带来了困难。因此临床上应给予足够的重视:一方面要紧密结合实验室药敏试验结果,合理选用抗生素;另一方面临床实验室和医院感染管理部门要注意监控感染病原菌和质粒动态,及时切断传播途径,减小医院感染的流行和暴发。
作者简介:李从荣(1969-),女,副教授,硕士生导师,研究方向:细菌耐药机制的研究。参考文献:
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(收稿日期:2006-05-31)
3通讯作者
文章编号:1007-4287(2007)05-0613-06
两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠
埃希菌生物被膜厚度的影响
严 岩1,2,李 彤1,刘树林13
(1.北京大学医学部病原生物学系,北京100083;2.北京大学第一医院检验科)
摘要:目的 探讨营养成分不同的两种培养基对临床分离的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌形成生物被膜形态的影响。方法 使用电击转化将pS MC21转入临床分离的3株铜绿假单胞菌和3株大肠埃希菌体内,构建表达绿色荧光蛋白的菌株。在Luria 2Bertani (LB )和M9葡萄糖基础培养基中以盖玻片为支持表面,进行细菌生物被膜的连续培养。经过12天的培养周期,使用共聚焦激光扫描显微镜检测盖玻片上生物被膜的厚度。使用方差分析检验每个样本5个测量值的重复性,并用配对T 检验来分析同一株细菌在两种培养基中生物被膜的厚度变化。结果 pS MC21可以在6株临床分离株中稳定表达绿色荧光蛋白;每个样本5个测量值重复性好,其差异无统计学意义(P =0.46);大肠埃希菌在LB 和M9培养基中形成生物被膜平均厚度的差异无统计学意义(t =-0.42,P >0.7),而铜绿假单胞菌在LB 培养基中形成的生物被膜更厚,其差异有统计学意义(t =3.46,P <0.02)。结论 铜绿假单胞菌所形成生物被膜的平均厚度因培养基成分的不同而有显著差异,而大肠埃希菌所形成生物被膜的平均厚度则不受培养基成分不同的影响。
关键词:细菌生物被膜;绿色荧光蛋白;共聚焦激光扫描显微镜中图分类号:R372
文献标识码:A
E ffects of tw o culture media on the thickness of biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli Y AN Yan ,LI Tong ,LIU Shu 2lin.(Department o f Microbiology Peking Univer sity Health Science Center ,Beijing 100083,China )
Abstract :Objective T o study the effects of different levels of nutrient abundance on the thickness of biofilms formed by bacte 2ria.Methods Three G FP 2tagged clinical strains of P.aeruginosa and 3G FP 2tagged clinical strains of E.coli were constructed with the plasmid pS MC21,and bacterial biofilm culture was carried out for 12days.Thicknesses of biofilms in 144sam ples were measured with con focal laser scanning microscopy (C LS M )and analyzed by variance and pair T test.R esults pS MC21expressed green fluo 2rescent protein in all 6bacterial strains.In the cultures ,P.aeruginosa formed thicker biofilms with Luria 2Bertani (LB )than with M9(t =3.46,P <0.02),but no statistically significant differences were observed in the thickness of biofilms formed by E.coli in the tw o culture media (t =-0.42,P >0.7).Conclusion Thickness of biofilms was affected by the kinds of culture media for P.
aeruginosa but not for E.coli.
K ey w ords:Bacterial biofilm;G reen Fluorescent Protein;C on focal Laser Scanning M icroscopy
(Chin J Lab Diagn,2007,11:0613)
细菌生物被膜(Bacterial biofilm)是细菌粘附于物体或宿主细胞表面,与细菌代谢产物和外源物质共同构成的结构特异的生物群体[1-2]。越来越多的证据表明,一些细菌性感染疾病与细菌生物被膜有关[3-6]。例如,感染性肾结石、牙周炎、原发性心内膜炎及肺囊性纤维化均牵涉到细菌形成的生物被膜,在其治疗当中,使用常规化学药物疗效往往不显著。因此,对生物被膜生物学性状的研究至关重要,它有利于人们进一步理解生物被膜现象,以寻找切实可行的控制生物被膜相关感染的策略。
细菌生物被膜是细菌表现出的一种特殊的生长方式,是细菌自身和外界多种因素相互作用的结果。在研究生物被膜生长发育的过程中,人们通过显微镜直接观察发现,细菌生长的微环境中很多因素,例如营养成分[7]、代谢所需的碳源[8]、pH、渗透压以及流体切力等,都会影响细菌生物被膜的结构和形态。其中营养成分的作用尤为重要。丰富的营养物质是细菌形成生物被膜的物质基础,然而低营养状态也可以激活一些细菌基因的表达,启动生物被膜的发生[9]。当营养极度耗竭的时候,细菌会从生物被膜上脱落下来并寻找适合生存的新环境。当环境中碳源相同而浓度不同时,生物被膜结构不均一性的特征非常明显[10]。Heydorn观察到在一定浓度的枸橼酸钠基础培养基中四种假单胞菌可以形成形态不同的生物被膜[11],这些研究结果表明细菌生物被膜的结构是复杂多样的,需要建立不同的研究模型来反映在外界环境压力变化时细菌生物被膜各种生物学性状相应改变的真实情况。
目前,应用最广泛的细菌生物被膜的研究模型有改良R obbins装置(M odified R obbins Device, MRD)[12]和流室系统(Flow Chamber System)[13]。这两种方法都提供了稳定、流动的营养条件,样本检测前处理步骤少,有利于生物被膜形态学的观察,但是仪器成本高和一次研究菌株数量少也限制了方法的使用范围。
我们发现国外在研究生物被膜形成机制和结构特点时多采用实验室菌株和缺陷株,无论在种系发育还是在对环境压力的适应性方面它们与临床分离细菌都存在很大不同。因此,此前的实验数据无法完全反映导致感染的细菌生物被膜的真实特征。然而临床分离细菌生物学性状的多样性可能影响到结果的重复性,所以使用批量培养及适当的统计方法来减少实验中出现的偶然因素是一个不错的选择。本实验使用细胞培养板建立了一个简易模型,利用共聚焦激光扫描显微镜检测表达绿色荧光蛋白的细菌在盖玻片上形成生物被膜的厚度,比较从临床分离的大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudom onas aeruginosa,P.aeruginosa)在Luri2 a2Bertani(LB)和M9培养基中形成生物被膜厚度的变化,并探讨这种变化的内在规律,为寻找控制细菌生物被膜感染策略提供数据准备。
1 材料与方法
1.1 细菌与质粒
1.1.1 细菌:6株临床分离细菌分离于北大医院住院病人的送检标本,包括:P.aeruginosa17207,P. aeruginosa30212,P.aeruginosa20133,E.coli18641,
E.coli18746和 E.coli18751。
1.1.2 质粒:携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,G FP)编码基因,有氨苄西林、卡那霉素双抗性的pS MC21[14],由美国波士顿麻省总医院E liana Drenkard博士馈赠。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1 培养基和抗生素:LB培养基、LB琼脂(北京陆桥技术有限责任公司);M9基础培养基按照《分子克隆实验指南第三版》中相关方法配置;氨苄西林、卡那霉素(华北制药股份有限公司)。
1.2.2 细胞培养板和盖玻片:北京欣隆福医药销售有限公司。
1.2.3 电击转化仪:Micr oPulser T M(BioRad,https://www.doczj.com/doc/4710751585.html, A)。
1.2.4 共聚焦激光扫描显微镜(C on focal Laser S canning M icr osc opy,C LS M):T C S NT(LEI C A,Inc.G E R M A NY)。
1.2.5 V ITEK2AMS自动细菌鉴定系统:VITEK32 (bioMérieux Vitek,https://www.doczj.com/doc/4710751585.html, A)。
1.2.6 倒置荧光显微镜(E piFluorescence Mi2 croscopy):O LY MPUS XC60,JAPAN。
1.3 方法
1.3.1 标记GFP实验菌株的构建
根据《分子克隆实验指南第三版》所述 E.coli 电击转化方案构建标记荧光的细菌。基本实验过程如下:使用预冷的10%甘油多次洗涤细菌制备感受态细菌,加入适量pS MC21轻轻混匀,所有菌株使用电转仪预设的E.coli电转条件,脉冲后加入1ml LB
培养基于37℃振荡(100r/min)培养90min,通过接种含抗生素的LB琼脂平板和荧光显微镜观察筛选表达G FP的转化子。
1.3.2 标记GFP菌株主要生物学性状和表达G FP 稳定性的检测
使用VITEK32对标记G FP菌株和未标记G FP的亲代菌株分别进行细菌鉴定和药物敏感试验,了解荧光蛋白的表达对细菌生物学性状的影响;将标记G FP 菌株在LB和M9培养基中连续传代(最多30代),LB 琼脂平板上传代的菌落置室温(最多两周)保存,在荧光显微镜下观察所有菌株G FP表达的变化。
1.3.3 标记GFP菌株浮游状态生长曲线的绘制
用新鲜实验菌株配置0.5麦氏浊度菌悬液,取100μl菌悬液加入到50ml LB或M9培养基中混匀, 37℃振荡(100r/min)培养。在指定时间检测菌悬液OD600,以吸光度值2培养时间绘制细菌生长曲线。
1.3.4 细菌生物被膜的培养
向24孔细胞培养板每个反应孔中加入2ml培养基(LB或M9),并加入1片灭菌盖玻片(1.0×1.0 cm2)和200μl稀释好细菌悬液(终浓度为2×105 cfu/ml)混匀,37℃培养。每块培养板设1个阴性对照孔(不加入菌悬液),每24h更换1次培养液(吸去1ml菌悬液,加入1ml相应培养基)[15]。
1.3.5 样本接种及检测前处理
采取分别接种集中收获的方法。每株细菌每天接种两个反应孔(1孔为LB培养基,1孔为M9培养基),连续接种12天[16]。培养结束后,取出有生物被膜生长的盖玻片,用0.9%无菌生理盐水轻轻洗涤两次,吸掉多余水分,将盖玻片置于洁净载玻片上并滴加1滴2%甘油,其上覆盖稍大的盖玻片,以指甲油封片。
1.3.6 C LS M和图像采集
考虑到实验结果和图像的可重复性,我们关注几个参数:激光功率、pinh ole值、增益值(P MT),整个实验过程尽量保持一致。扫描图像与镜下图像尽可能接近。所有检测由同一人完成。每个样本随机采集5个荧光最强的视野,记录Z轴结果并保存扫描图像。1.3.7 统计学分析
使用S AS8.0分析软件对测定的生物被膜厚度进行统计学分析,以Z轴结果为变量,同一样本重复测量为影响因素,进行单变量方差分析。对同一株细菌在LB培养基和M9培养基中形成细菌生物被膜厚度结果进行配对T检验。
2 结果
2.1 成功构建标记GFP的菌株
使用电击转化和抗生素平板筛选方法,得到表达G FP的转化子,并且G FP表达稳定,如图1。细菌鉴定和药敏试验结果表明:转化子和亲代菌株主要生化试验和药敏结果(氨苄西林除外)完全一致,可见G FP的表达没有影响细菌的主要生物学性状
。
A:细菌培养24小时;B:细菌培养2周;400×
图1 在LB琼脂平板上E.coli18746/GFP培养物于荧光显微镜下图像
2.2 标记GFP的菌株浮游生长状态的生长特点
如图2、图3所示:经过20h培养,6株细菌在两
种液体培养基中的生长曲线都可以分为3个时相—
延迟期、对数生长期、稳定期。延迟期时间与营养条
件有关,与细菌种类关系不大。12条生长曲线差异
最大的部分是在对数生长期,由于对数生长期曲线
斜率反映细菌生长速度,因此在对数生长期内 E.
coli在LB培养基中的生长速度大于其在M9培养基
中的生长速度;P.aeruginosa的情况大致相同。经
过20h培养,所有细菌都进入稳定期,E.coli在两
种培养基中的OD600值表明两种培养基中细菌数量
接近;而P.aeruginosa OD600值表明两种培养基中细
菌数量存在明显差异,LB培养基中细菌数量多。由
此可见,两种培养基对不同细菌浮游状态的生长速
度和细菌数量的影响是不同的
。
图2 3株P.aeruginosa 在LB 和M9培养基中浮游状态生长曲线
于培养时间为0,1.5,3,4,6,8,10,12,14,16,20h 检测菌悬液的OD 600。根据培养基的不同,6条曲线大致分为两组,上面3条曲线为3株P.aeruginosa 在LB 培养基中的生长曲线,下面3条曲线为
3株P.aeruginosa 在M9
培养基中的生长曲线
图3 3株 E.coli 在LB 和M9培养基中浮游状态生长曲线
于培养时间为0,1.5,3,4,6,8,10,12,14,16,20h 检测菌悬液的OD 600。根据培养基的不同,6条曲线大致分为两组,上面3条曲线为3株E.coli 在LB 培养基中的生长曲线,下面3条曲线为3株E.coli 在M9培养基中的生长曲线
2.3 标记GFP 菌株生物被膜的生长状态的特点
在本次实验12天的培养周期中,6株细菌在玻璃表面均形成了生物被膜。对所有生物被膜厚度检测值进行方差分析,结果显示:每个样本的5个测定值之间差异无统计学意义(P =0.46),因此我们将它们取算术平均值作为该样本生物被膜的平均厚
度,从而得到表1和表2。根据表1和表2的结果,我们发现6株实验菌株形成的生物被膜平均厚度在
12天培养期间的变化呈现一种非线性、阶梯状的改变。6株细菌生物被膜厚度达到最大值的时间为9-12天,意味着这个阶段为生物被膜成熟时期。
表1 C LSM 检测P.aeruginosa 生物被膜平均厚度(μm)
时间(天)
LB
P.aeruginosa17207
P.aeruginosa30212
P.aeruginosa20133
M9
P.aeruginosa17207
P.aeruginosa30212
P.aeruginosa20133
17.047.30 5.58 6.60 6.26 6.9228.008.447.887.288.087.9439.309.129.708.409.268.52410.369.528.929.809.469.16510.4810.9610.1610.429.649.56612.2212.6413.2612.649.489.96712.0211.8615.4413.3410.0410.10813.2012.8016.9414.609.4611.96913.1614.4020.8016.4612.3013.201014.2616.8417.5617.2613.9613.041117.6818.1015.7617.8412.6813.2812
21.74
17.02
14.72
17.72
12.04
12.82
表2 C LSM检测E.coli生物被膜平均厚度(μm)
时间(天)
LB
E.coli18641 E.coli18746 E.coli18751
M9
E.coli18641 E.coli18746 E.coli18751
1 6.087.08 6.747.488.66 6.20
2 6.588.627.228.129.887.84 38.208.468.128.2810.247.72 48.608.749.249.4211.489.10 59.8810.389.6810.4811.4410.10 610.3811.309.7610.6612.3410.14 711.5013.2810.3412.7212.6410.32 812.4015.5210.2214.5412.9412.10 912.7215.1613.1015.5413.0414.32 1013.4616.2814.6015.8615.0014.92 1115.4018.2813.9616.6815.8815.72 1214.6016.6412.5015.2617.1214.34
2.4 两种培养基对 E.coli和P.aeruginosa生物被膜平均厚度的影响
通过对6株细菌生物被膜平均厚度的比较,我们发现3株 E.coli在LB培养基中的最大值都小于它们在M9培养基中的最大值,对应的培养时间前者也短于后者。将 E.coli在LB培养基和M9培养基中生物被膜平均厚度进行配对T检验,统计结果表明 E.coli在这两种培养基中形成的生物被膜厚度的差异无统计学意义(t=-0.42,P>0.7),也就是说 E.coli在LB培养基和M9培养基中生物被膜平均厚度没有差异。然而3株P.aeruginosa在LB 培养基中的最大值都大于它们在M9培养基中的最大值,对应的培养时间前者也长于后者。将P. aeruginosa在LB培养基和M9培养基中生物被膜平均厚度进行配对T检验,统计结果显示P.aerugi2 nosa在这两种培养基中形成生物被膜厚度的差异有统计学意义(t=3.46,0.01 3 讨论 尽管细菌生物被膜在自然界中存在非常广泛,但是人们对它的了解却十分有限。近些年,C LS M 在细菌生物被膜结构功能研究中的应用,使人们可以直接观察体外生物被膜的真实结构。G FP是C LS M最常用的示踪分子,它的编码基因是从水母体内一种发光蛋白克隆而来[17]。本次实验使用的pS MC21能够在细菌周质间隙表达G FP,而且未造成细菌主要生物性状的改变,适合体外生物被膜连续培养试验的要求。 我们详细记录了6株临床分离细菌在LB培养基和M9培养基中形成生物被膜的厚度。在12天的培养期间,细菌生物被膜平均厚度在5-20μm之间。这一结果同之前一些国外学者的研究数据相比有很大差异。例如,Davies等[18]报道P.aeruginosa 在流室系统中生物被膜厚度达到近100μm;Stewart 等[19]描述使用流室系统培养P.aeruginosa,在葡萄糖基础培养基中生物被膜厚度为13-60μm。我们认为,这些实验结果的差异主要是培养基成分不同造成的。本次实验我们使用的M9培养基是一种葡萄糖基础培养基,葡萄糖是其唯一碳源,含量为0.4%,为细菌生物被膜的生长提供一种低营养环境;LB培养基是细菌培养常用的培养基,含有蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖,为细菌生物被膜生长提供一种高营养环境。我们实验目的是了解实验菌株在这两种营养条件下形成生物被膜厚度的规律。 实验结果表明,3株P.aeruginosa在培养的前5天于LB培养基和M9培养基中形成生物被膜的厚度十分接近,而且结果都小于10μm。通过细菌浮游生长试验,我们知道P.aeruginosa在LB培养基中的数量远远超过其在M9培养基中的数量,这说明在生物被膜形成的初始阶段,培养基中细菌数量对细菌粘附的影响不是主要的,细菌表面结构可能起重要作用。O’T oole等[20]认为革兰阴性菌的鞭毛和Ⅳ型菌毛在细菌粘附及生物被膜形成初始阶段起关键作用。随着培养时间的延长,3株P.aeruginosa 在LB培养基和M9培养基中形成生物被膜的厚度出现差异,对P.aeruginosa整个培养期间检测结果进行配对T检验,发现结果差异有统计学意义。如果不考虑前5天的结果,差异会更显著。与P. aeruginosa相比,3株 E.coli在LB培养基和M9培养基中生物被膜厚度的差异相对较小,配对T检验证实这种差异无统计学意义,也就是说这种差异可 能有一定的偶然性。由于在浮游细菌生长试验中我们发现稳定期E.coli在两种培养基中数量相当,因此生物被膜培养期间,3株 E.coli所处的环境压力(氧分压、pH、渗透压等)基本一致。从这个角度上讲,环境压力是细菌生物被膜结构变化的重要影响因素。通过对整个实验结果的分析,我们认为营养(培养基成分)对 E.coli和P.aeruginosa生物被膜结构的作用效果是不同的。就P.aeruginosa而言,可以用营养来解释LB培养基和M9培养基中生物被膜厚度的差异;E.coli在本实验中生物被膜厚度的不同与LB培养基和M9培养基的选择无关,可能是实验操作(室温操作时间、细胞培养板密封程度和视野选择等)造成的。总而言之,与P.aeruginosa相比,无论是浮游状态还是生物被膜 E.coli在LB培养基和M9培养基中都表现出比较稳定的生长能力。最近有文献提出使用生物方法包被尿管预防尿管相关感染的观点,为控制细菌生物被膜感染提供了一种新思路,这要求我们掌握不同细菌生物被膜的生物学性状,为包被菌种的选择提供数据支持。 生物被膜被认为是微生物发育的一种特殊方式[18],有完整的生长周期。本实验记录每天生物被膜的厚度,以期了解其结构与时间的关系,这一点是非常重要的。临床分离株的使用,为验证前人的研究结果并评价其应用价值提供了可能。尽管我们实验中的培养系统能够完成生物被膜培养和厚度的检测,但是仍然存在有待完善之处。例如,pS MC21的抗性使实验菌株的选择非常有限,因此构建合适的质粒增加实验菌株(包括多重耐药菌株)的范围,是眼下当务之急;进一步增加实验菌株数量可以使统计结果更真实可靠。生物被膜的生长发育受多种因素影响,它们可以单独或相互作用影响生物被膜结构,目前的实验多是针对一种因素设计的。我们认为各种因素交互作用的研究是今后生物被膜结构变化研究中重要的组成部分。 参考文献: [1]D onlan RM.Biofilms:M icrobial life on surfaces[J].Emerging in fectious disease,2002,8(9):881. 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(收稿日期:2006-04-20) 铜绿假单胞菌生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌，它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性支气管炎常见，分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。 罕见情况下该菌可引起心内膜炎,通常发生于心脏直视手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜上。右侧心内膜炎用内科治疗,但为根治累及二尖瓣,主动脉瓣或人工瓣膜的感染,通常必须将感染的瓣膜切除。 二、细菌的生物学特性 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属，是一种非发酵革兰阴性菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。本菌生长温度范围25~42℃，最适生长温度为35℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。需氧生长，在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素。在血平板上会溶血。 该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：一种是其外膜蛋白，为保护性抗原；另一种是脂多糖，有特异性。O抗原可用以分型。 细菌的实验室检查及其它检查 1.标本采集采自不同感染部位的各种标本，包括血液、尿液、痰标本、脓汁、穿刺液等。还包括来自医院环境中的各种标本如水、空气、物体表面采样等。 2.染色镜检为革兰阴性菌，菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛。 3.分离培养对有正常菌群存在的临床标本或采自环境中的标本应接种选择性培养基如MAC； 铜绿假单胞菌感染 百科名片 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)在自然界分布广泛，对人类而言，属于条件致病菌。长期应用激素、免疫抑制剂，进行肿瘤化疗、放射治疗等导致病人免疫功能低下，以及手术后或某些治疗操作后(气管切开、保留导尿管等)的病人易导致本菌感染，故认为该菌为医院内感染的重要病原菌之一。 [编辑本段]病原 铜绿假单胞菌是假单胞菌属的代表菌种，在琼脂平板上能产生蓝绿色绿脓素，感染伤口时形成绿色脓液。本菌为无荚膜、无芽胞、能运动的革兰阴性菌，形态不一，成对排列或短链状，为专性需氧菌，最适宜生长温度为370C，致病性铜绿假单胞菌在420C 时仍能生长，据此可与荧光假单胞菌等进行鉴别，本菌生长对营养要求不高。菌体0抗原有两种成分，一为内毒素蛋白，是一种保护性抗原，另一为酯多糖，具有特异性，根据其结构可将铜绿假单胞菌分成12个血清型，此外还可利用噬菌体或铜绿假单胞菌素分型。铜绿假单胞菌对外界环境抵抗力较强，在潮湿处能长期生存，对紫外 线不敏感，湿热550C 1小时才被杀灭。 [编辑本段]流性病学 正常人皮肤，尤其潮湿部位如腋下、会阴部及耳道内，呼吸道和肠道均有该菌存在，但分离率较低。铜绿假单胞菌感染常在医院内发生，医院内多种设备及器械上均曾分离到本菌，通过各种途径传播给病人、病人与病人的接触也为传播途径之一。除院内感染外，铜绿假单胞菌还可引起与医院环境无关的感染，近年来对此已有更多的认识，它已成为足穿刺感染、心内膜炎、滥用药物所致的骨髓炎、眼部感染、新生儿感染性外耳炎、游泳池等引起的皮肤病的主要病原菌，亦是战伤感染的常见致病 菌。 [编辑本段]发病机制 铜绿假单胞菌的多种产物有致病性，其内毒素则在发病上无重要意义。其分泌的外毒素A(PEA)是最重要的致病、致死性物质，进入敏感细胞后被活化而发挥毒性作用，使哺乳动物的蛋白合成受阻并引起组织坏死，造成局部或全身疾病过程。动物模型表明：给动物注射外毒素A后可出现肝细胞坏死、肺出血、肾坏死及休克等，如果注射外毒素A抗体则对铜绿假单胞菌感染有保护作用。铜绿假单胞菌尚能产生蛋白酶，有外毒素A及弹性蛋白酶同时存在时则毒力最大;胞外酶S是铜绿假单胞菌所产生的一 铜绿假单胞菌感染治疗策略 铜绿假单胞菌作为一种条件致病菌常定植于正常人的呼吸道,皮肤粘膜以及医疗设备等处。当患者免疫力低下,长期使用广谱抗生素,糖皮质激素及接受吸氧、气管插管机械通气时,铜绿假单胞菌大量繁殖,往往导致严重下呼吸道感染。因为铜绿假单胞菌的耐药及复发率高,故临床治疗较为困难。为更好地预防和控制医院感染，建议应采取以预防为主，加强对铜绿假单胞菌的耐药性监测，及早进行菌株鉴定和药敏检测，避免大量和长期使用同一类型的抗菌药物，并规范抗菌药物的应用，具体措施如下： 一、阻断病原菌播散 医院加强对高危患者的病原菌监测，尤其将下列患者列为目标监测的重点：住在ICU、接受过广谱抗菌药物治疗或抗菌药物治疗效果不佳的患者，留置各种导管以及合并慢性基础疾病的患者。对目标监测患者进行主动筛查和定期监测，及时发现、早期诊断铜绿假单胞菌感染与定植患者。如：患者的呼吸道长期定植铜绿假单胞菌，到多家医院就诊导致其克隆传播，致使不同医院间存在同一克隆株的PA,因此，加强对铜绿假单胞菌定植患者的监控，是控制克隆株播散的关键。有文献报导PA克隆朱主要在ICU病房流行，原因可能为ICU住院患者病情重、自身免疫力低下，多接受过侵入性治疗，因此，加强病区（尤其是重点科室）的消毒、隔离和监控工作，阻断外源性传播媒介，是有效控耐药PA在医院感染发生和流行的重要途径。 二、加强监测抗铜绿假单胞菌的药物及其敏感性 目前可用于治疗铜绿假单胞菌感染的药物基本有六类：青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类，氨基糖苷类和喹诺酮类，另外多黏菌素类(如黏菌素，多黏菌素B)以及磺胺类(甲磺灭脓、磺胺嘧啶银)主要用于铜绿假单胞菌的局部感染的治疗。多黏菌素B也用于难治性的铜绿假单胞菌感染的全身治疗。2011年中国C H IN E T铜绿假单胞菌耐药性监测显示铜绿假单胞菌对阿米卡星的耐 药率最低，为14．3%，对头孢哌酮和氨曲南的耐药率最高，分别为31.7%和38.9%，对其他抗菌药物的耐药率为19～30%，耐药率从低到高依次为：阿米卡星<头孢吡肟<头孢他啶<头孢哌酮一舒巴坦<环丙沙星<哌拉西林一他唑巴坦<庆大霉素<美罗培南<亚胺培南<哌拉 西林<头孢哌酮<氨曲南。 （1）青霉素类药物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、美洛西林、替卡西林、替卡西林／克拉维酸，其中以哌拉西林最常用于铜绿假单胞菌导致的肺部感染。 （2）头孢菌素类药物包括头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢匹胺是铜绿假单胞菌的敏感药物。头孢他啶是目前针对铜绿假单胞菌作用最强的药物，头孢吡肟对铜绿假单胞菌的作用与头孢他啶相似，头孢哌酮对铜绿假单胞菌有良好的抗菌作用，可用于铜绿假单胞菌感染的联合治疗用药，头孢匹胺对铜绿假单胞菌的作用与头孢哌酮和哌拉西林相似或略优。 （3）碳毒霉烯类药物该类药物抗菌谱特别广，抗菌活性强。治疗PA感染应首选敏感药物碳青霉烯类，并且初始剂量宜大，以增强其 铜绿假单胞菌 的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌，它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人，它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性支气管炎常见，分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。 铜绿假单胞菌的生物危害评估报告 一、细菌的传播与致病 假单胞菌普遍存在,而在潮湿环境尤甚。铜绿假单胞菌是存在于人类中最常见的一种假单胞菌,它偶尔可在腋下和肛门生殖道周围的正常皮肤,但除非给服抗生素,在粪中甚为罕见。该菌通常伴随毒力较强的细菌存在于病灶中,但偶尔也可单独引起暴露于外部的组织感染.假单胞菌感染通常发生于医院内。洗涤槽,防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。通过医护人员可将病菌传给病人,特别在灼伤和新生儿重症监护室.是重要的医院内病原菌。 铜绿假单胞菌引起的很多感染发生在衰弱或免疫受损的住院病人,它是重症监护室感染的第二位最常见的病原菌,是换气机相关性肺炎的常见原因。除医院内获得感染外,HIV感染者很容易在社区获得该菌的感染,而且一旦被铜绿假单胞菌感染,常可出现晚期HIV感 染的体征。 铜绿假单胞菌感染可发生于很多解剖部位,包括皮肤,皮下组织,骨,耳,眼,尿 路和心脏瓣膜。感染部位与细菌的入口及病人的易感性有关。烧伤时,焦痂下区域可成为大量细菌侵犯的场所,进而成为引起菌血症的病灶,而菌血症常是烧伤的致死性并发症。 本菌所致感染的临床表现取决于受累部位。在住院病人中,若口咽部有绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌共同繁殖,则气管插管,气管 1 切开或间歇性正压呼吸可引起肺部感染。囊性纤维病的后期铜绿假单胞菌性 支气管炎常见,分离得到的菌株有粘液状菌落的形态学特征。烧伤伴有恶性肿瘤的 病人常见在其血液中分离出该菌株,临床表现为革兰氏阴性败血症,有时出现坏疽性深部脓疱,其特征为直径约1cm 的紫黑色病变,中央区溃疡,四周为红斑。这种病变最常见于腋下和肛门生殖 器部位。该菌还是 尿路感染的常见病原菌,特别常见于有过泌尿科操作的病人,尿 路梗阻的病人或接受广谱抗生素的病人。 热带气候条件下常见的外耳炎流脓是耳部铜绿假单胞菌感染最 常见的临床类型。糖尿病患者可发生更为严重的恶性外耳炎,表现为严重耳痛常伴有单侧颅神经麻痹,需要肠外给药治疗。绿脓杆菌眼部感染一般表现为角膜溃疡,最多见于外伤之后,但有些病人也可因角膜接触镜片或镜片液体污染而感染。引流的窦道,特别在足部外伤或深部穿刺伤后,可发现该菌菌。引流物常有汗味和果味.这种穿刺伤有很多可引起铜绿假单胞菌性蜂窝织炎和骨髓炎,为此除抗生素外,还要早期外科扩创。 罕见情况下该菌可引起心内膜炎,通常发生于心脏直视手术所装的人工瓣膜或静脉吸毒者的自然瓣膜上。右侧心内膜炎用内科治疗,但为根治累及二尖瓣,主动脉瓣或人工瓣膜的感染,通常必须将感染的瓣膜切除。 二、细菌的生物学特性 铜绿假单胞菌属于假单胞菌属,是一种非发酵革兰阴性菌,菌体细长且长短不一,有时呈球杆状或线状,成对或短链状排列。菌体的一端有一根鞭毛,在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。本菌生长温度范围25~42℃,最适生 长温度为35℃,特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。需氧生长,在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素。在血平板上会溶血。 一、改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜体外模型 （扫描电镜观察） 1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释 2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次 3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌 4、2.5%戊二醛预固定2小时（戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。） 5、0.1mol/LPBS漂洗三次，再用1%锇酸固定2小时（经锇酸固定后，又能防止用酒精脱水时所产生的沉淀作用。也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂） 6、40-100%系列浓度酒精脱水（1、酒精可以置换组织内的水，最终脱水用的是无水乙醇。高浓度的酒精（95%以上）对细菌有强烈的收缩和脆化的缺点，因此洗后不能立即投入高浓度酒精中。脱水时为了避免细菌萎缩、僵硬，应在不同浓度的酒精里逐渐脱水。2、如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，这时细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好的深入细菌内部） 7醋酸乙戊酯置换（醋酸乙戊酯的极性较弱,临界点干燥时可以更好的与co2置换,从而更加完整的保持生物样品的表面形态.） 8将盖玻片装入样品盒中置HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时（扫描电镜在观察样品要求在高真空中进行。无论是水还是脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈的汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构，因此，样品在用电镜观察前必须要干燥。 ） 9喷金三分钟，电镜扫描（生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。） 二、激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜 1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释 2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次 3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌 带来了困难。因此临床上应给予足够的重视:一方面要紧密结合实验室药敏试验结果,合理选用抗生素;另一方面临床实验室和医院感染管理部门要注意监控感染病原菌和质粒动态,及时切断传播途径,减小医院感染的流行和暴发。 作者简介:李从荣(1969-),女,副教授,硕士生导师,研究方向:细菌耐药机制的研究。参考文献: [1]牟立东,张立平.产超广谱β内酰胺酶细菌的检测及耐药性分析[J ].中国现代应用药学杂志,2005,1(22):77. 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(收稿日期:2006-05-31) 3通讯作者 文章编号:1007-4287(2007)05-0613-06 两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠 埃希菌生物被膜厚度的影响 严 岩1,2,李 彤1,刘树林13 (1.北京大学医学部病原生物学系,北京100083;2.北京大学第一医院检验科) 摘要:目的 探讨营养成分不同的两种培养基对临床分离的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌形成生物被膜形态的影响。方法 使用电击转化将pS MC21转入临床分离的3株铜绿假单胞菌和3株大肠埃希菌体内,构建表达绿色荧光蛋白的菌株。在Luria 2Bertani (LB )和M9葡萄糖基础培养基中以盖玻片为支持表面,进行细菌生物被膜的连续培养。经过12天的培养周期,使用共聚焦激光扫描显微镜检测盖玻片上生物被膜的厚度。使用方差分析检验每个样本5个测量值的重复性,并用配对T 检验来分析同一株细菌在两种培养基中生物被膜的厚度变化。结果 pS MC21可以在6株临床分离株中稳定表达绿色荧光蛋白;每个样本5个测量值重复性好,其差异无统计学意义(P =0.46);大肠埃希菌在LB 和M9培养基中形成生物被膜平均厚度的差异无统计学意义(t =-0.42,P >0.7),而铜绿假单胞菌在LB 培养基中形成的生物被膜更厚,其差异有统计学意义(t =3.46,P <0.02)。结论 铜绿假单胞菌所形成生物被膜的平均厚度因培养基成分的不同而有显著差异,而大肠埃希菌所形成生物被膜的平均厚度则不受培养基成分不同的影响。 关键词:细菌生物被膜;绿色荧光蛋白;共聚焦激光扫描显微镜中图分类号:R372 文献标识码:A E ffects of tw o culture media on the thickness of biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli Y AN Yan ,LI Tong ,LIU Shu 2lin.(Department o f Microbiology Peking Univer sity Health Science Center ,Beijing 100083,China ) Abstract :Objective T o study the effects of different levels of nutrient abundance on the thickness of biofilms formed by bacte 2ria.Methods Three G FP 2tagged clinical strains of P.aeruginosa and 3G FP 2tagged clinical strains of E.coli were constructed with the plasmid pS MC21,and bacterial biofilm culture was carried out for 12days.Thicknesses of biofilms in 144sam ples were measured with con focal laser scanning microscopy (C LS M )and analyzed by variance and pair T test.R esults pS MC21expressed green fluo 2rescent protein in all 6bacterial strains.In the cultures ,P.aeruginosa formed thicker biofilms with Luria 2Bertani (LB )than with M9(t =3.46,P <0.02),but no statistically significant differences were observed in the thickness of biofilms formed by E.coli in the tw o culture media (t =-0.42,P >0.7).Conclusion Thickness of biofilms was affected by the kinds of culture media for P. 保健用品微生物检验方法 第3部分：铜绿假单胞菌测定 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了保健用品中微生物中铜绿假单胞菌的测定方法。 本标准适用于生产和经营的保健用品中的铜绿假单胞菌测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa 属于假单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素。此外还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42 ℃±1 ℃条件下能生长。 4 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯 。实验用水符合GB/T 6682中二级水的要求。 4.1 灭菌生理盐水:详见附录A.1。 4.2 灭菌液体石蜡:详见附录A.2。 4.3 灭菌吐温-80:详见附录A.3。 4.4 SCDLP:详见附录A.4。 4.5 十六烷基三甲基溴化铵:详见附录A.5。 4.6 乙酰胺:详见附录A.6。 4.7 革兰氏染液:详见附录A.7。 4.8 绿脓菌素测定培养基:详见附录A.8。 4.9 硝酸盐蛋白胨水:详见附录A.9。 4.10 明胶液化培养基:详见附录A.10。 5 仪器和设备 5.1 天平：感量0.1 g。 5.2 灭菌刻度吸管:10 mL、5 mL、1 mL。 5.3 高压灭菌器。 5.4 量筒：100 mL、200 mL、2000 mL。 5.5 恒温水浴箱或隔水式恒温箱:44.5 ℃±0.5 ℃。 5.6 无菌锥形瓶：100 mL、200 mL、250 mL、2000 mL。 5.7 研钵。 5.8 振荡器。 5.9 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃、42 ℃±1 ℃、28 ℃±2 ℃。 5.10 接种针、接种环。 5.11 显微镜。 5.12 小倒管。 5.13 玻璃棒。 5.14 冰箱：2 ℃～5 ℃。 6 样品 6.1 样品的采集 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批保健用品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应从不少于2 个包装单位的取样中共取10 g(5.1)或10 mL(5.2)。包装量小于20 g的样品，采样时可适量增加样品包装数量。 6.2 注意事项 6.2.1 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。 6.2.2 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴凉干燥处，不要冷藏或冷冻。 6.2.3 若只有一个样品而同时需做多种分析，如微生物、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做微生物检验，再将剩余样品做其它分析。 6.2.4 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应事先灭菌(5.3)，全部操作应在符合生物安全要求的实验室中进行。 6.2.5 如检出铜绿假单胞菌，自报告发出之日起该菌种应保存一个月。 6.3 样品的制备 6.3.1 液体样品 水溶性液体样品，用灭菌吸管吸取10 mL加到90 mL（5.4）灭菌生理盐水（4.1）中，混匀后，制成1:10匀液。 油性液体样品，取样品10 g，先加5 mL 灭菌液体石蜡（4.2）混匀，再加10 mL灭菌的吐温-80，在 40 ℃～44 ℃水浴中（5.5）振荡混合10 min，加入灭菌的生理盐水75 mL（在40 ℃～44 ℃水浴中预温），在40 ℃～44 ℃水浴中乳化，制成1:10的悬液。 一例支气管扩张继发感染铜绿假单胞菌治疗分析 一、病史简介 患者，男性，84岁，身高177cm，体重79kg，因“慢性咳嗽、咳痰、喘息30年，加重半月”入院。现病史：患者30年前无明显诱因出现慢性咳嗽、咳痰、以黄脓痰为主，伴喘息，活动后明显。病情反复发作，逐年加重，治疗期间给予喹诺酮类、头孢类药物等进行抗感染治疗。半月前，患者无明显诱因出现咳嗽、咳黄痰、痰量多、伴喘息加重，活动后明显，门诊以“支气管扩张继发性感染”收入我院。既往有慢支、肺气肿、肺心病、支气管扩张、骨质疏松症病史。否认肝炎、结核病等传染病史，否认高血压、糖尿病史，否认药物过敏史。体格检查：体温36.3℃，脉搏95次/分，呼吸22次/分，血压121/87mmHg，神清语明，查体合作。咽无充血、红肿，扁桃体无肿大，桶状胸，双肺听诊呼吸音粗糙，双肺闻及广泛干啰音。辅助检查：血常规：白细胞11.59×10?/L；中性粒细胞百分比：78.5%；C-反应蛋白：159mg/L；胸部CT平扫：1.左肺上叶陈旧性肺结核，2.双肺支气管扩张继发性感染。临床确定诊断为支气管扩张继发性感染、慢性支气管炎继发性感染、阻塞性肺气肿。 二、治疗经过 入院后完善相关检查，在化痰、平喘的同时给予抗感染治疗。初始治疗方案给予左氧氟沙星注射液500mg ivgtt qd。入院第4天，患者咳嗽、咳黄痰、痰量多且不易咳出、喘息症状无缓解，血常规：白细胞12.5×10?/L；中性粒细胞百分比：85.9%；C-反应蛋白：186mg/L。痰培养结果：铜绿假单胞菌。药敏结果：氨苄西林、氨苄西林/棒酸、阿莫西林/棒酸为耐药；左氧氟沙星、环丙沙星为中介；头孢他啶、阿米卡星、头孢哌酮/舒巴坦、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、妥布霉素、哌拉西林/他唑巴坦为敏感。经药师建议，停用左氧氟沙星，加用头孢哌酮舒巴坦 3.0g ivgtt bid，联合用硫酸依替米星 0.15g ivgtt qd。入院第7天，患者咳嗽、咳痰有所减轻，继续抗感染6天，患者述无痰，偶有咳嗽，喘息明显减轻。复查C-反应蛋白<3.71 mg/L,复查肺CT,炎症情况较入院前好转。入院第13天，患者病情平稳，要求出院。出院带药吸入用布地奈德福莫特罗粉吸入剂1盒，160μg 雾化吸入 bid。嘱患者每次吸完药后用水漱口，不要吞咽。 大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用 彭 程 肖永红 [摘要] 目的:研究大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的影响。方法:用高分子膜片制备铜绿假单胞菌生物膜,计数滤膜菌落与扫描电镜观察,观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜形成前后的影响及对已形成生物膜的清除作用。结果: 2mg/L阿奇霉素、2mg/L红霉素可抑制生物膜的形成,生物膜菌落计数由对照10.0×109cfu/cm2,分别降至1.9×103cfu/ cm2、5.0×103cfu/cm2。麦迪霉素作用不明显;单用阿奇霉素、红霉素及麦迪霉素不能清除已形成的生物膜,但阿奇霉素、红霉素与环丙沙星协同作用,可使已形成生物膜中细菌下降至0.9%～2.2%。电镜观察与上述结果一致。结论:红霉素、阿奇霉素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,增强环丙沙星对生物膜的渗透性,增强其杀灭生物膜内细菌的作用,清除生物膜;麦迪霉素对生物膜的形成及清除均无影响。 [关键词] 大环内酯类药物; 铜绿假单胞菌; 生物膜 中图分类号:R978.1+5 文献标识码:A 文章编号:1009-7708(2001)01-0007-03 Effects of macrolides on Pseudomonas aeru ginosa biofilms PENG Cheng,X IAO Yong-hong(Department of In fectious Diseases,the First A ffiliated Hospital, Chongqing U niversity of Medical Scienc es Chongqing 400016,China) [Abstract]Purpose:T o investig ate the effects of macrolides on Pseudomonasmol aeruginosa biofilms.Methods:Pseudomonas aerugi-nos a bio film was prepared using high malecular membrane,the number of colonies in biofilm were counted,then observed by scanning electron microscopy.Results:The number of colonies in biofilms w ere reduced from10×109cfu/cm2in co ntrolled biofilmm to1.9×103cfu/cm2treated with2mg/L azithromycin,and to5.0×103cfu/cm2treated with2mg/L ery thromycin.T he number of colonies in biofilms treated with azithromy cin,ery thromy cin or medemycin alone had no significant effect on biofilm,however w hen treated w ith azithromycin or erythromycin in combination with ciproflo xacin,the number of colonies decreased to0.9%-2.2%of the orig i-nal.N o sig nificant change was observed when medemycin combined with ciprofloxacin.Similar results were obtained when observed w ith scanning electron microcopy conclusions.C onclusions:T hese results indicate that azithromy cin and erythromycin can inhibit the formation of biofilm by P.aerugino sa;enhance the bactericidal actio n of ciproflox acin on bacteria within the bio film.M idecamycin has no such effect. [Key words] M acrolides; Ps eudomonas aeruginos a; Biofilm 生物膜(biofilm,BF)是一种膜样结构,是由细菌通过胞外多糖复合物或(和)纤毛共同作用粘附在生物材料或人体组织表面,不断分裂繁殖,分泌大量胞外多糖复合物(主要成分为藻酸盐)而共同形成的。由于BF内细菌代谢、繁殖缓慢,其对抗生素不敏感;BF基质胞外多糖通过吸附与机械阻滞抗生素分子进入BF;BF表层细菌被杀灭后,释放出抗生素灭活酶,如β内酰胺在体内不易被人体的免疫系统清除等[1～3],使BF清除十分困难,常致顽固性感染。能形成BF的细菌主要有铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、肺炎链球菌、葡萄球菌属等,相关感染尤以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌多见。本工作通过菌落计数测定铜绿假单胞菌BF 作者单位:400016重庆医科大学附属第一医院感染科中细菌量及扫描电镜观察BF的变化来研究大环内酯类药物对BF形成的影响及对BF的清除作用。 材料与方法 一、药物 红霉素(ery thromy cin,EM)标准品购于重庆市药品检测所,阿奇霉素(azithromy cin,AZ)为山东齐鲁制药厂产品,麦迪霉素(midecamy cin,MDM)为日本明治制药厂产品,环丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)为重庆制药六厂产品。 二、培养基与菌株 所用培养基为Mueller-Hinton肉汤(MHB)与Mueller-Hinton琼脂(MHA),菌株为粘液型铜绿假单胞菌(编号970558-26),为本院临床分离。 （一）铜绿假单胞菌的传播途径： 1、水源：水与铜绿假单胞菌的存在联系紧密。水源污染主要来自人或动物排泄物、人肠道铜绿假单胞菌两个途径。铜绿假单胞菌在污染的水中可较长时间的存留，各种液体药剂，包括眼药水长期放置有可能被铜绿假单胞菌污染，消毒剂、手术器械浸泡液都可能成为铜绿假单胞菌的贮存场所。呼吸机湿化装置及导管可作为传播的直接媒介。 2、环境：医院内长期潮湿的地方及湿的物品是铜绿假单胞菌贮存的场所。洗涤槽，防腐溶液和贮尿容器中常可发现这种细菌。 3、医护人员：通过医护人员（手）可将病菌传给病人，特别在灼伤和新生儿重症监护室。 4、特殊的病人：人体本身是一个主要的铜绿假单胞菌贮存所，细菌主要存在人体较为潮湿的部位如腋下、会阴部、呼吸道和肠道等。HIV感染、气管切开和插管、大面积烧伤、恶性肿瘤、免疫力低下、静脉插管、留置导尿及各种侵入性操作的患者易感染本菌。 （二）铜绿假单胞菌的预防措施： 1、铜绿假单胞菌感染的患者应实行接触隔离，住隔离病室，隔离标志明确、醒目，在隔离病房或者区域的 入口处应配备手套、手消毒凝胶、隔离衣及外科口罩； 2、医务人员接触患者前，戴好口罩、帽子，穿隔离衣； 3、加强医务人员手卫生，接触患者血液、体液、污物后均应洗手。洗手提倡采用流动水洗手，如果手没有明显污染时，可以用消毒凝胶消毒双手；医务人员如手皮肤有破损，不宜护理此类感染性疾病的患者； 4、护士对患者导管的各项操作，应先从清洁的部位开始再到污染的部位，避免交叉污染，如进行可能产生气溶胶的操作（吸痰或雾化治疗、纤维支气管镜等）时必须戴标准外科口罩，必要时带保护性眼罩； 5、进行床旁检查（如便携式照片、心电图、B超）的仪器在检查完成后用消毒剂进行擦拭消毒； 6、如患者需离开隔离病室到医技科室做检查，主管医生应先电话通知该诊疗科室或在检查单上标注患者感染情况，检查完毕患者接触过的物体表面要及时进行消毒处理； 7、隔离病室患者接触过的一切物品，如被单、衣物、各类医疗器械、导管等应先行消毒处理，然后再清洁（洗）、消毒、灭菌； 8、严格医疗废物管理，患者用过的所有敷料、导管等废物须置入专用黄色医疗废物袋内、封口，锐利器具用后及时放入专用利器盒内,集中焚毁。 ?论 著? 铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究 谢红梅,胡必杰,周昭彦,何礼贤 (复旦大学附属中山医院,上海200032) 摘要:目的 检测各种因素对铜绿假单胞菌(PA E)生物膜形成的影响。方法 采用恒化器结合改良Robbins装置培养铜绿假单胞菌生物膜,用超声振荡2活菌计数法检测不同条件下形成的生物膜内的活细菌数。结果 固定其他条件不变,8、24、72h的生物膜内活菌数分别为4.01±0.26、4.59±0.49、5.20±0.47log10CFU/引导片, P<0.01;固定其他条件不变,23、37℃形成的生物膜内活菌数分别为5.12±0.43、5.30±0.42log10CFU/引导片,P<0.05;固定其他条件不变,分别以玻璃和硅胶为生物膜引导片所形成生物膜内活菌数分别为5.49±0.59、 6.21±0.40log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以30、90ml/h的培养基流速,其生物膜内活菌 数依次为5.44±0.58、5.83±0.52log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以M63、M2H和LB 作为培养基,生物膜内活菌数依次为6.01±0.75、6.24±0.42、6.66±0.12log10CFU/引导片,P<0.01。结论延长培养时间、培养温度为37℃、粗糙的黏附材料、高流速和营养丰富的培养基均有利于铜绿假单胞菌生物膜的形成。 关键词:生物膜;铜绿假单胞菌;影响因素;超声振荡;活菌计数 中图分类号:R378.99+1 文献标识码:A 文章编号:100524529(2007)1221475204 Impact F actors of Pseudomonas aer ugi nosa Biof ilms Formation XIE Hong2mei,HU Bi2jie,ZHOU Zhao2yan,H E Li2xian (Zhon gs han Hos pit al,Fu d an Universit y,S hang hai200032,Chi na) Abstract:OB JECTIVE To compare the difference of Pseudomonas aeruginosa(PA E)biofilms formation in different conditions including incubated time,temperature,attaching materials,and flowing speed.METH ODS PA E biofilms were established in a chemostat2coupled MRD and detected with the method of viable bacteria counting.The number of CFU/disc was measured in different culture time(8h,24h or72h),different temperature(23℃or37℃),different adherent materials(glass or silicone),different flow velocities(30ml/h or 90ml/h)and different culture media(M63medium,M2H broth or LB broth).RESU LTS Keeping the other conditions invariable,the log10CFU/disc of viable bacteria in8h,24h or72h biofilms were4.01±0.26,4.59± 0.49or5.20±0.47,respectively(P<0.01),the log10CFU/disc of the viable bacteria in biofilms in23℃or37℃ were5.12±0.43or5.30±0.42,respectively(P<0.05),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown on the surfaces of glass or silicone were5.49±0.59or6.21±0.40,respectively(P<0.001),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown in the flow velocities of30ml/h or90ml/h were5.44±0.58or5.83±0.52, respectively(P<0.01),and the log10CFU/disc of viable bacteria in the biofilms grown in M63,M H broth or LB broth were6.01±0.75,6.24±0.42or6.66±0.12,respectively(P<0.01).CONC L USIONS Prolonging the incubating time,at the temperature of37℃,coarse surface material and high flow velocities and rich nutritious culture medium do good for PA E biofilms formation. K ey w ords:Biofilms;Pseudomonas aeruginosa;Impact factors;Viable bacteria counting 细菌生物膜(B F)可定植于植入物、留置导管或人体组织表面引起机体的慢性难治性感染。随着近年来各种人工器官和留置导管的广泛使用,生物膜相关感染在迅猛地增多[1,2]。生物膜在形成过程中易受许多因素的影响,而恒化器结合改良Robbins 收稿日期:2007208205; 修回日期:2007210215装置这一体外生物膜形成模型的出现,使上述问题得到了有效地解决,它可在维持其他因素恒定的条件下,研究一种因素对生物膜形成的影响。本研究采用恒化器结合改良Robbins装置研究不同的培养时间、培养温度、生物膜引导材料、培养基流经速度和培养基种类对生物膜形成的影响。 ? 5 7 4 1 ? 中华医院感染学杂志2007年第17卷第12期(完整word版)铜绿假单胞菌生物危害评估报告
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