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实验四报告:液相色谱法用于不易挥发有机化合物混合物的定量分析

华南师范大学实验报告

学生姓名:学号:

专业:化学师范年级、班级:09级化四

课程名称:近代有机分析方法和实验实验时间:2011年10月12日

液相色谱法用于不易挥发有机化合物混合物的定量分析

一、实验目的:

1、学习利用高效液相色谱仪分离化合物和检测化合物的含量的方法

2、通过对样品的定量测定,初步掌握获得高效液相色谱图和数据的一般操作程序与技术

3、学习谱图和数据的处理方法

二、实验原理:

高效液相色谱分离是利用试样中各组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配系数不同,当试样随流动相进入色谱柱后,组分就在两相间进行反复多次(103~106)的分配,由于固定相对各种组分的吸附能力不同,各组分在色谱柱中的运行速度就不同,经过一定柱长后彼此分离,依次从色谱柱流出,通过检测器时样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、实验仪器与试剂:

仪器:岛津液相色谱仪,SPD-20A检测器,LC-20AT泵,微量进样器,C18色谱柱

试剂:水杨酸甲酯标准溶液,烟酸乙酯标准溶液,3个不同比例的水杨酸甲酯-烟酸乙酯混合液(1000ppm),甲醇(AR),超纯水

四、实验步骤:

1、准备

1.1准备所需的流动相,用合适的0.45μm滤膜过滤,超声脱气20min。(这里用的是流动相是甲醇(B)和超纯水(A),分别用有机相系和水相系的0.45μm滤膜过滤,超声脱气20min。)1.2根据待检样品的需要更换合适的洗脱柱(注意方向)和定量环。

1.3配制样品和标准溶液(也可在平衡系统时配制),用合适的0.45μm滤膜过滤。(水杨酸甲酯和烟酸乙酯标准溶液的配置:用移液管分别量取0.5 mL的水杨酸甲酯和烟酸乙酯用甲醇定容在5 mL的容量瓶中(105ppm),然后用移液管量取1 mL刚定容的溶液再用甲醇定容在10mL 的容量瓶后(104ppm)并用移液管量取1 mL刚定容的溶液再用甲醇稀定容在10mL的容量瓶中,这样就配制成浓度为1000ppm,用0.45μm滤膜过滤。水杨酸甲酯-烟酸乙酯混合液:用水杨酸

甲酯和烟酸乙酯的标准溶液按体积不同体积比定容至10mL)

1.4检查仪器各部件的电源线、数据线和输液管道是否连接正常。

2、开机

接通电源,依次开启不间断电源、B泵、A泵、检测器,待泵和检测器自检结束后,打开打印机、电脑显示器、主机,最后打开色谱工作站(即电脑桌面上的CS-Light Real Time Analysis)。

3、参数设定

3.1波长设定:在检测器显示初始屏幕时,按[func]键接着按[Enter]键,用数字键输入所

需波长值254nm,按[Enter]键确认。按[CE]键退出到初始屏幕。

3.2流速设定:在A泵显示初始屏幕时,按[func]键,用数字键输入所需的流速(柱在线

时流速一般不超过1ml/min),按[Enter]键确认。按[CE]键退出。

3.3流动相比例设定:在A泵显示初始屏幕时,按[conc]键,用数字键输入流动相B的浓

度百分数(80%),按[Enter]键确认。按[CE]键退出。

4、更换流动相并排气泡

4.1将A/B管路的吸滤器放入装有准备好的流动相的储液瓶中;

4.2逆时针转动A/B泵的排液阀180°,打开排液阀;

4.3按A/B泵的[purge]键,pump指示灯亮,泵大约以9.9ml/min的流速冲洗,3min(可

设定)后自动停止;

4.4将排液阀顺时针旋转到底,关闭排液阀。

4.5如管路中仍有气泡,则重复以上操作直至气泡排尽。

4.6如按以上方法不能排尽气泡,从柱入口处拆下连接管,放入废液瓶中,设流速为

5ml/min,按[pump]键,冲洗3min后再按[pump]键停泵,重新接上柱并将流速重设为规定值。

5、平衡系统

5.1按《N2000色谱数据工作站操作规程》打开"在线色谱工作站"软件,输入实验信息并

设定各项方法参数后,按下"数据收集"页的 [查看基线] 按钮。

5.2等度洗脱方式

5.2.1按A泵的[pump]键,A、B泵将同时启动,pump指示灯亮。用检验方法规定的流动相

冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。按A泵的[pump]键,A、B泵将同时启动,pump 指示灯亮。用检验方法规定的流动相冲洗系统,一般最少需6倍柱体积的流动相。

5.2.2检查各管路连接处是否漏液,如漏液应予以排除。

5.2.3观察泵控制屏幕上的压力值,压力波动应不超过1MPa。如超过则可初步判断为柱前

管路仍有气泡,按4.6操作。

5.2.4观察基线变化。如果冲洗至基线漂移<0.01mV/min,噪声为<0.001mV时,可认为系

统已达到平衡状态,可以进样。

6、进样

6.1进样前在CS-Light Real Time Analysis中:(1)点击“单次分析”,接着点击“样品

记录”,在样品记录名称中输入所要检测得样品名称,然后点击“数据文件”选择该样品储存在哪里,最后在“数据储存的文件夹”后面输入该样品名称,点击确定。(2)在信号采集菜单中设定停止时间(8 min)和延迟时间(3 min)。

6.2进样前按检测器[zero]键调零,按软件中 [零点校正] 按钮校正基线零点,再按一下

[查看基线] 按钮使其弹起。

6.3用试样溶液清洗注射器,并排除气泡后抽取20 L。

7、数据处理

7.1在桌面双击“CS-Light Postrum Analysis ”,点击确定按钮后,在“文件夹目录中”选中该样品记录双击鼠标,在谱图上单击鼠标右键的“显示设置”,在“显示设置”中选择“展开色谱”的“时间”填写“0”到“20”后点击确定

7.2用鼠标点击“编辑”选择“积分”中的“最小峰面积/高”输入“最小峰面积值”,然后又点击“定量”在“定量方法”中选择“面积归一法”,然后点击查看。 7.3复制谱图到Word 文档,在谱图中点击鼠标右键选择“复制”;复制数据,单击鼠标左键全选,然后鼠标右键“复制表格到剪贴板(b )”。 8、关闭仪器

分析完毕后,关闭色谱工作站,再自上而下关闭仪器。

五、数据记录

混合溶液1

0.0 2.5

5.0

7.5

10.012.515.017.5

min

0.0

1.02.03.04.05.06.07.08.0μV(x100,000)

4.304

5.985

混合溶液3

0.0 2.5 5.0

7.510.012.515.017.5

min

0.0

1.02.03.04.05.06.07.08.0μV(x100,000)

4.304

5.983

六、结果分析与讨论

烟酸乙酯结构水杨酸甲酯结构

本实验采用液相色谱法对于混合溶液进行定量分离分析,其中以保留时间作为定性判据,4.304min峰为烟酸乙酯峰,5.983min峰为水杨酸甲酯峰;定量分析的依据是被测组分的质量

与其色谱峰面积成正比m i=f i A i, 本实验中的定量方法是归一化法,即是若试样中含有n个组分,且各组分均能洗出色谱峰,则其中某个组分i的质量分数w i 可按下式计算

归一化法的优点是简便,准确,操作条件对结果影响较小,但试样中所有组分必须全部出峰,某些不需要定量的组分也要测出其校正因子和峰面积,因此,该法在使用中受到限制。

本实验所得结果,混合溶液1中烟酸乙酯含量35.9617%,而水杨酸甲酯为64.0383%,两者比约1:2;混合溶液3中烟酸乙酯含量59.8920%,水杨酸甲酯含量则为40.1080%,两者比约为3:2.

七、思考题

1、高效液相色谱的类型有哪些?

根据固定相和分离机理的不同,高效液相色谱可以分为如下几种类型。

(1)液一固吸附色谱

流动相为液体,固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。溶质分子被固定相吸附,将取代固定相表面上的溶剂分子。如果溶剂分子吸附性更强,则被吸附的溶质分子将相应地减少。吸附性大的溶质就会最后流出。

(2)液-液分配色谱

流动相和固定相都是液体。试样溶于流动相后,在色谱柱内经过分界面进入固定液(固定相)中,由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异,因而溶质在两相间进行分配。跟气一液分配色谱有相似之处:分离顺序决定于分配系数的大小,分配系数大的组分保留值大。分配系数为溶质在固定相和流动相中的浓度之比。但是气相色谱法中流动相的性质

对分配系数影响大小,而液相色谱中流动相的种类对分配系数却有较大的影响。

(3)化学键合相色谱

化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体(硅胶)表面,形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。对多数键合相来说,以分配机理为主。

(4)离子交换色谱法

离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的一种方法。

(5)离子对色谱法

离子对色谱法是将一种(或多种)与溶剂分子电荷相反的离子(称为对离子或反离子)加到流动相或固定相中,使其与溶质离子结合形成离子对化合物,从而控制溶质离子的保留行为。(6)离子色谱法

离子色谱是目前唯一能获得快速、灵敏、准确和多组分分析效果的方法,因而受广泛重视并得到迅速的发展。检测手段已扩展到电导检测器之外的其它类型的检测器,如电化学检测器,紫外光度检测器等。可分析的离子正在增多,从无机和有机阴离子至金属阳离子,从有机阳离子到糖类、氨基酸等均可用离子色谱法进行分析。

(7)空间排阻色谱

空间排阻色谱以凝胶为固定相,它的分离机理与其它色谱完全不同。它类似于分子筛的作用,但凝胶的孔径比分子筛要大得多,一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来分离,而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流体力学体积或分子大小有关。

(8)凝肤色谱法

凝胶是一种多孔性的高分子聚合体,表面布满孔隙,能被流动相浸润,吸附性很小。凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

2.请简述高效液相色谱分析原理

(1)高效液相色谱分析的流程

由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统,然后输出,经流量与压力测量之后,导入进样器。被测物由进样器注入,并随流动相通过色谱柱,在柱上进行分离后进入检测器,检测信号由数据处理设备采集与处理,并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。这和气相色谱的程序升温类似,不同的是气相色谱改变温度,而HPLC改变的是流动相极性,使样品各组分在最佳条件下得以分离。

(2)高效液相色谱的分离过程

同其他色谱过程一样,HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

开始样品加在柱头上,假设样品中含有3个组分A,B和C,随流动相一起进入色谱柱,开始在固定相和流动相之间进行分配。分配系数小的组分A不易被固定相阻留,较早地流出色谱柱。分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长,较晚流出色谱柱。组分B的分配系数介于A,C之间,第二个流出色谱柱。若一个含有多个组分的混合物进入系统,则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱,达到分离之目的。

不同组分在色谱过程中的分离情况,首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异,这是热力学平衡问题,也是分离的首要条件。其次,当不同组分在色谱柱中运动时,谱带随柱长展宽,分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱

的填充情况以及流动相的流速等有关。所以分离最终效果则是热力学与动力学两方面的综合效益。

3.关于谱图的问题

(1)造成峰拖尾的原因是什么,如何消除?

答:a.筛板阻塞;消除方法:反冲色谱柱、更换进口筛板

b.色谱柱塌陷;消除方法:填充色谱柱

c.有干扰物质的存在;消除方法:使用更长的色谱柱、改变流动相或更换色谱柱

e.流动相PH值不合适;消除方法:调整PH值,对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰

f.样品与填料表面的溶化点发生反应;消除方法:加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂或更改色谱柱

(2)造成峰分叉的原因是什么,如何消除?

答:保护柱或分析柱污染;取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。样品溶剂不溶于流动相;改变样品溶剂,如果可能采取流动相作为样品溶剂。

六实验总结

本实验采用高效液相色谱法对样品烟酸乙酯和水杨酸甲酯进行定量分析,两者分离分析的效果好,说明高效液相色谱法可用于定量分离和分析不易挥发有机化合物。

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