发酵过程优化原理
第一节发酵过程优化的微生物反应原理
一、概述
微生物是发酵工业的灵魂，对微生物控制的发酵过程进行优化，首先要了解微生物的生长反应特性。微生物细胞生长是细胞个体内许多化学反应的综合结果。这些反应包括合成提供其它反应需要的吉布斯自由能；利用底物合成结构单元，再聚合成大分子物质，供合成细胞所需等。正常情况下，微生物细胞为了确保有序和高效生长，必须将这些反应有机地结合在一起，经济地分配胞内各代谢途径的通量。
大肠杆菌是发酵研究中用得最多的微生物。在大肠杆菌生长过程中前人已观察到下列现象∶
(1)在大肠杆菌快速生长期间，生物合成的中间体很少渗漏到胞外培养基，结构单元(氨基酸、核酸等)的合成速率和聚合形成大分子的速率相一致；
(2)大肠杆菌胞内的大分子物质随比生长速率而变化。细胞以高的比生长速率进行生长时对蛋白质的需求很高，因此相对于低的比生长速率来说，蛋白质合成系统(PSS)是细胞量中较大的部分。在低比生长速率下，PSS的利用率很低，其合成和维护对微生物来说是无用的代谢负担；
(3)当生长培养基中的结构单元足够时，细胞就不再合成这些物质；
(4)特定的代谢途径代谢特定的底物，只有底物存在时，细胞才合成相应的酶。如只有当乳糖存在时，大肠杆菌才合成β-半乳糖苷酶将乳糖降解成半乳糖和葡萄糖；
(5)假如两个不同的底物同时存在于培养基中，细胞先合成能在一种底物上以较高比生长速率生长的酶系，当这种底物消耗完毕，再合成利用另一底物的酶。如大肠杆菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长，首先代谢葡萄糖，此生长阶段不产生β-半乳糖苷酶，不能代谢乳糖。当葡萄糖浓度变得很低时，系统合成β-半乳糖苷酶并利用乳糖继续生长。
以上观测结果对其它微生物也具有一定的适用性。由于微生物胞内代谢途径紧密结合，因此，对全部过程进行建模(如对特定微生物的生长和产物形成)，并不需要对所有独立的反应都要详细描述。如对微生物生长建模时，通常将所有的代谢途径混合起来用几个单一反应来表示，有时甚至用一个反应式就可描述全部的生长过程。本节主要讨论微生物生长反应的基本原理。
二、微生物生长反应
细胞生长过程可分为三个步骤：(1)底物传递进入细胞；(2)通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；(3)代谢产物排泄进入非生物相(胞外培养基)。
培养基中存在的底物都是化学物质，可以被细胞摄入并代谢掉，或转化为其它细胞生长所需要的物质。有些代谢产物还可以作为二次底物被细胞利用，所以很难将这些物质归类为底物或是产物。例如，酿酒酵母的二次生长现象。当酵母以葡萄糖为底物进行生长的同时还产生乙醇。葡萄糖消耗完毕，细胞可以继续以乙醇作为底物进行生长。根据大肠杆菌生长过程中观察到的五种情况进行类推，当培养基中存在葡萄糖时，细胞不产生代谢乙醇的酶。因此可以观察到，在利用葡萄糖生长和利用乙醇生长过程之间有一个滞后的阶段。在本书中，只有最初存在于培养基中的底物才被认为是底物。如上所述，葡萄糖是底物，而乙醇则是代谢产物。细胞质成分是由底物形成的、不能穿过细胞膜的物质。众所周知的细胞质成分有蛋
白质、RNA和DNA，而一些小分子如ATP、NADH以及NADPH也可以归为细胞质成分。代谢产物是那些形成于胞内，能够穿过细胞膜的物质，它们可以被排泄进入非生物相。因此，代谢产物既可以是底物经过多步反应形成的小分子物质，也可以是细胞产生的大分子物质，如胞外蛋白酶。
基于以上的讨论，本书对底物、代谢产物和细胞质成分的定义为：底物是一种存在于初始非生物相或者摄入物中起作用的可交换的化合物；代谢产物是一种作为代谢物产生于某代谢途径进入非生物相的化合物；细胞质成分是一种细胞利用底物产生的不可交换的化合物。以下分别对运输过程(底物的摄入和产物的分泌)和胞内反应过程进行讨论。
(一)运输过程
大多数细胞的细胞质外包围有两种结构：细胞壁和细胞膜。这些结构是细胞的屏障，其化学成分是允许非生物相和细胞质之间物质运输的决定性因素。细胞壁是一种具有交联肽聚糖的坚固结构，其主要功能是为了防止因胞内高的渗透压而引起细胞破裂。细胞膜主要由磷脂组成，在细胞生长过程中，具有变化的流动结构。大部分小分子很容易通过细胞壁，因此运输过程主要决定于细胞膜。大分子物质只有在细胞具有特定的排泄机制时才可以通过细胞壁。
革兰氏阳性菌(如乳酸杆菌)的细胞壁约厚35 nm，要比革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)薄2 nm 左右。但是革兰氏阴性菌具有两层磷脂分子膜，其中一层位于细胞壁外。胞外的膜含有蛋白质，能形成足够大孔径的通道，确保分子量大到800～900的分子自由进出。这些充满水的通道用于小的亲水分子通过细胞膜的快速扩散，因此胞外膜就起分子筛的作用。大分子物质只有在一些特殊的情况下，才能由专门的转运蛋白运输到细胞内部。然而一些重要的化合物(如糖、氨基酸和多数代谢产物)可以自由扩散进出胞外膜，因此对于革兰氏阴性菌来说，其细胞膜的特性决定着物质进出细胞的运输过程。
细胞膜由于胞内的渗透压而紧挨着细胞壁，但是革兰氏阴性菌和酵母细胞的细胞膜和细胞壁之间通常还有一层，即周质体空间。该层支持着20～40%的细胞质量，含有多种蛋白质，如蛋白酶、核酸酶和磷酸酯酶等水解酶。在周质体空间可发生许多反应，这使得从胞外培养基到细胞质的运输过程变得非常复杂。周质体空间最主要的功能就是以所谓的“结合蛋白”的形式富集底物，这可能与通过细胞膜的运输过程存在联系。因此，非生物相和周质体空间的底物浓度不一定相同，在对运输过程建模时必须考虑这些问题。
由于细胞膜是胞内和胞外环境的重要屏障，所以在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容。目前的研究表明在膜上可能存在三种不同的运输机制：(1)自由扩散；(2)协助扩散；
(3)主动运输。前两种机制是沿着浓度梯度进行运输，它们是被动的过程，在运输过程中不需要提供外部能量。而主动过程逆着浓度梯度进行运输，需要输入相当量的吉布斯自由能。表2-1-1总结了一些底物和代谢产物在细菌和真菌中的运输过程。可以发现大多数底物在这两种微生物中以相同的方式进行运输。以下分别介绍三种运输过程的特征。
表2-1-1 微生物体内不同底物和代谢产物的扩散过程
化合物细菌真菌
氨基酸葡萄糖乳糖主动运输
主动运输
主动运输
主动运输
协助扩散和主动运输
协助扩散和主动运输
甘油 乙醇 乳酸 乙酸 二氧化碳 氧气 水
自由扩散，协助扩散
自由扩散 主动运输和自由扩散
自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散
自由扩散，协助扩散
自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散 自由扩散
1、自由扩散
底物自由扩散通过脂膜包括三个步骤：(1)底物从胞外培养基运输到膜相；(2)分子在脂膜中扩散；(3)从脂相进入细胞质。一般情况下，细胞质具有和胞外培养基相似的物理和化学性质，因此，步骤(1)和(3)相似。另外，相内的过程可认为处于平衡，也就是说这些过程的特征时间要比分子扩散通过脂膜层的特征时间短得多。界面上脂膜层物质的浓度可认为是水相中产物的浓度，分配系数K par 就是化合物在脂层的溶解速率和在水中溶解速率的比值。分子扩散的质量通量遵守Fick 第一定律，化合物通过厚度为d mem 的质膜进入细胞的传质速率可以用方程(2-1-1)表示。
)(b a par mem
mem
c c K
d D J -=
(2-1-1)
式中，D mem 为化合物在质膜中的扩散系数，c a 和c b 分别为非生物相(胞外培养基)和生物相(细胞质)中化合物的浓度。D mem K par /d mem 的比率又称渗透系数P ，经常用于传质的计算。如果缺乏一独特的渗透系数，可以通过式(2-1-2)进行粗略的估计。
oil
par
w K M P 028.0= (2-1-2)
式中，M w 为化合物的分子量，oil
par K 为化合物在橄榄油～水体系中的分配系数，P 的单
位为cm/s 。通过大量不同化合物的测量，已经得到了它们之间的相互关系式。然而在使用该关系式时，有些化合物的P 值可能会偏离方程预测值
如果定义a cell 为细胞的比表面积(m 2/g 干细胞)，那么化合物的比运输速率为
)(b a cell cell c c Pa Ja r -== (2-1-3)
对于球形细胞来说，含水率为w(g/g)，细胞密度为ρ(g/m 3)，则比表面积为
cell
cell cell w d a ρ)1(6
-=
通过自由扩散进行运输的重要化学物质有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等。在电离状态下，小分子有机酸在脂膜中实际上是不溶的，此时应当用膜两边的非电离有机酸的浓度来代替方程(2-1-1)中的总浓度c a 和c b ，这些浓度可通过式(2-1-4)计算得到:
i pH a undiss i c K c i 1,)110(-+=
(2-1-4)
式中，K a 为酸的电离常数。可以看到，膜表面水相的pH 值对c i,undiss 有影响，由于通常胞内外的pH 不同，尽管c a =c b ，理论上一定流量的酸通过膜是有可能的。尽管有机酸能迅速达到电离平衡，同时，在水相和脂相中未电离的酸也产生溶解平衡，水相中靠近脂膜的地方仍然有可能存在一薄膜层。假如胞内的酸浓度比胞外培养基中高得多，那么未电离的酸就持
续移入脂膜，促使电离平衡向未电离形式移动，这样多数酸就溶解在脂膜中。在膜的培养基这边，未电离酸的浓度很高，快速电离促使脂相中的未电离的酸进入水相。这样，我们可以利用方程(2-1-1)模拟小分子有机酸的情况，只有当假设的膜层不合理时，才需要修正膜内的pH差异。
为了更好地理解自由扩散的意义，让我们来看一下乳酸的分泌过程。乳酸菌从葡萄糖转变为乳酸的过程中获得吉布斯自由能。为了保持胞内的pH不变，细胞必须将代谢产物乳酸排泄进入非生物相。乳酸的渗透系数大约为1.5×10-4cm/s。乳酸菌是直径约为1 μm的球形细胞，含水量80%，细胞的密度106 g/m3，因此细胞的比表面积为30 m2/g干重，代入方程(2-1-3)，得到∶
r lac=(1.5×10-6 m?s-1×30 m2/g干重)(c a-c b)
=(4.5×10-5 m3?s-1/g干重)(c a-c b) (2-1-5) 在细胞的快速生长阶段，乳酸的产生速度大约为1.4 mg/(g干细胞?s)。由方程(2-1-5)可知，如果胞外培养基和细胞质之间的浓度小至31g m-3时，扩散过程就可以将产生的乳酸转移出细胞。
乳酸通过脂膜的快速扩散还可以解释多数细菌体内乳酸(和其它小分子有机酸)的毒性效应。胞外乳酸浓度高时，胞内的浓度也很高。由于乳酸的电离常数很小，细胞很难维持胞内最适pH在7左右。尽管存在乳酸的主动运输系统，但通过细胞膜的快速自由扩散导致乳酸的连续流入，随后细胞就不再消耗排泄乳酸所需的能量。
2、协助扩散
细胞膜中有许多转运蛋白，允许特定的化合物进行被动运输，但是要比自由扩散通过细胞快得多，这一过程就是协助扩散。对于真菌来说，这种运输机制是很典型的，在细菌中则比较少见，文献报道中只有甘油是通过协助扩散进入大肠杆菌细胞的。协助扩散与自由扩散相似，因为只有存在浓度梯度时，才发生由高浓度向低浓度的运输。化合物只有在自由转运物的存在下才能进入细胞，因此运输过程的速率遵循典型的饱和型动力学，如在低浓度下，运输速率与底物浓度呈一级相关，而在高浓度时则呈现零级相关。真菌中通过协助扩散的重要底物有葡萄糖和其它糖类。
离子可以通过细胞特定蛋白(类似于革兰氏阴性菌细胞外膜的porin)形成的孔道而被摄入。当离子进入到孔道，内部就形成一种电荷，这可以防止其它离子进入。因此离子孔道和转运蛋白具有相似的功能，可以发现通过离子孔道的运输也遵循饱和型动力学。
3、主动运输
主动运输与协助扩散的相似之处为，两者都以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介。与协助扩散相比，主动运输可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程。运输过程中需要的自由能可以靠消耗ATP中的高能磷酸键来维持(一级主动运输)，或者和其它沿着浓度梯度方向的运输过程结合在一起(次级主动运输)。对于有些底物存在一种特别的主动运输过程，即所谓的基团移位，它是指底物在穿过细胞膜时，转变成不可渗透的异构体。
在氧化磷酸化过程中释放质子就是一个重要的一级主动运输过程。原核生物将质子释放到胞外培养基，例如穿过质膜而泵出体外。而在真核生物中，氧化磷酸化发生在线粒体内，质子穿过线粒体内膜而运输到线粒体内膜和外膜之间的空间里。在这两种情况下，质子的泵出是通过氧化NADH而释放大量的自由能来推动的。质子穿过膜的排出过程中会产生电化学
势，将质子运输回细胞(或线粒体内)，就可以获得吉布斯自由能。质子的内流是靠参与了A TP 合成的ATP酶传递的。质子的运输是可逆的，如ATP酶也可以通过消耗ATP的方式将质子泵出细胞，这也是一个一级主动运输过程。质子的运输过程如图2-1-1所示。
图2-1-1 质子的运输
次级主动运输是指在消耗已建立的其它物质梯度的基础上运输物质穿过细胞膜。如果这两种底物沿着相同的方向进行运输，过程就叫同向转移；若两种底物沿着相反的方向进行运输，过程则叫反向转移；如果电化学势驱动离子进行运输，则叫单向转移。一般情况下，次级主动运输是和穿过细胞膜的pH梯度相耦合的，为了保持胞内pH稳定，有必要通过ATP 酶将质子泵出细胞。由于该过程需要能量，宏观表现就是次级主动运输过程需要胞内能量。次级主动运输的例子有：微生物通过透性酶摄入糖类。在这个过程中，糖和一个质子结合在一起运输到细胞质中，即质子同向运输；此外还有大肠杆菌中的乳糖透性酶系统。研究者发现在乳糖—质子运输过程中，两种物质的化学计量比为1:1。在其它运输过程中尚未发现到类似的简单化学计量比。
基团移位是主动运输过程的一个重要方面。在该过程中，运输过程是和被运输底物的并发转变耦合在一起。最为人熟知的基团移位的例子是磷酸转移酶系统(PTS)，一些细菌用该系统来摄入不同的糖类。在这个系统中，糖类在被运输之前先被磷酸化，磷酸基团由EMP途径的中间体磷酸烯醇式丙酮酸提供。至少有4种蛋白参与磷酸基团的转移(见图2-1-2)，其中反应链的最后一环同时用作运输糖类穿过细胞膜的转运蛋白。反应链中的后两种蛋白对于特定的糖来说是特异的，而前两种蛋白在不同的PTSs中都是相同的。葡萄糖在PTSs运输下进入细胞时，直接被转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)。这样PEP中的高能磷酸键就得以保留，因此从能量的角度来看，这种摄入葡萄糖的过程要比通过透性酶摄入葡萄糖经济得多。此外，和其它的摄入系统相比，PTSs对糖类的摄入具有很高的速率。这可以用来解释为什么PTSs主要存在于发酵性细菌中，其中从糖代谢生成ATP的量比呼吸性细菌少，如严格好氧菌Azotobacter中不含有PTSs，而厌氧菌和兼性厌氧菌如乳酸菌属和埃希氏菌属拥有针对几种不同糖的PTSs。丝状真菌和酵母也不含PTSs。
图2-1-2 某些细菌中用于摄取糖类的PTS图解
(二)胞内反应
底物运输进入细胞质后，要经过1000多步不同的胞内反应转化成代谢产物和生物量成分，这些成分在大小和功能上存在差异，但是90%以上的细胞物质都是由蛋白质、RNA、DNA、脂类和碳水化合物等大分子组成。大分子物质是通过底物的合成代谢反应而形成的，底物首先转化为氨基酸和核酸等结构单元，然后这些结构单元聚合成大分子。细胞的合成代谢活力取决于培养基的成分，当细胞在含有所有氨基酸的复杂培养基上生长，正常情况下不会再合成这些化合物。微生物的种不同，其生物合成能力也不同。有些微生物可以在只含有糖、无机氮和少量无机盐的培养基中生长，而有些微生物需要在含有一些结构单元的复合培养基上生长。合成代谢反应需要消耗吉布斯自由能和还原力，吉布斯自由能主要靠ATP中的高能磷酸键来提供，而还原力则由辅酶NADPH来提供。A TP中的高能磷酸键水解可释放大量的吉布斯自由能：
ATP＋H20＝ADP＋～P G0=-30.5 kJ/摩尔(2-1-6) 式中，~P表示磷酸基团。ΔG为正的反应，可以通过水解A TP所释放的吉布斯自由能来起动。当NADPH被氧化成NADP+，释放两个电子，转移到细胞内其它化合物上使其还原。ATP和NADPH是在底物转化为能量更低的化合物的分解代谢反应中形成的，下面即对分解代谢和合成代谢作一介绍。
1、分解代谢反应
最常用于细胞生长的能源是糖类，它们在转化为代谢产物(CO2、乳酸、乙酸和乙醇等)的同时，还形成ATP、NADH和NADPH。其中NADH是和NADPH相似的一种辅酶。NADH 和NADPH都在分解代谢反应中产生，但NADPH主要消耗于合成代谢中，NADH则主要消耗于分解代谢途径，如氧化磷酸化。
大多数糖类在代谢之前都首先转化为6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)。正常情况下，胞内的G6P和F6P处于异构平衡，G6P可以作为许多糖代谢反应链的起点。有些微生物中在运输葡萄糖的过程中形成G6P，但在另一些微生物中，G6P是通过胞内葡萄糖与ATP水解相耦合的反应而形成的。一般把糖从G6P开始的代谢分成酵解和丙酮酸代谢两个部分，酵解定义为从葡萄糖转化为丙酮酸所有途径的总和。在EMP途径中，G6P转化为丙酮酸，从葡萄糖开始的总的计量式如方程(2-1-7)所示。
Glc＋2ADP＋2～P＋2NAD+→2PYR＋2ATP＋2H2O＋2NADH＋2H+=0 (2-1-7) F6P转化为1,6-二磷酸果糖的ΔG为正，需要ATP水解提供能量才能进行。因ATP(或PEP)用于由葡萄糖形成G6P，故ATP的净产率是每摩尔葡萄糖转化为丙酮酸时产生2摩尔ATP。1摩尔葡萄糖经过部分氧化得到2摩尔丙酮酸所释放的四个电子，被2摩尔NAD+捕获形成2摩尔NADH。
磷酸戊糖(PP)途径的主要作用是为合成代谢提供NADPH形式的还原物和合成核酸的前体物质5-磷酸核糖(R5P)。由于PP途径存在分枝点，对于需要R5P和NADPH的细胞来说，存在4种可能的化学计量式(表2-1-2)。
表2-1-2 4种情况下PP途径的化学计量式
情况化学计量式
对R5P的需求远大于5G6P＋5ATP→6R5P＋5ADP＋4H2O＋4～P
NADPH
对R5P和NADPH的需求平
衡
G6P＋2NADP+＋H2O→R5P＋2NADPH＋2H+＋CO2
对NADPH的需求远大于
R5P，且G6P完全氧化为
CO2
G6P＋12NADP+＋7H2O→12NADPH＋12H+＋6CO2＋～P
对NADPH的需求远大于R5P，且G6P转化为丙酮酸3G6P＋6NADP+＋5NAD+＋5～P＋8ADP→
5PYR＋3CO2＋6NADPH＋5NADH＋8ATP＋2H2O
酵解途径形成的丙酮酸通过乙酰CoA的形式进入三羧酸循环(TCA)，并被完全氧化生成CO2和水。这里，1摩尔丙酮酸氧化可形成1摩尔ATP，4摩尔NADH和1摩尔FADH2。丙酮酸在TCA循环中被完全转化的先决条件是，NAD+和FAD可以从NADH和FADH2中再生。该过程在呼吸链中发生，呼吸链是一个需要自由氧的氧化过程，因此只有在好氧微生物中才是可行的。在呼吸链中，电子从NADH通过NADH脱氢酶传递到辅酶UQ，再从辅酶UQ经过一系列细胞色素(含有亚铁血红素基团的蛋白)，最后传递给氧而形成水。细胞色素或辅酶UQ存在于细胞膜上或附近(或真核细胞线粒体的内膜)，当电子经过呼吸链，质子就通过膜层泵出细胞。当质子在ATP酶的作用下再进入细胞(或线粒体)，ADP就被磷酸化形成ATP，因此呼吸链通常也被称为氧化磷酸化。质子可以通过呼吸链上的3个位点泵过细胞膜。根据化学计量式可知，理论上1摩尔NADH氧化可形成3摩尔ATP∶
NADH＋0.5O2＋3ADP＋3～P＋3H+→NAD+＋3A TP＋4H2O (2-1-8) 对于NADPH也有相似的反应，但是该辅酶主要用于生物合成。FADH2在UQ处进入呼吸链，因此电子不经过NADH脱氢酶。FADH2的氧化只导致质子在两个位点泵过细胞膜，化学计量式和方程(2-1-8)有所区别。
FADH2＋0.5O2＋2ADP＋2～P＋2H+→FAD+＋2ATP＋3H2O (2-1-9) 每个氧原子所形成ATP的摩尔数在氧化磷酸化中，通常称作P/O比，这个变量经常用于能量的计算，此处不作详细介绍。由方程(2-1-8)可以看出，如果NADH是代谢反应形成的唯一辅酶，理论P/O比率的值即为3，但是FADH2的P/O比率通常小于3。FADH2和NADH 之比会随着操作条件而变化，因此P/O比也不是一个常数。
对于真核生物，情况可能更为复杂。NADH在细胞质中形成(酵解)，同时线粒体中也形成NADH。细胞质中形成的NADH不能穿过线粒体膜，它氧化为NAD+是和线粒体中FAD 还原为FADH2的反应耦联进行的。细胞质中NADH在和FADH2同样的位置进入呼吸链，所以细胞质NADH氧化的理论P/O值只有2。为了计算总的P/O比率，有必要将细胞质中发生的反应和线粒体中发生的反应区分开来，由于这两种情况下形成的NADH的比率随操作条件而变化，所以通常不能指定P/O比率的值，除非知道理论值在2～3之间。由于氧化反应和磷酸化过程不完全耦合，所以实际的P/O比率的值与理论值不同。
当氧化磷酸化失活(缺乏氧或必需的蛋白质)时，丙酮酸不能在TCA循环中氧化，否则将导致NADH在细胞内的积累。这种情况下，NADH被氧化的同时，丙酮酸可被还原为乙酸、乳酸或乙醇。这些过程统称为发酵性代谢。发酵性代谢并不是所有的微生物都一样，但有许多共同点。图2-1-3(a,b,c)揭示了两种细菌和一种酵母如何通过发酵性代谢来平衡EMP途径产生的还原力。如果乳酸是最终的代谢产物，所有EMP途径中利用的NAD+都可以再生。当
乙醇是代谢产物时，就会形成NAD+过剩，不可能从葡萄糖中重新得到所有的碳，因为从碳元素的角度考虑，每摩尔葡萄糖最多只能产生2/3摩尔乙醇，其它的碳转化为CO2或甲酸。形成乙酸时，NADH也过剩，同样可得出类似的结果。大肠杆菌的发酵性代谢中可形成图2-1-3中所示的代谢产物，因此，这种现象通常又称作混合酸发酵。大肠杆菌和乳酸菌的主要区别在于大肠杆菌缺乏在丙酮酸降解为乙酰CoA时生成CO2的能力。
图2-1-3 Escherichia(A)，Lactococci(B)和Saccharomyces(C)在葡萄糖上的发酵性代谢酵母中丙酮酸的代谢(图2-1-3-C)相则对复杂一些。TCA循环中化合物的代谢与合成是从乙酰CoA开始在线粒体中进行。为了使发酵代谢过程中细胞的氧化还原水平得以平衡，丙酮酸转变为乙醛、乙酸和乙醇。值得注意的是，细胞质中在乙醛氧化成乙酸时会形成NADPH。最后，乙酸可通过乙酰CoA而被代谢掉(主要通过好氧生长)。酿酒酵母则既不产生乙酸也不产生甲酸，但可摄入乳酸并转化为丙酮酸。
2、生物合成和聚合反应
为了合成细胞物质，需要合成结构单元并将其聚合。E. coli细胞中大约70%的能量和还原力被用于蛋白质的合成，微生物的种类和操作条件不同时，这一数值会发生很大变化。更深入的研究发现，细胞对于吉布斯自由能和还原力的需求取决于培养基中是否存在结构单元，因此，若细胞在只含部分结构单元的复杂培养基中生长，就很难对其进行详细的生理学研究，这也解释了优化培养基组成的困难所在。
由于合成蛋白质需要消耗大量的自由能，因此细胞能否根据其自身需求来调节蛋白质的合成是很重要的。蛋白质的合成是通过蛋白质合成系统(PSS)进行的，该系统中核糖体是主要部分。细胞可通过调节PSS的大小和活性来控制蛋白质的合成，因此需要消耗能量。当细胞从能量充足的环境到缺能的环境，1～2 h内细胞就可调节PSS的大小来适应新的环境。考虑到PSS的重要作用，有理由将它的相对大小(g/g干重)作为结构模型中的关键变量。
细胞合成所需要的结构单元数在75～100之间，这些物质都是从12种前体代谢物合成得到的(表2-1-3)。可以发现，这些前体代谢物就是分解代谢反应的中间产物，因此分解代谢在细胞生长过程中起着双重的作用(为生物合成提供能量和前体代谢物)。
表2-1-3 合成E. coli细胞对前体代谢物的需求
前体代谢物分子式摩尔质量(g/mol) 需要量(μmol/g细胞)
6-磷酸-葡萄糖C6H13O9P 260 205
6-磷酸果糖C6H13O9P 260 71
5-磷酸核糖C5H11O8P 230 898
4-磷酸赤藓糖C4H9O7P 200 361
3-磷酸甘油醛C3H7O6P 170 129
3-磷酸甘油酸C3H7O7P 186 1496
磷酸烯醇式丙酮酸C3H5O6P 168 519
丙酮酸C3H4O388 2833
乙酰辅酶A 3747
α-酮戊二酸C5H6O5146 1079
琥珀酰辅酶A
草酰乙酸C4H4O5132 1787
TCA循环的中间体用于生物合成会使TCA循环活性降低，所以有必要补加这些化合物。丙酮酸羧化途径和乙醛酸循环是最重要的两条回补途径。在丙酮酸羧化反应中，草酰乙酸可由磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸合成；在乙醛酸循环中，异柠檬酸可转化为琥珀酸和乙醛酸，而乙醛酸可和乙酰CoA反应生成苹果酸。草酰乙酸和苹果酸的生成可保证TCA循环的持续运转。
氮的同化也是细胞代谢很重要的一部分。在大多数合成培养基中，氨是用作氮源(氨也常作为复合培养基中的补充物)。氨通过结合进入谷氨酸或谷氨酰胺等氨基酸而被同化，如方程(2-1-10)和(2-1-11)所示。
C5H6O5(α-酮戊二酸)＋NH4+＋NADH＝C5H9O4N(谷氨酸)＋NAD+＋H2O
(2-1-10)
C5H9O4N(谷氨酸)＋NH4+＋ATP＝C5H10O3N2＋ADP＋～P＋H+
3、次级细胞代谢
细胞代谢和生长过程偶联在一起的过程，我们称之为初级代谢。但许多工业上重要的产品，其合成反应并不与生长过程偶联，我们称之为次级代谢，这些反应合成的产物叫次级代谢产物，就象初级代谢形成的产物叫初级代谢产物一样。次级代谢产物最典型的代表是抗生素。一般来说，所有细胞的初级代谢都是相似的，而次级代谢则随细胞不同而异。定义一个代谢产物是初级代谢物还是次级代谢物并不麻烦，但因为所有胞内反应都紧密相联，所以有时要对特定的代谢产物进行分类是有困难的。
最早人们认为，只有与细胞生长过程中形成的才称之为初级代谢产物。乳酸是初级代谢产物，但它是乳酸菌在非生长条件下形成的，许多其它的初级代谢产物也同样是在非生长条件下产生的，因此初级代谢产物定义为“在细胞生长所需要的反应中形成的产物”可能比较确切一些。与之相应，次级代谢产物就可定义为“在那些对于细胞生长不重要的反应中形成的产物”。根据这一，胞外蛋白(由插入的基因编码)也是代谢产物，但由于重组蛋白对于细胞功能不是必需的，因此不能称之为初级代谢产物，应当将这类产物归类为次级代谢产物。表2-1-4列出了一些重要的初级和次级代谢产物，其中大部分次级代谢物为抗生素。
表2-1-4 一些工业上重要的初级和次级代谢产物一览
初级代谢产物次级代谢产物
乳酸青霉素
乙醇头孢菌素
CO2四环素
乙酸链霉素
柠檬酸短菌肽
谷氨酸氯霉素
赖氨酸卡那霉素
葡萄糖酸灰黄霉素
核黄素赤霉素
第二节发酵过程数量化方法
一、数量化方法的基础
如果把细胞看作是一个黑箱，忽略细胞内部的各种生化反应，仅考虑微生物和外界的营养和物质交换，可以得到深层发酵过程的宏观模式图，如图2-2-1所示。一般情况下，微生物生活在液相中，营养物S i(包括好氧过程中的氧)和产物P j、CO2及反应热(H v=容积反应热，J/L)均通过各相及其界面传递。在发酵过程中，传质限制性步骤可能包括4个方面∶(1)气－液界面上的液膜；(2)液相主体；(3)液－固界面上的液膜；(4)细胞壁和膜或固相细胞物质。
图2-2-1 以液相中可观察的拟均相参数来表示的发酵过程原理
X∶生物量；S i∶底物；O∶氧；P j、产物；C∶二氧化碳；H v∶容积产热发酵过程的数量化处理包括：(1)发酵过程的速度；(2)化学计量学和热力学；(3)生产率、转化率和产率。只有当变量可测量时，才有可能对发酵过程进行数量化处理。因此在实践中，要求方便、可靠和迅速地测量这些变量，特别是对发酵过程影响较大的关键变量进行准确测定。一般实验条件下能够检测的发酵过程参数如表2-2-1所示。
表2-2-1 发酵过程常规的参数及其测量
符号参数测量方法
X 生物量细胞干重，浊度，细胞数
S 底物酶法分析，化学法，色谱法
P 产物酶法分析、HPLC或特殊方法
X 氧P
－专用电极分析
O
C 二氧化碳 ＰCO ２－专用电极分析 H v
发酵热
温度、热平衡
对这样一个带有6个变量的系统进行数量化处理，可基于带有化学计量系数νi 的方程进
行：
v v c j p x o i s H CO P X X O S ννννννν+++→++202
(2-2-1)
这一方程常用于好氧、并产生CO ２的分批发酵过程。当然在有些情况下例外，如藻类生长时，利用CO 2而产生O 2。原则上讲，所有发酵工艺在较宽范围内都是自催化反应。这种催化由方程2-2-1表达。
对发酵过程进行数量化处理涉及很多数学符号，为便于理解，以下对本章即将出现的各种符号的数学含义进行解释。
(1) 比生长速率(μ)、比合成速率(q p 、q c 或q Ｈv )和比消耗速率(q s 或q o )，与消耗速率(r s 或r ０)
或形成速率(r x 、r p 、r c 、r ＨＶ)的概念是不同的。前者表示细胞的个体行为，反映了细胞的生长和代谢能力，是相对速度；而后者所表示的则是细胞的整体行为，是绝对速度。 (2) 省略了表示一阶微商的符号，用r i 表示反应的绝对速度(r i )，n i 表示物质的传递速度，q
表示产热速度。
(3) Y 和νi 分别表示产率系数和化学计量系数；K 专门用于表征动力学方程的平衡、饱和或
抑制常数。物质的浓度用小写字母表示，大写字母用于表征物质的量(X=x ?V)。 (4) 反应速度和传递速度的速度常数均用k 来表示。带有n 级反应的反应速度通常为：
n j r i C k r ?= (2-2-2A)
反应速度常数k r 取决于反应级数。传质速度为：
C k n TR i ??=
(2-2-2B)
式中?C 为浓度梯度。传热速度为：
T k q HTR ??=
(2-2-2C)
式中?T 为温度梯度。k TR 和k HTR 是表观传递系数，可用真传递系数(k L1、k L2、k H )和相应的界面面积(a G/L 、a L/S 、a H )进一步解释。
表2-2-2和表2-2-3对发酵过程优化所涉及的动力学参数的概念进行了解释。
表2-2-2 发酵过程的速度概念
变量
动力学参数
物质传递
热传递
反应速度 定义式
dt
dc r i
i ±
= 包括H v c p o s x r r r r r r ,,,,,
dt
dc n i
i ±
= dt
dH q v
=
单位 g ?L -1?h -1
g ?L -1?h -1
kJ ?L -1?h -1
比反应速率
定义式
x
dt dc i 1
? 包括H v c p o s q q q q q ,,,,,μ
单位
h -1
速度常数
定义式
n
i i
c r k )
(=
包括d p r k k k ,,
21,,L L Tr k k k g CO s k k k ,,2
Hv k
表2-2-3 发酵过程的化学计量学概念
概念 表示方法
宏观化学计量学 产率i
j i j r r Y ±
=/，包括x H v p x s p s x Y Y Y Y ////,,,
微观化学计量学 d c b a D C B A ?+?→?+?νννν
平衡常数
K ，包括K m 、K s 、K i
二、发酵过程的速度
以最简单的分批发酵过程为例。当反应器容积V R 恒定时，表2-2-1中6种参数随时间的变化曲线如图2-2-2所示。其中可观测的参数有：菌体(X)的生长，底物(S i 和O ２的消耗，产物(P i 、CO ２和H v )的积累。在研究反应器内部物料平衡和过程动力学时，研究者最感兴趣的是这些参数变化的速度。
图2-2-2 反应器容积恒定的分批培养中，发酵过程典型的浓度～时间变化曲线
S ，底物；O ，氧；X ，菌体；C ，二氧化碳；P ，产物；H v ，热。
那么，如何构建速度方程呢?一般来说需要用质量守恒方程来进行推导或解释。这一方程主要含二项：(1)组分i 被合成或消耗的来源和去向；(2)组分i 通过单位表面积的物质流n I ’(mol ?cm -2)。物质的流动n I ’=d(N/A)/dt ，来自各种传递现象，可用不同的术语来描述，例如流动速度v ；通过浓度梯度的传导，即扩散D ；分散作用D eff ；或界面传递k TR 。
方程(2-2-3)表示浓度c i 随时间的变化。一般，方程可使用矢量符号?写成(梯度=带方向坐标的偏微商)：
i i i r n t
c ±±?=??'
(2-2-3A)
将各种传递项(v c n i i ?='，A F v /=)分开，此方程可以以矢量的形式写成
i i TR j i i
r c k Dgradc div v c div t
c ±??++?-=??])()([ (2-2-3B)
或以单维形式(如用于管状反应器)写成：
i i TR i
i z i r c k z
c D z c v t c ±??+??+??-=??22 (2-2-3C)
组分i 形成或消耗的速度都是明显的变量(g ?L -1?h -１
)，形成速度为正，消耗速度为负。对于非连续的搅拌罐反应器中物质形成或消耗的速度，方程２.３c ，可简化成方程２.３d ：
i i
r dt
dc ±= (2-2-3D)
方程(2-2-3D)只有在T 、V R 为常数且理想混合条件下才是正确的，该式仅代表一种组分形成或消耗的速度。
对于图2-2-2中T 、V R 为常数且理想混合的非连续反应器中的典型分批发酵过程，菌体生长速度为∶
dt
dx
r x =
(2-2-4A)
氧和底物利用速度为∶
dt ds
r s -
=和dt
d r o o -= (2-2-4B)
P 、C 和H V 生成速度为
dt dp r p =
，dt
dc r c =，dt dHv r Hv = (2-2-4C)
这些速度的单位是(g ?L -1?h -１
)或(kJ ?L -1?h -１
)，其数值可直接代入质量平衡方程。由于这些速度是绝对速度，不能代表系统的特征，为了对不同生物体或不同生物反应系统进行比较，需要用到物质产生或利用的比速率的概念。比速率是一个相对速度，它与生物量(以细胞干重表示)或有催化活性物质的量(如酶量)有密切的关系，一般用式(2-2-5-A ～F)这一组方程来定义发酵过程中的各种比速率，其单位均为h -１
。
生长的比速率为μ
dt dx
x ?
=1μ (2-2-5-A) 或 dt
dn n ?=1ν
(2-2-5-B)
式中ν表示细胞数的比增加速率
底物消耗的比速率为q s
dt ds x q s ?=
1 (2-2-5-C)
对氧来说，
dt do x q o ?=
1 (2-2-5-D)
产物形成的比速率为q p
dt
dp x q p ?=
1 (2-2-5-E)
对CO 2，
dt
dc x q c ?=
1 (2-2-5-F)
对H V ，
dt
dH x q V H V ?=
1 (kJ ?g -１
?h -１
)
(2-2-5-G)
以上比速率的定义类似于化学反应动力学中比速率*i r 的定义。化学反应动力学中非均相催化时，用活性催化剂的量M C 给比速率下定义：
dt dN M r i
c i ?
=
1* (2-2-5-H)
均相催化时，则多使用反应器容积V R (V)定义比速率
dt
dN V r i i ?=
1* (2-2-5-I)
在某些情况下，也可用其它量，例如催化剂的外表面积或固相的体积。
方程(2-2-5-H)和(2-2-5-I)中的Ｎi 代表组分i 的摩尔数(c i =Ｎi ／V)。将其代入方程(2-2-5-I)，就可将方程(2-2-5-I)和方程(2-2-4)的定义联系起来∶
)()(1*dt
dV V c dt dc dt V c d V r i i
i i ?+=??=
(2-2-5-K)
当Ｖ=常数时，方程(2-2-5-K)与方程(2-2-3-D)相同。
为了完整，方程(2-2-5-I)常被用作化学动力学中反应速度的定义。而真反应速度r 则通过化学计量系数νi 同上述生长或消耗速度(r i 或r i ＊
)联系起来， i
i
r r ν±±=
(2-2-6)
νi 的符号遵循“消耗为负、形成为正”的原则。由于生物反应中的化学计量系数具有不确定性，故一般难以得到方程(2-2-6)中严格意义上的反应速度。在进行生物反应动力学研究时，用的最多的是方程(2-2-5-A)～(2-2-5-G)给出的比消耗或比形成速率。 发酵过程的自我催化性质可由方程(2-2-7)表示。
x r x ?=μ (2-2-7)
三、化学计量学和热力学
(一)化学计量方程
对发酵过程进行优化研究，需要深入考察不同结构反应器中各种代谢反应的数量关系，研究所有与获取最大转化率(或产率)相关的因素，此时需要用到元素平衡原理。平衡可以分为宏观平衡和微观平衡。对在反应过程不发生改变的守恒物质只使用宏观平衡，而对非守恒物质还可使用微观平衡。化学计量学是关于化合物组成和化学反应转化率的数量化研究，与热力学、动力学一起构成反应工程学的基础。热力学只强调系统的起始态和终止态，能给出关于反应可能进行到最大程度及热释放或吸收的信息；动力学主要涉及变化所需要的时间，可用于预测反应的进程；化学计量学则主要研究有关加工过程中反应组分组成的变化规律。 考虑到碳、氢、氧、氮元素的守恒，生物反应器中微生物细胞的活动可以用化学元素的
平衡方程代替方程(2-2-1)来表示：
v
Hv W C P X N O d c b a S H O H CO N O H C N O H C NH O N O H C ?++++→
++ννννννννδγβαδγβα)()()()()()()(22''''32 (2-2-8)
式中，d c b a N O H C 是通用化了的碳源，δγβαN O H C 是根据元素分析得出的细胞组成，
''''δγβαN O H C 为产物。在特殊情况下，元素硫和磷也可以包括进来。方程(2-2-8)是活细胞内
成百个代谢反应综合起来的总方程。不生成新细胞和产物的A TP 系统和能量处理系统等代谢网内的许多循环和代谢链，都不影响总反应。因此，在使用总化学计量方程进行宏观处理时，并不需要了解这些循环的详细情况，这样可使发酵过程的分析不太复杂，而又不失去重要的信息。
在生物反应中，原子守恒的一般形式是各反应的总和，由下式表示：
0=?∑γν
j
j
(2-2-9)
式中，ν为化学计量系数，γ为特定的元素。
然而，由于有数百种组分参与代谢，将方程(2-2-9)直接用于生物工艺的化学计量确实存在困难，但可以只将有限的几种化合物用在总生长化学计量方程中。理论上已证明这种方法是合理的。
当复合反应处于稳态(0=??t
C i
)时，可将方程(2-2-3)同方程(2-2-6)组合起来，写成和的形式：
∑∑?-=?j
j
j j
v n
γ'
(2-2-10)
这样，可以通过观察稳态时系统与环境之间的交流('j n ?)来研究反应的化学计量学。当反应系统中没有产物净生成时，有许多量被称为守恒量。这时的平衡方程没有产物生成项。
∑=?j
j
n
0'
(2-2-11)
在稳态情况下，上述论据证实了可根据生长和产物形成的总化学计量方程来对微生物代谢进行处理。除了非开放反应器系统的定量化之外，把化学计量学用于发酵过程的主要问题来自代谢反应是个复杂的反应网络。对于简单反应，化学计量学价值不大；而要处理复杂反应，只能借助于用于复杂化学反应的数学方法。在这种情况下，必须建立元素平衡方程。由于这种方法太复杂，人们首先在生物工艺的定量化中使用了一种简单得多的方法──使用产率系数Ｙ的概念。
(二)产率系数的概念
宏观产率系数(或称得率系数)Y i/j 是化学计量学中一种非常重要的参数，常用于对碳源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，其中i 表示菌体或产物，j 表示底物。Y i/j 最初是由Ｍonod 以质量单位和商的形式定义的：
ds dx r r dt ds dt dx S S X X S X Y s x t t s x =-=≈--=??-
=//00/=??
?
??底物消耗的克数细胞形成的克数
(2-2-12)
根据这一定义，可以将消耗的量同形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的
产率。产率的概念同样也能用于定量地表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系。表2-2-4对产率系数的定义进行了总结。表中质量组分的单位为(g 组分i/g 组分j)，有热量时的单位为(kJ/g 组分j)。
表2-2-4 生物反应过程中宏观产率系数的定义总览 产率系数 组分间的反应或关系
定义 Y X/S S →X Y X/S =-r X /r S Y X/O O 2→X Y X/O =-r X /r O Y P/S S →P Y P/S =-r P /r S Y C/S S →CO 2 Y C/S = -r C /r S Y P/O O 2→P Y P/O = -r P /r O Y Hv/S S →Hv Y Hv/S =-r Hv /r s Y C/O O 2→CO 2 Y C/O =-r C /r O Y Hv/O
O 2→Hv
Y Hv/O =-r Hv /r O
在某些情况下，以摩尔为单位表示产率系数更有利：
底物消耗的摩尔数
细胞形成的克数
=
mol S X Y /
(2-2-13)
异化过程中生成每摩尔ATP 时增加的菌体质量，即对ATP 生成的菌体产率Y A TP 是研究生化途径分子能量学时的重要参数。微生物通过氧化底物，获得菌体合成、物质代谢、物质传递等生命活动所需的能量，但只有氧化反应中以生成ATP 的形式获得的自由能，才能被微生物所利用，其余能量作为代谢反应热释放到环境中。根据这一观点，Bauchop 以异化代谢中A TP 的生长两作为菌体产率的基准，定义∶
S
ATP S S
X ATP Y M Y ATP X
Y //?=??=
(2-2-14)
式中Ms 为底物的分子量，Y ATP/S 为相对于能源底物消耗的ATP 产率，即每消耗1摩尔能源底物生成ATP 的摩尔数。计算Y ATP ，需要知道作为能源的底物的准确消耗量。在复合培养基上进行的厌氧培养，若培养基中所有碳源几乎都作为能源被分解，不转化为菌体成分，且只限于在底物分解过程中生成A TP 时，ATP 的生成、利用与菌体合成之间的关系如图2-2-3所示。
图2-2-3 复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP 的生成和利用
Y ATP 与微生物及底物种类无关，基本为一常数。在复合培养基的厌氧培养实验中观察到，不管微生物和环境的性质如何，Y ATP 总是约为10.5。但该值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP 生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从Y ATP ≈10。
把相似的概念用于重要的常数C ATP Y 和C O Y ，可表达为
形成的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数
ATP Y C
ATP =
(2-2-15) 氧消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数
=
C O Y
(2-2-16)
C
O
Y 值在实践中对推导元素平衡方程很重要，对与氧化磷酸化有关的理论问题也有重要意义。碳摩尔的概念可使产率以摩尔为单位来表达∶
底物消耗的摩尔数
细胞形成的碳摩尔数
=
C S Y
(2-2-17)
根据(2-2-17)的定义，可表示除了碳源和氧以外的底物的细胞产率。
(三)产率系数与化学计量系数的关系
在方程(2-2-8)给出的通用化学计量方程的基础上，每种主要元素(C 、H 、O 、N ，省略S 、P 和灰分)都可写成下列平衡方程
摩尔C ∶ 'αννανν?++?=?P C X S a
(2-2-18-A)
摩尔H ∶ W P X N S b νβνβννν2'3+?+?=+?
(2-2-18-B) 摩尔O ∶ W C P X o S c ννγνγννν++?+?=+?2'2
(2-2-18-C) 摩尔N ∶
'δνδννν?+?=+?P X N S d
(2-2-18-D)
在方程(2-2-18-A ～D)中，生成碳摩尔细胞的底物(S ν)和NH 3(N ν)的量可以直接测出。通过元素分析能测定细胞和产物的组成，得出α、β、γ、δ和α’、β’、γ’、δ’。当底物和产物中没有氮时，δνν?=X N ，此时测定NH 3不是必需的，但有助于检查总精确度。O 2和CO 2可用气体分析仪测定，求得O ν和C ν。唯一无法方便测定的量是W ν，但可以从方程(2-2-18-B)和(2-2-18-C)的差求得此值。
由方程(2-2-8)和(2-2-18)，能推导出一些重要的产率常数，例如
][)141612()1/()141612(/）
使用的底物（）
形成的细胞（g g d c b a r Y S X s x ?+++-+++=
νδγβαν
(2-2-19)
其中，r 为细胞物质中灰分的分数(r=0.07～0.10)。 依相似的方式，产物的产率为
)
141612()
141612(''''/d c b a Y S P S
P ++++++=
νδγβαν (2-2-20)
在实践中，通常能方便地由实验数据算出这些产率系数值，并用它们去求出细胞平衡方
程中的S ν 、O ν和C ν值。
(四)理论代谢产物产率
假设发酵过程中完全没有菌体生成，则Y P/S 可达到理论最高值，称之为理论代谢产物产率theor S P Y /。theor S
P Y /可根据以下两种方法进行计算。 1、根据化学计量关系计算theor S
P Y /。 若完全不考虑反应过程中NADH 及ATP 等辅助底物的生成和消耗，可纯粹由化学计量
关系计算theor S P Y /。例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶
O H CO NO H C O NH O H C 2249523612635.1++→++
依此计算，theor S P Y /=147/180=0.82 2、由生物化学计量关系计算theor S
P Y / 根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出theor S P Y /。由于NAD(P)H 及ADP 的再生过程要消耗底物，故依这种方法求得的theor S P Y /要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。仍以谷氨酸发酵为例，若α-酮戊二酸的氨基化还原反应中所需要的NADPH 由异柠檬酸脱氢反应供给，两个反应构成偶联反应系统，此时由生化计量关系得到的theor S P Y /与由化学计量关系得到的theor S P Y /一致。如果NADPH 由磷酸戊糖途径提供，则反应总方程式变为∶
O H CO NO H C O NH O H C 224952361262
7
2321213++→++ 由该反应式得∶theor S
P Y /=(147×13)/(12×180)=0.75 如果要用生化计量式求theor S
P Y /时，必须清楚有关的代谢途径，但这是很困难的，特别是对于抗生素、核酸、维生素及酶等产量小的代谢产物。此时，一般重视产量，而不重视产率。就是计算得到了产率，也是一个非常小的值。
(五)实际发酵过程中的产率系数
在实际发酵中，产率是变化的，所以必须对产率系数的概念进行修正。产率的值明显地取决于各种生物和物理参数。虽然产率因子是限定于特定菌株及特定物质的，但它并不仅是底物的函数。通常产率取决于下列因素：
Y=f(菌株、底物、μ、m 、Ｓ；t 、t m 、OTR 、C/N ，P/O)
(2-2-21)
式中m 为混合度，S 为底物浓度，t 为平均滞留时间，t m 为混合时间，OTR 为氧传递速
度，C/N 为碳氮比，P/O 为磷氧比。
Pirt 提出了下列函数式来论证Y 与比生长速率μ(在CSTR 操作中以不同的稀释率D 来实现，D=μ)及维持系数m s 的关系∶
μ
s
S
X S
X m Y
Y +
=
max
//11 (2-2-22)
m a x
/S X Y 是μ接近极限时的Ｙx/s 值。方程(2-2-23)可用于计算μ和m s 对Ｙx/s 的影响。
s
S
X S X S X m Y
Y Y ?+?=
max
/max //μμ (2-2-23)
方程(2-2-22)不能解释为什么当分批培养的指数生长期中μ为常数时，产率仍有变化。另外，对C １利用菌来说，Y X/S 仅随μ(或稳态CSTR 的D)增加而增加，故这一方程也不适用。Papoutsakis 和Lim(1981)用碳流分支的概念来解释菌体产率变化的原因：
2
1//11
)
(
r r M M Y S X X S X +?=ν (2-2-24)
其中r 1和r ２分别为碳源分支代谢途径1和途径2的反应速度，M X 和M S 为菌体和底物的分子量，νx 是S →X 反应的化学计量系数。在甲基营养菌中存在两种不同的碳代谢流：同化(r 2)和氧化(r 1)。在适宜条件下，细胞通过反应间的精细调节可导致生成最大的菌体量。根据方程(2-2-24)，产率只随r ２或r １变化。而碳源和其它营养物的浓度或温度、pH 等培养条件的任何变化都可能引起r ２或r １变化。这一概念表明，甲基营养菌菌体产率的变化是一个动力学问题，而不是生物合成问题。
第三节 微生物反应动力学
在微生物反应中，底物消耗和产物生成受微生物生长状态及代谢途径的影响很大。被摄入到微生物细胞内的底物中，一部分转化为代谢产物，还有一部分则转化为新生细胞的组成物质。因此，对微生物反应动力学进行研究，至少要对底物、菌体和产物3个状态变量进行数学描述。当然，有些时候只要能表示出3个变量中的2个，另一个可通过计量关系推导得出。对于仅以培养菌体为目标的微生物反应(如生产面包酵母)和废水的生物处理过程，无须考虑代谢产物的生成速率。
在推导这3个状态变量的变化速率方程时，依据普通化学反应的简单质量作用定律很难解决问题。这是因为微生物反应是很多种物质参与的复杂代谢过程的综合结果。因此，微生物反应的动力学方程只能通过数学模拟得到。在进行数学模拟时，难点在于细胞的生长、繁殖代谢是一个复杂的生物化学过程，该过程既包括细胞内的生化反应，也包括胞内与胞外的物质交换，还包括胞外的物质传递及反应。该体系具有多相，多组分、非线性的特点。同时，细胞的培养和代谢还是一个复杂的群体的生命活动，通常每1 mL 培养液中含有104～108个细胞，每个细胞都经历着生长、成熟直至衰老的过程，同时还伴有退化、变异。要对这样一个复杂的体系进行精确的描述几乎是不可能的。为了优化反应过程，首先要进行合理的简化，在简化的基础上建立过程的物理模型，再据此推导得出数学模型。
迄今为止，微生物生理学家和生化工程学家关于微生物反应动力学提出了许多数学模型，其中有些是经验模型，也有些是机理模型。这些模型可分为概率论模型和决定论模型两大类，其中决定论模型又可分为均相模型和生物相分离模型，或结构模型与非结构模型，如表2-3-1所示。
表2-3-1 微生物反应动力学模型的分类
模型类型 着眼点 说明
概率论模型 微生物个体 必须考虑每个细胞的差异，以说明某一特定现象；或用以说明平均值附近的波动情况
决定论模型 微生物群体 不考虑每个细胞的差异，而是取菌体性质及数量的平均值进行数学处理
均相模型
微生物群体
是一种认为菌体均匀分散于培养液中，可作为均相处理
的决定论模型。
生物相分离模型
微生物群体
是将菌体作为与培养液(连续相)分离的生物相处理所建立的决定论模型。这种模型需要说明培养液与菌体间的物质传递及分配效应。在高菌体浓度时，考虑微生物所占的体积分率，以及解析废水生物处理过程中洒水滤床和旋转圆盘的微生物膜，都是利用生物相分离模型。
结构模型
微生物群体
考虑菌体组成的变化，将活菌体和死菌体分别处理从而建立的模型。在单一菌体的结构模型中，将整个菌体分为两种或两种以上成分，并认为代谢过程是各种成分共同作用的结果。均相模型和生物相分离模型都可分别构成结构模型
非结构模型
微生物群体
这种模型与结构模型的主要区别在于它不考虑细胞组成的变化。
一、微生物生长的非结构动力学模型
一般情况下，当菌体细胞组成不随时间而变，即达到平衡生长，或在工业规模操作时细胞组成的影响不大时，适合用非结构模型描述反应过程，但在使用非结构模型时必须注意具体的使用条件，不能任意推广。不同情况下生长与底物消耗随着底物浓度增加而变化的函数关系如图2-3-1所示。
图2-3-1 比生长速率(或底物比消耗速率q s )与限制性底物浓度之间的关系
1∶Monod 动力学；2∶带底物抑制的Monod 动力学；3∶高浓度菌体下带有底物抑制的Monod 动力学；4∶高浓度菌体下带有底物抑制和产物抑制的Monod 动力学；5∶高浓度菌体下带有底物抑制、产物抑制和内源代谢的Monod 动力学；6∶高浓度菌体下带有底物抑制、产物抑制、双底物顺序利用或生物吸附的Monod 动力学；7∶过渡现象，如延迟期。
(一)无抑制作用的细胞生长动力学
温度和pH 恒定时，μ随培养基组分浓度变化而变化。若着眼于某一特定培养基组分的浓度s ，并假设其它培养基组分浓度不变，Monod 方程为∶
微生物生长的速率为∶
S
K S
s +=max
μμ
(2-3-1)
式中μmax 称为最大比生长速率(h -1)，K s 称为半饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率恰为最大比生长速率一半时的限制性底物浓度。S 为限制性底物浓度(g/L)，底物消耗速率方程对
第10章生物过程的优化和放大 生物过程的研究一般经历 摇瓶培养→小罐培养→中试→生产规模 10.1 生物过程的优化 优化方法 1单次单因子法 2统计法：Plackett-Burman法，部分因子设计法响应面法，响应面法 响应面法：中心组合设计法，Box-Behnken法 3改进单纯形法 统计法一般需要经过以下几步：实验设计；实验结果的数据分析，以得到合适的数学模型；数学模型的检验，即方差分析；求解最优化值及其校验。 一、Plackett-Burman法 Plackett-Burman法是一种两水平的实验设计方法，它试图用最少的实验次数达到使因子的主效果得到尽可能精确的估计，适用于从众多的考察因子中快速有效地筛选出最为重要的几个因子，但无法考察各因子对发酵的相互交叉的影响，因此常作为响应面法的初步实验，用于确定影响发酵过程的重要因子。 1. 实验设计 Hadamard矩阵 设计的准则为： 1)若要考察k 个因子，则需要进行N=k+1个实验，为便于进行方差分析，往往要求k 至少 包括1-3个虚构变量，即空项，且k为奇数； 2)每个因子取两个水平，即用“＋”、“－”分别代表其高、低水平，低水平为原始培养条件， 高水平约取低水平的1.25倍； 3)矩阵每行含“＋”的数目为(k+1)/2，含“-”的数目为(k-1)/2，而每列含“+ ”、“-”的数目相等； 4)矩阵第一行任意排列，但必须符合上述要求，最后一行全部为“-”；其余行以上一行的最 后一列为该行的第一列，上一行的第一列为该行的第二列，其余类推。 2. 数据分析 3. 方差分析 二、响应面法 1. 实验设计 2. 数据分析 3. 方差分析 4. 优化 10.2 生物过程的放大 不管是微生物细胞、动、植物细胞还是重组质粒，要进行工业化生产，都必须经过放大中试阶段，生化过程的放大有各种各样的方法和手段，其放大方法和原理林林总总，对具体某一体系来说，用何种放大模式可以快捷地成功过渡到工业化生产，没有固定模式，必须针对具体菌种生理生化及培养基及环境条件的放大效应综合考虑，至目前为止，生化过程放大一直是个长脖子的事。 传统的工业放大，一般要经过四个阶段：实验室摇瓶培养、实验室小型发酵罐培养、中间工厂和生产工厂。 一、摇瓶与罐培养的差异 摇瓶的试验条件放大到生产罐或小发酵罐的试验条件转移到大发酵罐时，它们所得产物的产量往往不完全一致，特别是产抗生素的新菌株，差异更大，当然也有一致的巧合。引起这种
工业发酵进展
微生物发酵培养基的优化方法 对于微生物的生长及发酵，其培养基成份非常复杂，特别是有关微生物发酵的培养基，各营养物质和生长因子之间的配比，以及它们之间的相互作用是非常微妙的。面对特定的微生物，人们希望找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。发酵培养基的优化在微生物产业化生产中举足轻重，是从实验室到工业生产的必要环节。能否设计出一个好的发酵培养基，是一个发酵产品工业化成功中非常重要的一步。以工业微生物为例，选育或构建一株优良菌株仅仅是一个开始，要使优良菌株的潜力充分发挥出来，还必须优化其发酵过程，以获得较高的产物浓度（便于下游处理），较高的底物转化率（降低原料成本）和较高的生产强度（缩短发酵周期）。设计发酵培养基时还应时刻把工 实验室最常用的优化方法是单次单因子法，这种方法是在假设因素间不存在交互作用的前提下，通过一次改变一个因素的水平而其他因素保持恒定水平，然后逐个因素进行考察的优化方法。但是由于考察的因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。另外，当考察的因素较多时，需要太多的实验次数和较长的实验周期[3]。所以现在的培养基优化实验中一般不采用或不单独采用这种方法，而采用多因子试验。 2.多因子试验 多因子试验需要解决的两个问题: (1)哪些因子对响应具有最大(或最小)的效应，哪些因子间具有交互作用。 (2)感兴趣区域的因子组合情况，并对独立变量进行优化。
3.正交实验设计 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。正交实验的实质就是选择适当的正交表，合理安排实验的分析实验结果的一种实验方法。具体可以分为下面四步： （1）根据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表； （2）根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验； （3）根据正交表给出的实验方案，进行实验； （4）对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。 正交试验设计注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因 次 报道。CastroPML报道用此法设计20种培养基，做24次试验，把gamma干扰素的产量提高了45%。 6.部分因子设计法 部分因子设计法与P1ackett-Burman设计法一样是一种两水平的实验优化方法，能够用比全因子实验次数少得多的实验，从大量影响因子中筛选出重要的因子。根据实验数据拟合出一次多项式，并以此利用最陡爬坡法确定最大响应区域，以便利用响应面法进一步优化。部分因子设计法与Plaekett-Burman设计法相比实验次数稍多，如6因子的26-2部分因子设法需要进行20次实验，而Plackett-Burman设计法只需要7次实验。 7.响应面分析法
发酵罐的结构系统及使用.txt28 生活是一位睿智的长者，生活是一位博学的老师，它常常春风化雨，润物无声地为我们指点迷津，给我们人生的启迪。不要吝惜自己的爱，敞开自己的胸怀，多多给予，你会发现，你也已经沐浴在了爱河里。实验十五发酵罐的结构系统及使用方法一、实验目的： 1 ．了解发酵罐（气升式、搅拌式）的几大系统组成，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。2．掌握发酵罐空消的具体方法及步骤3．掌握发酵罐进料及实消的具体方法及步骤4．掌握发酵罐各系统的控制操作方法 二、实验原理： 1．蒸汽系统：三路进汽——空气管路、补料管路、罐体） 2．温度系统： （1）夹套升温：蒸汽通入夹套。 （2）夹套降温：冷水通入夹套，下进水，上出水。 （3）发酵过程自动控温系统：热电偶控温，马达循环，只能加热，发酵设定温度低于室温时，由夹套进冷水降温。 3．空气系统： 取气口T空压机：往复式油泵获得高脉冲的压缩空气 粗过滤器：由沙布包裹棉花压实成块状叠加制得，作用是去除部分细菌及大部分灰尘 （贮气罐）：空压机压缩使气体温度升高，经贮气使气体保温杀菌；压缩空气中有油污、水滴，且压力不稳，有一定的脉冲作用，会冲翻后面的过滤介质，贮气后可使油滴重力沉降，减小脉冲。 冷却塔）：有降温并稳定作用，同时经旋风分离器进行气液分离 （丝网分离器）：通过附着作用，逐步累积沉降而分离5 微米以上的微粒其作用介质为铜丝网 （加温器）：对压缩空气升温，除湿，使湿度达50%-60% 总过滤器：纱布包裹棉花加活性炭颗粒，逐层压紧而成。 分过滤器：平板式纤维，中间为玻璃纤维或丝棉，下面放水阀应适时打开放出油、水，再用压缩空气控干。
发酵过程优化原理复习 1、 发酵过程优化的目标 答：①建立生物反应过程的数量化处理和动力学模型。 ②实现发酵过程优化，以更好地控制发酵过程； ③规避生物技术产业化过程的技术风险，追求其经济效益； 2、发酵过程优化主要涉及的研究内容 答：①细胞生长过程研究，了解微生物从非生物培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件下微生物的代谢产物分布； ②根据微生物代谢反应符合质量守恒定律，对微生物反应的化学计量进行研究，简化对发酵过程的质量衡算； ③研究生物反应速率及其影响因素，建立生物反应动力学，这也是是发酵过程优化研究的核心内容。 ④生物反应器工程，包括生物反应器及参数的检测与控制，它们是发酵过程优化最基本的手段。 3、Hasting （1954年）指出生化工程要解决的十大问题是哪些？ 答：深层培养、通气、空气除菌、搅拌、结构材料、容器、冷却方式、设备及培养基除菌、过滤、公害。其中通气搅拌与放大是生化工程学科的核心，其中放大是生化工程的焦点。 4、Cooney 指出，要实现发酵过程的优化与控制，必须解决好哪些问题？ 答：必须解决好5个问题：①生物模型；②传感器技术；③适用于生物过程的最优化技术；④系统动力学；⑤计算机-监测系统-发酵罐之间的接口技术 5、流加发酵、分批发酵、连续发酵方式的优缺点比较 答：①与传统的分批发酵相比，流加发酵可以解除底物抑制、葡萄糖效应和代谢阻遏等；与连续发酵相比，流加发酵则具有染菌可能性更小，菌种不易老化变异等优点。 ②与流加发酵和连续发酵相比，分批发酵工艺操作简单， 比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题， 对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。但其 人力、物力、动力消耗较大，生产周期较长，生产效率低。 ③连续发酵最大的优点是，微生物细胞的生长速度、代谢活性处于恒定状态，可达到稳定高速培养微生物或产生大量代谢产物的目的，且便于进行微生物代谢、生理生化和遗传特性的研究，在工业上可减少分批培养中每次清洗、装料、消毒、接种、放罐等操作时间，提高了生产效率和自动化程度。 6、重组生物药物生产过程的优化包括哪6个方面 答：①适宜宿主的选择；②重组蛋白积累位点（如可溶的胞内积累、胞内聚合积累、周质积累或胞外积累）的确定；③重组基因最大表达的分子策略；④细胞生长和生产环境的优化；⑤发酵条件的优化；⑥后处理过程的优化。 7、操作细胞循环生物反应器时必须考虑哪两个因素？为什么？ 答：①稀释率（流速/体积），因为稀释率的大小影响细胞的生长速率，不同的实验目的对稀释率的要求也不同； ②循环速率（指通过过滤系统的培养基速率），因为高的循环速率可使组分混合均匀，但循环速率过高会使作用在细胞上的剪切力过高，也会导致过滤单元膜的迅速损坏。 因此，很难同时确定合适的稀释率与循环速率，这也是限制细胞循环技术应用的一个重要因素。 8、细胞生长过程可以分为哪3个步骤，运输过程包括其中的两个步骤，在细胞膜上的运输过程是研究者普遍关心的内容，在细胞膜上可能存在哪些运输机制？各有何特点？ 答：（1）细胞生长过程的3个步骤：①底物传递进入细胞；②通过胞内反应，将底物转变为细胞质和代谢产物；③代谢产物排泄进入非生物相； （2）研究表明在膜上存在3种不同的运输机制：①自由扩散；②协助扩散；③主动运输。 特点：①自由扩散和协助扩散只有存在浓度梯度时，由高浓度向低浓度的运输才可能发生，统称被动运输，在运输过程中不需要提供外部能量； 自由扩散分子扩散的质量通量遵守Fick 第一定律，通过自由扩散进行运输的化学物质主要有氧气、二氧化碳、水、有机酸和乙醇等；协助扩散是通过膜上的转运蛋白来进行物质运输的，具有选择性，其运输速率比自由扩散又快又多，运输速率遵循典型的饱和型动力学。 ③主动运输是逆着浓度梯度进行运输，需要输入一定的吉布斯自由能，以特定的膜内蛋白作为运输过程的媒介，可以逆着浓度梯度的方向进行运输，因此是一个耗能的过程，根据运输动力来源可以分为一级主动运输和次级主动运输两大类，还有一种特别的主动运输过程为基团转移。 9、发酵过程数量化处理包括哪些方面的内容？常规的参数一般包括哪些？通常如何测量这些参数？ 发酵过程的数量化处理包括：①发酵过程的速度；②化学计量学和热力学；③生产率、转化率和产率； 10、比速率和速率有什么区别？ 答：比速率是一个相对速度，表示细胞的个体行为，反应了细胞的生长和代谢能力，它与生物量（以细胞干重表示）或有催化活性物质的量（如酶量）有密切的关系，各种比速率的单位均为h -1，定义类似于化学反应动力学中比速率r i *的定义 速率：是绝对速率，所表示的是细胞的整体行为，不能代表系统的特征。 11、生物反应过程中有关的宏观产率系数及定义 答：宏观产率系数（或称得率系数）Y i/j （i 表示菌体或产物，j 表示底物）是常用于对C 源等底物形成菌体或产物的潜力进行评价，将消耗的量同 形成的量关联起来，定量表示细胞或产物甚至热量的产率，也能用于定量的表示不同消耗量之间或形成量之间的相互关系，最初是由Monod 以质量单位和商的形式定义的： 12、Y A TP 与其它产率系数相比有何特点？ 答： ，是Bauchop 以异化代谢中ATP 的生长量作为菌体产率的基准而定义的。Y ATP 与微生物及底物种类无关，基本为一常数。 在复合培养基的厌氧培养中，不管微生物和环境的性质如何，Y ATP 总是约为10.5g/mol 。但该值对微生物生长具有普遍性。在基本培养基中无论是厌氧还是需氧培养，单一碳源中一部分作为能源通过异化代谢分解，其余部分用于同化构成菌体。假设用于同化的这部分碳源与ATP 生成无关，则对于异化代谢的碳源亦服从Y ATP ≈10g/mol 。 13、复合培养基厌氧培养过程中细胞的生物合成步骤及ATP 的生成和利用途径 P26 14、代谢产物理论产率系数和实际过程产率系数有何区别？影响实际过程产率系数的因素有哪些？ 答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则Y P/S 可以达到最高值，即为理论代谢产物产率，可以根据化学计量关系、生物化学计量关系计算。 而在实际发酵过程中的实际产率是变化的，所以需对产率系数的概念进行修正。实际产率值取决于各种生物和物理参数。 ，式中μ为比生长速率；m 为混合度；s 为底物浓度；t 为平均停留时间；t m 为混合时间； OTR 为氧传递速度 15、微生物反应动力学模型的类型及着眼点。Monod 模型属于什么模型？其使用的条件包括哪些? 底物消耗的质量细胞形成的质量==-=≈--=??-=ds dx dt ds dt d Y r r //x s s x x s x s x t 00t s /x Y M Y A x ATP/s s x/s ?=??=TP Y ATP
发酵过程及优化实验 ——产淀粉酶细菌的优化实验 淀粉酶是一类能催化淀粉糖苷键水解的酶类，作用于淀粉分子产生糊精、低聚糖及葡萄糖等多种产物。而淀粉酶是应用最广的酶制剂之一，占全球酶工业市场份额的25%-33%。淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物有机体中。 目前，已报道的能够产生淀粉酶的微生物种属包括不动杆菌属、微球菌属、黄隐球酵母、盐单胞菌属、青霉菌属、类芽孢杆菌属、链霉素属、假单胞菌属和杆菌菌属等。 实验一培养基的配置、灭菌 一、实验目的 1. 温故配制微生物培养基的原理及配制的一般方法、操作步骤。 2. 了解鉴别性培养基的原理，并掌握配制鉴别性培养基的放到和步骤。 二、实验原理 鉴别性培养基是一类在成分中加有能与目的菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而达到只需用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。如对于淀粉酶产生菌的筛选，选用的是在含有淀粉的培养基中培养微生物，滴加碘液进行染色，若出现透明圈，则表明该菌能产生胞外淀粉酶。 三、材料和器材 （1）培养基： 普通培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。鉴别型培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，可溶性淀粉10g，NaCl 5g，琼脂20g，自来水1000mL，pH7.2~7.4。另一个鉴别性培养基加可溶性淀粉15g每1000ml。（2）器皿：电子天平，烧杯，锥形瓶，量筒，培养皿，玻棒，涂布棒，移液管等。 （3）其他：药匙，记号笔，报纸等。 （4）碘原液：称取碘化钾22g，加少量蒸馏水溶解，加入碘11g，溶解后定容至500mL，贮于棕色瓶中。 稀碘液：取碘原液2mL，加碘化钾20g，用蒸馏水定容至500mL，贮于棕色瓶中。 四、方法和步骤 1．配制基本培养基，分装50mL至250mL锥形瓶，供实验菌株扩增。 2．配制鉴别培养基，检测实验菌株是否能产胞外淀粉酶。
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
第六章发酵设备 本章学习目标 ?了解常见嫌气发酵设备及其流程的类型与特点 ?掌握通风发酵设备的类型、结构及性能特性 ?了解空气过滤除菌原理、常见设备流程及其应用特点 ?掌握常见发酵设备的应用特点和选用原则 目录 发酵设备的类型和基本构成 发酵设备的基本要求 发酵设备的功能： 发酵设备的要求： 发酵设备的分类 ?发酵设备的功能和要求 功能：按照发酵过程的要求，保证和控制各种发酵条件，主要是适宜微生物生长和形成产物的条件，促进生物体的新陈代谢，使之在低消耗(原料消耗、能量消耗、人工消耗)获得较高的产量。 要求： ?良好的传递质量、能量、热量性能 ?结构应尽可能简单，操作方便，易于控制 ?便于灭菌和清洗，能维持不同程度的无菌度 ?能适应特定要求的各种发酵条件，以保证微生物正常的生长代谢 ?发酵设备的分类 按发酵用培养基状况：固体发酵设备和液体发酵设备 按微生物类型：嫌气(酒精、啤酒和丙酮、丁醇)和好气(谷氨酸、柠檬酸、酶制剂和抗生
素，发酵过程中需不断通入空气) 按发酵过程所使用的生物体：微生物反应器（主流）、酶反应器（固定化酶反应器和溶液酶反应器）和细胞反应器 嫌气发酵设备 一、间隙式发酵罐 间歇式发酵是指生长缓慢期、加速期、平衡期和衰落期四个阶段的微生物培养过程全部在一个罐内完成 特点：罐内环境和发酵过程易于控制。目前在工业生产中仍然占据主要地位 二、水洗装置 特点，水压不大洗涤不彻底 水平喷水管与水平面呈20°夹角，水流喷出时使喷水管以48～56r/min的速度自动旋转，洗涤一次约需5min 三、连续发酵设备 连续发酵：通过在发酵罐内连续加入培养液和取出发酵液，可使发酵罐中的微生物一直维持在生长加速期，同时降低代谢产物的积累，培养液浓度和代谢产品含量相对稳定，微生物在整个发酵过程中即可始终维持在稳定状态，细胞处于均质状态。 特点：产品产量和质量稳定、发酵周期短、设备利用率高、易对过程进行优化等优点，微生物在整个发酵过程中始终维持在稳定状态，细胞处于均质状态。技术要求较高、容易造成杂菌污染，易发生微生物变异、发酵液分布与流动不均匀等。 四、单罐连续发酵设备 连续搅拌发酵器 连续细胞回用发酵器 塔式发酵器 膜式发酵器 固定化细胞反应器 五、连续搅拌发酵器
发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物
发酵过程中的优化 高望 （兰州理工大学生命科学与工程学院） 摘要：发酵过程优化控制技术是发酵工程的重要技术。综述了近年来微生物发酵过程优化控制技术的研究现状，综合运用微生物反应计量学、生化反应和传递动力学、生物反应器工程及代谢工程理论，(1) 基于微生物反应计量学的培养环境优化技术；(2) 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术；(3) 基于反应动力学模型的优化技术；(4) 基于代谢通量分析的优化技术；(5) 基于系统观点的生物反应系统优化技术；（6）基于环境胁迫的优化技术；（7）基于辅因子调控的优化技术 关键词：发酵过程优化 1 发酵过程优化技术 1.1基于微生物反应计量学的培养环境优化技术 研究微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而优化微生物生长的物理和化学环境，保证微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步的发酵过程优化奠定基础。：(1) 培养基组成的优化技术。 (2) 发酵环境条件的优化技术。研究表明，培养基中的氮含量与葡
萄糖消耗及丙酮酸积累密切相关。氮源缺乏时, 葡萄糖消耗和丙酮酸生产均受到抑制。在小型反应器流加发酵中采用氨水控制pH 值( 相当于同时提供氮源) , 细胞能够持续、快速地积累丙酮酸。[1]李寅；陈坚；梁大芳营养条件对光滑球拟酵母发酵生产丙酮酸的影响[J]生物工程学报2000,16（2）：225-227 1.2 基于微生物代谢特性的分阶段培养技术 对分批发酵过程的研究发现，适合微生物生长的温度、pH 值、剪切和溶解氧浓度往往并不一定适合目标产物的形成，提出分阶段溶解氧和搅拌转速控制策略、分阶段温度控制策略及分阶段pH 值控制策略，将环境条件控制在最适合细胞生长或最适合产物合成的水平。研究表明，郑美英等以Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｍｏｂａｒａｅｎｓｅ为出菌株，研究了培养中温度控制策略，并在小型发酵罐上进行了验证。得出ＴＧ发酵过程中温度控制策略为：Ｏ～１８ｈ，控制温度为３２℃，１８ｈ后将温度切换到２８℃。采用此温度控制策略在２．５Ｌ小罐上进行ＴＧ发酵，酶活比未控制温度时的最好水平提高了１４%，发酵时间也缩短了６ｈ。由此可见，采用合理的温度控制策略确实能够显著提高ＴＧ的发酵过程中的各项指标。郑美英堵国成陈坚分批发酵生产谷氨酰胺转氨酶的温度控制策略[J]生物工程学报，200,16（6）：759-761 刘延岭，邓林，周昌豹，陈丽微生物发酵生产谷氨酰胺转胺酶的研究进展四川食品与发酵 2004,4：1-4 1.3 基于反应动力学模型的发酵过程优化和控制技术 研究不同目标代谢产物发酵过程的反应动力学，应用统计热力学理论和功能单元扩展理论，建立目标代谢产物分批发酵过程的动力学模型，用龙格库特法求取模型方程数值解，然后用单纯形搜索法或最速下降法寻出动力学模型方程中的最优参数，并对动力学模型的适用性进行评价。基于分批发酵动力学模型，在下列3 个方面已取得一定成果：①采用奇异优化理论，优化透明质酸的流加培养过程，并通过重复操作和优化补料组合发酵模式，显著提高透明质酸的生产强度[23]；②应用最小值原理，分别建立真氧产碱杆菌细胞生长期和聚羟基丁酸合成期底物流加的准优化控制策略，确定以指数速率流加和变速流加相结合的流加操作方式，得到以聚羟基丁酸最大生产强度和最高转化率为目标的准优化控制策略并成功应用[24－25]；③在无反馈控制的情况下，比较了不同流加培养模式对重组大肠杆菌生产谷胱甘肽的影响，发现采用简单的指数速率流加方式即可实现重组大肠杆菌的高密度培养[26]。 1.4 基于代谢通量分析（MFA）的发酵过程优化技术 参考已知的生化反应计量关系和特定微生物的代谢途径和生理代谢特征，构建生物合成特定目标代谢产物的代谢网络。利用代谢通量分析方法，对代谢中间产物进行拟稳态假设，然后通过测定细胞和代谢产物浓度的变化速率，计算得出胞内各条代 谢途径的通量变化。根据代谢通量分析的计算数据，分析特定目标代谢产物，如丙酮酸、透明质酸和生物絮凝剂生物合成途径中主要代谢节点的性质(刚性、弱刚性或弹性)，结合发酵
发酵工艺优化 发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统
CSTR厌氧发酵罐工作原理 一、概述厌氧生物处理技术在水处理行业中一直都受到环保工作者们的青睐，由于其具有良好的去除效果，更高的反应速率和对毒性物质更好的适应，更重要的是由于其相对好氧生物处理废水来说不需要为氧的传递提供大量的能耗，使得厌氧生物处理在水处理行业中应用十分广泛。 但由于总体反应式基于莫诺方程的厌氧处理受到低浓度废水Ks的限制，所以厌氧在处理低浓度废水方面没有太大的空间，可最近的一些报道和试验表明，厌氧如果提供合适的外部条件，在处理低浓度废水方面仍然有非常高的处理效果。 我们可以根据厌氧反应的原理加以动力学方程推导出厌氧生物处理低浓度 废水尤其在处理生活污水方面的合适条件。 二、厌氧反应四个阶段 一般来说，废水中复杂有机物物料比较多，通过厌氧分解分四个阶段加以降解： （1）水解阶段：高分子有机物由于其大分子体积，不能直接通过厌氧菌的细胞壁，需要在微生物体外通过胞外酶加以分解成小分子。废水中典型的有机物质比如纤维素被纤维素酶分解成纤维二糖和葡萄糖，淀粉被分解成麦芽糖和葡萄糖，蛋白质被分解成短肽和氨基酸。分解后的这些小分子能够通过细胞壁进入到细胞的体内进行下一步的分解。 （2）酸化阶段：上述的小分子有机物进入到细胞体内转化成更为简单的化合物并被分配到细胞外，这一阶段的主要产物为挥发性脂肪酸（VFA），同时还有部分的醇类、乳酸、二氧化碳、氢气、氨、硫化氢等产物产生。 （3）产乙酸阶段：在此阶段，上一步的产物进一步被转化成乙酸、碳酸、氢气以及新的细胞物质。 （4）产甲烷阶段：在这一阶段，乙酸、氢气、碳酸、甲酸和甲醇都被转化成甲烷、二氧化碳和新的细胞物质。这一阶段也是整个厌氧过程最为重要的阶段和整个厌氧反应过程的限速阶段。
微生物发酵过程优化控制技术进展 摘要发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础。在发酵工程领域，为了提高发酵水平和生产率，更多的研究工作集中在菌种的筛选和改造上。随着生物科学技术的发展，基因工程与代谢工程研究领域都出现了长足的进步与发展，利用基因重组与诱发等技术可以实现高产菌株普遍生产。但只有通过发酵过程的优化控制，才能实现产品质量最高、生产力最大、成本消耗最低的生产过程，因此对微生物发酵过程的优化控制成为发酵工程中研究人员日益关注的焦点。 关键词微生物发酵；影响因素；优化控制技术 1 培养基对发酵的影响 1.1 发酵培养基碳源和氮源的选择 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞以及形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂等，比如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及豆油等。氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的重要来源，与此同时，氮源也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源以及有机氮源，比如氨盐、硝酸盐、蛋白胨以及豆粉等。 1.2 发酵培养基中无机盐对发酵的影响 无机盐对代谢产物的生成及微生物的正常生长都具有相当重要的影响。在微生物的生长代谢过程中，磷参与了微生物细胞中核酸等辅酶的构成，是微生物能量代谢、生长的重要因素之一。在苏云金芽泡杆菌的发酵产物苏云金素的分子结构中包含磷酸根，所以在其发酵培养基中添加更多磷酸盐，更有利于产物苏云金素的合成。钙离子在微生物发酵过程中的主要作用是调节细胞的生理状态，比如说维持细胞的胶体状态、降低细胞膜的通透性等。与此同时，在大多数发酵培养基里面，添加适量的CaCO3，能够对发酵液含菌量的变化起到相当明显的影响，其主要原因是CaCO3的添加对发酵液的pH具有非常良好的缓冲作用，从而大大改善了菌体的生长环境。镁元素是许多酶的催化剂。锰、锌、铁、钼以及钴等元素是微生物所需要的微量元素[1]。 2 培养条件对发酵的影响 2.1 种子质量对发酵的影响 在发酵培养基中接入合适的接种量以及种龄适宜的优质种子液，能够使目标微生物更加迅速地进入到对数生长期，从而使发酵周期大大地减短，进而促使产物质量得以有效提升。如果种龄过长则会直接导致菌体过早的发生衰退，菌体的生产能力也随之而有一定程度的下降；如果种龄过短，则会直接导致菌体生长缓慢，产物合成时间大大推迟。若接种量过小，那么便会使得菌体细胞的生长量变
实验十一发酵罐的构造及操作 一、实验目的 1、了解发酵罐的结构和原理。 2、学习发酵罐的空消操作步骤。 二、实验原理 按照生物反应器的类型，发酵罐可分为三大类。（1）敞口式发酵：属于繁殖速度快的好氧发酵，例如酵母工业；（2）半密闭式发酵：如酵母菌等的发酵，大多数情况下属于不是很严格的厌氧发酵；（3）密闭式发酵：主要是好气性的液体深层培养，要求复杂，但无菌程度高。 发酵罐的主要部件包括以下几部分。罐体：主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）；罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程当中不停的搅拌；空气处理系统，用来供给菌体生长所需要的空气或氧气；蒸汽净化系统以供给发酵罐空消及实效所需蒸汽；罐体上有控制传感器，最常用的有pH电极和容氧电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化。此外有些发酵罐还配备有电气控制系统，用来显示和控制发酵条件等等。 三、实验材料 种子发酵罐
四、实验内容 1．型发酵系统的构造，以及各个部分的功能 （1）构造：发酵系统由三大组块构成：空气压缩机，蒸汽发生器，自控发酵罐体 （2）空气压缩机：用来供给菌体生长所需要的空气或氧气蒸汽发生器：供给发酵罐空消及实效所需蒸汽 罐体：主要用来培养发酵各种菌体，密封性要好（防止菌体被污染）；罐体当中有搅拌浆，用于发酵过程当中不停的搅拌；罐体上还有控制传感器，最常用的有pH电极和容氧电极，用来监测发酵过程中发酵液pH和DO的变化。 2．发酵罐空消的流程和具体操作步骤 （1）空消流程： （2）具体操作步骤： 3．发酵罐空消时的注意事项 （1）升温过程中所有的控制按钮必须处于关闭状态或单片机处于关机状态，否则自动冷却水会自动开启，影响升温，也浪费蒸汽。（2）在灭菌过程中，应时刻注意罐压，并控制在0.11～0.12MPa之间，请勿超压 （3）当蒸汽阀关闭后，发酵罐内的压力会迅速下降，为防止发酵罐
发酵工艺条件的优化集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
发酵工艺条件的优化 发酵优化对于搞发酵的工作者而言是非常必需的，下面结合其他战友的一些经验之谈引出此专题，希望大家踊跃讨论，以其提高发酵水平和解决实际问题。 发酵工艺的优化在发酵行业起到很大的作用,尤其是在发酵生产中,它是提高发酵指标的一项非常,有用的技术手段.同时也是搞发酵行业的人的必备知识要求之一,借此我想通过和大家交流共同提高发酵方面的知识水平.发酵工艺优化方法与思路:发酵工艺优化的方法有很多,它们之间不是孤立的,而是相互联系的。在一种发酵中,往往是多种优化方法的结合,其目的就是发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率,在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。 注意:大家可以从以下各个方面进行交流.尽量能够分类进行叙述,我总结了以下几累,也不是很全,当然从其他的方面进行交流也可以,但是希望你注明附加说明!!!谢谢大家的参与!!!!!!!!!一. 好氧发酵1. PH 工艺的优化2. 溶氧工艺的优化3.原材料工艺的优化4.消毒(灭菌)工艺的优化5.菌种制备工艺的优化6.小试到中试,中试到生产等扩大实验的工艺优化7.成本工艺优化8.种子罐工艺的优化9.发酵罐工艺参数控制的优化10.仪表控制的工艺优化11.环境的工艺优化12.染菌处理的工艺优化13.紧急情况处理的工艺优化(停电\停水\停气\停汽等)14.补料工艺的优化15.倒种工艺的优化16发酵设备的工艺优化17.其他的工艺优化 二. 厌氧工艺的优化三.固体发酵的工艺优化四.其他1. PH工艺的优化A.配料中的PH 很重要,其中有配前PH,配后PH,消前PH,消后PH,接种前PH,工艺控制PH等,配前PH,配后PH,可以用来检测厡材料的质量,初步估计配料的情况,如果出了错误,有时候可以从PH中的变化看出来,能够减少错误的发生.B.另外,每次有新的配方我们总是要用PH方法检测其中的每种厡材料是否会和其他的发生反应,可以互相两两混合,检测PH的变化,也可以用来作为配微量元素的检测.C.消前PH可以用来减少消毒过程对培养基的破坏,因为培养基在消毒中会有PH的变化,在不同的PH条件下对培养基破坏也不一样,因此可以在消毒的时候选择合适的PH,消毒完后可以调节过来,这样一来可以对PH敏感的一些原材料减少破坏,这种方法在生产中已经取得了初步的成绩,提高了指标.D.工艺控制的PH,在发酵的产抗期间,通过在不同的发酵时间调整不同的P H,可以减少杂质的产生,同时还可以缓解溶氧,比如在头孢发酵中,通过在后期调整PH可以减少DCPC的含量,给提取工序带来很大的好处,E.补料罐通过PH的调节可以更好的通过流加物料而不影响发酵.(部分发酵在不同时期的PH有所不同,所以通过补料罐的调整可以对发酵指标有所提高)F.发酵过程中的PH调节可以通过各种方法,不一定要添加氨水和氢氧化钠,可以添加玉米桨等其他的物料来进行调节.G.控制放罐时的PH可以对后面的过滤有所影响,所以一定要控制好放罐前的PHH.绘制种子瓶和种子罐以及发酵罐等整个发酵过程的PH生长曲线,可以用来参考控制工艺,检测无菌情况的发生.A. 华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化
CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2008年第27卷第8期·1210· 化工进展 微生物发酵过程优化控制技术进展 王建林，冯絮影，于涛，薛尧予 （北京化工大学信息科学与技术学院，北京 100029） 摘要：微生物发酵过程优化控制技术是发酵工程的重要技术。综述了近年来微生物发酵过程优化控制技术的研究现状，讨论了机理分析建模、黑箱建模、混合建模等发酵过程建模方法，对基于模型的优化控制策略进行了分析。指出了基于混合模型和多目标优化策略建立动态优化控制器，是微生物发酵过程优化控制的有效方法，并给出了实现优化控制需要解决的关键问题。 关键词：发酵过程；过程建模；非线性控制；优化控制 中图分类号：TP 18；TP 274 文献标识码：A 文章编号：1000–6613（2008）08–1210–05 Research progress of optimal control techniques in fermentation process WANG Jianlin，FENG Xuying，YU Tao，XUE Yaoyu （School of Information Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）Abstract：The optimal control technology of the microbial fermentation process is a crucial part of fermentation engineering. The researches on bioprocess optimal control techniques in recent years are reviewed from two points，modeling and control methods. The modeling techniques include the mechanism based methods，the experience based ‘black-box’ methods，and the hybrid methods by combining different modeling techniques. The progress of the research in the model based optimal control strategies are reviewed. It demonstrates that an efficient method to deal with the control problems in bioprocess optimization is to construct a dynamic optimization controller，based on hybrid modeling and multi-objective optimization techniques. Finally，some important problems which need to be resolved in the implementation of fermentation optimal control are presented. Key words：fermentation process；process modeling；non-linear control；optimal control 发酵工程是生化工程和现代生物技术及其产业化的基础。在发酵工程领域，为了提高发酵水平和生产率，更多的研究工作集中在菌种的筛选和改造上[1]。尽管现代生物技术在基因工程和代谢工程领域内有了长足的进展，通过诱发变异、基因重组和培养能够得到高产菌株，然而，通过优化控制使发酵过程产品生产最优（即生产能力最大、成本消耗最低、产品质量最高）仍是发酵工程领域中存在的主要问题之一，因此对微生物发酵过程优化控制的研究日益受到重视。微生物发酵过程优化控制的主要问题是建立过程模型和制定优化控制策略和算法。近年来，微生物发酵过程优化控制技术研究已经取得了一些进展，发酵过程建模方面的主要研究成果包括：机理分析建模、黑箱建模和混合建模。发酵过程优化控制策略方面的主要研究成果包括：基于线性化近似的经典优化控制，基于直接寻优算法的仿真优化控制，基于非线性系统理论的优化控制以及基于人工智能技术的优化控制。 1 微生物发酵过程建模 1.1 基于过程机理分析的建模 发酵过程机理分析建模是基于质能平衡、Monod方程、Contois方程等建立过程机理模型[2]，以及从基因分子、细胞代谢和反应器等多尺度建立 收稿日期：2007–12–28；修改稿日期：2008–03–25。 基金项目：国家自然科学基金资助项目（20676013）。 第一作者简介：王建林（1965—），男，博士，教授，主要研究方向 为复杂工业过程智能检测与优化控制。电话010–64433803；E–mail wangjl@https://www.doczj.com/doc/4312820892.html,。