S YB R green 实时荧光定量PCR 检测微小RNA21的方法建立
及在食管鳞癌中的应用
马文静1,李鲁2,吕国栋1,刘涛1,郑树涛1,霍奇1,林仁勇1,卢晓梅
1*
(1.新疆医科大学第一附属医院医学研究中心,新疆乌鲁木齐830054;
2.新疆医科大学第一附属医院检验科,新疆乌鲁木齐830054)
摘要:目的:建立SYBR green 实时荧光定量PCR 检测微小RNA m i R -21的技术平台及应用。方法:设计微小RNA21和U6的的颈环结构反转录引物和PCR 扩增引物,以U6为内参利用SYBR green 实时荧光定量PCR 法检测小鼠各器官中的微小RNA21的含量。提取16例食管鳞癌患者的肿瘤组织及其近旁组织中的总RNA ,检测其微小RNA21表达水平。结果:S YBR green 实时荧光定量PCR 检测U6和微小RNA21含量的熔解曲线单一,PCR 产物特异。在Ba l b /c 小鼠的4种器官中,肝脏、脾脏、肾脏分别为脑组织的8.71、5.38、3.47倍。16对食管鳞癌患者的样本中,14例微小RNA21的拷贝数高于其近旁组织约10.58倍(p <0.01)。结论:此研究成功建立了S YBR green 荧光定量PCR 法检测小鼠和人微小RNA-21含量的技术平台,为进一步阐述m i R -21在食管鳞癌的发生中的作用提供了新方向。
关键词:S YB R green 实时荧光定量PCR;m i R -21;微小RNA ;食管鳞癌
中图分类号:Q789 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2010)01-0045-04
A M ethod for D etection m i R -21by usi ng S YBR G reen R ea l -ti m e
F l uorescen t Q uan tita ti ve PCR
MA W en-jing 1,LI Lu 2,L V Guo-dong 1,L I U Tao 1,Z H E NG Shu-tao 1,HUO Q i 1
,
L I N Reng-yong 1,L U X iao-mei
1*
(1.M edical Research Cen ter ,The F i rstA ffili ated H os p ital of Xi n ji ang M edicalUn ivers i ty ,U rumq i 830054,Ch i na ;2.Depart m ent ofCli n i ca lDetecti on ,The Firs tA ffili ated H os p ital ofX i n jiangM ed icalUn i vers i ty ,U ru m q i 830054,Ch i n a)
Abstr ac t :Ob jec ti ve :To estab li sh a me t hod of S YBR green real-ti m e quantitati ve PCR for de tecti ng levels ofm i R -21and apply i n de 2
tecti on .M ethod :Accord i ng to t he sequence ofm i R -21and U6,the ste m -l oop reverse transcri p tio na l pri m er ,the pri m ers of real-ti m e PCR we re desig ned and synt hesized .The expressio n l eve l s ofm i R -21i n d ifferen t organs ofm o use wasm easured by SYBR green re 2a l-ti m e quan tita ti ve PCR to de tect the accuracy of th i s m etho d w it h U6as co ntro.l In add iti on ,si xteen spec i m ens of cance r and corre 2spond i ng nor m a l tissues were collected fro m si xteen esophagea l squa m ous cancer patients .The t ota lRNA were extracted and reverse tran 2scripti ed .The expressi on leve ls of m i R -21were co n fir m ed .R esu lt :The m e lti ng curve of m i R -21analysis in four organs of Ba l b /c m o use sho wed a single peak ,the product of PCR i s specific .The quantitati ve PCR results sho wed that ,m i R -21i n brai n leve l s is less than liver ,sp l een and k i dney .And co m pa red w i th the control samp l es ,m i R -21levels i n t he esophagea l cance r sa mp leswas s i gnificantl y h i gher abo ut 10.58fol d(p <0.01).C onclusion :The m ethod of de tecti ng m i R -21levels by SYBR green rea l-ti m e quantita ti ve PCR was establi shed successfull y both in m o use and human samp l es .M oreo ver ,the present resu lt provi ded a new vie w bet ween m i R -21and eso phagea l cancer ca rc i nogenesis .K ey word s :S YBR green real-ti m e PCR;m i R -21;m icro RNA ;Esophageal squamous cance r 收稿日期:2009-09-25;修回日期:2009-11-17基金项目:国家自然科学基金资助项目(30760223、30860097);新疆高技术研究发展计划基金项目(XJ K J T200511113);新疆医科大学第一附属医院科研奖励基金项目(2008-YF Y -01)资助
作者简介:马文静(1985-),女,在读硕士,研究方向:食管癌分子流行病学及其致病机制;*通讯作者:卢晓梅(1970-),女,博士,教授,硕导,Em ai:l l ux i aom ei 88@163.co m 。
微小RNA(m i R NA)是1993年R osa lind C .Lee ,[1]在线虫发育的研究中首次发现的一类非编码小分子RNA ,长约21~24个核苷酸(n t)。它通过干扰mRNA 的翻译而下调靶基因的表达,能够对基因表达进行微调,参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡等[2]。近期一些研究表明很多m i R NA 在肿瘤的发生、分化和发展中起重要作用,如微RNA21(m i R -21)。m i R -21在肺癌、乳腺癌、胃癌、
前列腺癌、结肠癌、胰腺癌[3]和胶质母细胞瘤[4]
中高表达,能够下调视网膜母细胞瘤?(RB1)、转移生长因子B 受体ò(T GFBR2)、程序性死亡基因4(PDCD4)等抑癌基因的表达[5]
,从而促进癌细胞增殖。在胃癌细胞中下调m i R -21的
表达,能够促进癌细胞凋亡并降低其迁移能力[6]
。m i R -21有可能成为一种与癌症预后相关的临床诊断标志物。建立一种廉价、快捷、准确检测m i R -21的方法对于癌症研究和诊断均具有实际意义。
目前常用的检测m i R NA 方法有Taq m an 探针法、Northern b l ot 和原位杂交等方法。Northern blot 和原位杂交两种方法分别能够半定量地表示m i RNA 的丰度和定位显示m i R NA ,但检测时间较长。Taq m an 探针发是目前最常用的检测m i RNA 的工具,具有特异性高,花费时间短等优点,但成本较高。本研
究旨在以较廉价的SYBR G reen 染料代替Taq m an 探针,建立
利用S YBR green 实时荧光定量PCR 方法检测m i R -21的表达丰度的技术平台,该方法未见同类报道。通过分别对3只小鼠的肝、脾、肾、脑等器官中m i R -21定量,以及检测16对食管鳞癌患者癌组织及其近旁组织中的微小RNA21表达情况,来验证该方法的可重复性和准确性。
1 材料与方法
1.1 材料1.1.1 小鼠来源:Ba l b /c 小鼠购自新疆医科大学动物研究中心,雄性小鼠,年龄约为10w 。1.1.2 食管癌组织来源:经新疆医科大学第一附属医院胸外科行手术治疗的食管鳞癌患者16例,术前未行放、化疗及内分泌治疗,每例标本留取食管鳞癌组织及其近旁正常食管组织,离体后10m i n 内置于液氮保存。1.1.3 试剂和主要仪器:T rizol (美国Invitrogen 公司),反转录试剂盒(P ri m eScr i pt T M o ne step RT -PCR k it 反转录试剂盒,大连宝生物公司),S YB R P rem ix(天根生化科技有限公司),荧光定量PCR 仪(I Q5,美国B I O -rad 公司)。1.1.4 引物设计和合成:依据m i R B ASE (http ://m i crorna .sanger .ac .uk /sequences /)数据库中人和小鼠的U6和m i R -21的序列,设计其特异性反转录引物和PCR 扩增引物:m i R -21反转录引物为5c -GTCGTATCCAGTGCAGG -GTCCG AGG 2TAT TC GCACTG GATACGACTCAACA -3c ,PCR 扩增引物上游为5c -GTGCAGG GTCCG AGGT -3c ,下游为5c -GC 2CGCTAGCTTATCA GACT-GATGT-3c ;内参U6反转录引物序列为5c -AACGCTTCACGAATT TGCGT -3c ,PCR 扩增引物上游为5c -CTCGCTTCG GC AGC ACA -3c ,下游为5c -
AACGCT TC ACG AATTTGCGT-3c;以上引物均由上海生工公司合成。
1.2方法
1.2.1RNA提取
T rizol法分别提取正常Balb/c小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织和食管鳞癌组织及其近旁组织的总RNA,紫外分光光度仪ND1000检测RNA质量和浓度,1.2%的甲醛变性凝胶电泳。
1.2.2m i R-21S YB R green实时荧光定量PCR检测
Ba l b/c小鼠肝脏的RNA为模板,分别以m i R-21和U6反转录引物行逆转录反应,反转录条件为42e60m i n,85e 5s,获得小鼠肝脏组织的m i R-21和U6cD NA。分别以m i R-21和U6cD NA为模板,以m i R-21和U6的特异性引物,实时荧光定量PCR,反应参数为95e10m i n预变性,95e15s;60e 30s,荧光检测1次,共40个循环。从70e至97e,每0.5e/s 为间隔绘制熔解曲线,记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即C t值,反应结束后根据熔解曲线分析产物特异性。每组设2个复孔。PCR产物3%琼脂糖凝胶电泳检测。并克隆至p MD18-T载体,寄往上海生工公司测序。
1.2.3Ba l b/c小鼠四种器官中m i R-21含量的检测
采用m i R-21S YBR green实时荧光定量PCR法(同上)检测3只正常Ba l b/c小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑组织中的m i R -21含量。以2-v v Ct法来计算小鼠四种器官中m i R-21的相对含量,U6作为内参照,所有组织均与m i R-21含量最低的
脑组织比较,其中v v C t=(Ct
m i R-21-Ct
U6
)
各器官
-(C t
m iR-21
-
Ct
U6)
脑组织
。
1.2.4食管鳞癌组织中m i R-21含量的检测
采用m i R-21S YBR green实时荧光定量PCR法(同上)检测16对食管鳞癌患者的癌组织及其近旁组织中的m i R-21含量。以2-v v Ct法来计算癌组织及其近旁组织中的m i R-21的相对含量,U6作为内参照,各组织均与m i R-21含量最低的3号患者近旁组织比较,其中v v C t=(Ct
m i R-21
-
Ct
U6)
各食管鳞癌组织及其近旁组织
-(Ct
m i R-21
-Ct
U6
)
3号患者食管鳞癌近旁组织
。
2结果与分析
2.1小鼠肝脏组织m i R-21SYBR green实时荧光定量PCR 检测:U6和m i R-21阴性对照的扩增曲线CT值均在30以上,肝脏组织U6的CT值为11.15?0.256,m i R-21的CT值为16.62?0.046。熔解曲线图表明,U6和m i R-21的熔解曲线单一峰值略有差异(图1),m i R-21和U6均未见杂峰信号出现,m i R-21溶解温度为82.5e;U6溶解温度为81.5e。3%琼脂糖凝胶电泳显示,m i R-21和U6片段大小分别为66bp和88bp,PCR产物为单一条带(图2),测序结果与目的序列一致,表明m i R-21和U6的反转录引物和扩增引物能够分别扩增出m i R-21和U6片段。说明二者的PCR参数选择适当,产物特异度较好,非特异产物对结果影响较小。
2.2Ba l b/c小鼠四种器官中m i R-21含量的检测:分别对3只Balb/c小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑组织进行m i R-21和U6的检测,U6的C t值基本相近而m i R-21的Ct值按肝、脾、肾、脑的顺序依次升高(图3)。表明U6在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏、脑组织含量基本一致,而m i R-21的含量按肝、脾、肾、脑的顺序依次降低(图4)。
2.3食管鳞癌组织中m i R-21含量的检测:R eal-ti m e PCR 产物单峰的溶解曲线(图5A)均说明茎环RT-PCR能特异扩增人的m i R-21片段。图5的扩增曲线可见食管鳞癌组织中m i R-21的Ct值明显低于对应的癌旁组织,说明其表达高于正常食管组织。各食管鳞癌组织m i R-21相对表达量(2-Ct)与其近旁组织比较,其m i R-21表达值,如表1和图6所示。食管鳞癌中的m i R-21的表达量明显高于癌旁组织(P<0101;平均倍数是10.58倍)。
图1小鼠肝脏的m i R-21、U6realti m e PCR扩增曲线(1A)及扩增产物的熔解曲线1B)
a:u6;b:m i R-21;c:u6阴控;d:m i R-21阴控。
F i g.1The a m p lificati on cu rve and m elti ng cu rve ofm i R-21and U6i n m ou se li ver
a:u6;b:m i R-21;c:u6negati ve contro;l d:m i R-21negati ve contro.l
图2小鼠肝脏的m i R-21和U6PCR产物的凝胶电泳图
1:Puc19DNA标志物;2:U6;3:U6阴控;4:m i R-21;5:m i R-21阴控。
F i g.2Gel electrophoresis of the m i R-21and U6(m ou se li ver)a m p lifi2 cation produ cts
1:Puc19DNA M arker;2:U6;3:U6n egati ve con tro;l4:m i R-21;5:m i R-21negati ve contro.l
3讨论
自被发现以来,m i R N A即成为生命科学的研究热点。原因在于该小分子在生命活动中具有广泛的调节功能,对基因表达、生长发育和行为等都有十分深远和复杂的效应。在肿瘤的发生、发展过程中,m i R NA是对中心法则中RNA作为中介角色的重要补充,m icro RNA与某些癌基因、抑癌基因、凋亡相关基因相互作用参与肿瘤的生成、发展甚至侵袭转移。如let-7和m i R-24参与细胞凋亡[7],m i R-21可能通过对肿瘤
图3 m i R-21及U6realti m e PCR 的扩增曲线A ~C 分别为1#、2#和3#Ba l b /c 小鼠;a :u6;b :m i R-21。
Fi g .3 The a m p lification curve ofm i R -21and U6
Fi gureA,B ,C rep res en t t h e a mp lifi cati on cu rve of m i R-21and U 6i n 1#,2#and 3#Bal b /c m ouse respecti vely a :u6;b:m i R -
21
图4 Bal b /c 小鼠各器官的m i R -21的S YB R green 荧光定量PC R 结果
Fi g .4 The releti ve quan tity ofm i R -21i n d ifferen t organ of Bal b /cm ouse
细胞周期调控相关蛋白Septi n-7、P21及肿瘤增殖、侵袭相关蛋白PCN A 、MMP 9的表达调控以及诱导细胞凋亡抑制肿瘤生长[8]
。这类非编码小分子将成为更好认识和攻克人类癌症的一个重要突破口。m i RNA 分子的序列短小,在基因组中存在较多的互补序列,在不同生物体内与靶标结合的方式也不尽相同,而且通常还与多种蛋白相互作用,这使得建立一个有效
而且普遍适用的研究方法异常困难。目前已经发展了多种有效的m i R N A 检测方法:(1)克隆测序:是用于发现新的m i R N A 的首选方法。(2)芯片技术:可以实现快速、高通量的检测。但是基因芯片检测方法的信息质量的稳定性和可重复性比较差,对获得的结果通常需要采用Nort hern blot 和实时荧光定量PCR 方法进行验证。(3)Northern blot :是验证和确认m i R 2N A 的重要方法,但该方法繁琐且灵敏度较低且时间较长,不适用于高通量检测。(4)实时荧光定量PCR (quantitative rea l -ti m e PCR )可以很精确地定量分析m i R N A 的表达,常用的有茎-环的RT-PCR 方法(ste m -loo p RT-PCR )[9]和pol y A 加尾的RT-PCR 方法[10]。实时荧光定量PCR 方法具有检测范围宽、灵敏性高、精确度高、产出率高、可以进行多重检测的优点。从原理上讲有两大类荧光模式:第一种为荧光杂交探针,如Taq m an 等。第二种为DNA 结合染料,如SYBR Green 等。S YB R green 实时荧光定量PCR 法,引物设计较简单且只需合成序列特异引物,成本相对较低。
应用本实验设计的引物能够特异性扩增出m i R -21和U6基因,定量检测结果和电泳结果均显示引物二聚体极少,不会干扰PCR 的结果。本研究应用SYBR green 染料实时荧光定量检测了m i R -21在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑组织和食管鳞癌组织的表达量,其小鼠检测结果与Chen Ca if u [9]等使用Taq m an 探针检测韦氏小鼠的结果基本一致,表明该方法准确。而该方法对3只小鼠分别检测,均得到一致结果,表明该方法具有可重复性,小鼠肝脏、脾脏、肾脏、脑组织中m i R -21的定量结果在3只小鼠中含量略有差异,这可能与每次PCR 的扩增效率和模板质量有差异造成的,
但不影响相对定量的结果。
图5 食管鳞癌及癌旁m i R -21及U6realti m e PC R 扩增曲线(5A)及扩增产物的熔解曲线(5B)a :u6;b :m i R -21。F i g .5 The a m pli fi cati on curve and m elti ng curve ofm i R -21and U6i n e 2sophageal s qua m ous cell carci noma ti ss u e and ad j acen t tiss ue a :u6;b :m i R -21.
表1食管鳞癌及对应癌旁m i R-21表达m i R-21的表达水平比值
T able1The rel eti ve quanti ty ofm i R-21i n each esophageal squa m ou s cell carci no m a tis sue and ad jacent ti ss u e
样本
s p eci m en
U6的Ct值
Ct val ue ofU6
m i R-21的Ct值
Ct val ue ofm i R-21
样本
s p eci m en
U6的Ct值
Ct val ue ofU6
m i R-21的Ct值
val ue ofm i R-21
各食管鳞癌样本m i R-21表达量与癌旁
的比值The rel etive quan tit y ofm i R-21
1#食管鳞癌9.5914.701#癌旁11.1315.090.45 2#食管鳞癌10.7113.422#癌旁10.3716.359.65 3#食管鳞癌10.1314.043#癌旁10.5315.942.83 4#食管鳞癌10.2514.674#癌旁10.8516.983.27 5#食管鳞癌10.4613.385#癌旁12.4020.2430.27 6#食管鳞癌10.7914.666#癌旁10.7118.1011.47 7#食管鳞癌10.8612.707#癌旁11.5217.9824.59 8#食管鳞癌10.7313.498#癌旁11.0217.7115.24 9#食管鳞癌11.0713.729#癌旁12.0114.741.06 10#食管鳞癌11.0811.7410#癌旁11.3717.4241.93 11#食管鳞癌10.6913.0111#癌旁10.8713.871.60 12#食管鳞癌11.0313.1612#癌旁10.8316.5411.96 13#食管鳞癌11.3713.9113#癌旁10.4516.4110.70 14#食管鳞癌11.9914.6814#癌旁12.0215.261.46 15#食管鳞癌9.8515.2115#癌旁11.316.040.65 16#食管鳞癌9.8313.916#癌旁11.6816.82.07
图6各食管鳞癌样本的m i R-21的S YB R green荧光定量PC R结果Fi gure6Th e rel eti ve qu antit y ofm i R-21i n each esophageal squamous cell carci no m a ti ssue and ad jacen t tiss u e
Ste fano Voli n i a等[11]利用微阵列芯片对6种实体肿瘤(包括肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌)进行表达谱分析,发现肿瘤组织正常组织相比m i R-21在6种肿瘤中表达升高。Andrew F eber[12]等研究了包括Barrett食管、食管腺癌和异型食管组织的样本,使用m i R NA探针芯片分析,发现在食管肿瘤中m i R-21是正常组织的3~5倍。Yuk i haru H i yosh i[13]应用Taq m an方法分析了20例食管鳞癌及其邻近上皮的样本,发现有18例食管鳞癌中的m i R NA-21比临近食管上皮高表达升高。本研究采用特异性、灵敏度高的茎环RT-PCR应用S YBR green荧光定量PCR的技术平台。检测了16对食管鳞癌组织中m i R-21的表达,食管鳞癌组织中m i R-21的表达水平明显高于对应的癌旁组织。
本实验建立了一种较为廉价的、简便快捷,结果准确可靠、可重复性的检测m i R-21含量的实时荧光PCR方法,可应用于癌症科学研究和临床检测;并且为进一步阐述m i R-21在食管鳞癌的发生中的作用提供了新的方向。
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一株分离自酸梅酱的酵母菌的分离鉴定
邝海菊,肖婷,何香,兰晓君,艾尔肯#热合曼,索菲娅*
(新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐830046)
摘要:目的:分离及鉴定来自于新疆塔城民间自制酸梅酱中的酵母菌。方法:用NL1/NL4引物对扩增酵母菌株的26S rD NA D1/D2区,测序结果进行序列分析,用Ne i ghbour-joi n i ng(N-J)方法构建系统发育进化树,同时结合酵母的传统形态学鉴定对菌株进行鉴定。结果:26S r DNA D1/D2区序列分析表明菌株K KS与M etschniko w i a aff.fructicola D3895相近,相似率为99.2%。在N-J法构建的系统发育进化树中,菌株KKS与M etschn i ko wia aff.fructicola聚类在同一分枝上。结论:从新疆塔城民间自制酸梅酱中分离得到一株酵母菌并将该菌株鉴定为M ets chni ko wia aff.fructicola。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量PCR全方位解析 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下： 1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧
荧光定量PCR实验指南（一） 一、基本步骤： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 2、引物、探针的设计； 3、引物探针的合成； 4、反应体系的配制； 5、反应条件的设定； 6、反应体系和条件的优化； 7、荧光曲线和数据分析； 8、标准品的制备； 二、技术关键： 1、目的基因（DNA和mRNA）的查找和比对； 从https://www.doczj.com/doc/4114098213.html,/网点的genbank中下载所需要的序列。下载的方式有两种：一为打开某个序列后，直接点击“save”，保存格式为“.txt”文件。保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后，再打开DNAstar软件中的Editseq 软件，点击“file”菜单中的“import”，打开后点击“save”，保存为“.seq”文件。另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件，点击“file”菜单中的“open entrez sequence”，导入后保存为“.seq”文件，保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。然后要对所有的序列进行排序。用DNAstar软件中的Seqman软件，点击“sequence”菜单中的“add”，选择要比较的“.seq”的所有文件，点击“add”或“add all”，然后点击“Done”导入要比较的序列，再点击“assemble”进行比较。横线的上列为一致性序列，所有红色的碱基是不同的序列，一致的序列用黑色碱基表示。有时要设定
比较序列的开始与结尾。有时因为参数设置的原因，可能分为几组(contig)，若想全部放在一组中进行比较，就调整“project”菜单下的“parameter”，在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80，可调低即可。再选择几个组，点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。选择高低的原则是在保证所分析的序列在一个“contig”内的前提下，尽量提高“minimum math percentage”的值。有时因此个别序列原因，会出现重复序列，碱基的缺失或插入，要对“contig”的序列的排列进行修改，确保排列是每个序列的真实且排列同源性最好的排列。然后，点击“save”保存即可。分析时，主要是观察是否全部为一致性的黑色或红色，对于弥散性的红色是不可用的。 2、引物和探针设计 2.1引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： 序列选取应在基因的保守区段； 扩增片段长度根据技术的不同有所分别： sybr green I技术对片段长度没有特殊要求； Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp； 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对； 避免引物自身形成环状发卡结构； 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
相对定量方法实际操作 （三种常用方法） 本人用的是相对荧光定量PCR法，在分子水平上比较课题中5种新基因的表达差异。实验进行很多次，感受颇深，同时遇到了一些问题：扩增效率、标准品选择（及赋值）、标准曲线、重复性等问题，希望有同行朋友一起探讨和指教。 1. Comparative Delta-delta Ct法定量流程（RG6000软件设置） 1).先对样品中的目的基因与看家基因分别做标准曲线，通过标准曲线确定两个 基因的扩增效率是否一致或接近；将扩增效率优化为一致。 2).同一样品分别进行看家基因和目的基因的扩增，分列在两页中 公式： P1 P2 相同的样品在两页里命名成相 同的名称，并定义为unknown 分别分析P1和P2页 选delta-delta Ct选项 依次填入，并定义对照样品 完成分析 F=2— 待检样品看对照组目的 基因平均Ct 对照组看家 — 待检样品目 ——
Comparative Delta-delta Ct法的特点、注意事项及实际应用 1). Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一种相对定量方法，其最大特点 是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2). 其缺点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真 实扩增情况的反映，这里势必存在一定的误差。 3). Comparative Delta-delta Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基 因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene 的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量 分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。 应用实例：
荧光定量PCR完全攻略 1、什么是定量PCR？ 以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 2、定量PCR定量的理论依据是什么？ 特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，最终扩增片段的含量通常是一样的。理想的扩增结果：Y=X×2n其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。 3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？ PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。 PCR扩增通式：① T n=T0（1+E）n ② T n=Tn-1（1+E）n 注：[0 实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法： 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系 实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管，盖上管盖；或加入底缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须戴一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序，运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（protocol tab）b.设置反应板文件（plate tab）。c.点击‘‘start run’’键，运行程序。 3.2热循环程序文件（protocol tab）设置指南：点击edit（编辑）或create new （创建新程序）。 3.3反应板设置文件（plate tab）设置指南：选择本次试验所需要使用的荧光染料种类；单机样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（standard），点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid（打开热盖）或close lid（关闭热盖）放置样品；单击start run，保存文件，开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。 荧光定量PCR详细流程和问题解析 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR 技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR 片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案， 确认文件 类别：确认方案编号： 部门：质量部页码：共11页，第1页 DA7600PCR扩增仪 方案与报告 版次：新订替代： 起草：年月日 审阅会签： （确认小组） 批准：年月日 目录 1.概述 (2) 2.确认目的 (2) 3.确定确认范围 (3) 4.确定确认小组成员及职责 (3) 确认小组成员及确认小组负责人 (3) 人员 (3) 评价方法： (3) 标准： (3) 5.风险评估 (4) 评估概述 (4) 评估方法 (4) 6.确认内容 (7) .安装确认 (7) 安装信息 (7) 仪器放置检查 (7) 操作规程等资料确认 (8) 运行确认 (8) 基本称重功能确认 (8) 校正功能确认 (9) 性能确认 (9) 准确度 (9) 天平重现性检查： (10) 四角偏差检查： (11) 7确认计划安排 (11) 9.确认结果评定与结论 (11) 10.拟订日常监测程序及确认周期 (12) 1.概述 DA7600实时荧光定量PCR仪，是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。结合半导体致冷器实现PCR扩增过程，并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测，实现同时对样品的扩增和检测。友好的全中文计算机界面，可满足不同PCR实验的需求。其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高，能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求，是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。 2.确认目的 通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等，验证仪器能否正常准确运行，给出可靠的分析结果，以及48孔孔间差异是否在允许范围内。 3.确定确认范围 本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。 4.确定确认小组成员及职责 确认小组成员及确认小组负责人 列出参加DA7600确认的所有人员名单，评价培训情况是否符合操作的要求。 评价方法： 查阅培训档案，确认是否对有关操作者进行了相关培训，包括： 前一段时间在百度中搜索，发现多年前写的一个关于荧光定量PCR技术的PPT有很多人看过或引用过，后来又听见一些认识的人也说，近来也就觉得自己对社会有点看得见的贡献了。考虑到自己作为荧光定量PCR仪的技术支持人员已经工作了五年了，做的实验以及解决的问题远比五年前多了，因此利用过年的时间，写点荧光定量PCR实验中的一些注意事项及感想，无论对错，都是希望对相关的人员有些参考价值。 荧光定量PCR原理等大家都已经很熟了，我就不细说了，主要是写一些有人问过的事，希望写的内容是大家都关心的。 普通PCR与荧光定量PCR技术区别？ 简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。 前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR 样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。 Sybr Green、Taqman、Molecular beacon、LUX这些方法如何选择？ 从实验成本来讲，Sybr Green是最好的，基本上就是普通PCR加上一点Sybr Green I 荧光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种PCR反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验结果，当然也有一些技术解决这些问题，后面会讲到。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR反应的检测可以满足实验要求，则Sybr Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，即在一个反应管中进行2种或以上的反应，则要选择其他的方法，最常用的是Taqman、Molecular beacon，这两种都是探针的方式，由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增的成分。因此商业用途的检测试剂盒大都采用这一技术，以减少非特异性产物造成错误结论的可能性。其缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适，有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件的优化。这两种探针技术用于商业目的时都有专利问题，据说取得Molecular beacon的许可权的成本相对较低，但只是据说。 另一种值得一提的是LUX探针，它也可进行多通道实验，但它没有Taqman和Molecular beacon方法的增加探针特异性的功能，因此只能是一种折中的方案，如果不考虑多通道实验，则不如Sybr Green法 选择单通道实验还是多通道实验？ 这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择多通道实验。多通道实验的好处是可以消除样本加样的误差。但要克服的困难也比较多，一是条件的优化比较麻烦，即多种PCR反应以及探针要在同一个反应条件下进行，并且效率都要比较高，另一个困难是要求相互之间没有干扰，因为干扰会影响到实验结果。还有一个困难是当一个基因的模板数显著大于其他基因时，因为共用核苷酸等资源的原因，会让模板数少的基因的定量值变小或变为零。因此一般两通道的实验比较多些，即一个基因进行多样本比较，用看家基因进行对照。实时荧光定量pcr步骤
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