸铵72.008蛋白胨158.884谷氨酸钠
54.794
酵母膏
129.403
由表3可以看出,添加无机氮源的产量明显比添加有机氮源的产量低,特别是添加氯化铵的产量在8
种氮源中最低.有机氮源中以添加大豆粉的产量最高,它除了作为菌体生长繁殖的营养外,可能还存在着目的产物所需要的调节物、前体物质等.因此确定大豆粉为最佳氮源.2.4 碳氮比对洛伐他汀产量的影响除了碳、氮源利用之间又密切关系外,碳源与氮源之间的比例也能够直接影响微生物的生长和发酵产物的积累.本试验考察碳氮比对产洛伐他汀的影响.以9%甘油为碳源,大豆粉为氮源,配成不同碳氮比(6/1、9/1、12/1、15/1、18/1、21/1)的培养基,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表4所示.由表4可以看出,碳氮比为12∶1时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳碳氮比为12∶1.
表4 碳氮比对洛伐他汀产量的影响
碳氮比
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
碳氮比
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
6∶1184.24015∶1204.4239∶1199.69518∶1193.79812∶1
228.331
21∶1
169.204
2.5 培养基初始p H 对洛伐他汀产量的影响
p H 是影响微生物发酵的一个重要因素,本试验对培养基初始p H 值进行优化.配制如下培养基:甘油
?
14?第4期危勤涛,等:红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究
9%,大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%.用1mol/L 的HCl 和1mol/L 的NaO H 调节培养基初始p H 分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0左右,经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表5所示.
由表5可以看出,在偏酸性条件下,洛伐他汀的产量最高.在酸性条件和碱性条件下,产量均偏低.因
此,确定培养基的初始p H 为5.0.
表5 培养基初始p H 对洛伐他汀产量的影响
p H 洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
p H 洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
4.020
5.314
6.0230.1954.5222.586
7.016
8.5905.0248.7018.0
133.099
5.5
243.409
2.6 接种量的对洛伐他汀产量的影响
将种子液分别按照体积分数为3%、5%、7%、9%、11%的接种量接入装有发酵培养基的250mL 三角
瓶中,摇瓶发酵培养14d ,结果如表6所示.
表6 接种量对洛伐他汀产量的影响
接种量/%
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
接种量/%
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
3189.2459271.0155239.60811
245.387
7
286.290
由表6可以看出,接种量为7%时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳接种量为7%.
2.7 装液量对洛伐他汀产量的影响
250mL 三角瓶分别装入不同量(30mL 、40mL 、50mL 、60mL 、70mL )的发酵培养基,摇瓶发酵培养14d ,结果如表7所示.
表7 装液量对洛伐他汀产量的影响
装液量/(mL ?250mL -1)
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
装液量/(mL ?250mL -1)
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
30289.34660253.18440294.70970
212.367
50
314.098
由表7可以看出,装液量为50mL 时,洛伐他汀产量达到最大,因此确定250mL 三角瓶中最佳装液
量为50mL.2.8 摇床转速对洛伐他汀产量的影响
250mL 三角瓶,装液量为50mL ,置于旋转式摇床上,以不同转速(110rad/min 、130rad/min 、150rad/min 、170rad/min 、190rad/min )30℃摇瓶发酵培养14d ,结果如表8所示.
表8 摇床转速对洛伐他汀产量的影响
摇床转速/(rad ?min -1)
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
摇床转速/(rad ?min -1)
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
110202.712170341.468130294.639190
327.329
150
312.04
由表8可以看出,在摇床转速为170rad/min 时,洛伐他汀产量最高,因此确定最佳摇床转速为170rad/min.2.9 培养温度对洛伐他汀产量的影响
本试验考察温度对洛伐他汀产量的影响,以寻找最佳温度保证顺利地进行目的产物的生产.将发酵培
养基分别置于不同温度(24℃、26℃、28℃、30℃、32℃
)的培养箱中经液态三角瓶摇瓶发酵培养14d 后,结果如表9所示.
由表9可以看出,培养温度对GM026产洛伐他汀十分敏感,在26℃时最为合适,因此确定最佳温度为26℃.
?24?安 徽 工 程 科 技 学 院 学 报2008年
表9 培养温度对洛伐他汀产量的影响
温度/℃
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
温度/℃
洛伐他汀产量/(mg ?L -1)
24364.47530244.76326375.85332
196.023
28
353.367
3 讨 论
通过对红曲霉GM026产洛伐他汀的发酵培养基和发酵条件的探索,得到最佳发酵条件为:甘油9%,
大豆粉0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%,p H =5.0,培养温度26℃,初始p H =5.0,接种量7%,装液量为50mL/250mL 三角瓶,摇床转速170rad/min.在优化过后的发酵条件下,发酵培养14d 后洛伐他汀产量达到375.853mg/L.在工业上,考虑到甘油的成本问题,必须研究甘油促进红曲霉产洛伐他汀的机理,寻找其他物质替代甘油或者采用复合碳源来进行洛伐他汀生产.
参考文献:
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(8):8522854.
[2] Endo A ,Monacolin K.A new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy -3-methyglutaryl co 2
enzyme a reductase[J ].Antibiotics ,1980,33(3):3342336.
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rity US :6695906[P].United States Patent .2002204214.
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zone electrophoresis with UV 2vis detector[J ].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis ,2007,43:3872392.
Conditions for submerged fermentation
in lovastatin production by monascus
WEI Qin 2tao ,ZHAN G Qing 2qing ,L IU Hui ,HUAN G Peng
(Dept.of Bioch.Engn.,Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation ,
Anhui University of Technology and Science ,Wuhu 241000,China )
Abstract :The medium compositions for submerged fermentation and t he fermenting conditions of monas 2cus producing lovastatin were st udied.The result s indicated t hat t he best medium compositions were as fellows :glycerol 9%,soybean powder 0.75%,NaNO 30.2%,MgSO 4?7H 2O 0.05%,KH 2PO 40.15%.And t he optimal fermenting conditions were as fellows :t he temperat ure was 26℃,t he initial p H was 5.0,t he inoculum ′s size was 7%,t he installing liquid volume was 50mL of medium in 250mL t riangle bottle ,t he shaking speed was 170rad/min.After 14d of incubation ,t he yield of lovastatin ar 2rived at 375.853mg/L under t he optimized condition and medium.Key words :monascus;lovastatin ;submerged fermentation
?
34?第4期危勤涛,等:红曲霉液态发酵产洛伐他汀条件的研究
毕 业 论 文 课题名称 米曲霉的制备 姓 名 学 号 所在系 制药与生物工程系 专业年级P09生物制药 指导教师 职 称 讲师 指导教师 职 称 二O 一二年六月八日
摘要 微生物在酱油生产制曲工艺和发酵过程中起着至关重要的作用，在高盐稀态发酵工艺过程中，培养良好的米曲霉菌种不仅可以提高酱油中总氮、氨基酸态氮含量和酱油风味,而且还可以提高原料利用率。因此米曲霉种曲培养是生产优质酱油的有效保证。本论文主要介绍米曲霉在不同阶段的扩大培养方法，包括试管菌种、锥形瓶菌种、种曲罐菌种、种曲等方面的培养方法及注意事项。米曲霉培养温度为28～32℃,培养时间为72h,米曲霉生长最旺盛作用,此时,曲料的曲酶孢子数大于8×109个/g,蛋白酶活力可达1000mg/100g以上。 关键词米曲霉；温度；时间；试管菌种；三角瓶菌种；扩大培养
目录 引言 (1) 1 菌种的种类 (1) 1.1 米曲霉 (1) 1.2 黑曲霉 (1) 2 菌种的选择条件 (1) 2.1 不产生黄曲霉毒素及其他真菌毒素 (1) 2.2 酶系全、酶活力高 (2) 2.3 对环境适应能力强，生长繁殖快 (2) 2.4 酿制的酱油风味好 (2) 3试管实验 (2) 3.1 灭菌 (2) 3.2 培养基的制备 (2) 3.3 培养基的鉴别 (2) 3.4 接种培养 (3) 3.5 菌种的留选 (3) 4 锥形瓶培养 (3) 4.1 原料配比 (3) 4.2 接种培养 (3) 5种曲制备 (3) 5.1 种曲原料要求 (3) 5.2 做料前检查事项 (4) 5.3 做料 (4) 5.4 蒸料 (4) 5.5 抽真空 (4) 5.6 降温 (4) 5.7 接种 (5) 5.8 自动培养 (5)
开题报告 红曲霉培养培养条件的研究 1背景及其研究意义 红曲霉以其产生红曲色素而得名。红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，红曲色素具有稳定性很好，蛋白着色力强，色调柔和，酸碱稳定等优点。随着人们对合成色素具有诱发癌症等毒副作用的认识，天然食用色素日益受到重视。 红曲色素是由红曲霉丝状真菌经发酵而合成的天然色素，由黄色及红色等6种色素组成。红曲霉属真菌门，子囊菌纲，真子囊菌亚纲，曲霉科，菌丝体呈紫红色，菌丝体生长过程中会产生大量胞外色素和胞内色素。可用传统的固体发酵法生产，也可用液体发酵的现代技术生产红曲霉素红曲霉主要用于食品添加剂而具有安全保健的功能。 目前，红曲霉的生产工艺已由传统的固体发酵转向液体深层通气发酵，大大提高了色素的产量和纯度。本课题采取液体深层发酵的方式生产红曲霉素，并研究红曲色素的提取及在食品中的应用：同传统工艺相比，具有更适应大规模，自动化生产的特点。 本课题主要开展液体深层发酵条件的研究，找出红曲霉培养的最佳环境条件，包括温度、酸度、装量纱布层数、转速、发酵时间等。 2实验方法 2.1菌种选择 选取易于培养、产色能力强的红曲霉。 2.2培养基 一级培养基：饴糖5%蛋白胨1.5%琼脂3%PH自然 121℃高压灭菌30分钟
二级培养基：麦芽糖5%豆饼粉2%K2HPO4.3H2O0.5%MgSO4.7H2O 0.25%H2O1000ml PH自然121℃灭菌30分钟 2.3工艺流程 菌种→斜面培养→摇瓶培养→发酵罐培养→测量色价 2.4具体方案 选择出最佳培养条件，设计正交实验进行实验 因素温度(℃)发酵时间(h)转速（r/min）酸度纱布层数(层)装量（ml）12048100 5.5230 22360120 6.0440 ******** 6.6650 427841607.0860 530961807.51070 采用上述培养基配方，根据表格设计安排实验。 2.5测定色价 取发酵液离心后，分别对上清液和沉淀进行了处理，测定胞内色素和胞外色素的OD值，然后把OD值转换为色价，则总色价=胞外因素色价+胞内因素色价。 3预期达到的目标 通过实验，比较总色价，找出最价的正交组合，得出红曲霉的适应培养条件。
1.菌种特点： 米曲霉( 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产的，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、、、等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链降解为糊精及各种低分子糖类，如、等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为、及各种，而且可以使辅料中、等难吸收的物质，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于、、生产曲酸、等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产不能表达的真核生物活性蛋白的。米曲霉所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量。米曲霉基因组的破译，也为研究由曲霉属真菌引起的曲霉病
培养基适用性检查记录 质量部
培养基名称：沙氏葡萄糖琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取5个无菌平皿，分别接种白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含 菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照沙 氏葡萄糖琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，20-25℃培养5天计数。被检培养基同 法操作。 四、结果判断 五、结论 本品按《中国药典》2015年版“非无菌产品微生物检查：微生物计数法”及培养基适用性检验操作规程检验，结果：□符合规定□不符合规定。
培养基名称：胰酪大豆胨琼脂培养基来源：批号： 对照培养基：来源：批号： 检验依据：检验人：检验日期： 一、实验菌种： 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003]第代 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104]第代 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501]第代 白色念珠菌[CMCC(F)98 001]第代 黑曲霉[CMCC(F)98 003]第代 二、菌液制备 将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌分别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 小时；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将白色念珠菌接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天；取上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌悬液。将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，20～25℃培养5～7天。加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成稀释至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml 的菌悬液。 三、培养基适用性检查 取11个无菌平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2皿，每皿接种1ml菌液（含菌适宜浓度），另一皿接种1ml PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液作为空白对照，倾注对照胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀。凝固后倒置培养，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌皿30-35℃培养3天计数；白色念珠菌、黑曲霉20-25℃培养5天计数。被检培养基同法操作。 四、结果判断
红曲霉 叶静 （西南民族大学，成都610225） 摘要：红曲霉（Monascus）是我国最早应用于食品加工的有益真菌之一，主要集中应用在传统酒曲、制醋、着色、防腐等领域，国外红曲霉主要应用于肉品加工及其他食品着色方面，其药理活性物质可抑制胆固醇活性、降血压物质和麦角固醇，利用红曲霉可生产纯红曲及添加红曲提取物的胶囊、红曲口服液以及酒、醋、酱油及食品添加剂和饲料等。 1.古代人对红曲霉的认识 红曲是红曲霉在蒸熟的稻米上生长发酵而形成的红色米粒。由于颜色鲜红宛如朱砂，亦称丹曲。红曲是我国古代人的伟大发明。明代李时珍引《丹溪补遗》中的记载是说“以白米饭受湿热蒸变而为红，即成真色，久亦不渝，此乃人窥造化之巧者也。”从雪白的稻米变成紫红色的红米，在没有微生物知识的古代确实给人以神奇、奥秘的感觉，所以有人说红曲是中国古代先人巧夺天工的发明。 2．红曲霉的形态特征 红曲也称红曲霉、红糟、红大米，学名Van Tieghem，是1884年法国人van Tieghem分离鉴定命名的，属于不整子囊菌纲散囊菌目(Eurotiales)红曲科红曲属。 红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落初为白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色等，因种而异。菌落呈绒毡状或呈皮膜状，呈皮膜状的菌落少褶皱或具有辐射纹。红曲霉多能形成红曲色素，可分泌到培养基中，使培养基着色。菌丝具有横隔，多核，分枝繁且不规则。细胞幼时含有颗粒，老后含空泡及油滴。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或以向基式生出，2~6个成链。闭囊壳呈球形，有柄，柄长短不一。闭囊壳内散生十多个子囊，子囊呈球形，含8个子囊孢子，成熟子囊壁
解体，孢子留在薄壁的闭囊壳内。呈卵球形，光滑，无色或淡红色。红曲霉的生活史 见图： 3.红曲霉的生理生化性质 红曲霉能在15~45℃，最适温度为32~35℃，最适PH为3.5~5.0，有良好的耐酸和耐乙醇能力。能利用淀粉、糊精、麦芽糖、蜜二糖、纤维二糖、葡萄糖、甘油、乙醇、乳酸、苹果酸、柠檬酸等多种糖类和酸类作为碳源，能利用硝基氮、氨基氮和有机氮，而以有机氮为最好的氮源。红曲霉能自身合成生物素、硫胺素、核黄素、麦角固醇等多种维生素。红曲霉可代谢生成多种酶类，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。 4．红曲霉的应用 （1）防腐剂《天工开物》中首次明确提到红曲防止食物腐败的作用：“凡丹曲一种，法出近代。其义臭腐神奇，其法气精变化。世间鱼肉最朽腐物，而此物薄施涂抹，能固其质于炎暑之中，经历旬月蛆蝇不敢近，色味不离初，盖其药也。” 红曲中的抑菌物质红曲色素是红、橙、黄、三种色素的混合物，红曲霉的抑菌作用是有橙色素引起的。红曲色素对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用，对大肠杆菌、灰色链霉菌抑菌作用较弱，而对啤酒酵母、黄曲霉、青霉、黑曲霉无抑制作用。红曲色素灭菌溶液能抑制肉毒梭状芽孢杆菌的生长，对发酵菌株的生长和产酸均无显著影响，因此将其应用于发酵香肠的生产，替代亚硝酸盐应用到肉制品行业是可行的。 （2）色素日本学者对其进行毒性试验证明：红曲色素安全无毒。我国毛宁等对色素提取液进行分析，证明提取液中，不含黄曲霉毒素，可用于糕点、肉罐头、糖果、药片染色。中国食品发酵工业研究所王柏琴等人将红曲色素用在发酵香肠中，代替亚硝酸盐发色，用1．6mg／g红曲色素制作的颜色，更接近于用0．15mg／gNaNO2，取得很好的效果。中国古代人民很早就认识到它的食用价值。红曲用途极
1.菌种特点： 米曲霉( Asp.oryzae) 属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色，后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色，背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业产品霉变。米曲霉(Aspergillus oryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶,其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。米曲霉 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵
- 培养基适用性 验证 方案起草人： 方案审核人： 方案批准人： XXXXX药业股份
目录 1. 验证目的 (2) 2. 参照标准 (2) 3. 验证项目 (2) 4. 验证小组人员及职责 (3) 5. 验证可接受的标准 (3) 6. 验证步骤 (3) 7. 菌液制备 (6) 8. 适用性检查 (6) 9. 控制菌检查 (7) 10. 操作方法 (8) 11.结论 (11)
1. 验证目的： 需氧菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基及控制菌培养基应进行培养基的适用性检查。本次验证的目的是确认胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基适合需氧菌、霉菌及酵母菌总数及测定和控制菌适用性检查。 2. 参照标准：2015版中国药典微生物限度检查法。 3. 验证项目：营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基的适用性检查和控制菌适用性检查。 4.验证小组人员及职责： 4.1 4.2验证人员职责及要求 4.2.1按验证方案及相关文件实施验证。 4.2.2认真观察并做好验证原始记录。 4.2.3对实施验证的结果负责。 4.3验证中各部门的职责 4.3.1验证领导组职责 4.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。 4.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。 4.3.1.3负责验证方案的批准工作。 4.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。 4.3.1.5负责验证报告的批准工作。 4.3.2验证工作小组职责 4.3.2.1负责验证方案的起草工作。
4.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。 4.3.2.3负责验证方案的实施。 4.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。 4.3.2.5参与验证结果的评价工作。 4.3.3质量部职责 4.3.3.1负责验证方案的审核工作。 4.3.3.2负责验证过程中仪器、仪表、计量器具的校验工作。 4.3.3.3负责验证中各项检测工作，提供验证的检验记录、检验报告，对验证过程中的各项检验工作负责。 4.3.3.4负责验证资料和报告的审核工作。 4.3.3.5负责验证文件回收、归档管理工作。 5. 合格标准：被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落平均数的70%，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致。 6. 试验材料： 6.1. 被验证产品：溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基、肠道菌增菌液培养基、RV沙门菌增菌液培养基、麦康凯琼脂培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、麦康凯液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 6.2. 仪器设备： 6.2.1. LXD型压力蒸汽灭菌器 6.2.4.JMP-250霉菌培养箱(20～25℃) 6.2.5. SHP-250生化培养箱(30～35℃) 6.2.7 101-1电热鼓风干燥箱 6.3. 验证用培养基
大曲中红曲霉的简易分离方法 李晓楼 （四川职业技术学院，四川遂宁 629000 ） 摘要：本文采用无菌过滤收集大曲中红曲霉孢子悬液和基内接种技术，运用稀释平板法，实现了从大曲中简易分离红曲霉，文章介绍了红曲霉的生物学特征，阐述了从大曲中分离红曲霉的原理、分离培养基的设计与制作、大曲中红曲霉分离纯化的技术方法及过程，为获取红曲霉纯菌及红曲生产爱好者提供参考。 关键词：大曲；红曲霉；分离；基内接种；稀释平板法 红曲霉的用途非常广泛，利用红曲霉生产红曲，古称丹曲，是我国古代的伟大发明。红曲不但用于酿酒，而且还应用于发酵食品、食品色素等方面[1] 。此外有的红曲霉能产生 Monacolin 类活性物质，具有很强的降低胆固醇的作用；某些红曲霉种还含有较高的麦角甾醇，可防止婴儿佝偻病，促进孕妇和老年人对钙、磷的吸收；另外有报道红曲霉的有些种还有酯化能力[2] 。因此有关红曲霉在酿酒、保健、食疗等方面的作用越来越受到人们的重视。本文采用无菌过滤收集大曲中红曲霉孢子悬液和基内接种技术，运用稀释平板法，实现了从浓香型大曲中简易分离红曲霉，文章介绍了红曲霉的生物学特征，阐述了从大曲中分离红曲霉的原理、分离培养基的设计与制作、大曲中红曲霉分离纯化的技术方法及过程，为获取红曲霉纯菌及红曲生产爱好者提供参考。 1 红曲霉的生物学特征 红曲霉（Monascus sp . ）是腐生菌，分布较广，常存于乳品或乳制品中，多数出现在乳酸自然发酵的基物里，制曲作坊和大曲等都是它们适宜的繁殖地。红曲霉属于不整子囊菌纲、散囊菌目、红曲科、红曲属。已描述过的红曲霉约有19 个种[3] 。 1.1 形态特征 红曲霉一般多用麦芽汁琼脂培养。在生长的过程中能形成红色色素，菌落初为白色，老熟后变成淡红、紫红等颜色。菌丝有隔，多核，多分枝。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或以向基式生出 2 — 6 个成链，形状多为梨形，闭囊壳球形，内散生 10 多个子囊，子囊球形，内含有 8 个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢子留在闭囊壳内[4] 。 1.2 生理特性 红曲霉的最适温度一般在30 ℃—35 ℃ ，25 ℃ 以下40 ℃ 以上不利于生长。最适 pH 值一般在 3 —5 ， pH 值在 3 以下，生长缓慢， pH 值在 5 以上，不利于色素的形成。同时酿酒用的红曲霉能够耐受一定的酒精度[4] 。
1.米曲霉是一种好气性真菌,菌丝一般呈黄绿色,米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 米曲霉在工业上的应用：用于发酵生产豆豉、豆酱；与黑曲霉、绿色木霉复合发酵用于酱油生产；用于饲料工业；用于酿酒制曲、生产低醇乳糖饮料。 2.葡萄糖淀粉酶又称γ一淀粉酶, 简称糖化酶，糖化酶是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白,在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉等丝状真菌和酵母中获得,从细菌中也分离到热稳定的糖化酶, 人的唾液、动物的胰腺中也含有糖化酶生产方法： a.黑曲霉固体发酵法 工艺流程:试管菌种→三角瓶款曲扩大培养→帘子曲种→通风制曲→成品。 b.液体深层发酵法. 工艺流程:试管斜面种子→种子扩大培养→发酵→过滤→浓缩→干燥→粗酶制剂。
糖化酶成品提取工艺 成品糖化酶可分为液体酶和固体酶2 种, 而固体酶的制备方法又可 分为盐析法、有机溶剂沉淀法和附吸法等, 采用一条合理的提取工艺, 可制备系列酶产品以满足不同行业的需求及降低成品的成本. 目前国外糖化酶生产一般采用液体深层培养, 发酵罐最大可达200m , 罐体都采用不锈钢制造, 冷却系统采用罐外冷却盘管关键阀门都采 用隔膜阀, 培养基可在罐内灭菌, 也可用薄板冷却器作连续灭菌, 并装有节能器, 发酵过程中的控制参数有搅拌功率、溶解氧、空气 中的二氧化碳与氧气量以及温度、P H 等。 糖化酶处理技术： 糖化酶的处理工艺过程分为预处理、固液分离、液体浓缩、酶的沉淀干燥四个工序。国外采用的无机絮凝剂有硫酸铝、碱式氯化铝、氯化铁、锌盐等能在水中形成各种氢氧化物凝胶;采用的有机高分子絮凝剂有聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸(或钠盐) 、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酞胺等。国内外最普遍采用的固液分离设备是板框压滤机, 除此以外, 国外还有管式、多室式、碟式及篮式离心机, 国内主要采用篮式离心机, 也有少数管式离心机的厂家。国内外糖化酶的浓缩方式已从蒸发浓缩发展到超滤浓缩。目前采用的超滤装置有搅拌室式、浅道式系统、套筒膜式和中空纤维。沉淀酶方式, 国内外仍普遍用硫酸钱或硫酸钠等中性盐类盐析糖化酶。 3.植酸提高米曲霉产糖化酶能力:
麦康凯琼脂对照培养基 麦康凯琼脂对照培养基用途： 培养基适用性实验 麦康凯琼脂对照培养基外观： 本品为肉粉色均一粉末，加入水中混悬均匀，灭菌后融化状态为半透明棕红色液体 麦康凯琼脂对照培养基酸度： 本品灭菌后pH7.4，符合2010版中国药典灭菌后pH7.2±0.2的规定。 麦康凯琼脂对照培养基注意事项： 1.检查平板内是否干裂或染菌，如长菌请勿使用； 2.请在洁净的环境下操作，避免杂菌干扰； 3.在冰箱储存很久的培养基容易出现一些冷凝水，请在洁净的环境下将水倒出， 然后在培养箱放置10-30Min，待其表面干燥后再接种；或在使用前，提前一到两周放置室温即可； 4.弃物处理：使用后应高压灭菌或焚烧后按一般垃圾处理，也可按专业技术人 员指示方法处理。 保存：避光保存，放于阴凉干燥处。 麦康凯琼脂对照培养基其他相关对照培养基： 硫乙醇酸盐流体对照培养基 改良马丁对照培养基 营养琼脂对照培养基 营养肉汤对照培养基 玫瑰红钠琼脂对照培养基 胆盐乳糖对照培养基 甘露醇氯化钠琼脂对照培养基 沙氏葡萄糖肉汤对照培养基 麦康凯琼脂对照培养基 沙门、志贺菌属琼脂对照培养基 4-甲基伞形酮葡萄苷酸（MUG)对照培养基 沙氏葡萄糖琼脂对照培养基 念珠菌显色对照培养基
绿脓菌素测定用对照培养基基础 梭菌增菌对照培养基 哥伦比亚琼脂对照培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂对照培养基基础 四硫磺酸钠亮绿对照培养基基础 乳糖发酵对照培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（YPD）对照培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基 胰酪大豆胨肉汤对照培养基 R2A琼脂对照培养基 三糖铁琼脂对照培养基 麦康凯液体对照培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂对照培养基 肠道菌增菌液体对照培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐对照培养基
第２７卷第６期路秀玲等：红曲霉固态发酵中生物量的测定方法４５ 红曲霉固态发酵中生物量的测定方法 路秀玲赵树欣刘忠华 （天津轻工业学院食品工程系，天津，３００２２２） 摘要探讨了红曲霉固态发酵中生物量的测定方法。红曲霉固患发酵的生物量基本可以 通过测定红曲霉酋体细胞中的麦角固谆和氨基葡糖含量来推断．对于幸文中红曲霉固态发肆 采用氨基葡糖法相对较好，可以估测出固志发酵物中的茁体量。底物于重减重与苗体量存在 一定的正向关系，通过测定底物减重可以推断出红曲霉生长代谢状况，并且方法筒便易行，易 于实现在线监测。 关■调红曲ｌ生物量固态发酵 目前对红曲霉发酵的研究多集中于液态发酵，但固态发酵与液态发酵相比具有产量较高、后处理简单、对环境污染小、产品更安全等优点。固态发酵中生物量的测定方法国内报道很少，国外多集中为以下４大类：（１）直接从固态培养基中分离测定，如除去基质、直接计效等；（２）通过检测代谢活动推断生物量，如测定０２和ｃ０２的代谢量、胞外酶量、ＡＴＰ等；（３）测出生物体中某些特殊物质（如蛋白质、总糖、核酸、氨基葡糖、麦角固醇等）的含量推测生物量；（４）利用与茵体生长有关的某些现象（如压降、底物减重等）估测生物量［２］。红曲霉菌丝发达，与培养基结合紧密，故无法直接测定。从报道的结果中可以看出各种间接测定方法均有一定的局限性，如产生单位菌体量所需的ｑ量或排放的ｃ０２量会随菌龄变化［３１；细胞的特殊生物组分含量会因不同菌种、培养条件和培养时间而不同【３ｏ；检测时间长、过程繁复影响测定的精确性，因此很难判定哪种检测方法最好。有关红曲霉固态发酵生物量测定方法尚未见报道。综合对固态发酵生物量问题的研究结果，本文选用较为准确且易行的几种方法：测定细胞中的特殊物质如麦角固醇、氨基葡糖等组分含量推测生物量（核酸提取过程复杂，故不采用）；研究由于生物体代谢释放ｃＱ 第一俸者：萌士研究生。造成的底物减重与生物量的关系。力求确定一种操作简便。能快速准确测定生物量或反映生物生长状态的方法。 １材料与方法 １．１菌种 烟灰色红曲霉（Ｍｊｎ口”ｍ彬培ｉ”ｎ”“５）。１．２测定方法 １．２．１地菌体的制备 采用膜培养法：在麦芽汁平板上铺一层无菌的玻璃纸，吸取由斜面制得的孢子悬浮液Ｏ．５ｍＬ铺于膜上。３０℃保温培养７ｄ＇再降到２５℃培养到１４ｄ，然后将菌膜从玻璃纸上剥下，８０℃烘干即为纯菌体。 １．２．２固态发酵样品的制备 将大米浸泡１０ｈ．洗净沥干，称４０９装入２５０ｍＬ三角瓶１２ｌ℃高压蒸米３０ｍｉｎ。冷却后接人孢子悬浮液１ｍＬ（含孢子约１０７个），调初始水含量为５０％。３０℃保温培养７ｄ，再降到２５℃培养１５ｄ．成品于８０℃烘干，磨成粉即为待测样。 １．２．３发酵底物减重的测定 每次取３个２５０ｍＬ三角瓶，将其中的固态发酵物于８０℃烘干，准确称其干重，计算其与初始发酵底物干重的差值即为底物减重。
两种曲酶糖化性质的比较研究在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌, 属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低, 只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶, 现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计, 25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁, 。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用, 例如, 柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之, 黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点, 已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1．1材料 菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1．2培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液
WOIRD格式 1.菌种特点： 米曲霉(Asp.oryzae)属于真菌菌落生长快，10d直径达5~6cm，质地疏松，初白色、黄色， 后变为褐色至淡绿褐色。背面无色。分生孢子头放射状，一直径150~300μm，也有少数为 疏松柱状。分生孢子梗2mm左右。近顶囊处直径可达12~25μm，壁薄，粗糙。顶囊近球 形或烧瓶形，通常40~50μm。上覆小梗，小梗一般为单层，12~15μm，偶尔有双层，也 有单、双层小梗同时存在于一个顶囊上。分生孢子幼时洋梨形或卵圆形，长大后多变为球形 或近球形，一般4.5μm，粗糙或近于光滑。（半知菌亚门丝孢钢丝孢目从梗孢科曲霉属真 菌中的一个常见种）。菌落生长较快，质地疏松。初呈白色、黄色，后转黄褐色至淡绿褐色， 背面无色，分布甚广，主要在粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤等处。是我国传统酿造食 品酱和酱油的生产菌种。也可生产淀粉酶、蛋白酶、果胶酶和曲酸等。会引起粮食等工农业 产品霉变。米曲霉(Aspergillusoryzae)具有丰富的蛋白酶系,能产生酸性、中性和碱性蛋白酶, 其稳定性高,能耐受较高的温度,广泛地应用于食品、医药及饲料等工业中。米曲霉也是美国食品与药物管理局和美国饲料公司协会1989年公布的40余种安全微生物菌种之一。 米曲霉 米曲霉是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、 植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子 糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为 蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解， 提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵 工业，并已被安全地应用了1000多年。米曲霉是理想的生产大肠杆菌不能表达的真 核生物活性蛋白的载体。米曲霉基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵 专业资料整理
念珠菌显色对照培养基 念珠菌显色对照培养基用途： 培养基适用性实验 念珠菌显色对照培养基外观： 本品为淡黄色均一粉末，加入水中混悬均匀，灭菌后融化状态时为黄色透明液体。 念珠菌显色对照培养基酸度： 灭菌后pH6.0. 念珠菌显色对照培养基注意事项： 1.检查平板内是否干裂或染菌，如长菌请勿使用； 2.请在洁净的环境下操作，避免杂菌干扰； 3.在冰箱储存很久的培养基容易出现一些冷凝水，请在洁净的环境下将水倒出， 然后在培养箱放置10-30Min，待其表面干燥后再接种；或在使用前，提前一到两周放置室温即可； 4.弃物处理：使用后应高压灭菌或焚烧后按一般垃圾处理，也可按专业技术人 员指示方法处理。 保存：避光保存，放于阴凉干燥处。 念珠菌显色对照培养基他相关对照培养基： 硫乙醇酸盐流体对照培养基 改良马丁对照培养基 营养琼脂对照培养基 营养肉汤对照培养基 玫瑰红钠琼脂对照培养基 胆盐乳糖对照培养基 甘露醇氯化钠琼脂对照培养基 沙氏葡萄糖肉汤对照培养基 麦康凯琼脂对照培养基 沙门、志贺菌属琼脂对照培养基 4-甲基伞形酮葡萄苷酸（MUG)对照培养基 沙氏葡萄糖琼脂对照培养基 念珠菌显色对照培养基 绿脓菌素测定用对照培养基基础 梭菌增菌对照培养基
哥伦比亚琼脂对照培养基 溴化十六烷基三甲铵琼脂对照培养基基础 四硫磺酸钠亮绿对照培养基基础 乳糖发酵对照培养基 酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂（YPD）对照培养基胰酪大豆胨琼脂对照培养基 胰酪大豆胨肉汤对照培养基 R2A琼脂对照培养基 三糖铁琼脂对照培养基 麦康凯液体对照培养基 紫红胆盐葡萄糖琼脂对照培养基 肠道菌增菌液体对照培养基 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐对照培养基
红曲霉深层发酵法生产红曲红 杨晓暾 红曲红色素生产由固态转向液体深层发酵在中国是近10余年的事，而目前国内深层发酵生产红曲红色素水平尚较低，多数厂家仍是利用红曲米提取生产红曲红色素。由于受条件限制（如设备、场地）、发酵水平等因素的影响，产品的产量和质量均难以达到理想水平。因红曲红液体深层发酵是利用纯种经一、二级种子罐培养后，直接进入发酵罐培养，故摸索和掌握适于红曲霉液体生长的最佳工艺条件和配方是十分重要的，只有找到最适生产配方及工艺条件，才有希望突破固态法生产水平，从而降低生产成本，提高生产效益，生产出高色价、高质量的红曲红产品，以满足当今市场需求。 笔者从事红曲红研究及规模化生产多年，有着丰富的生产经验。红曲红色素液体深层发酵工艺经十余年研究发展，目前已达到相当高的生产水平，东莞市天益生物工程有限公司生产的红曲红无论从产品质量或生产能力都居国内同行领先水平。我们的宗旨是科学技术为指导，坚持科技创新，严格加强生产管理。具体作法主要有以下几个方面： 一、筛选高色价、性能稳定的红曲霉菌种，是降低生产成本、提高红曲红液体深层发酵水平的关键所在。 我们公司除了按常规的霉菌分离方法之外，主要利用红曲霉的特性（耐酸性及抵抗酒精能力强等）。具体做法是：用含乳酸0.7%、酒精约10%的麦芽汁或大米进行分离、纯化培养红曲霉，同时还对生产菌种进行不同方式的诱变、驯化（如紫外诱变、酸热处理等），以此来增强其逆境生存能力。经紫外诱变处理5~10min；耐高温（55~65℃）、耐高压（0.8-1.0Mpa）、耐酸（pH2.0-3.0）等方面情况下生长性能测试后，筛选出的高色价菌株，具有优良、稳定和培养粗放等特点，在生产上便于操作和应用。除此之外，我们还特别注意保持菌种的强壮与新鲜，太嫩或太老均不可取（斜面菌种一般生长7-8d 为最佳）。不仅如此，我们还采取多种方式经常改变培养基配方用于菌种培养及保藏试验，以减少红曲霉菌因多次传代而发生变异。为进一步验证其生产种性能是否优良、稳定，我们还经常进行摇瓶分离试验、改变配方等，从中摸索出一整套相关的红曲霉生产试验配方，使生产工艺得到不断改进与完善，也使菌种在大生产中充分得以驯化，更加适应液体深层发酵，为生产稳定、质量提高打下坚实的基础。经长期不懈的努力，严格把好菌种质量关，使生产水平稳中有升，发酵水平比两年前提供了近1倍，产品总收率比原来提高了20％，从而大大降低了生产成本，使产品在市场中更加有竞争力。 二、制定合理的生产工艺及配方，是发酵高水平的重要前提。 目前我公司红曲红液体深层发酵经不断摸索、改进后，已初步形成了一套较为成熟、完善的生产工艺流程： （一）斜面与平板培养基：可溶性淀粉3％、麦芽糖3％、蛋白胨2％、琼脂2％，ｐH自然约5.0-5.5。（二）种子液体培养基组分：淀粉3％、NaNO30.25%、KH2PO4 0.2-0.3％、MgSO47H2O 0.2％-0.3％、黄豆粉1.0％、玉米浆1.5％。 （三）发酵罐培养基组分：米粉6％-7％、黄豆粉2％-3％、NaNO3 0.2%-0.3％、KH2PO4 0.2-0.3％、
两种曲酶糖化性质的比较研究 ××××××××××在国内传统的制酒行业中，由于黑曲霉含有丰富的酶系如液化酶、糖化酶、纤维素酶和蛋白酶等，自70年代大多都由米曲霉改为黑曲霉作糖化用菌种。但在日本迄今仍在采用米曲霉做糖化菌，说明其中必有原因。鉴于此，本实验以黑曲霉和米曲霉为研究对象，研究比较它们的液化酶和糖化酶（葡萄糖淀粉酶）生产性质。 黑曲霉是一种常见的真菌，属于半知菌类曲霉属。黑曲霉对营养要求较低，只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好。黑曲霉可以产生许多种酶，现已成为工业应用常见的菌种之一。根据bigelis1989年的统计，25种主要商品酶制剂中就有15种来源于黑曲霉仁。它们分别是α-淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、半纤维素酶、橙皮昔酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶。美国准许使用的食品工业用酶生产菌种只有黑曲霉、酵母、枯草杆菌等约20种, 其中以黑曲霉所产酶类最多。我国酶制剂工业生产用菌种中, 黑曲霉占了17种中3种, 即黑曲霉变异株和,它们分别用于糖化酶、果胶酶和酸性蛋白酶的生产[1]。黑曲霉酶类在工业上具有重要的作用，例如，柠檬酸等有机酸的发酵生产、食品及饮料加工以及用于轻化工业、纺织工业、饲料加工和废物的处理等等。总之，黑曲霉生产的酶制剂具有用量大、应用范围广、安全性好的特点，已愈来愈受到人们的重视。 米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸，而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵工业。 1 材料与方法 1.1 实验材料菌种：黑曲霉UV-48；米曲霉-4 1.2 实验培养基 种子培养基（土豆汁培养基；察式培养基）；发酵培养基（麸皮培养基；液体深层发酵液）1.3 实验试剂 1.33%可溶性淀粉；碘液；0.01MNacl-HAC缓冲液；6NHCL；DNS试剂；葡萄糖标准溶液；无菌水
米曲霉在食品中的应用 摘要：介绍了米曲霉的生物学特性，并综述了它在调味品、饲料、生产曲酸、消除乳糖不耐症、酿酒等方面的应用，提出了其发 展前景。 关键词：米曲霉；工业：应用；展望 1米曲霉的生物学特征 米曲霉CAs ) 是一种好气性真菌，属于半知菌亚门、曲霉属，菌丝一般呈黄绿色，后为黄褐色，分生孢子梗生长在厚壁的足细胞上，分生孢子头呈放射形，项囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形平滑，少数有刺，培养适温为37度。米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤 维素酶、植酸酶等。在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸， 而且可以使辅料中粗纤维、植酸等难吸收的物质降解，提高营养价值、保健功效和消化率，广泛应用于食品、饲料、生产曲酸、酿酒等发酵业。 2米曲霉在工业上的应用 2．1用于发酵生产 豆豉、豆酱豆豉是我国古老的大豆发酵制品之一，营养丰富，药食兼用，对我国人民的饮食文化和医疗保健发 挥着重大作用。在传统豆豉酿造工艺中，米曲霉酿造豆豉在我国应用最早、最广。《食经》等历史文献记载作豉法大都是米曲霉豆豉。当时先人们能够巧妙地控制米曲霉的最适温度，不超过37℃，“温如人腋下”，直到“后着黄衣，色均足”。由于没有显微镜，看不到微生物的个体形态，但能通过微生物的群体形态“黄农”来控制微生物的生长繁殖。成曲以米曲霉为主，兼有其它霉菌、酵母和细菌等稳定的群 体。随着科学发展，在前人基础上相继出现改良的多菌制曲和无盐固态发酵工艺，己达到相当高的水平，在生产实践中产生了良好的效果。 随着人们对食品的营养结构及保健性要求的提高，虽然酱具特有的色、香、味，然而已满足不了人民生活水平不断提高的需求。最近，日本研制了保健酱一荞麦豆酱，其除了含有17种氨基酸外，还含有 其它酱品没有的芦丁(2．4rag／lOOg)，在保持原有豆酱生理机能的同时，又增加了荞麦的保健性，是一种多功能的保健调味品。鞠洪荣等[3]研究表明，在传统工艺和日本工艺的基础上进行改进，即按一定比例如入米曲霉酿造的荞麦豆酱，酱香较浓，与传统豆酱相比具有独特的醇香味，且提高了营养价值和保健效果，有潜在的市场前景。 2．2与黑曲霉、绿色木霉复合发酵 用于酱油生产酱油酿造主要靠米曲霉的作用。在米曲霉生过程中能分泌多种酶系，其中最重要的是蛋白酶、淀粉酶和酯酶等。天然发酵酱油是利用蛋白酶的水解作用，将豆类中的蛋白质降解成多肽、氨基酸等可溶性含氮物，且口味好，营养丰富，是营养性风味调料的发展方向[4]。而淀粉酶的作用是将制曲后原料中的淀粉或经糖化后糖浆中残留的淀粉进一步彻底糖化降解，糖化后生成的单糖类如葡萄糖、果糖、多缩戊糖等，对酱油的色、香、味、体有重要影响。因此，米曲霉所产淀粉酶的性质与酱油质量好坏密切相关。吕嘉枥等[5]对分离纯化的米曲霉(今野菌株)所产．淀粉酶进行了研究，探索出了该菌株产淀粉酶的培养温度和最佳培养时间。米曲霉酶系活性的高低将直接影响到原料的利用率及产品的产率，影响酱油中可溶性含氮物的含量，从而也会影响酱油的品质；而米曲霉产孢子能力的强弱则会影
红曲霉的分离纯化 傅慧华 摘要：红曲霉属真菌门（Eumycophyta）、子囊菌纲（Ascomycetes）、真子囊菌亚纲（Euascomycetes）、红曲霉属（Monascus）。红曲霉是腐生真菌，生长的最适pH为3．5～5，能耐pH3．5，尤嗜乳酸。生长温度为26～42℃最适温度32℃～35℃，能耐10%乙醇。红曲霉以其能产大量的天然红色素而受到关注。长期以来，国内外微生物工作者对红曲霉的研究大多集中在传统的酿酒、制醋、着色剂以及进行关于生产淀粉酶、糖化酶等的研究与探讨。而对于药用及其他用途仅停留在《本草纲目》、《兽医本草》中的记载：红曲主治消食活血，健脾燥胃等。从上世纪80年代前后，国内外微生物学家才开始对其药用价值进行研究与探讨，近年来，对红曲霉中功能因子的分子结构和安全性等方面进行了广泛的研究。 关键词：红曲米；红曲霉；酵母菌；分纯； 1.菌种分离 1 实验材料 1.1 红曲米：取自广西武宣地区，是居民制作红糟酸所用的发酵剂。 1.2 培养基：①孟加拉红培养基②PDA培养基③营养琼脂④营养肉汤
1.3无菌生理盐水 1.4其他实验用品 试管，三角烧瓶，量筒，玻棒，高压蒸汽灭菌锅，PH试纸（PH5.5-9.0）牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等 2.实验步骤 2.1培养基的配制 按实际用量计算后，按配方称取药品放入三角瓶中，其中营养肉汤1.8g,营养琼脂0.33g,孟加拉红3.16g加水100ml加热溶解并不断搅拌至完全溶解后包扎，于115℃高压灭菌20分钟（由于当时疏忽导致灭菌温度没有达到121℃） 2.2生理盐水的配制称取Nacl0.85g加水100ml后加热溶解，包扎于115℃下灭菌20分钟, 2.3其他工具灭菌移液枪头，移液管等 2.4无菌检查将无菌的营养肉汤，营养琼脂培养基放入37℃恒温箱中，孟加拉红培养基放入28℃恒温箱中培养24-28h,无菌生长即可 3细菌分离 将无菌培养基加热溶解后于超净工作台倒平板，每皿厚度应为15-20mm,待冷却凝固后取2-3颗红曲米，采用点植法将之放入培养基中培养，贴上标签，其中孟加拉红6皿，PDA3皿放入28℃恒温箱中培养，其余放入37℃恒温箱中，培养24-28h观察结果 4观察结果