ISO与美国FDA的不同处
食品微生物检验方法（FDA与ISO对比）
内容提要：
l 菌落总数检测
l 大肠菌群及大肠杆菌检测
l 金黄色葡萄球菌检测
l 沙门氏菌检测
l 单核细胞增生李斯特氏菌检测
菌落总数测定——菌落总数的概念
l 菌落总数是指在被检样品的单位重量（g）、容积（ml）或表面积（cm2）内，所含能于某种固体培养基上，在一定条件下培养后所生成的菌落的总数。
菌落总数测定——卫生学意义
l 判定食品被细菌污染的程度及卫生质量。
l 及时反映食品加工过程是否符合卫生要求，为被检食品卫生学评价提供依据。
l 通常认为，食品中细菌数量越多，则可考虑致病菌污染的可能性越大，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
FDA BAM 菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
（每个稀释度做两个平行）
每皿内加入适量平板计数琼脂（PCA）
35 ℃ 48 ± 2h
菌落计数
FDA BAM 菌落计数方法
l 选择25~250CFU之间的菌落进行计数，计算公式如下：N=∑C/（1*n1+0.1*n2）*d
l 所有平板的菌落数都不足25CFU，报告EAPC/ml（g）为＜25*1/d。 EAPC：estimated aerobic plate count
l 所有平板的菌落数都超过250CFU，但不足100/cm2 ，报告EAPC/ml（g）为最接近250CFU 的平板菌落数的估计值，乘以相应的稀释度。
l 所有平板的菌落数都超过100/cm2 ，计算平板的面积（直径为90mm的平板面积为
65cm2），估计最高稀释度每cm2的菌落数，乘以相应平板面积作为该稀释度的菌落计数结果，报告EAPC/ml（g）为＞65*100* 1/d。
l 无法计数的平板报告LA（Laboratory Accident）。
l 最终结果保留前两位有效数字。按照4舍6入，5是奇进偶不进。
ISO4833-2003菌落总数测定流程
检样xg/mL+9xml稀释液（磷酸盐缓冲液）
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
各取1mL分别加入灭菌平皿内
（每个稀释度做两个平行）
每皿内加入适量（12~15mL）
平板计数琼脂（PCA），
30±1 ℃ ，72 ±3 h
菌落计数
ISO4833-2003菌落计数方法
l 选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板，且一个平板至少含15CFU进行计数，计算公式如下：N=∑C/（n1+0.1*n2）*d
l 所有平板的菌落数都不足15CFU，计算2平板菌落的算术平均值m，液体样品：NE=m 固体样品：NE=m×d-1
l 无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 ×d-1
l 最终结果保留前两位有效数字。
菌落总数测定几点说明
l 由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养，因而并不是样品中实际的总活菌数，一些特殊营养要求的细菌、厌氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌，均难以反映出来。
l 鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因而平板上所得菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容积或表面积内的菌落数或菌落形成单位（colony forming units，CFU）报告。
菌落总数测定几点要求
l 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过15min，主要为防止细菌增殖和产生片状菌落。样液与琼脂应充分混合，避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上。皿内琼脂凝固后，不要长时间放置，然后倒置培养，可避免菌落蔓延生长。
l 检样过程中应用稀释剂做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检样过程中应在工作台上打开一块空白平板计数琼脂，其暴露时间应与检样时间相当，以了解检样在检验操作过程中有无受到来自空气的污染。
l 检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃放置，以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
l 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。l 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出的与粪便污染
有关的细菌，即作为食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
l 大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。
l 大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验）为++--或-+--的细菌。
l 与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌（EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
卫生学意义
l 大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。
l 食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
l 大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCP管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCP实施效果的评估指标。
大肠杆菌的生物学特性
培养特性：
l 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃
大肠菌群及大肠杆菌测定
——MPN法检验流程（FDA BAM）
检样50g+450ml稀释液
适当十倍稀释样品
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），
每管接种1mL
35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h 没有产气管有产气管
报告阴性
接种BGLB肉汤管接种EC肉汤
44.5±0.5 ℃ （水浴培养）
24 ± 2h ~48 ± 2h
查MPN表报告结果产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）
（大肠菌群）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜
面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气
查MPN表报告结果（大肠杆菌）
大肠菌群测定——MPN法检验几点说明
l MPN检索表：
MPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加10倍。l 初发酵和证实试验：
1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在37℃分解乳糖产酸产气”。
2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。
l 产气量与倒管：
在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
EMB平板典型大肠杆菌菌落特征：
中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽
大肠杆菌测定——EMB选择性分离鉴别
l EMB是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；
l 高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；
l 大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；
l 该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件
大肠杆菌测定——革兰氏染色
基本步骤：
l 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；
l 滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；
l 滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；
l 滴加番红复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。
l 结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
大肠杆菌测定——生化鉴定
（表略）
金黄色葡萄球菌——概述
l 根据《伯杰氏鉴定细菌学手册》，按葡萄球菌的生理化学组成，将葡萄球菌分为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis)和腐生葡萄球菌(S. saprophyticus)，其中金葡多为致病性菌，表葡偶尔致病。
l 金黄色葡萄球菌是人类化脓性感染中最常见的病原菌。可引起局部化脓性感染，如疖、痈、皮下脓肿、外科切口及烧伤创面的感染；也可引起肺炎、伪膜性肠炎、肾盂肾炎、心包炎等多系统的化脓性感染；还可引起败血症、脓毒症等全身性感染。葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶。
金黄色葡萄球菌——生物学特性
金黄色葡萄球菌呈球形，直径0.8μm左右，排列成葡萄串状，无芽孢，无荚膜。
金黄色葡萄球菌——生长特性
l 金黄色葡萄球菌在肉汤中呈浑浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈浑浊生长
金黄色葡萄球菌检验——方法适用性
l MPN法：适用于检测带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的含少量金黄色葡萄球菌的食品。
l 直接平板计数法：适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10/g（ml）的食品。
l 增菌培养法：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
金黄色葡萄球菌检验——直接平板计数法
（FDA BAM &ISO）
检样（50g+450mL稀释液）
适当十倍稀释样品
选择2~3个连续适宜稀释度
吸取1ml菌液按照0.3mL、0.3mL、0.4mL分别涂布于
3块90mmBaird-Parker平板上（做平行试验）
35℃ ，45~48 h
确证试验
报告
FDA BAM 金黄色葡萄球菌检验——MPN法
检样（50g+450mL稀释液）
适当十倍稀释样品
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管10% NaCl TSB肉汤，
每管接种1mL
35℃ ，48 ±2 h
从生长的管中接种1环划线于 Baird-Parker平板上
35℃ ，48 h
确证试验
报告
FDA BAM 金黄色葡萄球菌确证试验
1.凝固酶试验
l 方法：从平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落，移种到TSB/BHI肉汤中，置35℃培养18-24h。取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆充分混合，置35℃培养，定时观察是否有凝块形成，至少观察6h。试验中需同时做已知阳性和阴性对照。
l 结果判定：以内容物完全凝固，使试管倒置或倾斜时不流动为阳性。部分凝固（2+和3+）的必须进行生化鉴定加以证实。
FDA BAM金黄色葡萄球菌确证试验
2.革兰氏染色
l 对所有的可疑培养物都要进行革兰氏染色。
3.生化鉴定
l 过氧化氢酶试验
l 葡萄糖厌氧利用试验
l 甘露醇厌氧利用试验
l 金葡溶菌酶敏感性试验
l 耐热核酸酶试验（辅助
ISO 金黄色葡萄球菌检验——MPN法
检样（xg+9xmL稀释液）
适当十倍稀释样品
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，
每个稀释度接种三管
modified Giolitti and Cantoni broth，
37℃ ，24~48 h
从变黑或出现黑色沉淀的管中
接种1环培养物于 Baird-Parker平板上
37℃ ，48 h
确证试验
报告
沙门氏菌属简介
l 1880年E. Berth首先发现伤寒沙门氏菌，1885年Salmon与Smith又分离出猪霍乱沙门氏菌，以后取Salmon氏之名为本菌属之名。
l 沙门氏菌属是一群符合肠杆菌科定义并与其血清学相关的革兰氏阴性、需氧性、无芽孢杆菌。本菌属种类繁多，抗原结构复杂，现已发现2000多个血清型，我国已发现血清型近200个。
沙门氏菌属——生物学特性
形态特征：
革兰氏阴性，大小为1~3×0.4~0.9μm的两端钝圆的短杆菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡沙门氏菌和雏沙门氏菌以外，都有周身鞭毛，运动力强。
培养特性：
l 沙门氏菌需氧或兼性厌氧，10-42 ℃都可生长，最适生长温度为37℃，最适pH为6.8~7.8。
l 营养琼脂平板上：35~37℃培养18~24h，其菌落大小一般为2~3mm，光滑、湿润、无色、半透明、边缘整齐。
l 血平板上：中等大小的灰白色菌落。
沙门氏菌属的抗原
l 菌体抗原（O抗原）
l 表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原
l 鞭毛抗原（H抗原）
l 纤毛抗原
FDA BAM沙门氏菌检验流程
前增菌 25g样+225mL乳糖肉汤（肉制品、肉副产品、动物产品）
匀质2min，室温放置60 ±5min
混合均匀，测定调节PH6.8 ±0.2
35℃、24 ± 2h
选择性增菌
0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB
42℃、24h
（水浴培养）35℃、24h 43℃、24h （水浴培养）
含菌量高含菌量低
分离培养划线接种选择性培养基（BS、XLD、HE）
35℃、24~48h（BS）
生化鉴定每个平板挑取至少2个可疑菌（包括典型和非典型各2个）
接种TSI三糖铁、LIA赖氨酸铁高层斜面（LIA高层深4cm）
（松盖以保持有氧条件防止产生过多H2S）
35℃、24±2h
弃去尿素酶试验卫矛醇、氰化钾、丙二酸钠、吲哚试验阳性阴性
血清学血清学试验——沙门氏菌的分类
报告结果
ISO6579沙门氏菌检验流程
前增菌 25g样+225mLBPW
匀质
37±1℃、18 ± 2h
选择性增菌
0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn
41.5 ± 1℃、24 ± 3h37 ± 1℃、24 ± 3h
（水浴培养）
分离培养划线接种选择性培养基（XLD和第二种选择性培养基，如 BS）
37℃、24~48h（BS）
每个平板挑取至少5个可疑菌进行纯培养和确认试验
37℃、24±3h
生化鉴定 TSI、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、β-牛乳糖、V-P、吲哚试验
血清学血清学试验——沙门氏菌的分类
报告结果
沙门氏菌检验选择性分离培养
XLD琼脂：
FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，带或不带黑色中心。许多沙门氏菌培养物可呈现大的具光泽的黑色中心或几乎为全部黑色的菌落。
——非典型菌落：黄色带或不带黑色中心。
ISO——中心黑色、周围由于指示剂颜色的改变而出现红色的轻微透明带。
菌名菌落形态
鼠伤寒沙门氏菌红色，有黑心
伤寒沙门氏菌红色，有黑心
弗氏志贺氏菌红色
大肠埃希氏菌黄色，有胆盐沉淀环
粪链球菌 -
沙门氏菌检验选择性分离培养
BS琼脂：
FDA BAM——典型菌落：产硫化氢菌落黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围的培养基通常开始呈褐色，但伴随培养时间的延长而变为黑色，并有晕环效应；
——非典型菌落：有些菌株不产生硫化氢，形成灰绿色菌落，周围培养基不变色。
沙门氏菌检验选择性分离培养
HE琼脂：
FDA BAM——典型菌落：兰绿色至兰色，多数菌株产硫化氢，菌落带或不带黑色,中心或几乎全黑色。
——非典型菌落：乳糖阳性的菌株为黄色中心黑色或全黑色。
沙门氏菌检验生化鉴定
TSI：
典型反应：斜面产碱（K）：红色；底部产酸（A）：黄色；产H2S：黑色（少数不产）
沙门氏菌检验——几点注意
l 冷冻样品解冻需在45℃以下，有自动调温器自控的水浴锅内不断搅拌进行15min或在2-8℃，18小时内软化。
–为保证检验的准确性，必须在选择性培养基上挑取足够数量的菌落进行生化和血清学鉴定。
l 进行生化反应时，应以纯培养物进行试验，如出现血清学阳性，而生化反应特征不符合时，应对接种物进行纯化，用纯化后的培养物重新进行生化试验。
–测试中应同时接种阳性对照菌株。
李斯特菌属简介
l 《伯杰氏鉴定细菌学手册》第9版中，李斯特菌属有7个种：单核细胞增生李斯特氏菌（L. monocytogenes）、英诺克李斯特氏菌（L. innocua）、西尔李斯特氏菌（L. seeligeri）、威尔斯李斯特氏菌（L. welshimeri）、绵羊李斯特氏菌（L. ivanovvi）、格氏李斯特氏菌（L. grayi）、默氏李斯特氏菌（L. murrayi）。
l 单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌病的致病菌，可引起动物的感染，也可引起人的感染。
单核细胞增生李斯特氏菌——生物学特性
培养特性：
l 生长温度为2~42℃（冷藏不能阻止该菌的生长），最适生长温度为35~37℃。20~25 ℃培养有动力，37 ℃培养动力消失；在显微镜下观察该菌新鲜的室温肉汤培养物可见翻筋斗运动。l 在pH3.8~4.4仍能生长，在pH中性至弱碱性（9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在6.5%NaCl肉汤中也能良好生长。
l 血平板上：菌落通常不大呈灰白色，刺种血平板可产生窄小的β溶血环。
FDA BAM单核细胞增生李斯特氏菌检验流程
检样25g
增菌 EB增菌液基础225mL
30℃ 4h
加入抑菌剂
30℃ 20h 30℃ 44h
选择性分离培养接种OXA和 PALCAM 接种OXA和 PALCAM 35℃ 24-48h 35℃ 24-48h
生化鉴定 TSA-YE纯培养
30℃ 24-48h
典型运动 TSB-YE
过氧化氢酶试验
革兰氏染色
溶血试验
ISO单核细胞增生李斯特氏菌检验流程
测试样品（x g或x mL）+9x mL一次增菌培养基（Half Fraser肉汤）
30℃培养24±2h
1mL培养液加入划线接种Oxford琼脂
10mL二次增菌培养基中和PALCAM琼脂
（Fraser肉汤）
35℃或37℃培养48±2h30℃、35℃或
37℃培养24-48h
划线接种Oxford琼脂
和PALCAM琼脂
30℃、35℃或37℃培养24-48h
李斯特菌属的确证：
挑取可疑菌接种TSAYE培养基
过氧化氢酶试验
革兰氏染色
动力试验
单核细胞增生李斯特菌的确证：
溶血试验
碳源利用试验
CAMP（协同溶血）试验
单核细胞增生李斯特氏菌——溶血试验
l 制备5~7%羊血琼脂平板。
l 挑取TSAYE平板上的典型菌落刺种血平板，刺种时避免接触到平板底部和使琼脂破裂，同时接种阳性（单核细胞增生李斯特氏菌）和阴性（英诺克李斯特氏菌）对照。
l 单增呈现狭窄、清晰、明亮的β-溶血；
l 西尔李氏菌出现弱的溶血现象；
l 绵羊李氏菌通常呈宽的、轮廓清晰的β-溶血；
l 英诺克李氏菌不产生溶血现象。
单核细胞增生李斯特氏菌——协同溶血试验（CAMP）
l 方法：在羊血琼脂平板上平行接种β-溶血金黄色葡萄球菌（S.aureus）和马红球菌(R.equi),在它们中间垂直划线接种可疑菌，与两线相近但不相交，在30℃培养24h-48h,检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。
l 结果：靠近金黄色葡萄球菌接种点的单增李斯特氏菌的溶血增强，西尔李斯特氏菌的溶血也增强，绵羊李斯特氏菌在马红血球附近的溶血增强。
ISO李斯特氏菌鉴定反应
种别溶血性产酸 CAMP试验
鼠李糖木糖金黄色葡萄球菌马红球菌
L.monocytogenesL. innocuaL. ivanovviL. seeligeriL. welshimeriL. grayiL.
murrayi +-+(+)--- +v--v-v --+++-- +--(+)--- --+----
v: vatiable reaction(+): weak reaction+: >90% of positive reaction -: no reaction
FDA李斯特氏菌属的区别
种别溶血性毒力a 糖发酵c
甘露醇鼠李糖木糖
L.monocytogenesL. ivanovvi L. innocua L. welshimeriL. seeligeriL. grayiL. murrayi b ++--+-- ++----- -----++ +-vv-vv --++-+-
a: mouse testv: variable biotypesb: 硝酸盐还原试验阳性，其它种该反应为阴性。c: 葡萄糖、麦芽糖、七叶苷糖发酵试验全部为阳性。
几种常用稀释缓冲液介绍
l 磷酸盐缓冲液
储备液的制备：称取34g磷酸二氢钾溶解于500ml蒸馏水中，用1NNaOH
溶液调整pH值为7.2，再用蒸馏水稀释至1000ml，121℃高压灭菌
15min，于冰箱中储存。
稀释液的制备：取1.25ml储备液，用蒸馏水稀释至1000ml，定量分
装，121℃高压灭菌15min备用。
l 0.85%生理盐水
称取8.5gNaCl溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌
15min备用。
l 0.1%蛋白胨水
称取1g蛋白胨溶解于1000ml蒸馏水中，定量分装，121℃高压灭菌
15min备用。蛋白胨水对细菌细胞有更好的保护作用，不会因为在稀释
过程中使检样中原已受损伤的细菌细胞导致死亡。
l 无菌水
菌落总数检测中的注意要点 菌落总数测定 一、茵落总数的概念和测定意义 菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。 菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。 菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据． 二、茵落总数测定的几项说明 1．菌落总数的测定。是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。 2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。 3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。 三、茵落总数的测定 测定食品中菌落总数时，是将食品检样做成几个不同的lO倍递增稀释液，然后从各个稀释液中分别取出一定量在平皿内与营养琼脂相混合，经培养后，按一定要求计算出皿内琼脂平板上所生成的细菌集落数，并再根据检样的稀释倍数，计算出每g或m1样品中所含细菌菌落的总数。 四、菌落总数测定中的一些要求和规定 为了正确地反映食品中各种需氧和兼性厌氧菌存在的情况，检验时必须遵循以下一些要求和规定。
食品中菌落总数的测定 一、实验目的 （1）学习和掌握测定食品中菌落总数的基本方法 （2）学会菌落总数的报告方式 二、实验材料 1、仪器与设备：恒温培养箱、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、灭菌刀或剪刀、75%酒精棉球、玻璃蜡笔。 2、培养基和试剂：75%乙醇、0.85%生理盐水、琼脂培养基：胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、 琼脂15.0g、蒸馏水1000mL、pH 7.0±0.2 3、检样：利乐包装鲜牛奶250ml 三、实验方法与步骤 1、检验程序 菌落总数检验程序： 检样→做成几个适当倍数的稀释液→选择2-3个适宜稀释度各以1ml之量分别入灭菌平皿内→每皿内加入46℃15-20ml营养琼脂→置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出→菌落数→报告 2、检样稀释及培养 （1）以无菌操作，将检样包装打开，用吸管取25ml鲜牛奶，放于含有225ml灭菌生理盐水的500ml灭菌玻璃三角瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠），经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。 （2）用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。 （4）根据食品卫生检验标准要求和检样的菌落数量，选择3个连续适宜稀释度即10、10－1、10－2，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿15ml~20mL，并转动平皿使与稀释检样混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃恒温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1mL样品所含菌落总数。 四、检样中细菌菌落总数的计算与报告 1、菌落计算方法 （1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300 CFU之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， ②稀释度的选择 应选择平均菌落数在30～300 CFU之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30～300之间，按以下公式计算：
二、施工测量的工作划分 1、控制测量包括： （1）开工前的交桩和接桩； （2）控制网建立，导线点加密，基线的铺设和测量； （3）控制水准点的布设和测量。 2、定位测量包括： （1）测放样路线中桩、路线用地界桩、路堤坡脚桩和控制桩等； （2）测放构造物的轴线点位，桩与柱的中心定位； （3）墩台的中轴线位等。 3、现场放样：包括测放构造物的轴线和轮廓线，路线中线和边线等。 4、工程计算的测量。 5、中间交工和竣工验收测量。 三、测量工作的管理 1、施工单位测量工作的组织。 （1）施工单位必须有一位有经验的测量工程师负责施工的测量放样工作，并有固定的专业测工从事测量工作。 （2）施工单位使用的测量仪器必须定期由国家主管部门进行标定，证明精定合格后，方可使用。 2、监理测量工作的组织 监理组设测量监理工程师一人，工程师助理2人，配置经过标定的测量仪器，负责所管工程范围内全部测量的监理工作。测量监理工程师应巡视和检查全站测量工作的情况，指导和检查全路线的测量工作。 3、工作关系 施工单位测量组负责施工测量工作的实施，在工作全过程中必须严格按本细则的监理程序执行，全面接受监理组的监理。监理组对本段的测量放样负有全面监理责任，并严格按本细则规定的监理程序实施监理。测量监理工程师应对放样的成果进行复核和签证。 四、监理程序及工作内容 1、交接桩的监理工作程序 （1）由设计单位按图纸到现场交桩和提交桩点坐标，包括导线桩、水准点等。 （2）施工单位接桩后，应在14天内对全路线导线进行复测，复测导线时，必须和相邻施工段的导线闭合经平差计算，测量精度应满足设计要求。 （3）施工单位复测后，认为各桩点坐标高程值符合精度要求，即可书面表示接受并负责保护直至竣工。若有错误桩点的编号和经复测量计算的坐标或高程值报测量监理工程师。（4）施工单位在复测结束后，应向监理组提交一份桩位复测报告，交测量监理工程师审核，报告应包括： a、全部复测的记录（导线水平角观测记录、测距记录、四等水准测量记录）。 b、坐标、高程平差计算书，及计算结果 （5）监理组审核了复测报告之后，认为测量无误，桩位准确，即可批准按原设计提供的导线桩点坐标和水准点高程进行测量控制；若有错误，则请设计单位复测并对有错误的桩位坐标进行更正。 2、控制测量的监理程序 （1）导线点加密的监理程序 a、由施工单位负责埋桩和测量，并计算桩位坐标。 b、施工单位将测量的全部记录和计算书上报驻地办。
菌落总数的测定 基础知识： 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。 菌落总数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每g（mL）检测样品所生长出来的细菌菌落总数。由于厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际其中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数、需氧菌数等。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生长过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。中国国家标准是国内常用的检验方法。 菌落总数测定的卫生学意义： 食品本身的新鲜程度 加工、贮存运输过程中是否受到污染 卫生学指标：食品中菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检验，才能对食品做出较全 面的评价。 细菌在平板计数琼脂上的菌落特征蔓延菌在平板计数琼脂上的菌落特征方法来源：
GB 4789.2-2016 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定 1、范围 本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定方法。 本标准适用于食品中菌落总数的测定。 2、术语和定义 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃~5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4 天平：感量为0.1g。 3.5 无菌袋。 3.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。 3.7 无菌培养皿：直径90mm。 3.8 放大镜或/和菌落计数器。 4、培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基 按照称取23.5g培养基溶于1000mL蒸馏水的比例进行配置，分装到锥形瓶，121℃高压灭菌15min。 4.2 0.85%无菌生理盐水 称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水。一般用1000mL锥形瓶配置，称取6.8g的氯化钠，加入800mL蒸馏水，121℃高压灭菌15min。
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
Process and product of monitoring and measurement control Procedure 过程和产品的监视测量控制程序 1.目的 对产品的监视和测量活动进行控制，确保对产品监视和测量的结果的正确性，流转或交付使用的产品符合规定质量要求。 2.适用范围
适用于产品实现全过程对产品的监视和测量，包括进货检验、过程检验、出厂检验。 3.职责 3.1 质量部负责产品检验规程的制定。 3.2质量部负责产品监视和测量活动的实施，建立并保存记录。 3.3 生产部负责对产品实现过程的监视和自检 3.4厂长、技术部、质量部负责紧急放行的审核与批准。 4.过程活动 4.1 产品监视和测量的总要求 4.1.1总要求 a) 质量部负责（必要时生产部配合），对具体的产品，依据其产品标准和规定产品特性的设计文件编制产品检验规程，确定检测控制点、检测项目、检测方法、判定依据和使用的测量设备。关键过程，出厂检验应编制检验指导书。 b) 检验控制点包括：进货检验，工艺文件规定的检验控制点，关键过程、特殊过程作业指导书规定的检验控制点，装配测试、出厂检验检验指导书或检验表格规定的检验内容等。 c) 产品的监视和测量活动必须按检验规程进行，严格对照产品标准，设计文件、工艺规程等技术文件的要求，对产品质量的符合性做出科学、客观的判定结论。用于产品监视和测量的设备应符合《监视和测量控制程序》的相关规定。 d)质量部负责对工艺纪律的执行情况进行监视，在检验控制点对产品实施测量，对不同检验状态的产品按《标识和可追溯性控制程序》的相关规定进行标识、放置。对经检验不合格的产品或过程制品，严格执行《不合格品控制程序》的相关规定。 e) 供销、生产和操作人员在作业过程中对作业过程进行监视、对产品实现过程进行自检、互检。在检验人员对产品进行检验时，支持和配合检验人员的工作。 f) 负责产品监视和测量的检验人员，必须在技能、经验或培训方面取得相应的资格。 g）检验规程的更改，应执行《文件控制程序》 4.1.2 记录建立及保存 按《记录控制程序》的要求建立和保存产品监视和测量的记录。检验记录应符合以下方面的要求： a)包括检验项目、标准或设计要求、检验结果和检验结论等内容。当检验项目有量值要求时，应在要求栏中描述规定的量值、在检测结果栏内填写实测量值。 b) 符合《记录控制程序》的要求。
文件制修订记录
1.0目的 规范实验室管理，确保在组织质量控制、质量改进工作中所进行的检验、测量、试验等工作的顺利进行，快速准确的完成各项质量检验、测量和试验工作。2.0适用范围 本规定适用于公司范围内所有用于检测、测量和试验活动所涉及到的实验室的全过程管理控制。 3.0术语及定义 3.1实验室 进行包括但不限于包括化学、冶金、尺寸、物理、电性能或可靠性试验在内的检验、测量、试验和校准的机构，包括人员、设施和环境。 4.0职责 4.1过程质量管理部 4.1.1负责实验室测量设备的检定/测量归口管理，对外部实验室能力及进货检验的性能试验进行监控； 4.1.2负责整车检测线委外检测、整车路试、三坐标测试及日常管理。 4.2人力资源部 负责组织对实验室人员的培训和资格确认。 4.3试制试验部 4.3.1负责编制实验室管理制度、制定实验室操作及维护保养规程； 4.3.2负责实验室的日常管理，遵守实验室的操作规程； 4.3.3负责对生产制造过程和新产品研制开发过程中的零部件、发动机、白车身和整车等依据技术文件标准进行检验、测量和试验工作。 5.0工作程序 5.1工作流程：见附件。 5.2试验范围
5.2.1实验室有资格进行的特定试验、评价和校准。本公司实验室试验项目：检测线整车检测试验、整车性能与排放性能试验、整车安全性能试验、发动机性能试验、传动系统性能试验、电驱系统性能试验、混合动力系统性能试验、电池性能试验、环境与材料性能试验。 实验室设备及试验项目一览表
应建立相应的方法并经试验主管部门负责人批准后方可执行，并在试验记录中说明。 5.2.3用来进行上述活动的设备、方法和标准的清单详见《实验室设备及试验项目一览表》。 5.3实验室人员资格确认 5.3.1实验室应由技术、测量、试验人员组成，技术人员对技术负全面责任，测量、试验人员按照各自的职责完成测量/试验任务，确保测量、试验工作的公正性和准确性。 5.3.2监控与测量装置的有关人员（包括计量检测、计量管理以及其使用操作人员），应当具备相应的能力和资格，以确保测量系统的准确性和完整性。5.3.3实验室试验人员的资格参见实验室组织架构及人员资质，试验人员必须经过培训，持有检测/试验资格证书。 5.4实验室环境控制 5.4.1测试的环境条件应按照国家校准规范或校准设备技术说明书的要求进行控制，以消除或减少环境因素对测试结果的影响。 5.4.2对检测/试验结果有影响的环境条件应予以监测、控制和记录填写《实验室环境监控记录》，并对检测/试验结果做相应校正。
A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤 A.1.1 成分 胰蛋白胨或胰酪胨20.0 g 氯化钠5.0 g 乳糖5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g 磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g 月桂基硫酸钠0.1 g 蒸馏水1 000 mL pH 6.8±0.2 制法 将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH 。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL 。121 ℃高压灭菌15 min 。
菌落总数检验操作规程 一、目的 建立菌落总数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。 二、适用范围 适用于菌落总数的检验操作。 三、职责 1.检验人员 严格按检验操作规程进行检验。 2.QC主管 监督检查执行情况。 四、程序 1.范围 本方法适用于食品中菌落总数（Aerobic plate count）的测定 2.术语和定义 菌落总数：食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 3. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。 3.2冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 3.4天平：感量为0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11放大镜或和菌落计数器。 4.培养基和试剂 4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1。 4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.2 4.3 无菌生理盐水：见附录A中A.3。 5.检验程序 菌落总数的检验程序见图1。 图1 菌落总数的检验程序 6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液 6.1.3用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支
检验程序流程图
1）路基、基坑施工安全措施 （1）路基开挖、软基处理前对地下管线进行调查或控挖，有地下管线的地段，必须做好管线的改移或进行有效保护。 （2）由于施工用地紧张，多台大型土方机械集中施工时，各机械作业要保证有足够的作业空间，并要有专人在施工现场指挥调度，保证施工有条不紊的进行。挖掘机与土方运输车配合施工时，挖掘机的挖斗不得超过土方运输车的驾驶仓。 （3）弃土、淤泥及时清运，临时堆土的堆土坡脚至坑边距离应按挖坑深度、边坡的坡度和土的类别确定。 （4）深挖方地段挖掘机间距应大于10m，挖土自上而下、逐层进行，严禁先挖坡脚危险作业。 （5）挖方前对周围环境要认真检查，不能在危险土体建筑物下作业。 （6）基坑开挖须严格按要求放坡或支护，操作时应随时注意边坡的稳定情况，发现问题及时加固处理。 2）脚用架、支架工程施工安全措施 （1）钢管、扣件、螺栓的质量应符合规范规定。不准使用锈蚀、弯瘪、滑牙和有裂缝的金属杆件。 （2）脚手架纵、横距、步距应通过安全检算，满足结构安全需要。 （3）脚手架、支架搭设前，应对场地进行平整夯实、砼硬化处理，同时作好场地排水。
（4）脚手架、支架搭设完成后，应组织分段验收，合格后方准投入使用。 3）安全技术通用措施 （1）在施工现场主要施工部位、作业点、危险区、主要通道口布设足够数量的警示牌、防护栏杆、标牌等，夜间设红灯警示，保证施工安全。 （2）详细编制各工种作业技术标准和安全操作细则。杜绝违章行为，消除事故隐患，切实保障施工安全和重要设备不受损失。 （3）严格技术管理，在技术交底的同时，进行安全措施交底。坚持工序技术交底制，并在施工中督促检查，使安全工作落到实处。 （4）施工机械在投入使用前按规定的安全技术标准进行检测、试运行和验收，确认能安全运行的方可投入使用，使用期间是悬挂“安全操作规程牌”，由专人持操作证使用，并定期维修。
【说明】蛋糕具有松软香甜，携带方便、食用简单等特点，因此成为人们居家生活特别是旅途中不可或缺的一种美食，深受人们的喜爱。测定蛋糕中的菌落总数可以用来判定其被微生物污染的程度及卫生质量，它反映蛋糕在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价，菌落总数的多少在一定程度上标志着蛋糕产品质量的优劣，因此，测定蛋糕中的菌落总数具有重要意义。目前应用于测定食品中菌落总数的方法有: 纸片法、电阻抗法等。本实验采用国标法(GB\T 对独立包装小蛋糕中菌落总数进行测定。并与GB 7099-2003糕点、面包卫生标准中规定的冷加工糕点中菌落总数≤10000（cfu/g）的数据对比初步判断样品是否符合卫生要求。 一、实验目的 1、学习并掌握测定蛋糕中菌落总数的方法及原理。 2、通过对比实验验证冷藏对蛋糕的保鲜及抑菌作用。 3、了解菌落总数测定在食品卫生学评价中的意义。 二、实验原理 菌落总数即为食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。 菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、实验设备与材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1℃，30℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。
施工测量监理工作流程图 部门： xxx 时间： xxx 制作人：xxx 整理范文，仅供参考，可下载自行修改
二、施工测量的工作划分 1、控制测量包括： <1）开工前的交桩和接桩； <2）控制网建立，导线点加密，基线的铺设和测量； <3）控制水准点的布设和测量。 2、定位测量包括： <1）测放样路线中桩、路线用地界桩、路堤坡脚桩和控制桩等； <2）测放构造物的轴线点位，桩与柱的中心定位； <3）墩台的中轴线位等。 3、现场放样：包括测放构造物的轴线和轮廓线，路线中线和边线等。 4、工程计算的测量。 5、中间交工和竣工验收测量。 三、测量工作的管理 1、施工单位测量工作的组织。 <1）施工单位必须有一位有经验的测量工程师负责施工的测量放样工作，并有固定的专业测工从事测量工作。 <2）施工单位使用的测量仪器必须定期由国家主管部门进行标定，证明精定合格后，方可使用。 2、监理测量工作的组织 监理组设测量监理工程师一人，工程师助理2人，配置经过标定的测量仪器，负责所管工程范围内全部测量的监理工作。测量监
理工程师应巡视和检查全站测量工作的情况，指导和检查全路线的测量工作。b5E2RGbCAP 3、工作关系 施工单位测量组负责施工测量工作的实施，在工作全过程中必须严格按本细则的监理程序执行，全面接受监理组的监理。监理组对本段的测量放样负有全面监理责任，并严格按本细则规定的监理程序实施监理。测量监理工程师应对放样的成果进行复核和签证。p1EanqFDPw 四、监理程序及工作内容 1、交接桩的监理工作程序 <1）由设计单位按图纸到现场交桩和提交桩点坐标，包括导线桩、水准点等。 <2）施工单位接桩后，应在14天内对全路线导线进行复测，复测导线时，必须和相邻施工段的导线闭合经平差计算，测量精度应满足设计要求。DXDiTa9E3d <3）施工单位复测后，认为各桩点坐标高程值符合精度要求，即可书面表示接受并负责保护直至竣工。若有错误桩点的编号和经复测量计算的坐标或高程值报测量监理工程师。RTCrpUDGiT <4）施工单位在复测结束后，应向监理组提交一份桩位复测报告，交测量监理工程师审核，报告应包括： a、全部复测的记录<导线水平角观测记录、测距记录、四等水准测量记录）。
过程的监视和测量 控制程序 S10.1 版本号：2 编号：SKT-C-S10.1 编制：年月日 审核：年月日 批准：年月日 受控状态： 年月日发布年月日起实施
过程的监视和测量控制程序 1目的 证实过程实现所策划结果的能力，采取适当措施，确保过程符合要求。 2 范围 适用于公司产品质量形成全过程。 3 职责 3.1 总经理领导质量管理体系过程的监视和测量工作。 3.2 管理者代表具体组织体系过程监视和测量工作。 3.3 各职能部门按照有关文件规定的职责、权限实施与部门专业（业务）管理有关的过程的监视和测量。 3.4 技术质量部是过程监视和测量的主管部门，除承担本部门的“监视和测量的控制”职责外，还负有对其他部门进行监督、检查职责。 4 程序流程图（见本程序最后一页） 5 程序 5.1 总经理负责对质量管理体系进行策划，对管理评审进行策划，配置必要的资源，负责批准有关部门编制的质量策划输出文件，批准管理评审报告。 监测依据：《管理评审控制程序》 5.2 管理者代表负责内部质量体系审核的策划，实施与监测对管理评审所需输入汇总资料的审定，并报总经理批准。 监测依据：《管理评审控制程序》、《内部质量体系审核控制程序》 5.3 技术质量部负责对产品监视和测量过程进行控制；负责监视和测量设备的控制；负责对过程进行日常的监视和测量。 5.3.1 对生产现场直接影响产品质量的诸因素（人、机、料、法、环）的日常监测由现场检验员负责。 5.3.2 技术质量部负责监视和测量设备检定、校准、台帐的建立和工装的检验检定。 5.3.3 技术质量部负责对生产过程的监视测量。 监测依据：《产品监视和测量控制程序》、《监视和测量设备控制程序》、《内部质量体系审核控制程序》、《纠正预防措施控制程序》 5.4 各部门按照有关程序文件的要求，按时开展各自专业管理及检查活动，对发现的问题提出处理意见，并对有关的整改，纠正活动实施监视、测量控制并保存有关记录。 5.4.1 技术质量部负责新产品实现的策划、开发、持续改进和工艺主管工作，对生产现场的技术问题进行协调处理及检查考核，并保存相关记录。 监测依据：《持续改进控制程序》、《文件控制程序》、《产品防护控制程序》《产品标识和可追溯性程序》 5.4.2 市场部负责对顾客服务进行策划、顾客满意情况的收集、分析、传递及跟踪，负责与产品有关要求（合同草案）的评审，并保存相关记录。 监测依据：《顾客满意控制程序》 5.4.3 物流部负责原材料等物资的采购控制，确保采购物资符合技术要求；会同技术质量部对供方的质量保证能力及所供原材料等物资的质量、符合性、服务、价格等进行评价，建立合格供方名单，并保存有关记录。 监测依据：《采购控制程序》 5.4.4 生产部负责生产现场的日常管理，对生产现场的管理工作进行计划、组织、协调、检查、考核，确保生产现场、工作环境达到规定要求，并保存有关记录。 监测依据：《生产过程控制程序》、《设备、工装和环境控制程序》 5.4.5 行政部负责人力资源管理、职责权限落实和人员培训工作。
微生物学检验菌落总数的测定 1 原理 微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列 不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克（或mL ）样品中的活菌数量。 2 材料和仪器 2.1 平皿：φ90mm 。 2.2 无菌锥形瓶：容量250mL ，500 mL 。 2.3 无菌吸管：1mL （具0.01mL 个度）,10mL （具0.1mL 刻度）或微量移液器及吸头。 2.4 灭菌锅。 2.5 恒温培养箱 2.6 涂棒。 2.7 酒精灯。 2.8 超净工作台。 2.9 磁力搅拌器。 2.10 漩涡振荡器 3 检验程序 菌落总数的检验程序见下图。 方法①↙ ↘方法② ↘ ↙
4 操作步骤 4.1 培养基和试剂的配制 4.1.1 平板计数琼脂培养基：LB培养基（最常用） 牛肉膏5g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂20g 蒸馏水1L pH 7.0～7.2 将上述成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值，分装锥形瓶中，121℃高压灭菌30分钟。 4.1.2 无菌生理盐水的配制： 称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌30分钟。 4.2 样品的稀释： 4.2.1 固体样品：称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中（内装 数粒无菌玻璃珠），在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，制成1：10的样品均液，即10-1稀释液。 4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品均液1mL（吸取前需要摇匀1：10稀 释液），缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面），用漩涡振荡器振荡，混合均匀，制成1：100的样品稀释均液。 4.2.3按照4.2.2操作程序，制备10倍系列样品稀释液，每递增稀释一次，换用一次1mL 无菌吸管或吸头。 4.2.4 根据对样品活菌数量的估计，选择3~4个适宜稀释度的样品均液（比如10-6，10-7，10-8，10-9稀释液）。 4.2 平板接种与培养 接种方法1： 用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中（每个稀释度做三个重复），再在培养皿中分别倒入10～15mL已融化并冷却至45~50℃的培养基，盖好平皿盖子，趁热轻轻转动培养皿，使菌液与培养基充分混合均匀，冷凝后在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-8，10-9，10-10。 接种方法2： 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2ｍＬ稀释液均液于计数培养基平板上，将稀释液涂布均匀，吸附，在恒温培养箱中倒置培养24～２８ｈ，培养温度为36℃±1℃。同时以无菌水作空白对照。（计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内） 注：比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为：10-7，10-8，10-9。 ４.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时借用放大镜或菌落计数器，以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示 4.3.1 选取菌落数在30~300之间，无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。
3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。 4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下： A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml 吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均
菌落总数检验步骤 第一法平板菌落计数法 6 操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或吸头。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。 6.1.6 及时将15 mL~20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 6.2 培养 6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48h±2h 。水产品30 ℃±1 ℃培养72h±3h. 6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。 6.3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony - forming units , CFU ）表示。 6.3.1 选取菌落数在30 CFU~300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。 6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 7 结果的表述 7.1 菌落总数的计算方法 7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。 7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（l ）计算： N=∑C/（n1+0.1n2）d……………………（1 ) 式中： N ― 样品中菌落数； ∑C ― 平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和； nl ― 第一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2 ― 第二个适宜稀释度平板上的菌落数；
食品中菌落总数的测定实验 一、实验目的： 了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放射菌、霉菌、的菌落特征。 二、原理 平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。 该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测 三、试剂和材料 1.仪器 恒温培养箱：（36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。） 均质器或振荡器
无菌吸管：1 ml（0.01 ml 刻度）、10 ml（0.1 ml 刻度）或微量 移液器及吸头 无菌锥形瓶：容量250 ml、500 ml、 无菌培养皿：直径90 mm 菌落计数器 2.样品 1）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：蛋白胨 5.0 g 、酵母浸膏2.5 g 、葡萄糖1.0 g 、琼脂15.0 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0±0.2。 将所有成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。 注：用平板计数琼脂，称取23.5 g于1 000 ml蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，121 ℃高 压灭菌20min，冷却至45~47℃左右备用。 2）无菌生理盐水：氯化钠（NaCl）5.875g 蒸馏水(纯净水) 500ml 称取5.875ｇNaCl溶于500ml蒸馏水中，121 ℃高压灭菌20min。 3.器材 100ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、天平、称样瓶、 记号笔、酒精灯等。 四、操作及实验步骤 1.样品的稀释：25 g(ml)样品+225 ml 稀释液，均质。 10倍系列稀释。每递增稀释一次，换用 1 次1 ml 无菌吸管或吸头。 （注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）选择2个～3个适宜稀释度 的样品匀液，各取1 ml分别加入无菌培养皿内。吸取 1 ml 空白稀释 液作空白对照。每皿中加入15 ml～20 ml 平板计数琼脂培养基，并 转动平皿使其混合均匀。
3.1.1 现场质量控制流程图 施工准备 项工程施工计划施工方案 工程质量控制指标 检验频率及方法 材料、机械、劳动力、现 场管理人员准备 分项开工报告 批准 分项开工批复单 每道工序施工 施工测量放线 报告 检验试验报告设计施工复核 不批准 分析原因，及时修复改正或返工 材料检查工艺流程检查测量检测试验检测质检工程师检查 自检结果 工序交接报告 不合格 抽样检查资料检查试验抽测测量检测工序检验记录检查 交工报告 不合格 合格 交工证书 现场质量控制流程图
3.1.2 质量管理组织机构流程图 指挥长 生产副指挥长 质量安全 总工程师 材 料 厂 科 程 工 安全质量 试 验 室 指挥部质管 工程师 质量安全 委员会办 指挥部质管 工程师 工 程 队 队 程 工 程 队 工 质量管理组织机构流程图
3.1.3 质量检验总流程图 原材料取样 不 合 标准试验格 试验结果评定、是否合格 试验报告 实施控制检验 成品抽样检验 试验结果评定、是否合格 合格不合格 作业结论分析原因 结束提出处理意见 质量检验总流程图
3.1.4 工程材料、构配件和设备质量控制流程图 承包单位填写 《工程材料/构配件/设备报验单》 方法： 承包单位另选不合格 监理工程师审核 合 格 1．审核证明资料 2．到厂家考察 3．进场材料检验 4．进行验证复试承包单位使用 工程材料、构配件和设备质量控制流程图
3.1.5 技术质量主要工作流程图 图纸会审 参加设计交底 编制施工组织设计工程师审批 工程物料确认 进场验收 技术复核 分部工程验收 技术交底工程定位交接 甲方、监理确认工程师确认 隐蔽验收质量验收 资料审核 甲方、乙方、设计联合验收 交付使用送交资料和竣工图 回访维修 技术质量主要工作流程图