包头师范学院
本科学年论文
论文题目：哺乳动物胚胎干细胞多能性和全能性研究进展院系：生物科学与技术学院
专业：生物科学
学号：0911370087
姓名：李巧英
指导教师：图雅
撰写学年：2009 至2010 学年
二零一零年十二月
摘要
本文主要介绍了哺乳类动物胚胎干细胞的一些生物学特性，并着重介绍了它的多能性和全能性，以及多能性或全能性的检测技术。利用此技术制作嵌合体及嵌合体动物可以为人类器官移植提供实验材料。胚胎干细胞有着极广的应用范围，本文综述了它在基因、遗传、克隆、体外细胞分化及哺乳动物的个体发育等方面的研究。但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。
关键词：胚胎干细胞；全能性；嵌合；分化
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This article mainly introduced the mammalia animal embryonic stem cell's some biology characteristic, and introduced its pluripotent and the totipotency emphatically, as well as pluripotent or totipotency examination technology. May provide the experiment material using this technical manufacture chimaera and the chimaera animal for the humanity organ transplanting. The embryonic stem cell has the extremely broad application scope, this article summarized it in the gene, the heredity, the clone, in vitro cell differentiation and mammal's aspect and so on ontoge- nesis research. But, as a result of the mammal intriguing gene regulation and environmental factor's influence, also has many problems regarding the embryo stem cell's research, but must do more thorough careful research.
Key words：Embryonic stem cell; Totipotency;The Qianmatches ;Divide
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中文摘要 (2)
英文摘要 (3)
引言 (4)
1 胚胎干细胞的生物学特性 (5)
1.1胚胎干细胞的定义 (5)
1.2 胚胎干细胞的形态鉴定 (5)
1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性 (5)
1.4胚胎干细胞的体外分化 (6)
1.5胚胎干细胞的遗传稳定性 (6)
2．细胞全能性或多能性检测的方法 (6)
2.1 原核注射技术 (6)
2.2 胚胎嵌合技术 (7)
2.2.1嵌合体制作技术 (7)
2.2.2检测ES细胞在嵌合体表达的方法 (7)
2.3 ES细胞的诱导分化检测技术 (8)
2.4 胚胎干细胞核移植技术 (9)
2.5 免疫学方法鉴定 (9)
3．胚胎干细胞应用前景展望 (9)
3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究 (9)
3.2 生产嵌合体动物 (9)
3.3 为发育遗传研究提供实验材料 (9)
3.4.胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料 (10)
3.5胚胎干细胞作为外源基因 (10)
3.6克隆动物 (10)
3.7胚胎干细胞用于治疗疾病 (11)
4、胚胎干细胞应用中的争议 (11)
结论 (12)
参考文献 (13)
致谢 (15)
胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)是从早期胚胎的内细胞团(Inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞(Primordialgerm cells, PGCs)分离出来的具有发育全能性的一种未分化的细胞,它具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能。它一方面保留了所有的发育潜力，在适合的条件下能够分化成多种类型的细胞、组织，将ES细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主细胞多种组织的构成，形成嵌合体并产生遗传；另一方面，人们可以对ES细胞的基因组进行各种遗传操作。因此，ES细胞己成为一种研究哺乳动物细胞分化、早期胚胎的发生、基因表达和调控、组织形成过程的基本体系，又是临床移植治疗的新的细胞来源。将ES细胞分离与克隆技术和分子生物学技术相结合就可将新的遗传物质导入家畜的生殖腺细胞。通过囊胚注入胚胎干细胞产生嵌合体小鼠，以及最近以培养的细胞群落为供体进行核移植所生产的绵羊所取得的进展都表明了对胚胎干细胞进行遗传操作是对动物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一，该项技术也可成为改良家畜的有效方法。但是，由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎干细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。
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1.胚胎干细胞的生物学特性
1.1胚胎干细胞的定义
若在显微镜下观察，存活5-7天的胚胎由大约140个细胞所组成，看上去就像黏稠的浆果或花粉粒。它们通体毛绒绒，相互依偎着呈空心的圆球状，这被称为胚泡。其外层组织即滋养层，由一层扁平的细胞组成，会发展成胎盘。胚泡中心的腔称“囊胚腔”，腔内一侧的细胞群即“内细胞团(Inner cell mass,ICM)”，胚胎干细胞便是由此分离培养建系的。这时的内层细胞尚未决定今后生长发育的走向，但它们均具有“全能性”，亦即可演变为200多种构成从心脏、肝脏、肾到皮肤、神经元等人体中任何一种器官组织的组成细胞。内层细胞团在形成人的内、中、外三个胚层时开始分化，每个胚层将分别分化形成人体的各种组织器官。如外胚层将分化为皮肤、眼睛和神经系统等，中胚层将形成骨骼、血液和、肌肉等组织，内胚层将分化为肝、肺和肠等。由于内细胞群可以发育成完整的个体，因而这些细胞被认为具有发育全能性。当内细胞群在培养皿培养并传代用于研究时，我们称之为胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES)[1]。
1.2 胚胎干细胞的形态鉴定
ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态,细胞体积小,核大,胞浆少,有1~2个核仁。ES细胞集落紧密聚集在一起,细胞间隙小,界限不清,形似鸟巢状。有时,ES 细胞集落周围可见单个ES细胞。
1.3 胚胎干细胞的全能性或多能性
ES细胞象其它细胞一样,可在体外培养、扩增、克隆、冷冻,并且人们可对其进行遗传操作和选择,其本质特性是全能性或多能性。所谓全能性(Totipotency)是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力,能发育成完整的动物个体[2]。多能性(Pluripotency)则是指ES细胞具有发育为多种组织的能力,参与部分组织的形成[3]。ES细胞全能性或多能性的基础是其具有的高度的分化潜能。细胞分化终究归结为在胚胎发育过程中基因组中的特定基因按一定顺序相继活化和表达。所以,细胞全能性的实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定顺序表达。细胞全能性或多能性与细胞分化状态的相对稳定性密切相关。细胞分化具有相对的稳定性,但在一定条件下,细胞分化又是可逆的。低等生物细胞和高等动物的早期胚胎细胞具有全能性,但用成年绵羊的乳腺细胞和胎儿成纤维细胞为供体进行核移植生出了绵羊羔,这表明:不但未分化的胚胎细胞具有全能性,已分化的体细胞在特定条件下经过脱分化也具有全能性。已
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分化的细胞具有的全能性的前提条件是这种细胞在体外诱导进入休眠状态。细胞全能性是细胞核基因在不断变化的胞质环境的作用下有次序、有系统地表达的结果,在分化的细胞内存在有可逆性修饰的遗传物质［4］。但并非所有的体细胞均具有全能性,例如红细胞,在成熟时失去细胞核,丧失了可逆性分化的遗传物质。
1.4胚胎干细胞的体外分化
在特定的体外培养条件下，ES细胞也能分化形成各种细胞系，如造血细胞、肌肉细胞和神经胶质细胞等。ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎细胞不完全相同，但在分子水平上仍有许多相似之处，因而可将其作为研究各种类型体细胞决定与分化机理等发育生物学问题的新颖的实验模型。与传统的整体胚胎的研究相比，体外ES细胞具有以下几个优点：(1)ES细胞在体外可分化形成各种终末细胞，这为研究某些前体细胞的起源和特性提供了理想的实验体系；〔2)体外培养系统能定性甚至定量地研究某些细胞因子，胞外基质等因素对细胞生长和分化的影响，避免和减少了整体胚胎研究中各种内源性因素干扰的复杂性；(3)在研究胚胎早期发育中某些必需基因的功能时，在体胚胎的这些基因常发生突变引起胚胎过早地在子宫中死亡，而在体外这些基因突变的ES细胞仍保持存活、增殖和分化的潜能，参与胚胎发育[5]。因此为研究这些基因在胚胎发育中的功能提供了基本条件。1.5胚胎干细胞的遗传稳定性
ES细胞在分化的过程中，可以将完整地体现原有的生理特点和结构组成，即基因能够得到完全的表达，具有稳定的遗传性能。因此，在骨髓移植、肌肉和皮肤等的修复等医学方面具有广阔的前景。也可在体外对ES细胞进行遗传操作选择，如诱导外源基因，标志基因等制作嵌合体，通常不会改变选择后的ES细胞本身的遗传性能，所以在理论上经遗传操作后的ES细胞仍能保持其扩增、发育的全能性的稳定遗传。这就可以根据这种性能制备转基因动物个体或基因缺失、突变或过量表达的杂合或纯合个体，以便分析各种基因功能和因的表达调控机制等[6]。2．细胞全能性或多能性检测的方法
2.1 原核注射技术
将目的基因用显微注射的方法导入受精卵原核中,获取具有标记性状的转基因胚胎。在体外分化抑制培养转基因胚胎,形成内细胞团,从中分离克隆具有特定标记性状的ES细胞。以其作供体进行核移植,检测目的基因表达产物,就可对ES 细胞的全能性或多能性进行鉴定。将这种技术与核移植和胚胎嵌合等技术相结合,
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就可以在ES细胞的功能方面检测其全能性或多能性。尽管这种转基因技术已成功地应用到小鼠、山羊、绵羊、兔子、猪和牛等动物,但仍存在许多问题,如导入的基因并非全部在细胞期整合形成转基因胚胎；目的基因的随机整合导致其产物发生变化；只有少数简单基因能够表达产物等。这都限制了该项技术的应用。
2.2 胚胎嵌合技术
嵌合体是指由2个或2个以上受精卵发育成的复合个体。将早期胚胎未分化的细胞(ES细胞和胞团细胞)导入另一个品种动物的早期胚胎中,可获得嵌合体动物［7］。如果细胞具有全能性(或多能性),它就可参与受体胚胎的发育,形成组织。若不参与受体胚胎的发育,注入的细胞就不具备全能性(或多能性)。
2.2.1嵌合体制作技术
（1）聚合法(Aggregation)
将ES细胞,内细胞团细胞或早期的卵裂球与一个或多个去透明带胚胎聚合培养,形成胚胎嵌合体,再通过胚胎移植,使受体妊娠,检测ES细胞参与胚胎发育的情况,就可证明ES细胞是否具有全能性或多能性[8]。ES细胞与8-16细胞期胚胎嵌合,形成嵌合胚,将嵌合胚进行胚胎移植,生产嵌合鼠。
（2）共同培养法
将裸胚置于浓度为106个/ml的ES细胞悬液中,培养3-4 h,再将聚合胚移入新鲜培养液中过夜,即得嵌合胚[8]。在体外培养到囊胚阶段,移入受体子宫,使妊娠,并对胚胎或活体后代进行检测,就可证明ES细胞的多能性。
（3）囊胚注射法
用显微注射法将ES细胞直接注射到正常囊胚的胚腔中,使ES细胞与ICM嵌合,形成嵌合胚,并对嵌合胚进行分析,也可证明ES细胞的全能性(或多能性)。
2.2.2用于检测ES细胞在嵌合体表达的方法
(1) 色素分析法
选择2种肤色、毛色差异明显的动物胚胎干细胞与胚胎进行嵌合,观察胎儿或个体的肤色或毛色,若呈现皮毛嵌合体,证明胚胎干细胞参与了胚胎发育,具有多能性。色素分析法的优点是简单易操作不需任何仪器,仅凭肉眼即可观察到结果。缺陷是难以检测到其它性状的嵌合［9］。
(2) 生物化学分析法
利用生物化学法、免疫组织化学法分析嵌合体,确定ES细胞在器官或组织中嵌合的表达程度及细胞的分化等。常用的重要方法是同工酶分析。首先应选用同
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工酶谱系不同的2种或多种动物,一种做为分离干细胞的供体材料,另一种做为嵌合胚的受体胚胎,将胚胎干细胞与受体胚胎嵌合形成嵌合胚。如果用电泳方法分析嵌合动物(胚胎)的同工酶,出现2种特异的同工酶带谱,就证明ES细胞参与了胚胎的发育,具有多能性,若只出现一种带谱,则说明不是嵌合体［8］。
（3）利用标记基因检测
利用DNA重组技术将抗药性基因在体外与腺病毒载体相结合,通过腺病毒的感染,使外源基因与ES细胞基因整合形成转基因ES细胞。将这种ES细胞通过核移植形成重构胚或通过显微注射形成嵌合胚,通过胚胎移植获得的嵌合动物或核移植动物少量组织在含有特定药物的培养基中培养,若能正常增殖,证明ES细胞参与了该组织的形成,具有发育全能性或多能性。Mitan-k等用这种方法成功地获得了具有抗新霉素的小鼠ES细胞的克隆,丛笑倩等获得了抗秋水仙碱的ES细胞,并产生了嵌合鼠［10］。
（4）生殖细胞系中的嵌合
用携带特定基因的ES细胞制作嵌合体,如果ES细胞参与配子形成,特定基因即可在子代表达。应用该项技术检测培养细胞全能性应该注意：①培养细胞必须是整倍体；②嵌合现象应广泛存在于各个器官；③所用细胞系以XY型为好；其理由是,在培养过程中XY比XX细胞稳定；XY雄性哺乳动物能在短期内产生大量的后代,便于检测［7］。
2.3 ES细胞的诱导分化检测技术
体外分化试验：①类胚体将ES细胞从饲养层转移到涂有明胶的培养板中(6×106个/10 cm板)培养3 d,待ES细胞集落形成时,用PBS(-)清洗细胞表面,并加入2 ml胰酶,消化2 min。轻轻摇动培养皿,使细胞成片或成凝集团状离开底层,然后加入过量DMEM+10%NBS培养液中和酶。将ES细胞团在无饲养层溶液中悬浮培养4-5 d,若形成简单类胚体,就证明培养细胞具有多能性。②囊状胚体将类胚体在培养液中继续培养8-10 d(每2 d换一次溶液),可形成囊状胚体。③类胚体贴壁分化将4月龄的类胚体以适当密度在明胶层上培养。2 d后将贴壁进一步培养发分生分化,形成诸如神经细胞、肌肉细胞等,然后采用组织切片技术进行鉴定。④定向诱导分化将待测ES细胞培养在无分化抑制因子但有某种定向分化的诱导因子的培养基中,若形成特定的组织,即证明这种细胞具有多能性,用于ES细胞定向诱导分化的试剂主要有维生素A酸(Retinotic acid, RA), DMSO(二甲基亚砜)、六亚甲基乙酰胺(Hexamethylenebis-acctamide)及神经生长因子等。在实践中,将ES细胞培养在含有RA的培养基中,RA诱导ES细胞分化形成体壁内胚层;用神经生长因子诱导聚集培养的ES细胞,形成有节律性收缩的心肌细胞。这说明,用定向诱
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导分化的方法,可对ES细胞进行初步鉴定［11］。体内分化试验将浓度为106个/ml 的ES细胞悬液注射入同源动物皮下,形成混合组织瘤,取瘤块,按常规方法制作组织切片,染色,观察细胞分化情况。若形成多种组织细胞,就可证明注入的细胞具有多能性。该方法不需复杂的培养条件,利用动物体稳定的内环境,易于成功［11］。2.4 胚胎干细胞核移植技术
细胞核移植技术是哺乳类动物胚胎工程的重要组成部分,也是实现同型动物克隆的有效方法。采用该技术可对移植细胞的全能性进行有效的检测。将瓜蟾的囊胚细胞移入去核的卵母细胞,获得具有繁殖力的后代,将ICM细胞转入去核卵母细胞形成重构胚,该重构胚可发育至正常仔鼠,此外,家兔、山羊及牛的早期胚胎细胞及ICM的核移植胚胎都能发育成个体［12］。Campbell等用第三代类ES细胞作核移植,获得4只绵羊,从实践上也证明,用细胞核移植技术进行胚胎干细胞全能性鉴定是可行的。
2.5 免疫学方法鉴定
碱性磷酸酶(AKP)染色或免疫荧光标记是检测ES细胞多能性比较可靠的方法。ES细胞保持着早期胚胎未分化的特性,其表面含有丰富的AKP及胚胎阶段特异性抗原,采用AKP染色或SSEA免疫荧光标记,ES均表现为阳性反应[13]。
3．胚胎干细胞应用前景展望
3.1胚胎干细胞在哺乳动物个体发育中的研究
由于ES细胞可分化为胚胎的内胚层、中胚层和外胚层中任何一类细胞,于是可将带有遗传标记的ES细胞注入早期胚胎的囊胚腔,通过组织化学染色,了解ES 细胞的分化特点,这就为研究胚胎发育过程中的细胞分化及组织和器官形成的规律,进而研究动物体器官形成的时间、发育过程以及影响的因素等提供了可能［14］。
3.2 生产嵌合体动物
将ES细胞注入受精卵内,或将ES细胞与早期胚胎共同培养形成嵌合胚,再通过胚胎移植产生嵌合体动物,以获得新的性状。例如,异种动物的嵌合体,可以克服免疫排斥反应,为人类器官移植提供实验材料［15］。
3.3 为发育遗传研究提供实验材料
研究发育突变体需要纯合子型的实验材料。从同源型胚胎建立的多个干细胞突变株可满足此条件。将同源干细胞突变株在体外培养,研究它们对发育刺激信号
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的反应能力;也可将突变干细胞注入囊胚中产生嵌合体,研究其分化能力,从而揭示突变基因在发育过程中的作用。将外源DNA导入ES细胞,研究外源基因在发育中的作用［16］。例如,用这种方法可以探讨外源基因是在特异阶段表达还是特异组织表达等问题。如果能建立人类遗传性疾病有关基因的嵌合体模型,研究外源基因在个体发育中的作用,这将为人类遗传病的治疗提供新的技术。
3.4胚胎干细胞是研究体外细胞分化的理想材料
ES细胞在添加抑制因子的培养液中,能够维持不分化的状态。在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸、丁酰环腺苷酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段［17］。
3.5胚胎干细胞作为外源基因
导入的重要受体细胞之一随着功能基因组学研究的全面展开，利用胚胎干细胞建立转基因动物的研究热点在基因打靶上，因为这种方法能够将外源基因导入靶细胞染色体上某一特定部位，或使某一基因发生定点突变，实现了外源基因的定点整合。80年代转基因鼠的产生，使人们致力于建立有效的分析系统来从分子水平上研究不同的生物学问题.到了90年代，通过基因打靶在基因组水平上建立突变体己经成为近年来广泛应用的技术，而建立于ES细胞和基因打靶技术上的复杂的转基因体系无疑得到了普遍的应用.这项新技术对分子生物学、生理学、发育生物学等领域都产生了重大的影响.它不仅可以将一些在发育过程中对动物体通常非必需或可被替代的特定基因敲除(GeneKnockout)，在体进行功能缺失研究;还可以研究基因在不同发育时期中的作用［18］。这其中最主要的发现是ES细胞系的分离及其未分化状态在体外的永久保持的特性。并且，这些细胞也能重新植入胚胎内发育成包括生殖系统在内的各种组织。另外，ES细胞作为一种体外细胞系，提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系。因此，就有可能人为地产生一些基因突变，如对胚胎致死性基因的研究等，也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠，从而建立了基因突变的模型。此外，在免疫学领域多种遗传背景的ES 细胞系逐渐被发展应用，也建立了许多转基因动
3.6克隆动物
胚胎干细胞在理论上讲可以无限传代和增殖而不失其正常的二倍体基因型和表现型,所以可以对其进行体外培养至早期胚胎进行胚胎移植,在短期内可获得大量基因型和表现型完全相同的个体,这在保护珍稀野生动物方面有着重要意义。还可对胚胎干细胞进行遗传操作,通过细胞核移植生产遗传修饰性动物,有可能创造新的物种。
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3.7胚胎干细胞用于治疗疾病
目前,胚胎干细胞已经在多种疾病的治疗中发挥着重要的作用。如帕金森氏综合症是以某些运动障碍(静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势反射丧失)为临床特征的一组疾病。发病是由于多巴胺神经系统病变或损伤引起原发性多巴胺缺损。正常健康状态下,乙酰胆碱和多巴胺的效应之间存在一种平衡状态。患病时多巴胺减少,打破平衡,导致病人活动障碍。所以可以在体外培养胚胎干细胞,并定向诱导其分化成生成多巴胺的神经细胞,可望用于治疗帕金森氏综合症［19］。
4.胚胎干细胞应用中的争议
研究和利用胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。然而,人类胚胎干细胞的研究工作引起了全世界范围内的很大争议,支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症,可以利用这项研究诱导胚胎干细胞分化成组织器官进行自体器官移植,以解决在临床医学上存在的器官移植所带来的免疫排斥问题,是一种挽救生命的慈善行为,是科学进步的表现,应该对这项研究予以支持。而反对者则认为,支持进行胚胎干细胞研究就等于是怂恿他人“扼杀生命”,这是不道德的,违反伦理的。进行胚胎干细胞研究就必须在胚胎上“大动手脚”,破坏胚胎,而胚胎也是人尚未成形时在子宫的生命形式。如果这样做就是间接牺牲了一个未来的小生命,所以会惹来很多伦理上的反对和斥责。更有科学家认为,在培养准备阶段,哪怕是微小的变化都可能导致对移植后的细胞质量造成极大的影响。出于社会伦理学方面的原因,有些国家甚至明令禁止进行人类胚胎干细胞的研究［20］。然而无论从基础研究角度来讲,还是从临床应用方面来看,人类胚胎干细胞带给人类的益处远远大于在伦理方面可能造成的负面影响,所以要求展开人类胚胎干细胞研究的呼声也是越来越高。
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结论
经研究得知，虽然胚胎干细胞最伟大的用途首先是作为科学研究，但不管是从研究基础上还是临床应用方面，干细胞研究都有其深远的意义。由于ES细胞具有全能性和多能性，利用这一特性，将ES细胞移植到动物囊胚后，它可以参与宿主细胞多种组织的构成，形成嵌合体并产生遗传；通过囊胚注入胚胎干细胞产生的嵌合体小鼠表明对胚胎干细胞进行遗传操作是对动物生殖细胞进行遗传改造的有效方法之一。同时用于遗传操作的胚胎干细胞的多能性或全能性的检测技术，是改良家畜的有效方法。尽管胚胎干细胞的应用前景较广，但是由于哺乳动物错综复杂的基因调控和环境因素的影响，对于胚胎千细胞的研究还存在诸多问题，还需作更深入细致的研究。虽说胚胎干细胞最伟大的用途首先是作为科学研究，但不管是从基础研究还是从临床应用方面，干细胞研究都有其深远的意义。目前科学家已经能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。所以我们应以一种探索性的眼光来对待它。充分认识存在的问题和严峻的挑战，不断开拓思路，求同存异。
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致谢
本论文是在图雅老师的悉心指导下完成的。在完成论文的过程，我查阅了很多相关的资料，这大大丰富了我的知识，同时也为以后的毕业论文的准备工作打下了良好的基础。值此论文完成之际，谨向所有帮助过我的老师和同学们致以最诚挚的谢意。
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细胞的全能性 （2012江苏）22. 下列事实能体现细胞全能性的是（） A. 棉花根尖细胞经诱导形成幼苗 B. 单细胞的DNA 在体外大量扩增 C. 动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体 D. 小鼠体细胞经诱导培育成小鼠 【答案】AD 【解析】在多细胞生物中每个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因，只要条件许可，都可发育成完整的个体。要能产生完整的个体，才能体现全能性。 【试题点评】本题考查细胞全能性这一知识点，要求学生能根据细胞全能性的原理，对一些现象进行分析。属于理解层次。 （2011北京）1.下列生命过程中，没有发生细胞分化的是 A. 断尾壁虎长出新尾巴 B.砍伐后的树桩上长出新枝条 C. 蝌蚪尾巴消失的过程 D.胚胎发育中出现造血干细胞 答案：C （2011广东）26.（16分） 观赏植物蝴蝶兰可通过改变CO2吸收方式以适应环境变化，长期干旱条件下，蝴蝶兰在夜间吸收CO2并贮存在细胞中。 依图9分析，长期干旱条件下的蝴蝶兰在0～4时________（填“有”或“无”）A TP和[H]的合成，原因
是_________；此时段_________（填“有”或“无”）光合作用的暗反应发生，原因是_________；10～16时无明显CO2吸收的直接原因是___________。 从图10可知，栽培蝴蝶兰应避免__________，以利于其较快生长。此外，由于蝴蝶兰属阴生植物，栽培时还需适当_________。 蝴蝶兰的种苗可利用植物细胞的_________，通过植物组织培养技术大规模生产，此过程中细胞分化的根本原因是__________________。 答案：（1）有此时段细胞进行呼吸作用，呼吸作用的第一、二阶段均有[H]产生，第一、二、三阶段均有ATP生成；无此时段没有光反应，而暗反应必须要由光反应提供A TP和[H]，故不存在暗反应；气孔关闭。（2）干旱遮阴（3）全能性基因选择性表达 （2011山东）2．下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是 A．玉米种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造血干细胞形成各种血细胞 C．小麦花粉经离体培养发育成单倍体植株 D．胡萝卜根韧皮部细胞经组织培养发育成新植株 答案：D 【解析】本题要注意题干中的能体现体细胞全能型，玉米种子和小麦花粉都不属于体细胞，骨髓干细胞是多能干细胞，不能发育成一个个体，没有体现出全能性；胡萝卜的体细胞发育成一个新个体属于体细胞全能性。 （2009四川）30.（22分）回答下列Ⅰ、Ⅱ两个小题。 Ⅰ. 将小鼠胚胎干细胞定向诱导分化成一种特定的细胞 （命名为M细胞），再将M细胞移植到糖尿病模型小鼠（胰岛细 胞被特定药物破坏的小鼠）体内，然后测定小鼠的血糖浓度， 结果如右图所示（虚线表示正常小鼠的血糖浓度值）。请回答相 关问题： （1）实验用的胚胎干细胞取自小鼠的早期囊胚，取出胚胎 后一般用酶将其分散成单个细胞。 （2）根据实验结果可以判定M细胞已具有细胞的功能。说明判定的理由 。 （3）用胰岛素基因片段做探针，对小鼠胚胎干细胞和M细胞进行检测。请在下表的空格中填上检测结果（用“+”表示能检测到，用“—”表示不能检测到）。 用探针检测细胞的DNA 用探针检测细胞的RNA 胚胎干细胞M细胞胚胎干细胞M细胞
人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新
和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
人胚胎干细胞的研究进展 周进学号10170807 【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。 【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述 1、胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。 胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
植物细胞的全能性
课题：植物细胞的全能性 章节：人教版生物必修一·第6章第2节 授课者：生命科学学院2012级师范5班—兰海霞 授课对象：高中一年级学生 授课时间：12分钟 植物细胞的全能性 一、教学目标 （一）知识目标 1、掌握植物细胞全能性的概念和原理 2、了解植物细胞全能性的应用 （二）能力目标 1、在教师的引导下，师生共同探究，使学生学会学习，培养分析、归纳的思维能力和自主学习的能力 2、探究植物细胞全能性的概念，培养学生的科学探究方法和生物学素养（三）情感、态度与价值观目标 1、从植物细胞全能性概念的探索试验中，感悟植物细胞全能性的应用对社会经济发展的价值和作用。 2、引入濒危物种的保护，快速繁殖等方面，引导学生保护大自然的动植物，与自然和谐共处的意识。 二、教学重难点 （一）重点
1、植物细胞全能性的概念。 2、植物细胞全能性的原理。 （二）难点 1、植物细胞全能性的概念。 2、植物细胞全能性的原理。 三、教具准备 胡萝卜组织培养实验过程图、吸铁石、教棍 四、教学过程 1、导入：在前面的学习中我们已经知道，高度分化的细胞已失去了继续分裂的能力。比如植物的表皮细胞、叶肉细胞等等，在正常生长条件下，它们都是不能继续分裂的。那它们在某些特定的条件下，能不能像早期胚胎细胞那样，再分裂、分化成其他细胞呢？这就涉及到我们今天所要学习的内容——植物细胞的全能性。 2、植物细胞的全能性概念：我想，大家肯定会问“什么是植物细胞的全能性”，那我们就带着这个问题，一起来通过探讨1958年美国科学家斯图尔德所做的胡萝卜组织培养的实验来寻找答案吧！ 在斯图尔德的这个实验中，他先取了胡萝卜韧皮部的一些细胞，然后放入含有植物激素、无机盐和糖类等物质的培养液中培养，结果这些细胞旺盛的分裂和生长，形成一个细胞团块，继而分化出根、茎和叶，移植到花盆后，最终长成了一株新的植株。 首先，我们一起来看这个实验，大家能找到该实验中哪部分是已经高度分化的细胞吗？对，胡萝卜韧皮部的细胞就是高度分化的植物细胞。在本节课开
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
细胞全能性:指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息，具有发育成完整的个体的潜能。愈伤组织：由脱分化的细胞经过分裂产生的无组织结构无明显极性的松散细胞团，它具有再分化成为完整植物体的潜能。 继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，随着营养的消耗和代谢产物的积累，需将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代或传代培养。胚状体：离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。 植物组织培养：在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞、胚胎、原生质体等外殖体，培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，或者长成新的完整植株一种实验技术。人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体或芽包裹在含有和保护功能的人工胚乳和人工种皮形成的颗粒。 胚胎工程：又叫发育工程。主要是对哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的技术。 超数排卵：利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，利用手术的取出卵母细胞。目的是最大限度地利用母畜的生殖能力。 胚胎移植：是指将受精卵或发育到一定阶段的胚胎从供体母畜取出（也可是体外发育的胚胎），移植到另外一头与供体同时发情排卵、但未经配种的母畜（称为“受体”）的相应部位。胚胎分割：借助显微操作技术或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植给受体母畜，从而制造同卵多仔后代的技术。胚胎分割是扩大胚胎利用率的一种有效途径。试管动物：又叫体外受精动物。将供体的精子和卵子在体外受精、体外培养胚胎，然后将发育到一定程度的胚胎移植入受体完成发育出生的动物。 细胞重组：细胞重组又叫细胞拆合，指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。微细胞:又可被称为微核体，是指含有一条或几条染色体（即只含一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。 核质体:与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”。胞质体:是除去细胞核后由膜包裹的无核细胞。 胞质杂种: 将两种来源不同的核外遗传物质与一个特定的核组合在一起得到的细胞。细胞融合:又称体细胞杂交，是指用人工的方法使二个或二个以上的细胞或原生质体(除去细胞壁的细胞) 融合成一个细胞的技术。 染色体工程：按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体的技术，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。 胚胎融合：是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞融合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体母畜体内让其继续发育形成一种嵌合体后代的技术。植物细胞培养:在离体条件下，将分离的植物细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。 植物细胞两相培养技术: 在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长合成次生代谢物质，分泌出来的产物被转移至有机相中的培养技术。 对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。原代培养：是指将机体取出的细胞或组织进行培养，在首次传代前的培养。传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养称为传代培养。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 胚胎干细胞研究进展-干细胞的研究进展胚胎干细胞研究进展-干细胞的研究进展干细胞的研究进展干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。 近年来干细胞的应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。 本文概述了干细胞的生物学特性，并综述了干细胞的可塑性、分离培养及其在基础研究及临床上的应用的研究进展。 最后，展望了今后研究的方向。 干细胞；生物学特性；可塑性；分离培养；应用 Advances in study of stem cells Stem cells are non-specialized cells which have the ability of self-renewal and multiple differentiation potential. The application of stem cells has nearly involved in all the research field on life sciences and biomedicine in recent years. This article summarizes the biological characteristic of stem cells, and reviews the latest progress in the study on stem cells plasticity, isolation, culture in vitro, and its extensive application in basic research and clinical application. The prospects of stem cells are also discussed. stem cells; biological characteristic; plasticity; isolation; culture in vitro; application 干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细 1 / 10
简述干细胞的形态特征及其研究进展 干细胞是一类具有自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始的多潜能的细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，并具有较高的端粒酶活性。根据它所处的发育阶段可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。 胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。 干细胞的形态特征： 干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。 1 胚胎干细胞：胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的 细胞即为胚胎干细胞。具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。进一步说，胚胎干细胞是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。 2 成体干细胞：成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具 有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 3 造血干细胞：造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在 于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。 4 神经干细胞:理论上讲，任何一种中枢神经系统疾病都可归结为神经 干细胞功能的紊乱。脑和脊髓由于血脑屏障的存在使之在干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应。除此之外，神经干细胞的功能还可延伸到药物检测方面，对判断药物有效性、毒性有一定的作用。 5 肌肉干细胞:可发育分化为成肌细胞，可互相融合成为多核的肌纤维，形成骨骼肌最基本的结构。
胚胎干细胞体外培养 (一)胚胎干细胞的来源 目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。其中囊胚的ICM最为常用。 (二)胚胎干细胞的分离 1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。以PGCs取ES细胞时：小鼠取1 2.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或1 3.5～1 4.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。 2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。 从囊胚分离ICM的方法主要有三种： (1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。 (2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。Evans和Kaufman采用这种方法第一个建立了小鼠ESCs系。 (3)显微外科学方法：小鼠受精后3～4天，由子宫冲取胚泡，利用显微操作系统直接从胚泡中吸出ICM细胞进行培养。 由于免疫外科学方法需要特殊的试剂去除透明带和滋养层，易对内细胞群造成损伤，而显微外科学方法需要专门的仪器设备，且对人员的技术水平要求较高，均难以推广应用。组织培养法将胚泡接种在饲养层上，模拟体内胚泡的着床，更接近自然发育过程，内细胞群增殖旺盛，较易获得胚胎干细胞样集落。 (三)胚胎干细胞的培养和建系 ESCs的分离培养和建系是其得以应用的前提。ESCs建系的原理是：将分离获取的ICM 或PGCs与饲养层共同培养，使之增殖而又保持其未分化状态，这样代代相传从而使ESCs
第二节胚胎干细胞的研究及其应用 学习目标 1.理解干细胞的概念与分类。 2.掌握胚胎干细胞来源、特点及分离途径与方法。 3.举例说明胚胎干细胞的应用。 4.了解胚胎干细胞的研究进展及其所面临的各种挑战。 学习重、难点 学习重点 1.理解干细胞的概念。 2.简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 学习难点 简述胚胎干细胞的特点及其研究进展。 知识要点梳理 一、胚胎干细胞及其研究进展 1.干细胞的概念：是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞。 2.干细胞作用：具有重建、修复病损或衰老组织、器官功能。 3.干细胞分类 （1）专能干细胞：只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。（2）多能干细胞：具有分化成多种细胞或组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等。（3）全能干细胞：可以分化为全身的多种细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官。 二、胚胎干细胞的应用 1.如果科学家最终能够成功诱导和调控胚胎干细胞的分化与增殖，将会给胚胎干细胞的基础研究和临床应用带来积极的影响。 2.在研究新药对各种细胞的药理和毒理试验中，提供了材料，大大减少了新药研究所需动物的数量，从而降低了成本。 3.胚胎干细胞研究为细胞或组织移植提供无免疫原性的材料，用于疾病治疗等，给人类带来全新的医疗手段。
4.通过胚胎干细胞，结合基因工程等还可以在试管中改良并创造动物新品种，培育出生长快、抗病力强、高产的家畜品种等。 三、胚胎干细胞研究面临的挑战 1.胚胎干细胞的应用给法律、伦理、国家和社会安全带来的冲击是空前的。 2.胚胎干细胞在体内或者是体外都具有自我分化的潜能，极易分化成其他细胞，对培养条件的优化仍需要进一步研究。 3.对胚胎干细胞向不同组织细胞定向分化的条件还不清楚。 4.创造一种“万能供者”细胞，需要破坏或改变细胞中的许多基因，其可行性仍不清楚。
胚胎干细胞的研究进展 摘要：胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells) 是存在于胚胎发育早期阶段，具有自我更新和多分化潜能性的干细胞，是组成机体各种组织器官的起源细胞。已经广泛用于生命科学的许多领域，它在医学方面的应用成为医学领域的研究热点。本文综述了近些年关于胚胎干细胞分离培养与鉴定特征和应用的研究进展，同时也指出了目前所面临的问题，对今后的研究方向进行了展望。 关键词：胚胎干细胞；分离培养与鉴定特征；应用 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）是一种从早期胚胎的囊胚内细胞团细胞或胎儿原始生殖细胞( primordial germ cells，PGCs) 中经分离体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞，与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制，实现永生，无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内中外3个胚层的几乎所有类型细胞。因此，ES细胞成为研究哺乳动物早期胚胎发生细胞组织分化基因表达调控等发育生物学基础研究的一个非常理想的模型系统和非常有用的工具，也是进行动物胚胎工程开发和用于治疗各种疾病，修复受损伤的组织和器官的一个重要途径，具有广泛的应用前景[1,2]。 20世纪末开始，ES细胞的研究就一直是生物医学领域的热点。美国《科学》杂志评出的上个世纪十大科学突破中，“干细胞研究与应用”名列榜首。ES细胞的研究还处于起步阶段，目前人们已经能够分离培养干细胞，但诱导ES细胞定向分化还面临许多困难。
干细胞的应用及研究方向 摘要 干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。近年来干细胞的应用几乎涉及到所有生命科学和生物医学领域。本文概述了干细胞的生物学特性，并综述了干细胞的可塑性、分离培养及其在基础研究及临床上的应用的研究进展。最后，展望了今后研究的方向。 干细胞（stem cells）是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，即这些细胞可以通过细胞分裂维持自身细胞群的大小，同时又可以进一步分化成为各种不同的组织细胞，从而医学界称之为“万用细胞”。1981年英国的Evans和Kaufman用延缓着床的胚泡首次成功地分离了小鼠胚胎干细胞,从而在全球掀起了有关干细胞的研究热潮。1997年2月英国苏格兰罗斯林研究所威尔穆特博士等成功克隆出“多利”绵羊，1998年11月,美国Thomson［1］和Gearhart［2］分别用不同的方法获得人胚胎干细胞及胚胎生殖细胞,此后,干细胞的研究便进入了一个全新的时代。1999年，有关干细胞的研究被Science评为1999年度十大科学进展之首。2000年12月干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世界十大科学成就之一。本文就近几年来干细胞的研究进展综述如下。 1干细胞的生物学特性 根据干细胞的发育阶段，可将其分为胚胎干细胞和成体干细胞（Adult Stem Cell，AS）。胚胎干细胞即具有分化为机体任何一种组织器官潜能的细胞,包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞（Embryonic Germ Cell，EG）。成体干细胞即具有自我更新能力,但通常只能分化为相应组织器官组成的“专业”细胞,它是存在于成熟个体各种组织器官中的干细胞,包括神经干细胞、血液干细胞,骨髓间充质干细胞、表皮干细胞、肝干细胞等。 1.1胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞最早是直接从小鼠早期胚胎分离建系的,它们具有其自身的生物学特性。与其他细胞系相比较, 胚胎干细胞的特点在于:（1）具有不断增殖分化的能力，所以，在体外培养条件下可以建立稳定的干细胞系，并保持高度未分化状态和发育潜能性。1999年Soiter等［3］利用这个特性将ES/EBs及其分化细胞作为有关药物的针对筛选系统,进行药物毒性检测实验。（2）具有高度的发育潜能和分化潜能。体内外可分化出外、中、内三个胚层的分化细胞，可以诱导分化为成体细胞内各种类型的组织细胞。胚胎干细胞含有正常二倍染色体，具有种系传递功能,能广泛参与宿主胚胎各组织器官的生长发育,并形成包括生殖系在内的合体后代生殖细胞。1995年Pacacio等［4］利用骨髓基质细胞或其培养液,将胚胎干细胞在体外诱导分化为造血干细胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin,g418)的条件下,将Rosaβ-geo基因转染胚胎干细胞后能在体外诱导分化为软骨细胞。同年Deni等报告将胚胎干细胞通过悬滴培养可分化出脂肪细胞。（3）能进行体外培养扩增,还可以对其进行遗传操作选择, 如导入异源基因、报告基因或标志基因，诱导某个基因突变等。扩增、遗传操作及冻存均不丧失其多能性。冻存的细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性。 1.2成体干细胞的生物学特征
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤 一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF
课题：植物细胞的全能性 章节：人教版生物必修一·第6章第2节 授课者：生命科学学院2012级师范5班—兰海霞 授课对象：高中一年级学生 授课时间：12分钟 植物细胞的全能性 一、教学目标 （一）知识目标 1、掌握植物细胞全能性的概念和原理 2、了解植物细胞全能性的应用 （二）能力目标 1、在教师的引导下，师生共同探究，使学生学会学习，培养分析、归纳的思维能力和自主学习的能力 2、探究植物细胞全能性的概念，培养学生的科学探究方法和生物学素养 （三）情感、态度与价值观目标 1、从植物细胞全能性概念的探索试验中，感悟植物细胞全能性的应用对社会经济发展的价值和作用。 2、引入濒危物种的保护，快速繁殖等方面，引导学生保护大自然的动植物，与自然和谐共处的意识。 二、教学重难点 （一）重点 1、植物细胞全能性的概念。 2、植物细胞全能性的原理。 （二）难点 1、植物细胞全能性的概念。 2、植物细胞全能性的原理。 三、教具准备 胡萝卜组织培养实验过程图、吸铁石、教棍 四、教学过程 1、导入：在前面的学习中我们已经知道，高度分化的细胞已失去了继续分裂的能力。比如植物的表皮细胞、叶肉细胞等等，在正常生长条件下，它们都是不能继续分裂的。那它们在某些特定的条件下，能不能像早期胚胎细胞那样，再分裂、分化成其他细胞呢？这就涉及到我们今天所要学习的内容——植物细胞的全能性。 2、植物细胞的全能性概念：我想，大家肯定会问“什么是植物细胞的全能性”，那我们就带着这个问题，一起来通过探讨1958年美国科学家斯图尔德所做的胡萝卜组织培养的实验来寻找答案吧！
在斯图尔德的这个实验中，他先取了胡萝卜韧皮部的一些细胞，然后放入含有植物激素、无机盐和糖类等物质的培养液中培养，结果这些细胞旺盛的分裂和生长，形成一个细胞团块，继而分化出根、茎和叶，移植到花盆后，最终长成了一株新的植株。 首先，我们一起来看这个实验，大家能找到该实验中哪部分是已经高度分化的细胞吗？对，胡萝卜韧皮部的细胞就是高度分化的植物细胞。在本节课开始时，我们已经一起复习过，高度分化的细胞已失去了继续分裂、分化的能力。但在这个实验中，高度分化的胡萝卜韧皮部细胞经过培养最终却生长成了一株新的胡萝卜植株。大家思考下这样一个实验过程表明了什么呢？对，这个实验就表明了，高度分化的植物细胞仍然具有发育成完整植株的能力，这就是植物细胞的全能性。具体说来，植物细胞的全能性就是指：植株体内任何已经分化的细胞，仍然具有发育成完整新个体的潜能。这就是植物细胞的全能性的概念。 3、植物细胞全能性的原理：那为什么已分化的植物细胞还具有全能性呢？也就是说，植物细胞的全能性的原理是什么呢？其实呀，我们已经知道任何一个多细胞生物，其体内的任何一个正常的细胞中所含有的遗传信息都是一样的，即都含有发育成一个完整的新个体所必需的全部基因。对于植物细胞当然也是这样，这就是植物细胞具有全能性的最根本的原理。 4、植物细胞全能性的应用：讲到这里，我想大家对植物细胞的全能性肯定已经有了比较深入的了解与掌握。但是，我们常说知识要学以致用，那我们今天学习到的植物细胞的全能性对我们到底有什么用呢？最后，我们就再来一起了解一下植物细胞全能性的具体应用吧！现在人们已经可以利用植物细胞的全能性，通过组织培养的方法，快速繁殖花卉和蔬菜等作物。这就可以使我们可以在任何季节都可以看到我们喜欢的花卉，吃到我们喜欢的蔬菜。同时，还可以利用它来拯救珍稀濒危的物种，为珍贵植物的保护做出贡献。而且，还能将它与基因工程结合培育作物新类型。虽然这方面技术还不是很成熟，但却让我们看到了解决世界性粮食问题的新希望。 从这些应用我们可以看出，植物细胞全能性的价值是很大并且具有重要的实用意义的！ 5、总结：我们再一起回顾这节课所学习的主要内容吧！本次课中，我们主要学习了植物细胞全能性概念即植株内任何已经分化的得细胞，仍然具有发育成完整新个体的潜能、原理——任何一个多细胞生物，其体内的任何一个正常的细胞中都含有发育成一个完整的新个体所必需的全部基因，以及它的一些主要应用价值。希望大家在课后能对这部分的内容进行认真的巩固复习！本次课就到这里，谢谢大家！ 由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）显色出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lac Z′基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变