摘要
从土壤中筛选出一株产β-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的β-半乳糖苷酶进行了测定。单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 是6.5，最适生长温度为37℃，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmolL时，酶活力可达112.24％，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmolL）就可使酶失活。
本实验还进行了β-半乳糖苷酶的固定化实验。以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。结果表明，4％的海藻酸钠，在温度37℃、pH6~7、氯化钙浓度1％、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。
关键词：β-半乳糖苷酶酶活性酶的固定化
Absract
A strai n isolated from soil in producing β-galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and β-galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH β-galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37℃, enzyme be maintained above 85%; Mg2+on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmolL, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmolL) can inactivate the enzyme.
The experiments were also β-galactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the of enzyme
目录
摘要 ............................................................................................................................................... I Absract ............................................................................................................................................ II 目录 ............................................................................................................................................ I II 第1章绪论 (7)
1.1 研究背景 (7)
1.2 课题研究目的和意义 ..................................................................... 错误！未定义书签。
1.3 国内外研究现状和发展趋势 ......................................................... 错误！未定义书签。
1.4 β-半乳糖苷酶的来源及其特性....................................................... 错误！未定义书签。
1.4.1 细菌产生的β-半乳糖苷酶.................................................. 错误！未定义书签。
1.4.2 酵母菌产生的β-半乳糖苷酶.............................................. 错误！未定义书签。
1.4.3 霉菌产生的β-半乳糖苷酶.................................................. 错误！未定义书签。
1.5 β-半乳糖苷酶在食品工业中的应用............................................... 错误！未定义书签。
1.5.1 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 ...................................... 错误！未定义书签。
1.5.2 生产低聚半乳糖(Galactooligosaccharide) ........................ 错误！未定义书签。
1.5.3 分析食品中乳糖含量 .......................................................... 错误！未定义书签。
1.5.4 β-半乳糖苷酶在制药工业中的应用.................................... 错误！未定义书签。
1.5.5 β-半乳糖苷酶在酶联免疫反应(EIA)中的应用 .................. 错误！未定义书签。第2章材料和方法 ...................................................................................... 错误！未定义书签。
2.1 材料 ................................................................................................. 错误！未定义书签。
2.1.1 材料与试剂 .......................................................................... 错误！未定义书签。
2.1.2 仪器与设备 .......................................................................... 错误！未定义书签。
2.1.3 培养基 .................................................................................. 错误！未定义书签。
2.2 产β-半乳糖苷酶菌的筛选 (7)
2.2.1 菌株筛选方法 (7)
2.2.2 分离纯化 (7)
2.2.3 菌种生理生化鉴定 (7)
2.2.4 β-半乳糖苷酶粗酶液制备 (8)
2.2.5 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线 (8)
2.2.6 β-半乳糖苷酶酶活力测定 (8)
2.3 β-半乳糖苷酶酶学性质 (8)
2.3.1 菌种生长曲线测定 (8)
2.3.2 培养时间对菌株产酶能力的影响 (9)
2.3.3 接种量对菌株BGJ222产酶能力的影响........................... 错误！未定义书签。
2.3.4 pH值对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响..................... 错误！未定义书签。
2.3.5 温度对β-半乳糖苷酶活力和稳定性的影响。.................. 错误！未定义书签。
2.3.6 不同金属离子及离子浓度对β-半乳糖苷酶的影响。...... 错误！未定义书签。第3章β-半乳糖苷酶酶学性质.................................................................... 错误！未定义书签。
3.1 高产β-半乳糖苷酶细菌的筛选..................................................... 错误！未定义书签。
3.2 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线..................................................... 错误！未定义书签。
3.3 菌株生长曲线测定 ......................................................................... 错误！未定义书签。
3.4 培养时间对菌株产酶能力的影响 ................................................. 错误！未定义书签。
3.5 接种量对菌株产酶能力的影响 ..................................................... 错误！未定义书签。
3.6 pH对酶活性和稳定性的影响........................................................ 错误！未定义书签。
3.7 温度对酶活性和稳定性的影响 ..................................................... 错误！未定义书签。
3.8不同金属离子及离子浓度对β-半乳糖苷酶的影响...................... 错误！未定义书签。第4章酶的固定化研究 .............................................................................. 错误！未定义书签。
4.1固定化酶简介 .................................................................................. 错误！未定义书签。
4.2 酶的固定方法 (9)
4.2.1 包埋法 (9)
4.2.2 吸附法 (10)
4.2.3 吸附法 (10)
4.2.4交联法 (10)
4.3 固定化酶反应器的类型 (11)
4.3.1连续操作搅拌式反应器(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR)
(11)
4.3.2固定床反应器(Packed Bed Reactor，PBR) (12)
4.3.3流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，FBR) (13)
4.3.4中空纤维反应器(Hollow Fiber Reactor) (14)
4.4 固定化乳糖酶国内外研究进展 (15)
4.4.1 国外研究进展 (15)
4.4.2 国内研究进展 (17)
4.5 β-半乳糖苷酶的固定 (18)
4.5.1 包埋材料选择 (18)
4.5.2 β-半乳糖苷酶固定方法 (18)
4.5.3 固定酶活力测定 (18)
4.6 固定化的最适条件 (18)
4.6.1 海藻酸钠浓度的确定 (18)
4.6.2 CaCl2浓度的确定 (19)
4.6.3 固定化时间的确定 (20)
4.6.4戊二醛交联试验 (21)
4.7 固定化酶的酶学性质 (22)
4.7.1 固定化酶的最适pH (22)
4.7.2固定化酶的最适温度 (23)
4.8 固定化酶的催化反应机理探讨 (24)
4.8.1 固定化酶对反应体系的影响 (24)
4.8.2 影响固定化酶的动力学因素 (25)
4.9 固定化酶保护剂的筛选 (26)
参考文献 (28)
致谢 (28)
第1章绪论
1.1 研究背景
β-半乳糖苷酶（β-galactosidase），全名为β-D-半乳糖苷水解酶（β-D-galactoside- galcagalcato-。
液体发酵培养基：蛋白胨2%，酵母粉0.5%，乳糖2%，NaCl0.5%，蒸馏水200ml，pH自然。
2.2 产β-半乳糖苷酶菌的筛选
2.2.1 菌株筛选方法
取土样，稀释10倍，置于80℃水浴锅中加热30min，以去除不产芽孢的菌体。摇床振荡，使土壤颗粒被打散，混合均匀，用无菌水将上述溶液稀释成10-3、10-4、10-5、10-6梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖筛选平板上，35～40℃培养20～28小时。
2.2.2 分离纯化
培养后，挑取不同形态的蓝色菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次；对分离菌株进行培养形态观察和镜检，确定纯培养。
2.2.3 菌种生理生化鉴定
在细菌形态学鉴定的基础上，对所筛菌株进行初步的生理生化鉴定。
2.2.4 β-半乳糖苷酶粗酶液制备
将纯化菌株按体积分数为1％的接种量接种于液体发酵培养基中，37℃静置培养24h。将培养好的菌液以5000rmin离心10 min，弃掉上清液．沉淀经预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤后，在冰浴中进行超声波破碎。裂解后的菌液在4℃下以12000rmin离心10min，收集上清液，即为粗酶液。
2.2.5 邻硝基苯酚（ONP）标准曲线
用柠檬酸-Na2HPO4缓冲溶液(pH6.8)配制5mmolml 邻硝基苯酚（ONP）。取7 支试管分别吸取0，0.01，0.02，0.03，0.04 ，0.05 ，0.10 ，0.15 ，0.20，0.25，0.30 ，0.35，0.40 ，0.50，0.60mL 5mmolml ONP，补上述缓冲液至0.5mL，然后40℃保温15min，加入2mL ，1molLNaCO3，以第一管为空白，于420nm 测定吸光度，以ONP 的量为横坐标，以A420 为纵坐标绘制标准曲线。
2.2.6 β-半乳糖苷酶酶活力测定
取0.1mL粗酶液与0.9mL浓度为0.01 molL邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)的0．05 molL磷酸钠缓冲液(pH值为6．5)混匀，37 ℃反应10 min后，加入1.5 mL浓度为0.4 molL的Na2CO3终止液静置5 min，于420 nm比色测定生成邻硝基苯酚(ONP)浓度。1个酶活性单位(u)定义为在37℃下每分钟分解出1μmol ONP所需的酶量。
2.3 β-半乳糖苷酶酶学性质
2.3.1 菌种生长曲线测定
在筛选平板上挑一单菌落接种于装液量30 mL培养基的250 mL三角瓶中，37℃、225rmin恒温摇床培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24、30、36、48、60h取样。每个处理重复3次。以未接种的基础培养液为空白对照。测定菌液的吸光度OD595(即生物量)。以培养时间为横坐标；OD595为纵坐标绘制生长物线。
2.3.2 培养时间对菌株产酶能力的影响
将种子菌液以2％的比例接种到装有30 mL基础培养基的250 mL三角瓶中．在37℃、225 rmin的条件下培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、24、30、36、48、60 ofenzymes)是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处，呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科领域的研究异常活跃，得到迅速发展和广泛的应用，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求。
4.2 酶的固定方法
4.2.1 包埋法
载体(如聚丙烯酰胺凝胶、矽酸盐凝胶、藻酸盐、角叉菜聚糖等)在有酶的存在下发生聚合、沉淀或凝胶化。此法最简单，但固定后的酶活力不高，固定酶的牢度不强。
4.2.2 吸附法
通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶固定到载体(如硅藻土、陶瓷、塑料等)表面，方法简便，酶活力不受影响，但是吸附的静电作用力容易受到反应液中pH的影响。
4.2.3 吸附法
通过非特异性物理吸附法或生物物质的特异吸附作用将酶固定到载体(如硅藻土、陶瓷、塑料等)表面，方法简便，酶活力不受影响，但是吸附的静电作用力容易受到反应液中pH的影响。
4.2.4交联法
交联法又称为架桥法，是借助于双功能或多功能试剂与酶分子中的氨基或羧基发生反应，使酶蛋白分子之间发生交联，结成网状结构而制成固定化酶。最常用的交联试剂是戊二醛。与共价结合法一样，由于酶的功能团(如氨基、巯基和咪唑基)参与反应可能引起酶活性中心结构的改变，使酶活力下降。
虽然固定化方法及固定化载体较多，并用于多种酶，但是迄今为止，几乎没有一种固定化技术或载体能普遍适用于每一种酶，因为各种酶的化学特性和组成差别很大，底物和产物性质不同，产物的用途也不一样。因此，对任何一种酶的固定化，其载体和方法的选择都更多的依赖实验结果。根据酶的特殊性和应用目的(如工业生产、医学应用或是生物学模型系统)，可以从许多方法中选择。表4-2
为各种酶的固定化方法比较：
表4-2 固定化方法及优劣比较
方法优点缺点
吸附法制作条件温和、简便、成本
低、可再生、可反复利用结合力弱，对pH、离子强度、温度等因素敏感，酶易脱落，酶的装载容量较小
包埋法包埋材料、包埋方法可选择
余地大，固定化酶的使用面
广，包埋条件温和仅可用于低分子量的底物，不适用于柱系统，常有扩散限制问题
共价法载体与欧联方法可选择性
大；酶的结合力强，非常稳
定偶联条件激烈，易引起酶失活，成本高，某些偶联试剂有一定毒性
交联法可用的交联试剂多，技术简
易，酶的结合力强，稳定性
高
交联条件激烈，机械性差
4.3 固定化酶反应器的类型
4.3.1连续操作搅拌式反应器(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR)
该反应器内装有搅拌器，能使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，如图4-3-1所示。具有结构简单、温度和pH值容易控制、能处理胶体底物和不溶性底物及催化剂更换方便等优点，因而常被用于饮料和食品加工工业。其缺点是由于搅拌浆产生的剪切力较大，常会引起固定化酶的破坏。在CSTR的液体出口处设置过滤器，可以把固定化颗粒保存在反应器内，或
直接选用磁性固定化酶，借助磁场吸力固定。此外还可将载有酶的圆片聚合物，固定在搅拌轴上或者将固定化酶放置在与搅拌轴一起转动的金属网筐内，这样既能保证反应液搅拌均匀，同时又不致损坏固定化酶。适合于有底物抑制的催化反应。
图4-3-1 连续操作搅拌式反应器
4.3.2固定床反应器(Packed Bed Reactor，PBR)
把固定化颗粒填充在固定床(填充床)中的反应器叫做固定床反应器，如图4-3-2所示。这是一种使用的最广泛的固定化酶反应器。它具有单位体积的催化剂负荷高、结构简单、容易放大、剪切力小、催化效率高等优点。缺点是温度和pH值难控制；底物和产物会产生轴向分布，易引起相应的酶失活程度也呈轴向分布；更换部分催化剂相当麻烦；柱内压降相当大，底物必须加压后才能进入。适合于存在有产物抑制的催化反应。
图4-3-2 定床反应器
4.3.3流化床反应器(Fluidzed Bed Reactor，FBR)
流化床反应器是一种装有较小颗粒的垂直塔式反应器，如图4-3-3所示。底物以一定的流速从下向上流过，使固定化酶颗粒在流体中维持悬浮状态并进行反应，这时的固定化颗粒和流体可以看作是均匀混合的流体。流化床反应器具有传热与传质特性好、不堵塞、压降较小等优点，也很适合排气供气的反应，但它需要较高的流速才能维持粒子的充分流态化，故放大较困难。目前，流化床反应器主要被用来处理一些粘度高的液体和含
有固体颗粒的底物，如用于水解牛奶中的蛋白质。
图4-3-3 流化床反应器
4.3.4中空纤维反应器(Hollow Fiber Reactor)
中空纤维反应器是把酶结合于半透性的中空纤维，这种中空纤维的半透膜，只允许底物和产物等小分子量的物质通过，而分子量较大的酶则不能，如图4-3-4所示。它可以提供较大的催化表面，结构类似于列管换热器。在这种反应器中，酶与中空纤维可按不同的方式安排。例如，酶可被包埋于中空纤维内，然后再把纤维束放置于反应器内。操作时，底物流经纤维外表面，并扩散进入纤维内腔，再在腔内发生酶促反应，生成的反应产物又扩散返回流动主体。另一种方式是把酶保留在纤维的外侧，而底物则流经纤维内腔。其缺点是制作成本高，膜容易堵塞。此外还有螺旋卷膜式反应器以及不同反应器结合的类型，但并不存在一种通用的、理想的反应器。在生产中，必须根据具体情况，针对系统的特点，选择使用适合的
反应器。
图4-3-4 中空纤维反应器
4.4 固定化乳糖酶国内外研究进展
4.4.1 国外研究进展
美国、日本、意大利等国对固定化β-半乳糖苷酶分解乳糖进行了广泛的研究。Bodalo等人对不同固定化β-半乳糖苷酶进行了比较，他们所选用的固定化方法有：多孔玻璃共价结合法、GCP-醛交联法、GCP-芳香胺交联法、凝胶包埋法以及物理吸附法等。具体结果如表4所示：
固定化方法Vmax
（uml）Km（mM）相对活性
（%）
酶活力
（U）
GCP-交联法237.6 0.26 80.44 253.9 GCP-芳香胺交联
法
203.77 0.39 69.06 146.7 卡拉胶包埋法46.88 0.12 15.89 156.11 物理吸附法105.30 0.12 35.69 112.924
游离酶295.07 0.28
可见GCP一醛交联法效果最好。
Saito和Yoshida(1994)用多孔陶瓷作载体固定β-半乳糖苷酶，固定化酶70℃处理3小时，活力没有下降。固定化酶的特性几乎与游离酶相同，在巴氏消毒牛奶中65℃固定化酶的半衰期为450小时，体现了工业用于生产低乳糖牛奶的前景。
Papayannokos和Markas(1993)将黑曲霉来源的β-半乳糖苷酶通过吸附和分子内交联固定在多孔陶瓷上，固定化后没有酶脱落现象。固定化酶水解乳糖的最适pH和最适温度同游离酶相同。固定化酶的半衰期是180天，而游离酶仅为24天。
Tomoska和Gemeiner(1995)选用聚乙烯亚胺和戊二醛活化的果胶酸钙(CPG)和海藻酸钙(CAG)作载体固定克鲁维酵母属Marxianus CCYeSY2。在半连续反应器中循环25次以上，水解率能够维持在80%以上。固定化细胞在4℃储存2个月，水解效率不变。
Peterson，等将来源于米曲霉的乳糖酶固定在由聚氯乙烯和硅胶组成的毛细管填充床上，在30℃，停留时间7min，80%的脱脂乳能被水解。
用纤维素包埋酵母乳糖酶已有工业规模应用，用其间歇处理预先超高温消毒的牛奶。采用Coming Glass Systerm用盐酸把经巴氏灭菌的待处理液调pH值为3.8，通过酶反应器反应约15min，最初反应温度为37℃，逐渐升高到60℃，以补偿酶活力的损失。在pH3.5、30~35℃的条件下处理浓缩乳清，乳清浓缩程度取决于终产物的抑制作用和反应器的压降，所用固定化酶的装置曾成功地运转了两年。每日循环一次，20小时进行水解，4小时用于清洗。
Millert根据乳糖酶与乳糖分子的大小不同，牛奶先经过超滤，滤过液(主要是乳糖)与乳糖酶在反应器中反应，然后再经过一次超滤，乳糖、葡
萄糖、半乳糖等小分子物质通过，而大分子的乳糖酶被截流住，重新回到反应器中继续循环使用，第二次的滤过液和第一次的滤过液混合，就制成低乳糖牛奶。该系统连续反应6周，总酶的活性下降不明显，在10℃下反应，可减少微生物的污染[15]。
4.4.2 国内研究进展
我国的学者对β-半乳糖苷酶的固定化也展开了一些研究，但尚未见到进行工业化生产低乳糖奶的报道。
李文英等人(1990)对利用不同载体，不同方法固定化的β-半乳糖苷酶活力进行了比较，实验结果显示聚丙烯酰胺凝胶包埋活力回收率高。李绪渊等人将来自鹰嘴豆B一半乳糖苷酶固定在聚丙烯酰胺上，活力回收率为72%。与游离酶相比具有更宽的pH值范围和更好的热稳定性。冻干固定化酶室温保存60天，仍具有较高活力，重复使用数次后，仍具有操作稳定性，酶活力没有损失。
孙淑芳等人(1999)将β-半乳糖苷酶固定在D202载体上，用戊二醛作交联剂，与游离酶相比具有更宽的pH范围。反应动力学参数Ea、Km变大，Vmax变小。该来源的酶具有水解牛奶中乳糖特点。潘道东(1991)，用卡拉胶包埋法制备固定化脆壁酵母β-半乳糖苷酶，活力回收率可达83%，可以在实验条件下有效水解乳清、脱脂乳和全脂乳中的乳糖，在45℃下，水解半衰期均在1 69-200小时，但是卡拉胶的机械强度差，不适合工业化应用。
4.5 β-半乳糖苷酶的固定
4.5.1 包埋材料选择
包埋材料有琼脂、琼脂糖、k-卡拉胶、明胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、纤维素等，其中海藻酸钠包埋法简单、无毒、安全、价格低廉，材料易得，是最常用的方法。本文以海藻酸钠为包埋载体，戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化尝试，探讨了固定化的最适条件及固定化酶的部分性质。
4.5.2 β-半乳糖苷酶固定方法
将一定浓度海藻酸钠与酶液按l：l比例混合，吸入7号注射器内，再逐滴滴入氯化钙溶液中，即成规则球形，球体在一定范围内不受滴落高度、速度及接触溶液浓度的影响，操作完毕后，放入4℃冰箱中硬化2h，过滤洗涤，加入戊二醇溶液交联4h，洗涤，抽滤3次，测定酶活力。
4.5.3 固定酶活力测定
与2.2.4所描述的酶的测定方法相同，只是不加游离酶，而加固定化酶。
4.6 固定化的最适条件
4.6.1 海藻酸钠浓度的确定
分别配制浓度为1%，2%，3%。4%，5%的海藻酸钠，各取5mL，放置于5个烧杯中，每个烧杯中各加入5mL酶液，混匀静置30min，用注射器吸取lmL混合液逐滴滴入20mL 2％的CaCl2溶液中，于室温下固定
30min ，用蒸馏水洗涤，抽滤三次，获得固定化酶。将固定化酶加入5mL ONPG 底物溶液中（37℃预热），反应10min 后加入2mL Na 2CO 3溶液中止反应，在离心机中以120rnin 离心2~3min ，取上清液在420nm 下测定吸光值，结果见图4-6-1。可知海藻酸钠固定化酶的酶活有不同程度损失，海藻酸钠浓度低时，酶泄漏严重，清洗酶珠时，酶损失较多，酶活力下降，海藻酸钠浓度高时，微环境效应和扩散阴力对反应影响更大。且不易操作，很难将酶液从注射器中挤出，综合各种因素，确定海藻酸钠浓度为4％，酶液与海藻酸钠的体积比为l ：l(海藻酸钠实际浓度为2％)。
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
12345
6海藻酸钠浓度（%）吸光值
图4-6-1 海藻酸钠浓度对固定化酶酶活的影响
4.6.2 CaCl 2浓度的确定
分别配置浓度为1%，2%，3%，4%，5%的CaCl 2溶液各20mL 置于烧杯中，在相同条件下用4％海藻酸钠进行酶固定化处理，固定时间为1h ，固定化酶与底物精确反应10min ，加入Na 2CO 3溶液中止反应，测吸光值，结果见4-6-2。可以看出l% CaCl 2浓度固定化酶的酶活高些，确定为最适浓度。
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
12345
6
CaCl2浓度（%）吸光值
图4-6-2 CaCl 2浓度固定化酶酶活的影响
4.6.3 固定化时间的确定
取4％的海藻酸钠与酶液各10mL ，混匀静置1h ，取6个烧杯各加入20mL l ％CaCl 2溶液，分别用注射器吸取1mL 混合液滴入烧杯中，在不同时间(0，0.5h ，1h ，1.5h ，2h ，2.5h)抽滤得固定化酶，酶与底物精确反应10min ，加入Na 2CO 3溶液中止反应，测酶活。结果见图4-6-3。当固定化时间为0时，珠体破碎溶解，无法测酶活，最终确定固定化时间为0.5h 。
0.2
0.4
0.6
00.51 1.52
2.53
固定化时间吸光值
图4-6-3 固定化时间对固定化酶酶活的影响
货号：QS2614 规格：50管/24样α-半乳糖苷酶（α-Galactosidase,α-GAL）试剂盒说明书 可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 测定原理： α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal?broblast by p66Shc down-regulation Yi Na Wang a,1,Wei Wu b,1,Hong Chao Chen a,Hong Fang a,* a Department of Dermatology,1st Af?liated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,79#Qing Chun Road,Hangzhou310003,China b State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Infectious Disease,First Af?liated Hospital,College of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou310003,China 1.Introduction It has been noticed that the appearance of facial wrinkling in the Asian population is delayed for about10years when compared to the Caucasian population.The pattern and degree of facial wrinkling is different as well.There are many factors contributing to this difference,such as lifestyle,genetic background,and nutrition.The Asian diet is well known for being rich in soy or soy- containing products and the estrogen-like compounds in soy protein,along with their antioxidant activities,are regarded as potential weapons against the aging process. Iso?avones,a group of polyphenolic compounds found in and isolated from a number of plants,with soybeans and soy products like tofu and textured vegetable protein being the primary food source,have attracted a great deal of interest,especially for possible properties in the prevention and treatment of cancer and chronic disease including cardiovascular diseases and diabetes mellitus[1,2].Recent studies further suggested that iso?avones might act as a photoprotection and inhibit the initiation and promotion of skin carcinomas[3]. One of the main iso?avones is genistein.Genistein has been reported to modulate molecular functions mainly by acting as a tyrosine kinase inhibitor[4].Also genistein has anti-oxidation and anti-angiogenesis effects as well as estrogenic activities[5].Previous evidences have suggested that genistein down-regulates UVB- induced signal transduction cascades in carcinogenesis and confers photo-protective effect in SKH-1murine skin and in human reconstituted skin[6,7].Recent studies revealed that genistein prevent UV-induced photoaging and photodamage in human skin[8].However,although studies have been reported on the Journal of Dermatological Science58(2010)19–27 A R T I C L E I N F O Article history: Received4July2009 Received in revised form9February2010 Accepted10February2010 Keywords: Genistein Photoaging UVB p66Shc FKHRL1 A B S T R A C T Background:Genistein,as an active compound of dietary antioxidants,has shown considerable promise as an effective agent against aging process.However,the effect of genistein on skin photoaging and the associated mechanism remain unclear. Objective:To delineate the effect of genistein on UVB-induced senescence in human dermal?broblasts (HDFs)with emphasis on the mechanism of oxidative pathway regulated by p66Shc involved in the events. Methods:HDFs were induced to premature senescence by repetitive subcytotoxic doses of UVB irradiation.Cellular apoptosis and DNA cell cycle were analyzed using?ow cytometry.Intracellular levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)were detected by ELISA.Mutation levels of two large deletions of mitochondrial DNA,4977bp and3895bp deletion,were determined by quantitative PCR.Western blot was applied to detect the expression and activation of p66Shc(the66- kilodalton isoform of the growth factor adapter Shc)and FKHRL1(a forkhead protein that is intimately linked with intracellular oxidation). Results:Strong activity of senescence-associated beta-galactosidase(SA-b-gal),high percent of cell apoptosis as well as cell cycle arrest in G0/G1phase,and increased intracellular oxidative stress were observed in HDFs irradiated by UVB.Genistein exerted dramatically protective effects on HDFs in a dose- dependent manner.Elevated copy numbers of large deletions in mitochondrial DNA were also inhibited by genistein.Down-regulation of total and phosphorylated p66Shc on Ser36,as well as FKHRL1and its phosphorylation on Thr32,were observed after genistein treatment. Conclusion:The results indicate that genistein protects UVB-induced senescence-like characteristics in HDFs via maintenance of antioxidant enzyme activities and modulation of mitochondrial oxidative stress through down-regulation of a p66Shc-dependent signaling pathway,which may provide potential prevention against skin aging and even photoaging. ?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. *Corresponding author.Tel.:+8657187236340;fax:+8657187236385. E-mail addresses:hongfangzy@https://www.doczj.com/doc/4b14260031.html,,tango654321@https://www.doczj.com/doc/4b14260031.html, (H.Fang). 1These authors contributed equally to this work. Contents lists available at ScienceDirect Journal of Dermatological Science j o u r n a l h o m e p a g e:w ww.e l s e v i e r.c o m/j d s 0923-1811/$36.00?2010Japanese Society for Investigative Dermatology.Published by Elsevier Ireland Ltd.All rights reserved. doi:10.1016/j.jdermsci.2010.02.002
β-半乳糖苷酶（β-gal）ELISA试剂盒使用方法本试剂盒仅供研究使用。 检测范围：96T 0.8 pg/ml -35pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定微生物样本中β-半乳糖苷酶（β-gal）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中β-半乳糖苷酶（β-gal）水平。用纯化的β-半乳糖苷酶（β-gal）体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入β-半乳糖苷酶（β-gal），再与HRP标记的β-半乳糖苷酶（β-gal）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的β-半乳糖苷酶（β-gal）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中β-半乳糖苷酶（β-gal）浓度。 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀 释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、 待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 7.温育：操作同3。 8.洗涤：操作同5。 9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 10分钟. 10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止 液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项
钠测定试剂盒（半乳糖苷酶法） 适用范围：本试剂用于体外定量测定人血清中钠离子的浓度。 1.1包装规格 液体双剂型 试剂1（R1)：60mL×4 ,试剂2(R2)：30mL×4 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：60mL×2 ,试剂2(R2)：30mL×2 ,校准品：3mL×2（2个浓度）； 试剂1（R1)：40mL×2 ,试剂2(R2)：20mL×2 ,校准品：1mL×2（2个浓度）。 1.2主要组成成分 1.2.1 试剂1（R1）（液体） β-半乳糖酶（pH9.0）≥0.8U/L 硫酸铵 5.4mmol/L 1.2.2 试剂2（R2）（液体） ο-硝基酚基β-D-吡喃糖苷半乳糖（ pH9.0) 5.5mmol/L 1.2.3 校准品（液体） 在水基质中添加氯化钠，目标浓度（2个水平）：水平1：120mmol/L；水平2：170mmol/L。（每批定值，值有批特异性，详见值单） 2.1 外观 试剂盒中各组件的外观应满足：
2.1.1试剂1（R1)应为无色或浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.2试剂2(R2)应为浅黄色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损； 2.1.3校准品应为无色透明溶液，无杂质、无絮状物，外包装完整无破损。 2.2 试剂空白吸光度 在波长405nm～420nm处（光径1cm），试剂空白吸光度（A）应≤1.000；试剂空白吸光度变化率（△A/min）≤0.150。 2.3准确度 测定锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品（编号：360018），相对偏差应不超过±15%。 2.4分析灵敏度 对应于浓度为100mmol/L的Na所引起的吸光度变化率差值△A/min的绝对值应在0.200 ～0.600的范围内。 2.5重复性 重复测定高、中、低浓度样本，变异系数（CV）应≤3%。 2.6批间差 测定同一样本，批间差（R）应≤4%。 2.7线性范围 在[80,180]mmol/L检测范围内，线性相关系数（r）应≥0.9900，线性相对偏差应不超过±5%。 2.8试剂稳定性
β-半乳糖苷酶测定试剂盒使用说明 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，10μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）； 15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织， 加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用试剂二将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。
β-半乳糖苷酶染色（组织） 检测原理： 一般认为绝大多数正常细胞仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老(senescence)状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老的细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变大，并表达在pH6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化(aging)的一种潜在原因。由此以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。 操作步骤： （1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。 （2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。 （3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 注：对于冷冻切片直接按照以下步骤进行。 （4）加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于 15min。 （5）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（6）加入适当量的染色工作液。 （7）37℃孵育过夜，最好把整个切片浸泡在染色工作液中。 注：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。 （8）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。 （9）脱水：梯度酒精（由低到高）各5min → 二甲苯I 10min→ 二甲苯 II 10min。 （10）加上封片液封片后4℃可以保存较长时间。 （11）普通光学显微镜下观察。光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞。 注：所用试剂按照β-半乳糖苷酶染色试剂盒说明配制。β-半乳糖苷酶染色试剂盒市面上有很多种，但检测方法几近相同，具体还是要参照相应的试剂说明书来操作。祝实验顺利！
β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase,β-GAL）试剂盒使用说 分光光度法正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50管/24样 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取：
1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组 织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 试剂三10001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 标准条件下测定的回归方程为y=0.32x-0.0027；x为标准品浓度（nmol/mL），y为吸光值。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.32×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr
β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用 摘要：β-半乳糖苷酶是一种可以把乳糖水解成半乳糖和葡萄糖的酶。低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，在食品及保健品中应用广泛。因此，研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有极强的现实意义。 关键词：β-半乳糖苷酶；低聚乳糖；生产方法；工艺过程控制；固定化反应器；酶分离提取方法 Abstract：β- galactose glucoside enzyme is a kind of enzyme that can put the lactose hydrolysis into galactose and glucose. Low poly galactose is a natural functional oligosaccharide which has been widely applied in food and health products. Hence, doing Research of β-galactose glucoside enzyme’ application in the low poly galactose production has strong practical significance. Key words：β- galactosidase； galacto-Oligosaccharides；method of production; process control; immobilized enzyme reactor; methods of Extraction and Isolation β-半乳糖苷酶,简称乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中。β-半乳糖苷酶的最初应用也是利用其水解乳糖的性质来降低乳制品中的乳糖含量。利用各种技术手段研究β-半乳糖苷酶在低聚半乳糖生产中的应用具有一定现实意义[1]。 1.菌株选育 1.1低聚半乳糖生产法 低聚半乳糖(GOS)是一种具有天然属性的功能性低聚糖，其分子结构一般是在半乳糖或葡萄糖分子上连接1-7 个半乳糖基，即Gal-(Gal)n-Glc/Gal(n 为0-6)。在自然界中，动物的乳汁中存在微量的GOS，而人母乳中含量较多，婴儿体内的双歧杆菌菌群的建立很大程度上依赖母乳中的GOS 成分。 1.2发酵法中发酵工艺过程控制 培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 培养基的选择： （1）根据微生物的特点选择培养基 （2）根据发酵方式选择培养基 发酵工业中大多采用液体培养基培养种子和进行发酵，并根据微生物对氧的需求，分别作静止或通风培养。而固体培养基则常用于微生物菌种的保藏、分离、菌落特征鉴定、活细胞数测定等方面。 1.3从生产实践和科学试验的不同要求选择 种子培养基要求营养丰富、完全，氮源、维生素的比例应较高，所用原料也应是易于被微生物菌体吸收利用。常用葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏、麦芽汁、米曲汁等作为原料配制培养基。 发酵培养基除需要维持微生物菌体的正常生长外，主要是要求合成预定的发酵产物，所以，发酵培养基碳源物质的含量往往要高于种子培养基。当然，如果产物是含氮物质，应相应的增加氮源的供应量。 1.4从经济效益方面考虑选择生产原料 以价廉、来源丰富、运输方便、就地取材以及没有毒性等为原则选择原料。 培养基的配制原则： （1）根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基
货号：MS2615 规格：100管/48样β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase, β-GAL）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 测定原理： β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入2.5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体13mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、培养液等液体样本：直接检测 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
β-半乳糖苷酶染色试剂盒(组织专用) 简介： β-半乳糖苷酶染色试剂盒(β-Galactosidase Staining Kit)是一种基于衰老时SA-β-Gal (senescence-associated β-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。 Leagene β-半乳糖苷酶染色试剂盒(组织专用)以X-Gal 为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。本试剂盒仅染色衰老细胞，对衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞等不会染色。对于组织切片或组织块应采用冰冻切片，可以检测的样品数量视样品的大小而定，对于普通的切片按每片1ml 可以检测100个样品。 组成： 自备材料： 1、PBS 或HBSS 2、冷冻切片 3、显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、对于冷冻切片直接按照以下步骤进行：加入适当体积的β-Gal Fixative ，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于。 2、用PBS 浸泡洗涤组织3次，每次不少于。 编号 名称 DE0022 100T Storage 试剂(A): β-Gal Fixative 100ml 4℃ 试剂(B): X-Gal Solution 5ml -20℃ 避光 试剂(C): β-Gal Staining A Solution 1.5ml 4℃ 避光 试剂(D): β-Gal Staining B Solution 1.5ml 4℃ 避光 试剂(E): β-Gal Staining C Solution 100ml 4℃ 使用说明书 1份
β-半乳糖苷酶染色试剂盒使用说明 产品简介： β-半乳糖苷酶染色试剂盒(β-Galactosidase Staining Kit)是一种基于衰老时SA-β-Gal(senescence-associatedβ-galactosidase)活性水平上调而对衰老细胞或组织进行染色检测的试剂盒。在普通的光学显微镜下就可以观测到细胞或组织的衰老情况。 绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变。衰老细胞不能在一些常规的刺激下再诱导细胞分裂，并且衰老细胞的细胞周期分布也比较特殊，不同于一些损伤诱导的细胞休眠，也不同于细胞生长接触抑制的情况。衰老细胞通常体积变会大，表达pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶。细胞衰老也被认为是生物体抑制肿瘤的一种方式，同时也是生物体老化(aging)的一种潜在原因。本试剂盒可以用于培养细胞的衰老检测，也可以用于组织切片的衰老检测。 β-半乳糖苷酶染色试剂盒以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物，光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。本试剂盒仅染色衰老细胞，对衰老前的细胞(presenescent cells)、静止期细胞(quiescent cells)、永生细胞(immortal cells)或肿瘤细胞等不会染色。对于组织切片或组织块，可以检测的样品数量视样品的大小而定，对于普通的切片也至少足够检测100个样品，使用6孔板测定，足够测定100个样品。 产品组成：
试剂(C):β-半乳糖苷酶染色液A1ml4℃避光 试剂(D):β-半乳糖苷酶染色液B1ml4℃避光 试剂(E):β-半乳糖苷酶染色液C100ml4℃避光使用说明书1份 自备材料： 1、PBS或HBSS 2、细胞培养器皿 3、显微镜 操作步骤(仅供参考)： (一)贴壁细胞染色： 1、对于6孔板中培养的细胞，吸除细胞培养液，用PBS或HBSS洗涤1次，加入1ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15min。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。 2、吸除细胞固定液，用PBS或HBSS洗涤细胞3次，每次3min。 3、吸除PBS或HBSS，每孔加入1ml染色工作液。使用聚丙烯(polypropylene)容器，不能使用聚苯乙烯(polystyrene)容器配制染色工作液。染色工作液的配制方法参考表1。 β-半乳糖苷酶染色液A10μl β-半乳糖苷酶染色液A10μl β-半乳糖苷酶染色液C930μl
β-半乳糖苷酶（β-GAL）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2580 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1ml×1支，4℃保存，5μmol/ml对硝基苯酚溶液。 产品说明： β-GAL(EC3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解，此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量，还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解，释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 自备用品： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提 第1页，共3页
取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取 液），进行冰浴匀浆。15000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml. 二、测定步骤： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至400nm，蒸馏水调零。 2、样本测定（在EP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000 充分混匀，400nm处测定吸光值A，计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 三、β-GAL活性计算： 根据标准管的吸光度（x，减去浓度为0的标准管OD值）和浓度（y，nmol/ml）建立标准曲线，将△A带入标准曲线中，计算样品生成的产物量（nmol/ml）。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 β-GAL活力(nmol/h/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T =20×y÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。 第2页，共3页
β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays） 1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性） 2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer； 3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟； 4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟； 5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间； 6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度； 7、计算β-半乳糖苷酶酶活力： Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数； OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度； t ----显色反应时间(单位min)； V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。 Z buffer (总体积100 ml)： Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 g NaH2PO4·H2O 40mM 0.624g KCl 10mM 0.07455g MgSO4·7H2O1mM 0.0246g β-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl 加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。 Substrate solution(总体积10ml)----现用现配 Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g ONPG 4mg/ml 0.04g 终止液（100ml）： Na2CO3 1M 10.6g
α-半乳糖苷酶（α-GAL）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。 货号：BC2570 规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入5mL双蒸水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂三：液体80mL×1瓶，4℃保存。 标准液：液体1mL×1支，4℃保存，5μmol/mL对硝基苯酚溶液。 产品说明： α-GAL(EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，能专一地催化α半乳糖苷键的水解，主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要，种子萌发初期，其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗，为种子的萌发提供最初的能量来源，后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1、细菌或培养细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL 第1页，共3页
提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次），15000g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。 2、组织的处理：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；15000g，4℃，离心20min，取上清，置冰上待测。 3、标准液的处理：用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL. 二、测定步骤和加样表（在1.5mLEP管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL）测定管对照管标准管 试剂一200 蒸馏水200 试剂二250250 样本5050 迅速混匀，放入37℃准确水浴30min 标准液500 试剂三100010001000充分混匀，室温静置2min后，400nm处测定吸光值A。△A=A测定管-A对照管 α-GAL活性计算： 根据标准管的吸光度（x：各标准管吸光值减去浓度为零的标准管的吸光值）和浓度（y，nmol/mL）建立标准曲线，将△A带入标准曲线中，计算样品生成的产物量（nmol/mL）。 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 α-GAL活力(nmol/h/mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20×y÷Cpr 需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。 α-GAL活力(nmol/h/g鲜重)＝(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20×y÷W （3）按细菌或细胞数量计算： 第2页，共3页