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亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

亳芍生物碱提取及含量测定

作者周飞

指导教师陈乃东

摘要:用95%乙醇提取亳芍干粉,总提物回收乙醇后以盐酸酸化,继以二氯甲烷萃取,水相加氨水至pH ﹥8.0后以氯仿萃取,回收氯仿获粗提物。对该粗提物的TLC检测表明,亳芍中含有生物碱,且可能是乌头碱类生物碱。酸碱滴定法初步测定的生物碱含量,以乌头碱计,亳芍中总生物碱含量约为0.07%。

关键词:亳芍生物碱显色反应酸碱滴定

The primary research of the extracting and assaying of the alkaloids

from Baishao Paeoniae Radix Alba

Bachelor candidator Fei Zhou

Adviser Nai-Dong Cheng

Abstract:Total extract was extracted from Root of herbaceous peony's dry powder by using95%alcohol.We recover alcohol from the total extract,then join hydrochloric acid,then using

methylene chloride to extract.We join ammonia to pH﹥8.0in aqueous phase,then using chloroform to extract. We recover chloroform to get rough extract.TLC testing indicated that Baishao Radix Paeoniae Alba contains alkaloids,and the alkaloids may be aconitine class.Acid-base titration rough determination showed that Baishao Paeoniae Radix Alba content about0.07%total alkaloid with the aconitine represented.

Key words:Baishao Paeoniae Radix Alba Alkaloids Color reaction Acid-base titration

亳芍(Radix Paeoniae Alba),即亳白芍,主产安徽省亳州地区,为安徽道地药材之一,是芍药科植物芍药(Paeonia lactiflora)或其变种毛果芍药(Paeonia trichocarpa)栽培品的根。芍药为多年生草本植物,夏秋季采挖其根部,去净泥土和支根,沸水浸或略煮至受热均匀,再经晒干等处理后即炮制成中药亳芍,加工后的亳芍呈粉白色或白色。亳芍具有抗炎、免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗惊厥、护肝等作用,对胃肠道疾病和心血管疾病也有一定的疗效[1]。

已有的研究表明,亳芍主要含有单萜[2-7]、倍半萜及三萜[7,8]、单宁[9]、挥发油[10]、黄酮[8,11]、多酚类[13,14]、多糖[15,16]等活性成分,其中,芍药苷(一种单萜类化合物)是亳芍的主要活性成分[5,17-19]。为了进一步揭示亳芍的药效物质基础,为开发利用亳芍资源、繁荣当地经济提供参考依据,我们对亳芍的化学成分进行了一次深入研究。初步的定性鉴定研究结果表明,亳芍中含有生物碱。到目前为止尚未有亳芍中含有生物碱的研究报道,为此,本文对亳芍生物碱的提取、定性鉴定以及亳芍生物碱含量的初步测定等进行了研究,为后续的亳芍生物碱的分离鉴定奠定基础。

1材料仪器试剂

1.1材料

实验材料亳芍购于安徽省亳州市,品种经安徽中医学院黄和平博士鉴定。

1.2仪器

GJ14-DGF3006型电热恒温干燥箱(金坛市荣华仪器制造有限公司),HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市国华电器有限公司),LX-02型利祥100g手提式粉粹机(上海江信科技有限公司),RE-52D型旋转蒸发器(上海浦沪仪器厂),FA-1004型电子天平(上海精科天平厂),WD-9402E型紫外检测器(北京市六一仪器厂),TDL-5Z台式多管架自动平衡离心机(湖南星科科学仪器有限公司),冷凝管,漏斗,分液漏斗,碱式滴定管,250mL锥形瓶2个,150mL 锥形瓶5个,25mL量筒1个,50mL量筒1个,1mL移液管1个,5mL移液管1个,10mL移液管1个,250mL烧杯1个,50mL烧杯3个,100mL容量瓶1个

1.3试剂

无水乙醇(扬州沪宝化学试剂有限公司),氨水(扬州沪宝化学试剂有限公司),无水乙醚(扬州沪宝化学试剂有限公司),氯仿(西陇化工股份有限公司),二氯甲烷(西陇化工股份有限公司),乙酸乙酯(西陇化工股份有限公司),甲醇(河北四友卓越科技有限公司),冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司),甲醛(无锡市展望化工试剂有限公司),浓硫酸(汕头市西陇化工厂有限公司),次硝酸铋,碘化钾(蚌埠化学试剂厂),浓盐酸(汕头市西陇化工厂有限公司),茚三酮,甲基红,溴甲酚绿,硫酸,氢氧化钠以上试剂药品均为国产分析纯。

2方法

2.1工艺流程图

本实验中亳芍总生物碱的提取工艺流程如下:

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

2.2亳芍总生物碱的提取

2.2.1干燥

亳芍先剪成薄片状,然后粉粹,干燥箱中干燥至恒重。

2.2.2提取

称取25g干燥至恒重的亳芍粉末,以95%乙醇、料液比1:4(g:mL)、85℃冷凝回流提取三次,每次提取4小时。过滤,合并滤液,减压浓缩回收乙醇至提取液无醇味,浓缩液备用。

2.2.3纯化

将在2.2.2中所获生物碱浓缩液加水适当稀释、定容,缓缓加入浓盐酸,使溶液中浓盐酸含量达5%(V/V),摇匀,待充分反应后4000转/min离心5分钟,弃去沉淀,上清液加等体积二氯甲烷萃取萃三次取除杂,水相备用。

2.2.4萃取

向2.2.3所获水相中缓慢滴加氨水至溶液显碱性p H≧8.5(精密pH试纸测定),加入等体积氯仿萃取三次,合并氯仿相,减压回收氯仿,得亳芍总生物碱,加氯仿定容至100mL,平均分成2份,备用。

2.3亳芍生物碱的鉴定

2.3.1薄层层析

取一份总生物碱适当浓缩,在五块G254硅胶薄层板上分别点样,以乙酸乙酯:氯仿:

甲醇:氨水=8:2:3:2系统为展开剂薄层层析。

2.3.2显色剂的配制

(1)碘化铋钾显色剂的配制:0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸,加水40ml,8g碘化钾溶于20ml水,混匀后使用。

(2)甲醛浓硫酸显色剂的配制:30%甲醛溶液0.2mL与10mL浓硫酸混合均匀后使用。

(3)浓硫酸显色剂的配制:直接使用浓硫酸即可。

(4)浓硝酸显色剂的配制:直接使用浓硝酸即可。

(5)茚三酮显色剂的配制:1.5g茚三酮+100mL正丁醇+3.0mL醋酸,溶解混匀即可。

2.3.3紫外检测

取出薄层板,吹干薄层板上的展开剂,分别在254nm和365nm紫外灯下照射,记录现象。

2.4亳芍生物碱的含量测定

亳芍生物碱的测定,主要参照杨云[20]的方法改进而来。取另一份亳芍总生物碱,用于测定含量。

亳芍总生物碱的含量测定的计算公式为:

-V NaOH)×M×100%÷1000W

生物碱总含量=C×(V

空白

在公式中:

C是滴定用NaOH浓度,在本实验中C=0.02mol/L;

V NaOH是滴定加入过量硫酸的生物碱所用NaOH体积;

V空白是滴定相同浓度相同体积硫酸所用NaOH体积;

M是代表生物碱的相对生物分子量,在本实验中选择乌头碱的分子量。M=654.74为代表计算亳芍总生物碱的含量。

W是样品的质量,在本实验中W=25.8545g

2.4.1指示剂的配制

取0.1%甲基红的乙醇溶液20mL,加入0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30mL,摇匀,备用。

2.4.2有机试剂溶解

精确吸取配制的亳芍总生物碱溶液液10mL,置水浴锅上蒸干,残渣加无水乙醇3mL,再加乙醚5mL,使之溶解.

2.4.3滴定

精密加入0.01mol/L硫酸10mL,摇匀,置水浴锅上加热,使之充分反应,放置冷却,加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴,用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得,记录数据。

2.4.4空白对照

在锥形瓶中精密加入相同浓度相同体积的硫酸溶液(0.01mol/L硫酸10mL),加蒸馏水15mL和甲基红-溴甲酚绿指示剂2滴,用0.02mol/LNaOH溶液滴定至淡绿色即得,记录数据。

3.结果

3.1亳芍生物碱的显色鉴定结果

亳芍生物碱的显色鉴定结果见表1及图1~7。

表.1亳芍生物碱总提物TLC检测结果[21]

Table.1The identifications of alkaloids in Baishao Paeoniae Radix Alba by TLC

显色剂检测依据检测结果结论

碘化铋钾遇生物碱显橙红色4个橙红色斑点含有生物碱

浓硫酸遇乌头碱显紫色2个紫红色斑点可能含有乌头碱类

甲醛浓硫酸遇吗啡显橙色至紫色4个紫黑色斑点可能含有生物碱

浓硝酸遇秋水碱显蓝色,遇咖啡碱不

显色

未见显色斑不含秋水仙碱

茚三酮遇所有氨基酸及具有游离α-

氨基的肽都会产生显色反应

产生蓝紫色或(亮)黄色物质

未见显色斑不含氨基酸、短肽等

254nm紫外可观测到显色斑2个暗斑可能含有生物碱

365nm紫外可观测到显色斑2个蓝色荧斑

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

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亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

可能含有生物碱

图1碘化铋钾显色图2浓硫酸显色图3甲醛浓硫酸显色图4浓硝酸显色Fig.1Colored by Fig.2Colored by Fig.2Colored by Fig.4Colored by Potassium DOVAP formaldehyde/DOVAP nitric acid Heptaiodobismuthate

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

亳芍生物碱提取鉴定及含量测定

图5茚三酮显色图6254nm紫外下检测图7365nm紫外下检测

Fig.5Colored by Fig.6Colored by UV254nm Fig.7Colored by UV365nm

ninhydrin

3.2含量测定结果

滴定样品消耗的NaOH的体积V NaOH=9.40mL,滴定空白对照消耗NaOH的体积V空白=9.55mL。

将相关数据代入公式计算

亳芍总生物碱总含量=0.02mol/L×(9.55mL?9.40mL)×654.74g/mol÷(1000×25.8545g)×

100%×10

=7.5972×10-4

4讨论

4.1亳芍生物碱的鉴定

碘化铋钾是鉴定生物碱最常用的显色剂,如遇生物碱显橙红色。在我们的实验条件下,采用碘化铋钾显色,亳芍总生物碱检测到四个明显的橙红色显色斑(图1),说明亳芍中含有生物碱。但是一些含氮非生物碱物质如氨基酸等遇到碘化铋钾也会显色。为此,我们选择了浓硫酸、甲醛浓硫酸、浓硝酸和茚三酮等常用显色剂及紫外检测对亳芍总生物碱进一步TLC 显色鉴定以验证我们的结论。

TLC结果表明,采用浓硫酸显色,亳芍总生物碱提取物中可检测到两个明显的紫色显色斑(图2),提示亳芍中可能含有乌头碱类生物碱;用甲醛浓硫酸显色检测到四个明显的紫黑色显色斑(图3);浓硝酸显色,未见明显的显色斑(如4);253nm和365nm下分别观察到相应的显色斑(图6、7);用茚三酮显色未见明显的显色斑(图5)。

上述显色原理和显色结果表明,在亳芍氯仿提取物中,没有三帖、氨基酸、甾体、叔胺等小分子物质,可能含有乌头碱类生物碱。

4.2亳芍生物碱含量测定

酸碱滴定法是测定生物碱含量的经典方法,虽然此法的灵敏度较低,但是操作简便,成本低廉,且准确性、稳定性均较好[22]。在本实验条件下,测得生物碱的含量约为万分之七,远低于芍药苷的3.5%[6],因此,从含量角度考虑,生物碱可能不是亳芍的主要活性成分,这也可能是长期以来未能为人们发现报道的原因之一。

生物碱是人们最早研究的天然药物成分,也是最重要的中药有效成分之一。生物碱绝大多数分布在植物界,且在豆科、毛莨科等双子叶植物中含量较为丰富[23]。生物碱具有多种药物活性,如苦参碱、喜树碱等生物碱具有较强的抗肿瘤作用[24],四氢鸭木碱具有舒张血管平滑肌的作用[25],附子生物碱有较强的镇痛作用[26],贝母碱对卡他球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、克雷佰氏肺炎杆菌有抑制作用[27]等等,生物碱是天然药物活性成分中成药性较大的一类化合物。而在以前的研究中未见有亳芍生物碱的研究报道,因此,我们的实验结果对于研究中药亳芍及其复方的药效物质基础、探讨亳芍药理活性提供了新的研究方向,也为获得天然来源的生物碱提供了新的基源植物。

5.结论

(1)亳芍中含有生物碱,采用酸碱滴定法、以乌头碱计,亳芍中生物碱的含量约为0.075%;(2)初步显色鉴定显示,亳芍中可能含有乌头碱类生物碱。但对亳芍生物碱确切的类型及分子结构,尚待后续的定向分离研究加以确定。

致谢:

在此感谢我的毕业论文指导老师陈乃东老师,陈老师的细心指教使我的实验能够顺利完成,陈老师严谨的实验态度,让我明白实验得认认真真做,不能捏造数据,必需得追求真实,让我学到了很多知识。感谢在A503一起做实验的同学们,金亮和胡小玉同学在实验细节上的指导让我少走了很多弯路,严丽和陈洋同学借的实验仪器使我实验能够顺利完成,侯小龙和杜兆松同学的实验帮忙让我实验能够提前完成,一起做实验的时光开心而短暂,我们相处的很愉快,也学到了很多知识。在做实验这段期间,辅导员夏艳老师在班级工作上的即时通知,使我不必担心班级的事,解除了我的后顾之忧,在此感谢夏艳老师。

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