应用PCR-直接测序法测定结核分支杆菌rp sL基因突变的研究
吴雪琼Ξ 张俊仙 庄玉辉 张军芝 贾树林
(解放军309医院, 北京100091)
摘 要 目的:了解我国结核分支杆菌耐链霉素(Strep tom ycin,S M)分离株rp s L基因突变情况,建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法:通过聚合酶链反应(Po lym erase Chain R eacti on, PCR)2单链构象多态性(Single2stranded Confo rm ati on Po lymo rph is m,SSCP)、PCR2限制性片段长度多态性(R estricti on F ragm en t L ength Po lymo rph is m,R FL P)和PCR2直接测序法(D irect Sequencing,D S)分析38株结核分支杆菌耐S M分离株的rp s L基因。结果38株耐S M分离株中,25株SSCP异常、不被M bo 消化、D S分析43位密码子AA G→A GG突变;1株SSCP异常、可被M bo 消化、D S分析33位密码子GTA→A TA突变; 12株SSCP正常、可被M bo 消化、D S分析未见异常;未发现88位密码子突变。结论:大多数结核分支杆菌耐S M是由于其rp s L基因43位密码子突变所致,采用PCR2SSCP、PCR2R FL P和PCR2D S方法可快速测定部分结核分支杆菌S M耐药基因型。
关键词 聚合酶链反应; 单链构象多态性; 限制性片段长度多态性; 直接测序法; 药物耐受性; 结核分支杆菌
结核病的耐药问题已引起国内外广大结核防治工作者的高度重视,结核分支杆菌耐药分子机制的研究正在不断深入,目前已阐明大多数结核分支杆菌分离株耐S M是由于其核糖体S12蛋白基因(rp s L)突变所致,其突变位点主要是43位密码子,该位点有限制性内切酶M bo 的识别序列[GAA GGA(8 7)],发生A→G突变后,使赖氨酸(L ys)密码子(AA G)突变成精氨酸(A rg)密码子(A GG),酶切位点消失;少数链霉素耐药分离株是在88位密码子发生类似突变,但该部位无酶切位点。我们以前已报道[1]通过PCR2SSCP方法来筛选有rp s L突变的结核分支杆菌临床分离株,然后用PCR2R FL P方法初步确定突变的部位和性质,以便判断结核分支杆菌的耐药基因型,指导临床治疗。本文通过进一步研究建立了PCR2D S,应用该方法直接测定38株结核分支杆菌耐S M分离株的rp s L基因序列,了解我国该基因突变部位、性质及发生率,探讨该方法潜在的应用价值。
1 材料与方法
1.1 菌株来源和药敏试验
结核分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴定所;所选择的38株结核分支杆菌耐S M分离株分别来源于北京市结核病防治所、河北省胸科医院和上海市结核病防治中心,按全国结核病细菌学检验标准化规程进行分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。
1.2 细菌DNA的制备
采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,置
-20℃保存备用。
1.3 PCR扩增
PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25Λl反应体系中,4种dN T P的终浓度各为0.2mm o l L,引物(I N S1、2和S1、2)的终浓度各为0.4Λm o l L,纯化的
DNA模板10～100ng,T aq DNA聚合酶1U。置DNA 热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物I N S1和I N S2扩增结核分支杆菌复合群插入序列IS986产生245bp片段[2];根据结核分支杆菌rp s L 基因序列(Genbank accessi on num b le L08011)设计的引物S1和S2可扩增该基因序列产生267bp片段。
1.4 SSCP分析
rp s L扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳,溴化乙锭染色或银染色后观察结果并照相。
1.5 R FL P分析
限制性内切酶M bo 购自华美生物工程公司,酶切反应按厂家说明进行。rp s L基因扩增片段经该酶消化后,在2%琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙淀染色分析。结核分支杆菌rp s L基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被消化产生2个较小的片段(分别为177bp和90bp);若有该位点突变的菌株不被消化,电泳仍可见267bp片段。
1.6 D S分析
采用P rom ega公司生产的fm o l DNA测序试剂
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2
2
?中国抗生素杂志1999年6月第24卷第3期Ξ
盒。除了以S1和S2为测序引物外,另设计合成2个内部引物S3和S4为测序引物,分别测定rp s L含43位和88位密码子的序列。32P2dA T P购自北京亚辉生物工程公司,在6%变性聚丙烯酰胺凝胶中测序电泳后,放射自显影1～3d,肉眼识读结果。
2 结果
2.1 PCR扩增
以结核分支杆菌标准株DNA为对照,用引物I N S1和I N S2扩增上述38株结核分支杆菌分离株,均产生245bp片段,进一步证明这些分离株均为结核分支杆菌。用引物S1、S2扩增分离株的rp s L基因均产生267bp片段,说明rp s L基因扩增成功。
2.2 药敏试验、SSCP、R FL P和D S分析
38株耐S M分离株中,25株(65.8%)SSCP异常、不被M bo 消化、D S分析43位出现AA G→A GG突变;1株SSCP异常、可被M bo 消化、D S分析43位和88位密码子正常,但33位发生GTA→A TA突变(V al →L le置换),见图1;12株(31.6%)SSCP正常、可被M bo 消化、D S分析未见异常。所有菌株均未发现88位密码子异常。
3 讨论
结核分支杆菌耐S M的分子机制已较清楚,根据M o rris等[3]、F inken等[4]、M eier等[5]、Hono re and Co le[6]、N air等[7]和Douglass等[8]报道的资料统计,他们通过PCR2SSCP和DNA测序共分析了114株结核分支杆菌临床分离株的rp s L和rrs基因,77株S M敏感株在上述两个基因部位均未发现突变;107株S M耐药分离株中,52株(48.6%)有rp s L突变,其中43株(82.7%)为43位密码子突变(42株为L ys→A rg置换,1株为L ys →T h r置换),9株(17.3%)为88位密码子突变,31株(29.0%)为rrs基因突变,1株为rp s L和rrs双重突变,23株(21.5?)未发现任何突变。本文分析的38株结核分支杆菌耐SM分离株中,25株rp s L突变位于43位密码子(均为L ys→A rg置换),未发现88位密码子突变,虽与国外文献报道不完全相同,但仍说明绝大多数结核分支杆菌分离株耐S M是由于43位密码子突变所致;1株突变位于33位密码子,该位点突变尚未见文献报道,是否会引起结核分支杆菌耐S M,还需进一步研究;12株无rp s L突变的分离株将进一步分析其rrs基因,看是否是rrs突变所致或存在其它耐药机制。
我们通过PCR2D S分析结核分支杆菌H37R v标准株和38株临床分离株的rp s L22位至94位编码基因的核苷酸序列,与N air等[7]报道的完全相同,34位密码子是T GC,与Hono re and Co le[6]报道的34位密码子T GT不同,可能系所测菌株不同所致。
本文结果表明通过基因突变检测技术检测rp s L 基因突变,可测定大多数结核分支杆菌分离株的S M 耐药基因型,从而可能作为新的药敏试验方法,应用于临床,指导治疗。PCR2SSCP是一种普遍使用的基因突变筛选技术,其结果与PCR2D S结果比较表明,
该方
图1 结核分支杆菌临床分离株rp s L基因PCR2D S分析结果
B、C:药物敏感株, A、D、E:耐S M药物株;
A33位可见GTA→A TA突变, D、E43位可见AA G→A GG突变
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3
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应用PCR2直接测序法测定结核分支杆菌rp s L基因突变的研究 吴雪琼等
法灵敏、特异、简便、快速、经济、实用,易在临床实验室推广使用,但不能确定突变的部位与性质。PCR 2R FL P 是一种分析特定基因位点突变的技术,其简便、快速并可确定突变的部位与性质,具有高度特异性,本文结果证实该方法结果准确、可靠,但只能用于检测有固定酶切位点的基因,应用范围有限。本文采用的PCR 2D S 法是将PCR 反应与末端终止法相结合而产生的一种新的测序技术,与常规测序法相比具有许多优点,如(1)T aq DNA 聚合酶可在高温下进行反应,而使PCR 产物无需克隆或碱变性即可直接用于测序,更快速、可靠;(2)PCR 扩增使模板DNA 量呈线性增加,这样测序只需少量DNA 模板;(3)较高的复性温度,提高了引物和模板结合的特异性,减少了非特异性扩增产物的干扰;(4)高聚合温度可有效地解除模板DNA 的二级结构,使G 、C 含量丰富的结核分支杆菌DNA 的聚合反应能顺利进行;(5)测序引物可另外合成,也可采用PCR 扩增引物,而更经济。PCR 直接测序法直接分析了基因的核苷酸序列,从而客观地反映了基因是否发生突变、突变的部位与性质,避免了假阳性的发生。但该法技术难度较高,所测序列较短,较长片段需分段测序,而且采用同位素,存在污物处理问题,不适用于临床实验室常规开展。我们正在研究一种非同位素
DNA 测序法,以便更经济、
易于推广。参考文献
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2吴雪琼,庄玉辉,张晓刚,等.PCR 和DNA 探针联合检测临床标本中结核杆菌的研究.中华结核和呼吸杂志,1996;19:37
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(1999年3月29日修回)
Stud ies on the detection of rp sL gene m uta tion s i n
M .tubercu losis by PCR -d irect sequenc i ng
W u Xueqi ong , Zhang Junx ian , Zhuang Yuhu i , Zhang Junzi and J ia Shu lin
(T he 309th Ho sp ital ,PLA , Beijing 100091)
ABSTRACT O b jective :To understand the m u tati on s of strep tom ycin 2resistan t genes in M .tubercu losis clin ical iso lates ,and to develop a new m o lecu lar m ethod fo r detecting drug resistance .M ethod :A nalyzing the rp s L genes in 38strain s of M .tubercu losis strep tom ycin 2resistan t iso lates w ith PCR 2SSCP ,PCR 2R FL P and
PCR 2D S .R esu lts M .tubercu losis strain H 37R v w as u sed as a con tro l
.O f 38strep tom ycin 2resistan t iso lates ,25iso lates disp layed abno rm al rp s L SSCP p rofiles ,w ere no t digested by M bo II ,and had AA G →A GG m u tati on s at codon 43;one disp layed abno rm al SSCP p rofile ,w as digested by M bo II ,and had GTA →A TA m u tati on at codon 33;12exh ib ited no rm al rp s L genes w ith PCR 2SSCP ,PCR 2R FL P ,PCR 2D S .T here w ere no m u tati on s found at codon 88.Conclu si on s :R esistance to strep tom ycin in m o st M .tubercu losis iso lates is due to the m u ta 2ti on s situated at codon 43of genes encoding the ribo som al S 12p ro tein (rp s L ).PCR 2SSCP ,PCR 2R FL P and PCR 2D S ,an s it m igh t becom e si m p le ,rap id and reliab le diagno stic tests fo r strep tom ycin resistance in som e clin ical iso lates .
KEY WORD S Po lym erase chain reacti on ; Single 2stranded confo rm ati on po lym o rp h is m ; R estricti on ?
402?中国抗生素杂志1999年6月第24卷第3期
抗结核分枝杆菌感染的免疫机制 学生：何燕华学号：20111061 一、结核病及结核分枝杆菌 １、结核病简介 趣味背景：林黛玉的不足之症是什么病症呢？ 不足之症是中医的病症名，即民间常说的先天不足，泛指各种虚证。虚证是指人的正气虚弱不足，又分气虚、血虚，气虚可发展为阳虚，血虚可发展为阴虚，有些病人可气血皆虚或阴阳皆虚。气虚主要表现为少气、懒言、心悸、自汗、头晕、耳鸣、小便清而频、脉虚弱等。血虚主要表现为面色苍白、唇舌色淡、头晕目眩、心悸怔忡，疲倦乏力或手足麻木，脉细弱等。 根据小说的描写，林黛玉患的应是一种慢性病。她“从会饮食时便吃药，到今日未断，请了多少名医修方配药，皆不见效。”“每岁至春分秋分之后，必犯旧疾”，并且病症主要表现是咳嗽、咳痰、数量不等的咯血，“又咳嗽数声，吐出好些血来”。王大夫分析她的病症时说“这病时常应得头晕，减饮食，多梦，每到五更，必醒个几次。即日间听见不干自己的事，也必要动气，且多疑多惧。不知者疑为性情乖诞，其实因肝阴亏损，心气衰耗，都是这个病在那里作怪。”从她所患之病的症状及疾病演变和进展分析，林黛玉患的是肺结核病。 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病又称为痨病和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。结核病是青年人容易发生的一种慢性和缓发的传染病。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，结核病又卷土重来，发病率愈演愈烈。 据世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)统计，全世界约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年约有880万新发病例，200万人因结核病而死亡，每15s就会有一个死亡病例。并且,随着社会人员流动，HIV感染者增多造成的交叉感染使我国的结核病感染率一直处于上升趋势,已经成为造成全球人类死亡的主要传染病类型。了解宿主的免疫系统及机体相关细胞与病原菌的相互作用机制非常重要,并且能对结核病的预防和治疗提供一定的帮助。 2、结核分枝杆菌 结核分枝杆菌( mycobacteriumtuberculosis,MTB)是一种抗酸阳性棒状杆菌，主要包括人型、牛型、非洲型和鼠型，其中对人致病的主要是人型结核菌。结核菌细长略弯曲，大小约1～4X0.4μm，无鞭毛、无芽孢、不能产生内、外毒素，专性需氧，培养要求高，生长缓慢，菌体成分主要有脂质、多糖、蛋白质等。 大量研究表明结核杆菌属于兼性寄生菌，原因是首先在感染的巨噬细胞内复制，故称为胞内菌；然后，随着病变发展又会出现在坏死组织中即巨噬细胞外进行复制结核杆菌的致病性与其在组织细胞内大量繁殖引起的炎症反应，菌体和细胞壁成分以及代谢物质的毒性和机体产生抗结核免疫反应等有关。 在结核杆菌胞壁中含有许多特殊脂类物质这种特殊的胞壁赋予结核杆菌能在宿主吞噬细胞内生存的能力，也为特异性T淋巴细胞提供了独特的糖脂抗原；而且从其基因组序列可以看出结核杆菌具有潜在的由一种代谢途径转变为其他代谢途径的能力，包括有氧呼吸（如氧化磷酸化）和厌氧呼吸（如硝酸还原反应）。这一代谢途径转换的灵活性对结核杆菌适应生存环境的变化有极大的意义，主要表现为结核杆菌既可以在人高氧压力的肺泡中生存繁殖，还可以在结核肉芽肿的微氧和厌氧的环境中存活。 二、结核分枝杆菌在细胞内的免疫机制 1．非特异性免疫机制
抗结核分枝杆菌感染的免疫机制 1．非特异性免疫机制 结核杆菌作为兼性胞内寄生菌，以巨噬细胞为宿主细胞。组织中的巨噬细胞可以吞噬多种病原微生物并处理衰老死亡的组织, 其自身还能分泌多种细胞因子和其他炎性介质参与局部炎症反应、发热反应等。巨噬细胞可以通过氧依赖性和非氧依赖性杀菌系统发挥杀伤和消除病原菌的作用。 （１）巨噬细胞的识别作用 巨噬细胞是MTB进入机体内首先侵入的细胞, 是MTB感染过程中的主要靶细胞。巨噬细胞有两种识别MTB的方式：①直接识别：巨噬细胞能通过其表面的激素样受体直接识别侵入机体的MTB。②间接识别：巨噬细胞可以通过表达补体受体识别MTB。（２）巨噬细胞的杀菌作用 巨噬细胞能通过自身凋亡等杀灭菌体。巨噬细胞系统的细胞毒素具有两个系统:一个是氧依赖系统, 在抗微生物效应中起决定性的作用；另一个是氧不依赖的系统，溶菌酶等属于该系统产物，这个系统也参与杀微生物活性。巨噬细胞主要通过氧依赖系统杀伤侵入机体的MTB,激活的巨噬细胞发生呼吸暴发，产生反应性氧中间产物(ROIs)和反应性氮中间产物(RNIs)，释放溶菌酶等活性蛋白质，这些物质有强的氧化作用和细胞毒作用，对MTB有强的杀伤作用。另外，巨噬细胞与病原菌作用后处于激活状态的巨噬细胞可以通过病原菌与TLR相互作用激活caspase-8，诱导其自身凋亡，破坏MTB的生存环境，杀灭入侵的MTB。 （３）ＭＴＢ的免疫逃逸机制 MTB能在巨噬细胞内定居存活以及引起机体一系列的病理反应是与其免疫逃逸的机制分不开的。MTB进入巨噬细胞胞膜内化形成吞噬小体，然后与溶酶体结合形成吞噬溶酶体，溶酶体分泌的胞内酶可以促使吞噬溶酶体酸化，外源性抗原在吞噬溶酶体的酸性环境中被水解为抗原多肽。而MTB之所以能够在巨噬细胞内存活是因为它能够阻止吞噬溶酶体的酸化。MTB可以通过降低磷脂酶D的活性，抑制活性氧中间体和活性氮中间体的产生，下调MHCⅡ的表达,抑制吞噬溶酶体的成熟，进而抑制巨噬细胞的氧依赖杀伤作用。 2．特异性免疫在抗结核中的作用 MTB的感染过程，分为初始感染,潜伏感染,再次大量增殖造成的疾病复燃三个阶
3.结核分枝杆菌感染 3-1,痰结核菌检查阳性 肺阴菌结核的诊断：3次痰涂片及一次培养阴性的肺结核 患者连续三周以上的咳嗽，咳痰，若同时痰中带有血丝，就因想到肺结核病。 包括疑似病例，确诊病例，肺阴菌结核的诊断。 （1）典型肺结核临床症状和胸部X线表现； （2）抗结核治疗有效； （3）临床可排除其他非结核性肺部疾患； （4）PPD(5IU)强阳性，血清抗结核抗体阳性； （5）痰结核菌PCR+探针检查阳性； （6）肺外组织病理证实结核病变； （7）BALF检出抗酸分枝杆菌； （8）支气管或肺部组织病理证实结核病变。（不用写进PPT） 3-2 (1)全身症状表现为午后低热、乏力、食欲减退、消瘦、盗汗等。若肺部病灶进展播散，常呈不规则高热。妇女可有月经失调或闭经。 (2)呼吸系统症状 咳嗽咳痰：通常为干咳或带少量粘液痰，继发感染时，痰呈粘液脓性。 咳血：约1/3患者不同程度咯血，中等程度咯血，多为小血管损伤或空洞血管瘤破裂。咯血后常有低热。大咯血时可发生失血性休克;偶因血块阻塞大气道引起窒息。此时患者极度烦躁、心情紧张、挣扎坐起、胸闷气促、发绀，应立即进行抢救。 气急：慢性重症肺结核时，呼吸功能减退，常出现渐进性呼吸困难，甚至缺氧发绀。若并发气胸或大量胸腔积液，其呼吸困难症状尤为严重。 胸痛：固定性针刺胸痛，随呼吸和咳嗽加重，侧卧位症状减轻，常是胸膜受累缘故；当炎症波及壁层胸膜，可有不剧烈的胸壁刺痛。可放射至肩部或上腹部。 3-3肺结核的特征性病理改变包括肉芽肿和结核结节，病变包括渗出性病变出现浆液性和纤维素性炎症，形成病灶，导致咳嗽咳痰；增生性病灶形成肉芽肿，可发生毛细血管破裂，出现不同程度的咯血症状；当机体出现坏死性病变时，结核
结核病是由结核杆菌引起的一种慢性传染病。全身各器官均可发生，但以肺结核最为多见。其病变特征是结核结节形成并伴有不同程度的干酪样坏死。目前，临床使用的抗结核化学药物基本分为一线和二线用药两类。一线抗结核药物主要有利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素。继利福平之后，利福霉素类的利福喷汀和利福布汀也得到广泛应用。二线抗结核药物有卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星、乙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星和氯苯吩嗪等。近些年来的研究结果，综合起来，新型抗结核药物，主要分为九大类：首先是利福霉素类衍生物，如利福喷丁、利福布丁、苯并恶嗪、利福霉素；此外还有CGP7074、CGP27557，F22等长效抗结核药物；其次为喹诺酮类品种如氧氟沙星、左旋氧氟沙星、环丙沙星等，由于该类药物对结核杆菌有很好的抑制及杀灭效果，价格低廉，毒副作用较小，并且与其它抗结核药物不产生交叉耐药性，故而受到广泛重视，是当前抗结核病类药物研究中的一个主要方面；第三、氨基糖甙类主要有丁胺卡那霉素、硫酸奈替米星、硫酸西索米星、巴龙霉素等；第四、大环内酯类，如克拉霉素、罗红霉素、阿齐霉素等；第五、β-内酰胺类及其酶抑制剂，即阿莫西林、克拉维酸等；第六、多肽类主要是结核放线菌素-N，对耐链霉素或卡那霉素的结核病菌有效，可用于复治联合方案多药耐药的病患者；第七、为吩噻嗪类、主要有吩噻嗪，适合于耐药的结核病联合用药；第八，硝基咪唑类，其代表甲硝唑，与其它抗结核病药物配伍使用，不仅对各种状态的结核病菌有杀灭作用，而且对潜伏感染的患者也有预防发病的作用；第九，其它类，目前上市的有以氨基水杨酸与异烟肼的化合物力排肺痰，现在我国也开始使用，效果较好。[作用机制] 抗结核药亦可按作用机制的不同分为：⑴阻碍细菌细胞壁合成的药物，如环丝氨酸、乙硫异烟胺；⑵干扰结核杆菌代谢的药物，如对氨基水杨酸钠；⑶抑制RNA合成药，如利福平；⑷抑制结核杆菌蛋白合成药，如链霉素，卷曲霉素；⑸多种作用机制共存或作用机制未明的药物，如异烟肼、乙胺丁醇。[适应症] 抗结核病类药物主要对结核杆菌有良好的抗菌作用。[不良反应] 胃肠道反应，肝损害，关节损害，神经系统反应，过敏反应等。[禁忌] 肝功能不良者、孕妇慎用。[用药原则] 1.早期用药早期病灶内结核菌生长旺盛，对药物敏感，同时病灶部位血液供应丰富，药物易于渗入病灶内，达到高浓度，可获良好疗效。 2.联合用药联合用药可提高疗效、降低毒性、延缓耐药性，并可交叉消灭对其他药物耐药的菌株，使不致成为优势菌造成治疗失败或复发。联合用药二联、三联或四联则取决于疾病的严重程度，以往用药情况以及结核杆菌对药物的敏感性。 3.适量是指用药剂量要适当。 4.坚持全程规律用药。[药物相互作用] 和其他种抗结核病类的药物配合使用虽然对结核杆菌有协同的抗菌作用，但是同时也容易加强肝中毒性。
结核分枝杆菌教学设计 授课教师： 授课班级： 授课教师学校：重庆医药卫生学校
一、设计思路 1.教学内容分析 此教学设计是：《结核分枝杆菌》，选自《微生物检验技术》由郭积燕主编，人民卫生出版社出版，授课对象为中职二年级医学检验1班学生。《结核分枝杆菌》是本书第十二章第一节内容（结核分枝杆菌的分类、形态染色和培养特性）及微生物学常规检验（配套实验抗酸染色），本次授课内容学时为2学时。 2.学情分析 中职医学检验二年级学生，具有年龄小，具有强烈的好奇心，喜欢新奇的图片、搞笑的视频、动画等特点。根据实际情况，借助教室里的多媒体设备，运用网络资源，通过图片、视频、动画刺激学生感官，激发同学们对本节课产生兴趣，使同学们能够自主学习，从兴趣中了解和掌握本节课结核分枝杆菌的形态、特点及微生物常规检验等内容，最终达到优化教学效果的目的。 3.设计理念 此课程的教学设计通过情景教学、小组讨论以及实践操作，激发学生的自主探究能力，培养学生观察、思考、动手操作能力及总结归纳的能力，并且可以及时反馈学生的掌握情况。使同学们能够更深刻地理解结核分枝杆菌的临床意义和预防，以及树立从事检验工作的价值感和责任感。 二、教学目标 （一）认知目标
1.熟悉并掌握结核分枝杆菌的分类与主要生物学特征； 2.掌握结核分枝杆菌的形态染色与培养特性； 3掌握微生物学的常规检查。 （二）能力目标 1学会标本采集及注意事项；. 2正确进行抗酸染色的操作; 3能在显微镜下正确辨认抗酸菌与非抗酸菌。 （三）情感目标 1.激发学生学习兴趣，使学生能够自主学习； 2.理解结核分枝杆菌的临床意义、发展状况及对人群的危害； 3.树立自觉防范意识； 4.建立从事检验工作的价值感与成就感，重新审视自己的职业道德和责任感。 （四）教学重点： 1．结核分枝杆菌的主要生物学特征； 2．结核分枝杆菌的致病性； 3．微生物学的常规检验 （五）教学难点： 1．结核分枝杆菌的致病性； 2．抗酸染色的操作步骤及镜下观察。 三、教学教法的选择 1.教法：情景教学、小组讨论式、多媒体讲授式。
姓名：张俊学号：S1170850 新型抗结核分枝杆菌药物筛选模型摘要：结核病是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，世界卫生组织报告显示，全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病。结核病已成为仅次于艾滋病的第二大传染性疾病。近年来结核病发病呈逐年攀登趋势，目前多重耐药结核分枝杆菌的出现以及结核分枝杆菌在患者体内的持留状态已经成为结核病预防和治疗过程中的重大障碍，因此寻找新的药物作用靶点，建立新的药物筛选模型成为开发新型抗结核药物的关键。此综述介绍了新型的抗结核药物筛选模型，并说明模型的建立方法。 关键词：结核病，抗结核药物，耐多药结核病，筛选模型 Abstract: Tuberculosis is a infectious disease caused by Mycobacterium, as the World Health Organization report , 20 million people worldwide infected with Mycobacterium tuberculosis , there will be one tenth of the people will develop TB. Second only to AIDS, tuberculosis has become the second largest infectious diseases. In recent years, the trend of TB incidence was gradually increasing; the emergence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis has become the major obstacles of the tuberculosis prevention and treatment. Searching the new drug targets, establishing a new drug screening model becomes the key to the development of new anti-TB drugs. This review describes the new anti-TB drug screening model and explains the model approach. Keywords: tuberculosis, anti-TB drugs, MDR-TB, screening model 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。结核菌可能侵入人体全身各种器官，主要侵犯肺脏，因此称为肺结核病。结核病又称为痨病和白色瘟疫，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要方式。传染源是接触排菌的肺结核患者。结核病可以分为原发性肺结核、血行播散型肺结核、继发性肺结核和结核性胸膜炎。解放后人们的生活水平不断提高，结核已基本控制，随着环境污染和艾滋病的传播，以及耐药结核分枝杆菌的出现，结核病又卷土重来，发病率愈演愈烈。全球有20亿人感染结核分枝杆菌，其中会有十分之一的人会发展成结核病其中三分之一是处于潜伏感染状态[1?2]。 一、抗结核药物 1、抗结核药物的历史 上世纪40年代，链霉素（SM）和对氨基水杨酸钠（PAS）先后发现，而SM+PAS 疗效优于单一用药，并可以预防结核分枝杆菌产生耐药性[3]。异烟肼（INH）发现后，INH+PAS联用的优势得到证实[4]。1952年“三联疗法”（SM+INH+PAS）
结核分枝杆菌的致病机制 结核分枝杆菌成功感染需多个阶段：1）在巨噬细胞中成功繁殖；2）结核分枝杆菌能够修饰宿主的免疫反应，使宿主能够控制但不能根除细菌；3）能够在宿主中相对不活跃的持续存在而保留被激活的潜力。 1)致病物质 1.脂质 >>>索状因子(分枝菌酸和海藻糖结合的一种糖脂) 作用:破坏细胞线粒体膜,影响细胞呼吸,抑制白细胞游走和引起慢性肉芽肿>>>LAM(细胞壁的主要糖脂)(这个书上是没有的,是我在一篇论文里看到的,不知道靠不靠谱) 作用:抑制巨噬细胞产生γ干扰素,诱导巨噬细胞释放TNF-α和清除氧自由基. >>>磷脂 作用：促使单核细胞增生，并使炎症灶中的局势细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核结节 >>>硫酸脑苷脂 作用：可抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能在吞噬细胞中长期存活。 >>>蜡质D 作用：具有佐剂的作用，可激发机体产生迟发型超敏反应 2.蛋白质（包括菌体蛋白和生长周期中分泌于胞外的分泌蛋白） 作用：很多蛋白质有良好的抗原性，能和蜡质D结合后能使机体发生超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症状，并在形成结核结节中发挥一定作用。 3.多糖（由阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯甘露聚糖等组成） 作用：重要的抗原性物质，引发免疫学反应。还有研究发现该菌细胞壁表面的多糖物质类似荚膜，能够抵抗吞噬细胞的吞噬作用。 2）肺部感染类型及其机制 1．原发感染：结核分枝杆菌初次感染而发生的病变 主要特点：急性渗出性炎症并快速向相邻组织和区域淋巴结扩散以及干酪样坏死。 机制：结核分枝杆菌侵入巨噬细胞后大量繁殖 补充：结核分枝杆菌与巨噬细胞的相互作用 不同于其他通过逃避吞噬而致病的细菌，结合分枝杆菌主要是利用宿主细胞表面的多个受体而进入巨噬细胞。(甘露糖受体,补体受体和Fc受体),MTB进入巨噬细胞后,滞留在膜保围的液泡中. ———〉巨噬细胞裂解破坏 ———〉病原体释出，重复以上过程 ———〉肺泡渗出性炎症(缺乏特异性免疫力,故病灶局部反映轻微) ———〉肺门淋巴结肿大 ———〉（产生特异性细胞免疫后）超敏反应 ———〉刺激巨噬细胞转化为上皮细胞；抑制蛋白酶对组织的溶解，产生干酪样坏死（结核结节:坏死灶周围包着上皮样细胞,淋巴细胞,巨噬细胞和成纤维细胞形成的结节.） 2. 原发后感染：原发感染的再活化，或是外源性再感染，抑或是原发感染基础上的重叠感染。
结核分枝杆菌 Mycobacterium tube (五) 结核杆菌 1、概述 结核病是由结核杆菌引起的人畜共患的慢性传染病。 结核杆菌可能侵入人体全身各种器官，但主要侵犯肺脏，称为肺结核病。结核病又称为“痨病”和“白色瘟疫”，是一种古老的传染病，自有人类以来就有结核病。 在历史上，它曾在全世界广泛流行，曾经是危害人类的主要杀手，夺去了数亿人的生命。1882年科霍发现了结核病的病原菌为结核杆菌，但由于没有有效的治疗药物，仍然在全球广泛流行。自上世纪五十年代以来，不断发现有效的抗结核药物，使流行得到了一定控制。 但是，近年来，由于不少国家对结核病的忽视，减少了财政投入、再加上人口的增长、流 动人口的增加、艾滋病毒感染的传播，使结核病流行下降缓慢，有的国家和地区还有所回升。所以，世界卫生组织于1993年宣布“全球结核病紧急状态”，确定每年3月24日为“世界防治结核病日”。 通过很多调查分析看，肺结核病的主要症状有：咳 嗽、咳痰超过3周；咯血；发热或胸痛超过3周。有了上述 症状后，就是一位“肺结核可疑症状者”，就应当想到自己 是否患了肺结核病，最好到结核病防治所或结核病专科医 院检查。
Grange (1988） （1）无知时期始于有结核病的记载，直到十九世纪末叶发现结核病的病原菌为止。 （2）希望时期始于致病菌的发现到1950年左右有效药物如链霉素及异烟肼的陆续问世。 （3）目前处于进步时期，人们已经获得了分枝杆菌及其引起的疾病的丰富知识。 （4）人们期望在此基础上能进入第四个时期，也就是最后的征服时期。 2、流行病学 艾滋病日渐增加 抗结核药物菌株的广泛播散 2.1流行概况 外源性感染是指由来自宿主体外的病原菌所引起的感染。传染源主要包括传染病患者、恢复期病人、健康带菌者，以及病畜、带菌动物、媒介昆虫等。 内源性感染有少数细菌在正常情况下，寄生于人体内，不引起疾病。当机体免疫力减低时，或者由于外界因素的影响，如长期大量使用抗生素引起体内正常菌群失调，由此而造成的感染称之为内源性感染。 国内情况：
结核分支杆菌耐药性分析 了解绵阳市结核分支杆菌耐药情况，为耐药结核病的预防控制提供依据。方法采用比例法对79株结核分支杆菌进行一线抗结核药物：异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）耐药性检测。结果共检测出耐药菌17株，总耐药率为21.52%，多耐药率为12.66%，耐多药率为6.33%。初治耐药率为18.64%，获得性耐药率为30.00%。单耐药顺序为：INH＞SM＞RFP＞EMB，耐药率分别为15.19%，12.66%，7.59%，7.14%。耐药在性别和年龄组方面无统计学意义。结论绵阳市结核分支杆菌耐药率低于全国平均水平，应进一步加强耐药菌监测以指导临床合理用药。 近年来，耐药结核尤其是耐多药结核（multi drug-resistant tuberculosis，MDR-TB）呈全球流行趋势，是自20世纪80年代以来结核病疫情迅猛回升的主要原因之一，已成为结核病控制的重大难题[1]。根据2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查结果，绵阳地区15岁及以上人群肺结核的患病率为579/10万，高出全国平均水平26.1%（459/10万），属于结核疫情严重地区之一，但目前全市尚无耐药监测资料报告。现对2009年绵阳地区79株结核分支杆菌的药敏结果进行了初步分析，旨在为该地区耐药结核的监测、预防和临床用药提供重要信息。 1 材料与方法 1.1 菌株来源79株结核分支杆菌菌株于2009年由绵阳江油市和涪城区临床痰标本中分离获得，由四川省疾病预防控制中心结核病预防控制所负责传代培养、鉴定和保存。标准菌株H37Rv购自中国药品生物制品检定所。 1.2 药物敏感性试验采用比例法，取罗氏改良培养基上生长2～3周的新鲜菌落，研磨稀释成1 mg/ml 菌悬液，稀释至10-4和10-6mg/ml，分别用标准接种环以划线法接种至异烟肼（INH）、利福平（RFP）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）4种含药培养基及H37Rv对照培养基、PNB和TCH 2种鉴别培养基上，置37℃孵育4周后计算耐药百分比，耐药百分比＝含药培养基上菌落数/对照培养基上菌落数×100%，＜1%者报告敏感，≥1%者报告耐药[2]。 1.3 统计分析采用SPSS 1 2.0统计软件进行分析，运用卡方检验进行组间差异比较，P＜0.05为有统计学意义。 2 结果 2.1 一般情况79例结核菌株分别来源于江油市和涪城区2个地区，江油29例，涪城50例。患者最大年龄75岁，最小年龄17岁，平均年龄4 3.4岁；其中男性61例，女性18例；初治59人，复治20人。 2.2 总体耐药情况79株结核分支杆菌的药敏结果显示，62株对4种抗结核药全部敏感，至少耐1种药物的有17株，总耐药率为21.52%。只对一种药物耐药的有7株，耐药率为8.86%；对两种或两种以上药物耐药的有10株，多耐药率为12.66%。同时耐INH和RFP 的菌株5株，耐多药率为6.33%，占多耐药菌株的50.00%。对4种药物全部耐药的有2株，占多耐药菌株的20.00%。 2.3 初治耐药和获得性耐药情况初治患者59例，有11例对1种及1种以上药物耐药，初治耐药率为18.64%，初治耐多药率为11.86%；复治患者20例，有6例对1种及1种以上药物耐药，获得性耐药率为30.00%，获得性耐多药率为10.00%。复治患者耐药率高于初治患者耐药率，但差异无统计学意义（，P＞0.05）， 见表1。 表1 绵阳市结核分支杆菌初治耐药和获得性耐药情况 级别敏感株耐药株耐药率/%
结核分枝杆菌生物安全危害评估报告 危害程度分类 分类等级 在卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中将其列为第二类病原微生物（危害程度为m级），属高致病性病原微生物。 不同实验操作生物安全实验室级别要求 根据《名录》的规定，在实验操作涉及结核杆菌的大量培养、结核杆菌离心和冻干等易产生气溶胶的实验操作以及以结核杆菌活菌感染的动物实验，应在BSL-3或ABSL-3实验室进行。 临床样本的结核杆菌分离培养、药物敏感性实验、生化鉴定、免疫 学实验、PCF核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动可在BSL-2 实验室进行。 对经有效方法灭活后不含结核杆菌活菌材料的分子生物学、免疫学等实验可在BSL-1 实验室进行。 背景资料 般生物学特性 1. 形态染色结核杆菌细长略弯曲，端极钝圆，呈单个或分枝状排列， 无鞭毛和芽孢。结核杆菌一般常用萎~钠氏抗酸性染色法染色，结 核杆菌为红色，其他非抗酸性C细菌呈蓝色。 2.培养特性结核杆菌为专性需氧菌。最适，在35-40 C可生长，最 适温度为35-37 C,在2%-53二氧化碳环境中可促进其生长，在无 氧条件下则迅速死亡。 在外界环境的稳定性
结核分枝杆菌因细胞壁含大量类脂质，尤其是具有疏水性蜡样物质，对外界环境及理化因素的抵抗力比一般细菌繁殖体强，因而在外界环境中相当稳定，有利于结核菌的传播。 致病性和感染数量 1. 致病性人型结核杆菌是人类结核病的病原菌 2. 感染数量在自然条件下极易造成人群的感染。 四）传播途径及暴露后果 1. 传播途径结核杆菌有多种传播途径，以呼吸道吸入带菌的飞沫 及带菌的尘埃为主要传播途径。 2. 暴露后后果结核杆菌菌暴露后，在一定时间内暴露俞久，感染的 机会愈大。结核杆菌潜伏感染者一般无明显症状，发病者多为慢 性过程。可出现发热、盗汗、食欲减退、消瘦、疲乏无力等一般 结核病症状。如为肺结核还可出现咳嗽，咳痰、咳血及肺部X 线 改变等。部分病人，特别是儿童可出现脑膜炎及全身播散型结核。 五）宿主范围 天然宿主主要为人和牛. 六）结核病的预防、诊断和治疗 1. 预防卡介苗接种对预防和减少儿童结核病，特别是结核性脑膜 炎、血行播散性结核病的发生起着重要作用。目前对实验人员尚 无有效的特异性预防措施。 2. 诊断感染后是否发病依据可疑症状，X 线改变及病原学检查来判
结核分枝杆菌
结核分枝杆菌（M. tuberculosis）简称为结核杆菌（tubercle bacilli）。早在1886年，德国细菌学家郭霍（Koch）就已证明结核分枝杆菌是结核病的病原菌。本菌可侵犯全身各组织器官，但以肺部感染最多见。随着抗结核药物的不断发展和卫生生活状况的改善，结核的发病率和死亡率曾一度大幅下降。20世纪80年代后，由于艾滋病和结核分枝杆菌耐药菌株的出现、免疫抑制剂的应用、吸毒、贫困及人口流动等因素，全球范围内结核病的疫情骤然恶化。据WHO统计，全世界约每3个人中就有1个人感染了结核分枝杆菌，在某些发展中国家成人中结核分枝杆菌携带率高达80%，其中约5%～10%携带者可发展为活动性结核病。近二十年由于艾滋病的流行，感染了HIV的结核分枝杆菌携带者，由于病毒破坏了机体的免疫功能，发展为活动性结核病的可能性比未感染HIV者高30～50倍，且结核的病程发展更快。此外，在HIV感染的发展进程中，结核是最早发生的一种机会性感染，结核病加重了HIV感染者或艾滋病人的疾病负担，使其更易死亡。目前全球每年约出现8百万结核新病例，并导致约3百万人死亡。我国每年死于结核病的人约25万之多，是各类传染病死亡人数总和的两倍多。因此，结核病又成为了威胁人类健康的全球性卫生问题，并成为某些发展中国家和地区，特别是艾滋病高发区人群的首要死因。 编辑本段一、生物学性状 形态与染色 结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小1～4X0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼（Ziehl- Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。 近年发现结核分枝杆菌在细胞壁外尚有一层荚膜。一般因制片时遭受破坏而不易 结核分枝杆菌抗酸染色×1000