DOI :10.3724/SP.J.1096.2014.30857
黄油中8种类固醇激素的液相色谱/串联质谱检测
赵超敏1 岳振峰*2 吴晖*1 欧阳姗3 赖富饶1
肖陈贵2 张毅2 康海宁2 华红慧2
1
(华南理工大学轻工与食品学院,广州510640)2(深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心,深圳市食品安全检测技术研发重点实验室,深圳518045)3(中山大学生命科学学院,广州510275)
摘 要 建立了黄油中雌酮二α?雌二醇二β?雌二醇二雌三醇二睾酮二表睾酮二孕酮和丙酸睾酮8种类固醇激素的凝胶渗透色谱(GPC)?液相色谱/串联质谱(LC?MS /MS)检测方法三样品用乙酸乙酯?环己烷(1∶1,V /V )提取,提取液经GPC 柱净化除脂,GPC 浓缩液采用C 18色谱柱(100mm×2.0mm i.d.,3.0μm)分离,以乙腈和水为流动相进行梯度洗脱,电喷雾电离多反应监测模式进行定性和定量分析三8种类固醇激素以基质匹配外标法定量,药物在1.0~20.0μg /kg 线性范围内相关系数(r )均大于0.999;方法检出限(S /N =3)为0.04~0.30μg /kg,定量限LOQs(S /N =10)为1.0μg /kg;添加水平为1.0,2.0,4.0μg /kg 时,回收率范围在64.1%~
110%之间;相对标准偏差(RSD)小于11%三结果表明,本方法准确二可靠,满足黄油中8种类固醇激素的检测分析要求三
关键词 雌性激素;雄性激素;孕激素;黄油;液相色谱?串联质谱;凝胶渗透色谱 2013?09?04收稿;2014?11?06接受本文系国家质检总局局科技计划基金(No.2010IK137),广东省省部产学研项目基金(No.2010B090400342), 双打”质检公益项目子课题基金(No.2012104003?4)资助*E?mail:yuezhenfeng@https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html,;fehwu@https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html, 1 引 言
激素分析一直是诊断类固醇激素合成和代谢紊乱的重要手段[1]三动物源食品中激素残留的检测经常被报道,因为激素可被用于畜牧业以提高饲料转化率,达到促进动物生长发育二动物的同期发情及增加体重和育肥等目的,如雌二醇和睾酮等[2]三动物源食品中的激素残留通过食物链进入人体会产生健康危害,如生长发育障碍二出生缺陷和生长发育缺陷等[3]三我国农业部176号[4]二193号[5]和235号公告[6]明确规定,在动物食品中不得检出雌二醇和丙酸睾酮等激素类药物,许多国家和地区已禁止某些类固醇激素作为动物促生长剂[7]三黄油主要由甘油三酯(98%)二甘油二酯二单甘油酯和游离脂肪酸组成,已确定的脂肪酸约有500种,其它组分包括磷脂二脑苷脂二固醇二脂溶性维生素(V A ,V D 和V E )二色素(胡萝卜素)二矿物质和风味组分等三其中亚油酸的异构体共轭亚油酸具有抗癌二抗动脉粥样硬化二抗高血压和提高免疫力等功能;人类共轭亚油酸主要来自反刍动物食品,奶制品约占70%[8~12]三黄油因其营养价值二供能特性二良好的质构和口感特性而受到广泛欢迎,越来越多地被用于焙烤工业和餐饮业,中国2012年黄油累计进口量同2011年相比,同比增加10.6%[13]三人造黄油虽和黄油具有类似的食品加工特性,但其主要成分为氢化植物油和食品添加剂,基本没有激素残留的风险,营养价值也较差三关于动物源食品中激素的研究报道多是关于猪肉二牛肉[14]二羊肉二鸡肉和肝脏[15]二牛奶[16]二鸡蛋[17]和水产品[18]等,尚未见到黄油等高脂肪含量样品的报道三
黄油脂肪含量高,因此选择去除油脂效果良好的凝胶渗透色谱法(GPC)净化三GPC 净化技术已成
功应用于农药残留分析[19~21],近年来也有关于药物残留分析的报道,只有少量报道是关于激素分析[22,23]三类固醇激素的常用检测分析方法有GC?MS 法和LC?MS /MS 法等[24,25],但是GC?MS 法灵敏度低,并且需要衍生化,过程复杂且耗时;LC?MS /MS 法灵敏度高二重复性好二分析时间短,因此本文选择了全自动GPC 净化系统与LC?MS /MS 相结合检测黄油中的8种类固醇激素(图1),净化效果好二回收率高二灵敏度高和重现性好,满足残留分析技术要求三
第42卷
2014年3月 分析化学(FENXI HUAXUE ) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第3期360~366
图1 类固醇激素结构式Fig.1 Structure formulas of steroid hormones
E1:雌酮,E3:雌三醇,α?E:α?雌二醇,β?E:β?雌二醇,T:睾酮,EpiT:表睾酮,T?P:丙酸睾酮,P:孕酮三E1:Estrone,E3:Estriol,α?E:α?Estradiol,β?E:β?Estradiol,T:Testosterone,EpiT:Epitestosterone,TP:Testosterone propionate,P:Progesterone.2 实验部分
2.1 仪器与试剂API5000型三重四级杆串联质谱仪配电喷雾离子源(美国AB 公司);1200型高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);全自动凝胶净化系统(GPC Vario,德国LCtech 公司);漩涡振荡器(德国Heidolph 公司);低温离心机(美国Sigma 公司);往复式振荡器(日本Yamato 公司);恒温振荡水浴摇床(德国Julabo 公司);全自动氮吹仪(美国Caliper 公司);移液器(法国Gilson 公司)三
类固醇激素标准物质睾酮二17α?雌二醇二17β?雌二醇二雌三醇二雌酮二孕酮二丙酸睾酮和表睾酮(纯度≥
98%)购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司;甲醇二环己烷二乙酸乙酯和乙腈(HPLC 级)购自美国TEDIA 公司三
黄油样品:市售进口黄油(非人造黄油)三2.2 GPC 条件柱类型:GPC 40010(300mm×20mm);填料:24g Bio?Beads SX?3(中性二多孔的聚苯乙烯?二乙烯基苯微球体),柱床高24cm;流动相:乙酸乙酯/环己烷(1∶1,V /V );定量环:5.0mL,浓缩至2mL;流速:4.7mL /min;柱预洗时间:10s;前运行时间:约11min;主收集时间:34min;尾洗时间:4min;
溶剂交换周期:3次三检测波长:254nm三
2.3 色谱/质谱条件2.
3.1 色谱条件 雌性激素负离子模式:流动相A 为水,流动相B 为乙腈三液相洗脱条件为:0.0min (35%B)?12.0min(70%B)?13.0min(70%B)?13.1min(35%B)?18.0min(35%B),进样量:10μL,流速:250μL /min三雄性激素与孕激素正离子模式:流动相A 为水,流动相B 为乙腈三液相洗脱条件为:0.0min (35%B)?12.0min (70%B)?21.0min(100%B)?21.1min(35%B)?26.0min(35%B),进样量:10μL,流速:200μL /min三 2.3.2 质谱条件 负离子模式(ESI -):碰撞气压41.4kPa,气帘气压241.3kPa,雾化气压275.8kPa,去溶剂气压482.7kPa,离子喷雾电压-4500V,离子源温度500℃三
正离子模式(ESI +):碰撞气压41.4kPa,气帘气压241.3kPa,雾化气压275.8kPa,去溶剂气压
482.7kPa,离子喷雾电压5500V,离子源温度500℃三2.4 样品处理 称取1g 样品(精确到0.01g)于15mL 具塞离心管中,加5mL 环己烷/乙酸乙酯(1∶1,V /V )涡旋1min,溶解后定容至10.0mL,定容液往复振荡20min 和45℃下水浴5min,然后在9500r /min 下离心5min,收集上清液至GPC 样品瓶中,经GPC 净化二浓缩,浓缩液40℃氮气吹至近163第3期赵超敏等:黄油中8种类固醇激素的液相色谱/串联质谱检测
干,用35%乙腈溶液溶解浓缩物并定容至1.0mL,过0.22μm 滤膜,供测定三
3 结果与讨论
3.1 提取溶剂的选择
激素常用提取溶剂为乙腈[26]二甲醇[17]和叔丁基甲醚[2]三激素是分子量较小的脂溶性物质,样品中激素含量与脂含量成正比[27]三黄油是新鲜牛奶加以搅拌之后上层的浓稠状物体滤去部分水分之后的产物,其含脂量高,常用提取溶剂对其溶解性差,叔丁基甲醚和正己烷可溶解黄油,但溶解效果低于乙酸乙酯/环己烷三乙酸乙酯/环己烷(1∶1,V /V )能溶解油脂,且溶解黄油为澄清溶液,乙酸乙酯/环己烷也
是凝胶色谱常用流动相,因此选择乙酸乙酯/环己烷(1∶1,V /V )作为提取溶剂三
3.2 GPC 净化条件的确定黄油含脂量高,激素脂溶性强,基质效应严重,有效去除油脂是准确测定黄油中激素的关键三GPC 根据被分离物质分子量大小不同而分离,能有效去除油脂和色素等大分子物质三选择型号40010凝胶柱,Bio?Beads SX?3是为柱填料三流动相选择沸点一致的乙酸乙酯(77℃)和环己烷(88.7℃),因沸点一致比例不会发生显著变化,洗脱条件较稳定三进样量为5mL,检测波长为254nm三GPC 净化主要是切割时间点的选择,要充分考虑排除的基质与待测物的分离情况,如凝胶色谱图2所示,当流速为
4.7mL /min 时,大分子物质油脂的保留时间在4~9min,10min 时被完全洗脱下来,因此本实验前运行时间设计为10~11min,其间隔周期为10s;主收集时间设计为16.5,20,33和50min三如图3A 所示,前运行时间在10min 时加标回收率最高,但是在10.5min 之前存在基质效应,有部分油脂被接收,因此综合考察加标回收率二除脂效果和基质效应,最终选择前运行时间为10.5min;图3B 所示,主收集时间在33min 时回收率最大,时间即使再延长回收率也变化不大,因此选择主收集时间为33min;流速分别考察了4.0,4.5和4.7mL /min,结果显示,在获得相近回收率情况时,增大流速,缩短了样品的前运行时间和主收集时间,因此为了缩短样品处理时间,流速选择为4.7mL /min三
GPC 净化后结合SPE 柱(Florisil 柱:6mL,1g,Supelco)净化结果发现,单独使用GPC 净化与GPC?
SPE 联用净化效果相同,但是GPC?SPE 联用的加标回收率稍低于单独使用GPC,因此,为了减少目标物
图2 凝胶渗透色谱图(紫外波长:254nm)Fig.2 Chromatograms of gel permeation chromatography
(GPC)(Ultraviolet wavelength:254nm)的损失,只选择GPC 净化就能满足实验要求三3.3 质谱条件的优化取浓度为1.0mg /L 的各激素标准溶液,采用微
量挤压泵连续进样,一级质谱全扫描,确定准分子离
子三结果显示,4种雌激素在负离子模式下获得准分
子离子峰,3种雄性激素和1种孕激素在正离子模式
下获得准分子离子三以母离子为准分子离子进行扫
描二级质谱,选丰度较高的两个碎片离子作为定性
定量离子,并优化对应离子对的去簇电压(Decluste?ring potential,DP)二碰撞能(Collision energy,CE)二碰撞室出口电压(Collision cell exit potential,CXP)和碰
撞室入口电压(Entrance potential,EP)三综合所有离子对响应信号优化了质谱离子源温度(Temperture,TEM)二碰撞气压(Collision gas,CAD)二气帘气压(Curtain gas,CUR)二雾化气压(GS1)二去溶剂气压(GS2)和离子源喷雾电压(Ion spray voltage,IS)三碰撞
室出口电压为15V,碰撞室入口电压为10V,主要质谱参数见表1三
3.4 液相色谱条件优化分别选择乙腈?水和乙腈(0.1%甲酸)?水(0.1%甲酸)为流动相,选择C 18色谱柱,采用不同色谱柱二
流动相和流速分析结果三结果表明,YMC Hydrosphere C 18色谱柱优于Agilent poroshell C 18色谱柱,Hydrosphere 柱分离效果二批次重现性二重复性和峰型(窄而无拖尾)均较好,其色谱图如图4;Poroshell 柱重复性差,峰型不稳定,批次间响应值差异大,且峰裂较严重三选择YMC 柱为分离柱,改变柱温(20,263 分析化学第42卷
图3 GPC 前运行时间(A)和主收集时间(B)对黄油中激素加标回收率的影响
Fig.3 Influence of GPC?forerun time(A)and GPC?main fraction time(B)on the recovery of hormones in butter 1.雌酮;2.α?雌二醇;3.β?雌二醇;4.雌三醇;5.睾酮;6.表睾酮;7.孕酮;8.丙酸睾酮
1.Estrone;
2.α?Estradiol;
3.β?Estradiol;
4.Estriol;
5.Testosterone;
6.Epitepitestosterone;
7.Progesterone;
8.Testosterone propionate.表1 激素LC?MS /MS 检测的实验条件Table 1 Experimental conditions for LC?MS /MS detection for hormones
分析物类别Class of analytes 分析物Analyte
保留时间Retention time (min)母离子Precursor ion (m /z )子离子Product ions (m /z )去簇电压Declustering potential (V)碰撞气能量Cellision energy (eV)雌激素Estrogen
雄性激素Androgens 孕激素Progestin 雌酮Estrone
9.8017α?雌二醇17α?Estradiol
8.7917β?雌二醇17β?Estradiol
8.21雌三醇Estriol
2.35表睾酮Epitestosterone
12.82睾酮Testosterone
10.97丙酸睾酮Testosterone propionate
21.36孕酮Progesterone 16.87269.1145.0-120-43269.1143.0-120-75271.2145.0-160-58271.2143.1-160-78271.1144.9-160-55271.1183.1-160-55287.2145.0-120-56287.2171.1-120-53289.597.112035289.5109.212038289.597.212033289.5109.212037345.697.29035345.6109.29040315.497.29035315.4109.2903825和30℃)对分析物分离效果及响应值的变化影响不大,因此柱溫选择为室温;正离子模式时,流动相加甲酸并没有显著提高分析物的响应信号,乙腈在负离子模式时有利于分析物的去质子化,因此,正负离子模式时流动相选择为乙腈/水;流速分别采用0.2,0.25和0.3mL /min,分析结果显示,雌激素在0.25mL /min 时灵敏度高二分离度好,雄激素和孕激素在0.2mL /min 时灵敏度高二分离度好;α?雌二醇和β?雌二醇二睾酮和表睾酮是差向异构体,异构体的特征离子对相同,所以同时检测两对异构体时仅靠离子的对差异性分不开,因此必须优化液相条件使得差向异构体分开,研究发现,优化的液相条件对两对差向异构体分离度好三3.5 分析方法的评价3.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限 采用基质匹配外标法定量三回归方程的获得是利用浓度范围为1.0~20.0μg /kg 的混合标准溶液,以浓度为横坐标(x ,μg /kg)和定量离子对峰面积为纵坐标(y )进行线性回归计算,所得相关系数均大于0.999,线性关系良好三检出限(LOD)和定量限(LOQ)根据信噪比
S /N =3和S /N≥10确定,8种类固醇激素的LODs 为0.04~0.30μg /kg,定量限LOQs 确定为1.0μg /kg三
3.5.2 方法的回收率与精密度 按照1.0,2.0,
4.0μg /kg 浓度水平对空白黄油样品进行添加回收实3
63第3期赵超敏等:黄油中8种类固醇激素的液相色谱/串联质谱检测
图4 激素混合标准溶液的定量离子色谱图(雌三醇/17α/β?雌二醇/雌酮为1.0μg /L,其它药物为2.0μg /L)Fig.4 Chromatograms of quantification transitions of mixed standard solution of hormone (1.0μg /L for estriol /17α/β?estradiol /estrone,2.0μg /L for other drugs)验,每个添加水平平行测定6次,计算平均加标回收率和相对标准偏差(RSD),回收率为64.1%?110%,
相对标准偏差为2.5%~11%(表2)三可见,方法的准确度和精密度符合禁用药物分析技术要求三
表2 空白黄油基质中激素加标的回收率和精密度(n =6)Table 2 Rcoveries and accuracies of hormone drugs in spiked butter (n =6)激素Hormone 加标浓度Spiked (μg /kg)回收率Recovery (%)相对标准偏差RSD (%)雌三醇Estriol 1,2,464.1~88.5 4.6~9.317β?雌二醇17β?estradiol 1,2,477.9~105 4.5~8.517α?雌二醇17α?estradiol 1,2,484.6~100 4.5~6.7雌酮Estrone 1,2,489.1~110 3.5~6.8睾酮Testosterone 1,2,475.2~92.5 6.6~7.7表睾酮Epitestosterone 1,2,472.7~95.1 2.5~9.9孕酮Progesterone 1,2,480.1~110 6.9~8.4丙酸睾酮Testosterone propionate 1,2,468.9~90.1 6.0~11.03.6 实际样品分析应用所建方法对4个市售黄
油样品进行分析,结果见表3,样
品1和样品2中均含有孕酮二表
睾酮二雌酮和α?雌二醇;样品3
和样品4中含有孕酮二表睾酮和
雌酮,但除孕酮外,其它激素的含
量均小于方法的定量限;4个样
品中均未检出β?雌二醇二雌三
醇二睾酮和丙酸睾酮三4个市售
黄油样品中孕酮含量最高,样1,
2和4含量相近,范围在127~138μg /kg,这与文献报道的黄油中孕酮含量值(132.9±5.1)μg /kg 相近[28],样3含量稍高,达180.8μg /kg,但4个样品中孕酮含量均低于另一文献报道中黄油孕酮含量值300μg /kg [29],在4个样品中也检测到雌激素雌酮或α?雌二醇,这也与文献[30]报道牛奶中主要雌激素是雌酮和雌二醇一致,本实验与此文献差异为在报道中还检出α?雌二醇的差向异构体β?雌二醇三很少有报道对牛奶或黄油中雄性激素进行检测,但是曾有研究者在牛奶中检测出睾酮(0.02~表3 4个实际样品的检测结果Table 3 Results of four kinds of real samples
激素Hormone 样品1Sample 1(μg /kg)样品2Sample 2(μg /kg)样品3Sample 3(μg /kg)样品4Sample 4(μg /kg)雌三醇Estriol 未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)17β?雌二醇17β?estradiol
未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)17α?雌二醇17α?estradiol 0.340.33未检出(ND)未检出(ND)雌酮Estrone 0.28
0.080.160.08睾酮Testosterone 未检出(ND)
未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)表睾酮Epitestosterone 0.85
0.150.590.18孕酮Progesterone 127
132181138丙酸睾酮Testosterone propionate
未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)未检出(ND)ND:not detected.463 分析化学第42卷
0.15μg /L)[31,32],本实验未在动物黄油中检出睾酮,但是4个样品中均检测到表睾酮,表睾酮是睾酮的主要代谢物三
4 结 论
建立了黄油中8种类固醇激素的凝胶渗透色谱(GPC)?液相色谱/串联质谱(LC?MS /MS)检测方法三所建GPC 法简化了复杂的样品前处理过程,净化效果好,有效降低了样品中基质对激素检测的干扰,目标物回收率高三应用所建方法对实际动物黄油样品进行检测,结果表明,该方法灵敏度高二重现性好二准确可靠,满足高脂样品中类固醇激素残留量的确证检测要求,对高脂含量样品中药物残留分析具有一定参考意义三
References 1 Krone N,Hughes B A,Lavery G G,Stewart P M,Arlt W,Shackleton C H.J.Steroid Biochem.Mol.Biol.,2010,121(3?5):496-5042 Akre C,Fedeniuk R,MacNeil J D.Analyst ,2004,129(2):145-149
3 XIE Wei?Ping,OUYANG Yan?Ling,HUANG Ying?Yu,CHEN Chun?Zhu.Chinese Journal of Chromatography ,2010,28(4):388-392谢维平,欧阳燕玲,黄盈煜,陈春祝.色谱,2010,28(4):388-392
4 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 176,2002中华人民共和国农业部公告第176号,2002
5 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 193,2002中华人民共和国农业部公告第193号,2002
6 The Ministry of Agriculture Bulletin of PRC 235,2002
中华人民共和国农业部公告第235号,20027 Scarth J,Clarke A,Hands J,Teale P,Macarthur R,Kay J.Chromatographia ,2009,71(3?4):241-252
8 GAO Hong?Yan,MO Bei?Hong,JIANG Shi?Long,WANG Yin?Yu.Chinese Journal of Science and technology of Food
Industry ,2009,30(03):364-366高红艳,莫蓓红,蒋士龙,王荫榆.食品工业科技,2009,30(03):364-366
9 LIU Zhi?Dong,HUANG Hong?Liang,SHEN Jian,GU Jin?Hong,OUYANG Jie.Chinese Journal of Academic Periodical of Farm Products Processing ,2012,(10):93-97
刘志东,黄洪亮,沈建,顾锦鸿,欧阳杰.农产品加工(学刊),2012,(10):93-97
10 Serafeimidou A,Zlatanos S,Laskaridis K,Sagredos A.Food Chem.,2012,134(4):1839-184611 Bhattacharya A,Banu J,Rahman M,Causey J,Fernandes G.J.Nutr.Biochem.,2006,17(1):789-810
12 Mele M,Contarini G,Cercaci L,Serra A,Buccioni A,Povolo M,Conte G,Funaro A,Banni S,Lercker G,Secchiari P.Int.Dairy J.,2011,21(5):365-37213 LUO Jun,YU Jin?Yong,CHEN Bing.Chinese Journal of China Dairy Cattle ,2013,(2):16-22罗俊,于进永,陈兵.中国奶牛,2013,(2):16-22
14 Vanhaecke L,Vanden Bussche J,Wille K,Bekaert K,De Brabander H F.Anal.Chim.Acta ,2011,700(1?2):70-7715 Marchand P,Bize B,Gade C,Monteau F,AndréF.J.Chromatogr.A ,2000,867:219-233
16 Malone E M,Elliott C T,Kennedy D G,Regan L.J.Chromatogr.B ,2010,878(15?16):1077-108417 Wang Q L,Zhang A Z,Pan X,Chen L R.Anal.Chim.Acta ,2010,678(1):108-116
18 ZHANG Ai?Zhi,WANG Quan?Lin,SHEN Jian,ZHANG Shu?Fen,CHEN Li?Ren.Chinese Journal of Chromatography ,
2010,28(2):190-196张爱芝,王全林,沈坚,张书芬,陈立仁.色谱,2010,28(2):190-196
19 Wang J H,Guo C.J.Chromatogr.A ,2010,1217(28):4732-4737
20 JI Xin?Xin,SHI Zhi?Hong,CAO Yan?Zhong,SHI Li?Li,WANG Na,PANG Guo?Fang.Chinese Journal of Instrumental
Analysis ,2009,28(12):1433-1439纪欣欣,石志红,曹彦忠,石利利,王娜,庞国芳.分析测试学报,2009,28(12):1433-1439
563第3期赵超敏等:黄油中8种类固醇激素的液相色谱/串联质谱检测
663 分析化学第42卷21 XU Xiao?Qin.Chinese journal of Shandong University of Technology(Natural Science Edition),2011,25(4):74-78徐晓琴.山东理工大学学报(自然科学版),2011,25(4):74-78
22 Liu J L,Wang R M,Huang B,Lin C,Wang Y,Pan X J.Environ.Pollut.,2011,159(10):2815-2822
23 Sun H W,Kang Z S,Li H.Chinese J.Anal.Chem.,2010,38(9):1272-1276
24 SHI Xian?Zhe,CAI Bin,HUANG Si?Teng,SHAN Yuan?Hong,ZHANG Ting?Ting,LU Xin,XU Guo?Wang.Chinese J.
Anal.Chem.,2013,41(4):517-522
石先哲,蔡斌,黄思腾,单圆鸿,张婷婷,路鑫,许国旺.分析化学,2013,41(4):517-522
25 GE Feng,TAN Li?Chao,SHAN Zheng?Jun,WANG Yi.Journal of Instrumental Analysis,2011,30(11):1295-1300葛峰,谭丽超,单正军,王懿.分析测试学报,2011,30(11):1295-1300
26 ZHU Wei?Xia,LIU Ya?Feng,YUAN Ping,YANG Ji?Zhou.Chinese Journal of Chromatography,2010,28(11): 1031-1037
祝伟霞,刘亚风,袁萍,杨冀州.色谱,2010,28(11):1031-103
27 Hartmann S,Lacorn M,Steinhart H.Food Chem.,1998,62(1):7-20
28 Ginther O J,Nuti L C,Garcia M C,Wentworth B C,Tyler W J.J.Anim.Sci.,1976,42(1):155-159
29 Hoffmann B,Hamburger R,Karg H.J.Eur.Food Res.Technol.,1975,158(5):257-259
30 Erb R E,Chew B P,Keller H F.J.Anim.Sci.,1977,45(3):617-626
31 Hoffman B,Rattenberger E.J.Anim.Sci.,1977,45(3):635-647
32 Gaiani R,Chiesa F,Mattioli M,Nannetti G,Galeati G.J.Reprod.Fertil.,1984,70(1):55-59
Determination of Eight Steroid Hormones in Butter Samples by Liquid Chromatography?Tandem Mass Spectrometry
ZHAO Chao?Min1,YUE Zhen?Feng*2,Wu Hui*1,OYANG Shan3,LAI Fu?Rao1,
Xiao Chen?gui2,ZHANG Yi2,KANG Hai?Ning2,HUA Hong?Hui2
1(College of Light Industry&Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou510640,China) 2(Key Laboratory of Detection Technology R&D on Food Safety,Food Inspection Center,
Shenzhen Entry?Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shenzhen5108045,China)
3(School of Life Sciences,Sun Yat?Sen University,Guangzhou510275,China)
Abstract A method was developed for the determination of eight steroid hormones(estrone,α/β?estradiol, estriol,testosterone,epitestosterone,progesterone and testosterone propionate)in butter samples by gel permeation chromatography(GPC)purification?followed by liquid chromatography?tandem mass spectrometry (LC?MS/MS).The samples were first extracted by ethylacetate/cyclohexane(1∶1,V/V)and the extract was later degreased by GPC column.Then,the GPC concentrate was separated using a C18column(100mm×2.0mm i.d.,3.0μm)with gradient elution of acetonitrile/water.Finally,the steroid hormone components were qualitatively and quantitatively determined by mass spectrometer with electrospray ionization in multi reaction monitoring https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html,ing matrix matched external standard method,good linearity in response could be obtained in the concentration range of1.0-20.0μg/kg with correlation co?efficiency larger than0.999.The detection limits of the method were0.04-0.30μg/kg and the quantification limit was1.0μg/kg.At the spike levels of1.0,2.0and4.0μg/kg,the recoveries of hormones were within the range of64.1%-110%, and the relative standard deviation(RSD)was less than11%.The results show that the method is accurate and reliable,and meets the requirements for determination of8steroid hormones in butter samples. Keywords Estrogens;Androgens;Progestin;Butter;Liquid chromatography?tandem mass spectrometry; Gel permeation chromatography
(Received4September2013;accepted6November2013)
气相色谱-串联质谱仪操作规程
气相色谱-串联质谱仪(TSQ 8000 EVO)操作规程 1、开机 1.1 打开钢瓶氦气气源，使输出压力约为0.5Mpa；打开钢瓶氩气气源，使输出压力约为0.1-0.2 Mpa。 1.2 打开GC的总电源开关，设定载气流速，保证有载气通过色谱柱。 1.3 打开TSQ 8000总电源，观察前面板上的指示灯显示，此时Power 为绿色，Vacuum 和heaters为橙色，Busy为蓝色。 1.4 打开TSQ 8000 DashBoard，在Instrument Control中设置离子源温度和传输线温度。 5. 观察指示灯的颜色，待真空指示灯和加热指示灯由橙色变为绿色时，仪器即可以开始使用。 2、质谱调谐 仪器的真空度正常，离子源、进样口和质谱传输线温度稳定后，做质谱调谐： 2.1 打开TSQ 8000 Dashboard，选择Auto Tune。 2.2 选择调谐方式，点击Start。 3、AutoSRM 建立方法 3.1 打开TSQ 8000 Dashboard，选择AutoSRM。 3.2 选择新建AutoSRM，模式中选择优化母离子模式，输入化合物的名称及样品瓶的位置，保存并命名此AutoSRM。之后点击运行AutoSRM 的优化母离子模式。 3.3 数据采集结束后，在采集的数据中提取目标化合物的特征离子，找到合适的目标峰后，在右边的对话框中选择强度高的母离子，将母离子添加到做母离子全扫的列表中。
3.4所有化合物的母离子选择好之后，进入到子离子优化步骤。在模式中选择子离子优化模式，保存后点击运行样品。 3.5 数据采集结束后，选择强度高的子离子添加到列表中，点击，进入到SRM优化步骤。选择Full Range以步长为5V来优化碰撞能量；或者选择Targeted以步长为2V来优化碰撞能量。保存后点击运行样品。 3.6 数据采集结束后，选择强度最高的碰撞能量，点击加入到右边的列表中，所有SRM离子对优化完成后，将SRM列表导出成csv格式的表格，直接导入方法中使用。 4、TraceFinder 数据处理 4.1 打开现有的仪器方法，在TSQ8000子目录下，选择Create compound data store export file。 4.2 点击Create Export File，将方法中的SRM列表保存成xml的格式。 4.3 打开Trace Finder，在Configuration目录中点击import compound，导入上一步保存的xml表格。导入后在File的下拉菜单中选择Save Compound Datastore，完成自建CDS数据库过程。 4.4 打开TraceFinder，选择 Method Development这个目录，选择Create method建立进样方法及数据处理方法。 4.5 在Analysis 目录下，点击new batch 建立batch，选择相应的Master Method，选择要做数据处理或者进样的文件，输入样品瓶的位置，保存这个batch，然后Sumbit，运行单个样品或多个样品。可以选择进样，做数据处理或者出报告。 4.6在Analysis 中选择Data Review，可以查看数据结果。 4.7在Analysis 中选择Report Review，可以查看报告结果。 5、关机
消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定?液相色谱-串联质谱法 Determination of clobetasol propionate and levofloxacin hydrochloride in disinfection product - LC-MS-MS method 1 范围 本方法规定了膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量的测定。 取样量为0.1g时，本方法对丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限见表1。 表1 丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限、保留时间和特征离子 中文名称英文名称 检出限 （μg/g） 保留时 间（min） 特征离子(m/z) 丙酸氯倍他索Clobetasol propionate 0.009 7.83 467.0/355.2/373.4 盐酸左氧氟沙星Levofloxacin hydrochloride 0.06 1.11 362.0/260.9/318.2 2 规范性引用文件 3 原理 试样中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。 4.1甲醇：农药残留级。 4.2乙腈：农药残留级。 4.3甲酸：分析纯。
4.4标准品：丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星均购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99.8%。 4.5标准溶液：准确称取丙酸氯倍他索适量，用乙腈－水（1：1）配制成100μg/mL 的标准贮备液。准确称取盐酸左氧氟沙星适量，用纯水配制成100μg/mL的标准贮备液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用乙腈稀释配制成浓度为10.0μg/mL 的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4 C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。 4.6甲酸溶液(0.2%，v/v)：量取2mL甲酸，用纯水定容至1000mL。 4.7 0.45μm滤膜。 5 仪器 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ，电喷雾离子化源(ESIMS，NI/PI模式)。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。 5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。 5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡旋振荡器。 5.5 具塞试管：10mL。 6 试样的制备与保存 6.1 试样的制备 取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。 6.2 试样保存 制备好的试样置于室温保存。 7 测定步骤 7.1样品前处理 称取0.1g~0.2g样品(精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.7）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa; （5）检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口； （6）开启动力电源，电压稳定，正常；
液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03
实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，
用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以
气相色谱-串联质谱仪(TSQ 8000 EVO)操作规程 1、开机 1.1 打开钢瓶氦气气源，使输出压力约为0.5Mpa；打开钢瓶氩气气源，使输出压力约为0.1-0.2 Mpa。 1.2 打开GC的总电源开关，设定载气流速，保证有载气通过色谱柱。 1.3 打开TSQ 8000总电源，观察前面板上的指示灯显示，此时Power 为绿色，Vacuum 和heaters为橙色，Busy为蓝色。 1.4 打开TSQ 8000 DashBoard，在Instrument Control中设置离子源温度和传输线温度。 5. 观察指示灯的颜色，待真空指示灯和加热指示灯由橙色变为绿色时，仪器即可以开始使用。 2、质谱调谐 仪器的真空度正常，离子源、进样口和质谱传输线温度稳定后，做质谱调谐： 2.1 打开TSQ 8000 Dashboard，选择Auto Tune。 2.2 选择调谐方式，点击Start。 3、AutoSRM 建立方法 3.1 打开TSQ 8000 Dashboard，选择AutoSRM。 3.2 选择新建AutoSRM，模式中选择优化母离子模式，输入化合物的名称及样品瓶的位置，保存并命名此AutoSRM。之后点击运行AutoSRM 的优化母离子模式。 3.3 数据采集结束后，在采集的数据中提取目标化合物的特征离子，找到合适的目标峰后，在右边的对话框中选择强度高的母离子，将母离子添加到做母离子全扫的列表中。
3.4所有化合物的母离子选择好之后，进入到子离子优化步骤。在模式中选择子离子优化模式，保存后点击运行样品。 3.5 数据采集结束后，选择强度高的子离子添加到列表中，点击，进入到SRM优化步骤。选择Full Range以步长为5V来优化碰撞能量；或者选择Targeted以步长为2V来优化碰撞能量。保存后点击运行样品。 3.6 数据采集结束后，选择强度最高的碰撞能量，点击加入到右边的列表中，所有SRM离子对优化完成后，将SRM列表导出成csv格式的表格，直接导入方法中使用。 4、TraceFinder 数据处理 4.1 打开现有的仪器方法，在TSQ8000子目录下，选择Create compound data store export file。 4.2 点击Create Export File，将方法中的SRM列表保存成xml的格式。 4.3 打开Trace Finder，在Configuration目录中点击import compound，导入上一步保存的xml表格。导入后在File的下拉菜单中选择Save Compound Datastore，完成自建CDS数据库过程。 4.4 打开TraceFinder，选择 Method Development这个目录，选择Create method建立进样方法及数据处理方法。 4.5 在Analysis 目录下，点击new batch 建立batch，选择相应的Master Method，选择要做数据处理或者进样的文件，输入样品瓶的位置，保存这个batch，然后Sumbit，运行单个样品或多个样品。可以选择进样，做数据处理或者出报告。 4.6在Analysis 中选择Data Review，可以查看数据结果。
液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：
气相色谱-质谱联用技术 气相色谱-质谱联用技术，简称质谱联用，即将气相色谱仪与质谱仪通过接口组件进行连接，以气相色谱作为试样分离、制备的手段，将质谱作为气相色谱的在线检测手段进行定性、定量分析，辅以相应的数据收集与控制系统构建而成的一种色谱-质谱联用技术，在化工、石油、环境、农业、法医、生物医药等方面，已经成为一种获得广泛应用的成熟的常规分析技术。 1、产生背景 色谱法是一种很好的分离手段，可以将复杂混合物中的各种组分分离开，但它的定性、鉴定结构的能力较差，并且气相色谱需要多种检测器来解决不同化合物响应值的差别问题；质谱对未知化合物的结构有很强的鉴别能力，定性专属性高，可提供准确的结构信息，灵敏度高，检测快速，但质谱法的不同离子化方式和质量分析技术有其局限性，且对未知化合物进行鉴定，需要高纯度的样本，否则杂质形成的本底对样品的质谱图产生干扰，不利于质谱图的解析。气相色谱法对组分复杂的样品能进行有效的分离，可提供纯度高的样品，正好满足了质谱鉴定的要求。 气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass sepetrometry , GC-MS）技术综合了气相色谱和质谱的优点，具有GC的高分辨率和质谱的高灵敏度、强鉴别能力。GC-MS可同时完成待测组分的分离、鉴定和定量，被广泛应用于复杂组分的分离与鉴定。 2、技术原理与特点 气相色谱技术是利用一定温度下不同化合物在流动相（载气）和固定相中分配系数的差异，使不同化合物按时间先后在色谱柱中流出，从而达到分离分析的目的。保留时间是气象色谱进行定性的依据，而色谱峰高或峰面积是定量的手段，所以气相色谱对复杂的混合物可以进行有效地定性定量分析。其特点在于高效的分离能力和良好的灵敏度。由于一根色谱柱不能完全分离所有化合物，以保留时间作为定性指标的方法往往存在明显的局限性，特别是对于同分异构化合物或者同位素化合物的分离效果较差。 质谱技术是将汽化的样品分子在高真空的离子源内转化为带电离子，经电离、引出和聚焦后进入质量分析器，在磁场或电场作用下，按时间先后或空间位置进行质荷比（质量和电荷的比，m/z）分离，最后被离子检测器检测。其主要特点是迁建的结构鉴定能力，能给出化合物的分子量、分子式及结构信息。在一定条件下所得的MS碎片图及相应强度，犹如指纹图，易与辨识，方法专属灵敏。但质谱拘束最大的不足之处在与要求样品是单一组分，无法满足复杂物质的分析。
液相色谱串联质谱的 小知识
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。 4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa;
液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定癫痫患者血清中 卡马西平的浓度 谢 华ì，王 荣，贾正平?， 徐丽婷 （兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050） 摘要目的：本文建立了液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定患者血清中的卡马西平浓度的方法。方法：色谱柱：Zorbax Extend-C18柱（150×4.6 mm I.D，5μm）；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸 胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1。结果：卡马西平浓度在2～40 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为101.1%，日内精密度、日间精密度的RSD分别为3.39%和4.11%。并测定了10名患者血清中卡马西平的浓度。结论：本方法具有良好的灵敏度、准确度、精确度及专属性，结果准确，重现性好，易于操作，可用于患者血清中卡马西平浓度的测定。 关键词卡马西平；LC/MS/MS；血清 Content Determination of Carbamazepine in epileptic patient serum by Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry XIE Hua, JIA Zheng-ping*, WANG Rong, XU Li-ting (Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China) ABSTRACT OBJECTIVE:An analytical method based on Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detection was developed for the content determination of carbamazepine in epileptic patient serum. METHODS: The method included that the column was Zorbax Extend-C18(150×4.6 mm I.D.，5μm ); mobile phase was methanol-0.01mmol·L-1amine acetic acid (80:20，v/v) at a flow rate of 0.3 mL·min-1. RESULTS: The method was proved to be linear in the range of 2~40ng·mL-1 with a regression confficient of 0.9976. The average recovery rate was 101.1%(n=5). The RSD of average contents of intra-day and inter-day was 3.39% and 4.11% respectively. The carbamazepine concentrations of ten epileptic patient’s serums were detected. CONCLUSION: This method is accurate, precise, sensitive and specific to be used in the content determination of carbamazepine serum. KEY WORDS Carbamazepine; LC/MS/MS; Serum ?基金项目：国家科技部重大项目（2008ZXJ09014-010） ì主管药师。研究方向：临床治疗药物监测。电话：(0931)8994675; E-mial: xiehua-72@https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html, ?通讯作者：教授，主任药师，博士。研究方向：临床药学。电话：(0931)8994652。
固相萃取-高效液相色谱串联质谱法 测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究 李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076） 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。 关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China） Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate. *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html,。 作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。 基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。
浅谈液相色谱质谱联用技术 刘谦 保定出入境检验检疫局，保定 071000 摘要：液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在药物分析，食品检测等领域有广泛的应用。 关键词：液相色谱质谱食品检测 高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。 在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。 我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 下面说一说ESI和API源的异同点。 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性
附件 气相色谱-三重四极杆串联质谱仪技术参数原装进口 主要用途：用于食品、农产品、环境样品等复杂基质中痕量有机化合物的定量定性分析 1.工作条件 1.1电源:220V，50Hz 1.2温度:操作环境15?C -35?C 1.3湿度:操作状态25-50%, 非操作状态10-95% 2.性能指标 *2.1 气相色谱仪 2.1.1柱箱 2.1.1.1操作温度：室温以上4?C -450?C 2.1.1.2升温速度：0.1?C /分钟~120?C /分钟，降温速率：从450?C降至50?C<240秒 (22℃室温下) 2.1.1.3面板操作：控制面板必须可实时控制气相各项参数，显示色谱数据 2.1.1.4 20梯度/21平台程序升温以上，可程序降温 2.1.1.5 温度稳定性: ＜0.01?C /1?C环境变化 2.1.1.6全气相系统EPC的控制精度：0.001psi, *2.1.2 微流控附件，可实现柱中和柱后反吹功能，换色谱柱不用放真空。
*2.1.3分流/不分流毛细管柱进样口 (须带流量控制) 2.1. 3.1可编程电子参数设定压力、流速、分流比 2.1. 3.2最高使用温度400?C 2.1.4搬转式设计，30秒换衬管 *2.1.5 双进样口同时连接质谱，通过软件切换，无需手动更换 *2.1.6 165位以上自动进样器 2.1.6.1进样量范围：0.1-500ul 2.1.6.2进样量线性：≥99% 2.1.6.3最快进样速度：0.1s 2.2质谱部分 2.2.1 免清洁离子源：整体非镀层惰性，无需拆卸离子源，无需清洗透镜，无需重新调谐，无需重新校正。 *2.2.2无损双灯丝设计，且具有灯丝透镜，保护灯丝，提高灯丝寿命，灯丝电流：0-300uA 2.2.3离子化能量：10-300ev *2.2.4质量分析器：整体、双曲面石英镀金四极杆（首选）；四极杆温度（包括主四级杆及预杆）可独立加热至200℃，免清洗。 2.2.5质量轴分辨率：0.4-4amu 可调； 2.2.6质量轴稳定性：± 0.10u/48小时 2.2.7质量范围：10-1050 m/z
1.气相色谱Gas chromatography 用气体作为流动相的色谱法。它利用物质在流动相中与固定相中分配系数的差异，当两者作相对运动时，试样组分在两相之间进行反复多次分配，各组分的分配系数即使只有微小差别，随着流动相（气体）的移动也可以有距离，最后被测样品组分得到分离测定。 2.汽化室Vaporizer 使试样瞬时汽化并预热载气的部件 3.进样器Sample injector 能定量和瞬时地将试样注入色谱系统的部件，通常指注射器、进样阀或自动进样器。 4.EPC 5.相Phase、固定相stationary phase和流动相mobile phase 一个体系中的某一均匀部分称为相；在色谱分离过程中，固定不动的一相称为固定相；通过或沿着固定相移动的流体称为流动相。 6.色谱柱Chromatography Column 內有固定相用以分离样品組分的柱管。 7.填充柱Packed Column 填充固定相的色谱柱。 8.毛細管柱Caplliary Column 内径一般为0.1-0.5mm的色谱柱。 9.分流比Split Ratio 样品载气化时中完全气化并与载气充分混合后，一部分进入柱內，其余的放空，这两部分载气量的比值 10.色谱峰chromatographic peak 色谱柱流出物通过检测器系统时产生的响应信号的微分曲线。 11.基线base line
在正常操作条件下，仅有载气通过检测器系统时所产生的响应信号的曲线。12.基线噪声baseline noise 由于各种因素引起的基线波动。 13.基线漂移baseline drift 基线随时间定向的缓慢变化。 14.峰面积peak area 流出曲线（色谱峰）与基线构成之面积称峰面积，用Ａ表示。 15.保留时间Retention time 溶质自进入色谱柱至峰最高处所需的时间。 16.保留体积Retention Volume 溶质进入谱柱至峰最高处所需的流动相体积。 17.死时间Dead time 在柱上不保留的组分或杂质所形成峰的保留时间。 18.死体积dead volume 在柱上不保留的组分或杂质所形成峰的保留体积。 19.峰高与半峰宽 由色谱峰的浓度极大点向时间座标引垂线与基线相交点间的高度称为峰高，一般以h表示。色谱峰高一半处的宽为半峰宽。 20.归一法normalization method 测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。 21.内标法internal standard method 将一定重量的纯物质作为内标物加到一定量的被分析样品混合物中，然后对含有内标物的样品进行色谱分析，分别测定内标物和待测组分的峰面积（或峰高）及相对校正因子，按公式和方法即可求出被测组分在样品中的百分含量。22.外标法external standard method
第39卷2011年4月 分析化学(FEN XI H U A XU E) 研究报告Chinese Journal o f Analytical Chemistr y 第4期534~539 DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00534 高效液相色谱 串联质谱法分析大肠杆菌代谢组中样品提取方法的比较 梅辉 1,2 戴军 *1 刘文卫3 凌霞3 朱鹏飞3 赵志军 1 1 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122) 2 (江南大学食品学院,无锡214122) 3 (无锡市疾病预防控制中心,无锡214002) 摘 要 比较了基于液相色谱和串联质谱联用技术(L C M S/M S)的E.co li 代谢组分析的5种不同样品提取方法。在对样品进行淬灭和洗涤后,分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法对样品平行提取3次,每个样品重复进样3次。结果显示,冷甲醇法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD <5%)。从相对提取率、重复性等方面综合考察5种提取方法,从优到劣依次为:冷甲醇法>甲醇/氯仿法>高氯酸法>热乙醇法>热甲醇法。此外,以冷甲醇法的提取溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明,本方法的代谢物检测线性较好,线性范围较宽,提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。本方法的检出限为0.05~0.36m mol/L 。 关键词 代谢组分析;液 质联用;提取方法;大肠杆菌 2010 07 20收稿;2010 10 29接受 本文系江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题基金(No.SKLF T S 200803)资助项目*E mail:d j998lc@https://www.doczj.com/doc/4c14790728.html, 1 引 言 饲料工业的发展及在医药工业上应用的不断扩大使色氨酸的需求量越来越大,目前我国色氨酸主要依赖进口。采用微生物直接发酵法生产色氨酸,其合成代谢途径较长,代谢流弱,调控机制复杂,很难实现工业化。代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程等方面,但有关色氨酸生产的代谢组学及其分析策略的研究尚未见报道。 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析[1]。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤,一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤[2]。本实验所研究的E scherichia coli (E.coli )全部代谢物仅占细胞干重的3%~5%,但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系[3]。应用现代分析技术对大部分中心代谢途径的磷酸化代谢产物以及三羧酸循环中间代谢物的提取方法已有报道[4~6],多采用气 质联用(GC MS)[7]检测目标代谢物。但气 质联用法往往需要衍生化,且高温条件下易导致热敏性化合物的变性分解。本研究对生产色氨酸的E.coli 发酵液进行淬灭、洗涤处理后,分别运用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取胞内代谢物,在LC M S/M S 的多反应检测模式(M RM )对目标代谢物进行检测,由于胞内代谢物数量巨大,而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用。因此分别选择以上3类物质中有代表性的8种代谢物(共计24种)作为考察对象,比较5种提取方法的提取率及重复性。结果表明,冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(Agilent 公司);3200Q TRA P 质谱仪(Applied Biosystems 公司),配有电喷雾离子源;3L 发酵罐(NBS);高速冷冻离心机(T erm o 公司),超低温冰箱(NBS 公司);真空冷冻干燥机(Labconco 公司);JY 2006电子分析天平(Mettler T pledo 公司);YDS 6液氮罐(乐山东亚公司)。 苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、草酰乙酸、2 酮戊二酸、邻氨基苯甲酸的标准品均购自BBI 公司,其它