醋酸铅对人肾小球系膜细胞凋亡及Caspase-3的表达影响 贾庆华杨霄鹏杨志华哈小琴﹡唐瑜 （中国人民解放军兰州军区兰州总医院医学实验中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验 室，甘肃兰州730050，﹡通讯作者） 摘要目的探讨醋酸铅对人肾小球系膜细胞（HRMC）凋亡作用及Caspase-3活性的影响。方法醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒HRMC 6、12、24、48h后，四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖。经醋酸铅（5、10、20μmol/L）染毒24h 后Hochest33342染色法检测观察细胞形态学变化；细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting检测Caspase-3的转录与表达。结果与空白对照组相比，不同浓度的铅均不同程度的抑制了HRMC的增殖(P<0.01)。Hochest33342-PI染色显示出醋酸铅组细胞成凋亡形态学改变。细胞免疫化学法、RT-PCR和Western Blotting结果显示醋酸铅组的Caspase-3转录与表达升高。结论醋酸铅可促进人肾小球系膜细胞凋亡, Caspase-3参与了凋亡过程。 关键词: 醋酸铅；人肾小球系膜细胞；Caspase-3；凋亡 The Caspase-3 expression in the toxic effect of lead acetate on the human renal mesangial cells(HRMC) JIA Qing-hua Yang Xiao-peng Yang Zhi-hua HA Xiao-qin Tang Yu (Experimental Center of Medicine, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command of Chinese PLA, Key Labaratory of Stem Cell and Gene Drug in Gansu Province, Lanzhou 730050, Gansu Province, China) Abstract Objective To investigate the effects of lead acetate on apoptosis and activity of caspase-3 in human renal mesangial cells(HRMC). Methods After treated with 5、10、20μmol/L lead acetate 6、12、24、48h, methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was performed to measure HRMC proliferation. Hochest33258-PI staining was applied to observe the morphological changes, and the transcription and expression level of Caspase-3 was detected with immunohistochemical method, RT-PCR and Western blotting after lead(5、10、20μmol/L) treating HRMC 24h. Results Lead acetate significantly inhibited the cell viability of HRMC(P<0.01). Characteristical changes of apoptosis in HRMC were observed in the treated group. RT-PCR、western blotting and immunohistochemical analysis indicated the transcription and expression of Caspase-3 was increased by the treatment. Conclusion Lead acetate could induce apoptosis in HRMC with a possible mechanism which may be related to the activation of caspase-3. Key words: lead acetate; human renal mesangial cells(HRMC); Caspase-3; apoptosis 铅是环境中广泛存在的一种强重金属毒物，对机体的各个系统都有损害，特别是对肾脏。肾脏承担了近2/3排泄途径再由尿道排出[1]，当排泄率降低而吸收率升高，更易造成铅在体内的蓄积，最终导致铅中毒。大量研究动物实验已经证明铅中毒引起肾脏功能的损伤[2,3]，但其损伤机制尚不清楚。目前有关醋酸铅肾 甘肃省支撑计划项目(090NKCA106)
什么是系膜增生肾小球肾炎 系膜增生肾小球肾炎，这种肾脏疾病对我们来说是比较陌生的，那么什么是系膜增生肾小球肾炎呢？这个问题对于我们来说，也是需要了解一下的。接下来本文就为大家介绍系膜增生肾小球肾炎的相关知识，感兴趣的朋友可以一起来看看哦！下面请大家看详细的介绍。 系膜增生肾小球肾炎是根据光镜所见的一种病理形态学诊 断的肾炎，是一组以弥漫性肾小球系膜细胞增生及不同程度系膜基质增多为主要特征的肾小球疾病。1977年世界卫生组织正式 将其列为一种原发性肾小球肾炎病理类型。 系膜增生肾小球肾炎的病因仍未明确。部分病例起病前有感染史，以上呼吸道感染居多， 系膜增生肾小球肾炎但病原不明，感染对系膜增生性肾小球肾炎确切的作用也不清楚。鉴于免疫荧光检查有多种表现，推测系膜增生性肾小球肾炎的致病因素可能存在多种。
系膜增生肾小球肾炎的治疗方法应根据临床表现结合病理特点选择使用，并须通过长期随访，调整治疗方案。一般治疗同其他肾脏疾病。 1、单纯血尿病理改变仅有轻度系膜增生，中度以下蛋白尿伴或不伴血尿，24h尿蛋白定量小于1.5g，病理改变为轻度或中度系膜增生的患者，轻者无须特殊治疗。对于尿蛋白定量1～2g/24h的患者，给予常规量糖皮质激素治疗，有助于缩短缓解时间，减轻肾脏的病理改变。 2、大量蛋白尿或肾病综合征此类患者无论病理改变轻重，均应给予足量的糖皮质激素治疗。即便病理学改变为系膜增生轻微、无弥漫性Ig和（或）补体沉积，也不伴局灶节段性肾小球硬化者，也要给予泼尼松（强的松）治疗。 3、合并高血压及肾功能不全此型为系膜增生性肾炎中预后最差者。病理改变显示中度至严重弥漫性系膜增生伴局灶节段性
填空 弥漫性硬化性肾小球肾炎的特点是大量肾小球____________及__________。纤维化、玻璃样变性 肾盂肾炎是_________和__________感染性__________性炎。 弥漫性新月体性肾小球肾炎电镜检查见_________不规则__________部分 _________出现__________，_________。 急性毛细血管内增生性肾小球肾炎免疫荧光检查见毛细血管壁的________有 ________的IgG、C3沉积。 有一患者临床表现为少尿，血尿、蛋白尿、管型尿、水肿和高血压，经治疗后在短时间内痊愈，应诊断为下列哪种肾小球肾炎B A：新月体性 B：毛细血管内增生性 C：慢性硬化性 D：轻微病变性 第2题：关于肾细胞癌的组织来源下列哪项正确 d A：起源于血管内皮细胞 B：起源于系膜细胞 C：起源于移行上皮 D：起源于肾小管上皮 第3题：肾于肾炎细胞感染的主要途径是：b A：血源性感染 B：上行性感染 C：坏死后感染 D：以上都不是 第4题：有广泛新月体形成的是下列哪型肾小球肾炎：d A：膜性肾小球肾炎 B：IgA肾病 C：膜增生性肾小球肾炎 D：毛细血管外增生性肾小球肾炎 第5题：下列哪项不符合慢性肾盂肾炎：a A：双肾病变对称 B：双肾病变不对称 C：皮髓分界不清 D：肾盂肾盏变形 第6题：肾盂肾炎最常见的致病菌是：d A：葡萄球菌 B：链球菌 C：痢疾杆菌 D：大肠杆菌 第7题：关于肾母细胞瘤，下列哪项不正确： A：成人多见 B：瘤体巨大 C：肿瘤有多种成份 D：切面呈多色彩性 第8题：纤维化玻璃样变的肾小球相互靠近集中的现象见于下列哪型肾炎：b A：慢性肾盂肾炎 B：硬化性肾小球肾炎 C：膜性肾小球肾炎 D：新月体性肾小球肾炎第9题：慢性肾盂肾炎肉眼检查可见肾脏表面有b A：弥漫细小颗粒 B：不规则凹陷瘢痕 C：多发性小脓肿 D：斑块状出血状 第10题：弥漫性膜性肾小球肾炎的病变特征是：b A：系膜弥漫性增生 B：毛细血管壁弥漫性增厚 C：系膜及基底底膜均增生 D：局灶性基底膜增厚 第11题：急性增生性肾小球肾炎患者出现高血压的主要原因是：d A：肾素增加 B细动脉硬化 C小动脉硬化 D：水钠潴留 第12题：新月体性肾小球肾炎免疫荧光检查结果显示d A：线状荧光 B颗粒状荧光 C：荧光阴性 D：以上均可 第13题：下列那项符合轻微病变性肾小球肾炎：c A：间质病变轻微B：肾小管病变轻微 C：肾小球病变轻微D：血管病变轻微 第14题：新月体形成过程中刺激球囊壁层上皮细胞增生的主要成分是 d A：红细胞B：白蛋白C：血小板D：纤维素 第15题：新月体内的细胞主要是：c A：脏层上皮细胞B：血管内皮细胞 C：壁层上皮细胞D：系膜细胞 第16题：下列哪项符合急性肾盂肾炎：a A：肉眼观有大小不等的小脓肿形成 B：系膜细胞明显增生C：发病机理为变态反应 D：肾小管上皮再生明显 某患者发现尿中有细菌及变性坏死的中性白细胞，应诊断为下列哪种疾病 c A：肾小球肾炎B：肾萎缩C：肾盂肾炎D：肾积水 第18题：急性增生性肾小球肾炎肉眼观病变特征为：a A：大红肾B：大白肾C：脓肿肾D：出血肾 第19 下列哪型肾小球肾炎发病与T细胞功能异常有关d A：膜性肾小球肾炎B：膜增生性肾小球肾炎 C：硬化性肾小球肾炎D：轻微病变性肾小球肾炎 第20题：关于肾小球肾炎的发病机制，下列哪项错误：d A：体液免疫性损伤B：细胞免疫反应参与 C：主要由炎症价质所致D：感染因子直接引起
Caspase与细胞凋亡
Caspase与细胞凋亡 沈阳市第一人民医院神经内科 （110041）李莉 摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。 关键词：Caspase；细胞凋亡
细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。 1、什么是Caspase 通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。后来发现CED-3与哺乳动物的白介素-1β转换酶（Caspase-1，原名为interleukin-1β-converting enzyme，ICE）具有高度同源性，CED-4，CED-9则分别与Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、Bcl-2同源。Bcl-2基因家族产物包括促进及抑制凋亡的两个蛋白质亚群[1]。哺乳动物的ICE 类蛋白是一组半胱氨酸蛋白酶[2]；且有以下共同特点：①和ICE有同源性；②有高度保守QACXG（X为R、Q或G）五肽序列[3]；③有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；④特异地裂解天门冬氨酸位点；⑤前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；⑥转染不同细胞可诱导凋亡。因
系膜增生性肾小球肾炎患儿Bax蛋白表达与外周血淋巴细胞凋亡的关系 （作者:___________单位: ___________邮编: ___________） 【摘要】目的明确病理类型为系膜增生性肾小球肾炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)的原发性肾病综合征(nephrotic syndrome，NS) 患儿外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocytes，PBLs)Bax蛋白的表达与PBLs凋亡的关系。探讨MsPGN-NS患儿糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗的部分机制。方法所有患儿和正常儿童均于清晨空腹条件下采取静脉血，以密度梯度离心法分离PBLs，所得细胞用植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)或PHA+1×10-6mol/L地塞米松(dexamethasone，Dex)处理，培养24 h和48 h后应用流式细胞仪检测Bax蛋白的表达及细胞凋亡率。结果①MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs Bax蛋白表达量均显著高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组Bax 的表达均低于正常儿童相应组(P0.01);②MsPGN-NS患儿与正常儿童Dex组PBLs凋亡率均高于空白对照组(P0.01)，且呈时间依赖性
(48 h24 h)，但各时间点MsPGN-NS患儿Dex组细胞凋亡率均低于正常儿童组(P0.01)。结论MsPGN-NS患儿PBLs Bax蛋白表达水平与PBLs凋亡率呈明显正相关，但其表达显著低于正常对照组，提示Bax蛋白的低表达是导致MsPGN-NS患儿PBLs凋亡减少，进而造成GC抵抗的原因之一。 【关键词】系膜增生性肾小球肾炎;肾病综合征;外周血淋巴细胞;Bax;凋亡 )Abstract：Ojective To investigate the relationship between expression of Bax protein and apoptosis in peripheral blood lymphocytes (PBLs) in children with primary nephrotic syndrome (NS) with the pathology type of mesangial proliferative glomerulonephritis (MsPGN), so to further explore the mechanism of glucocorticoid-resistance in children. Methods The PBLs in MsPGN-NS and normal children were isolated with Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. Then they were treated with phytohemagglutinin (PHA) or PHA plus dexamethasone (Dex). At the 24th and 48th hour of culture, the expression levels of Bax protein and apoptosis proportion were measured by flow cytometric analysis. Results The Bax protein levels in PBLs of Dex in the control group were much higher than those in both the MsPGN-NS group and normal children (P0.01) in a time-dependence manner (48 h24 h). However, at each time point the Bax protein levels of
肾小球肾炎的常见发病机理 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎是肾病疾病的一种，经常引起肾功能衰竭。肾炎肾病一般早期症状不明显，到了晚期肾功能衰竭，危害病人的生命。肾小球肾炎分为原发性和继发性两种，下面我们听听专家是如何介绍的，原发性肾小球肾炎的发病机理。 肾小球肾炎的三大发病机理，专家给出如下解释： 1、免疫复合物沉积在肾小球上皮细胞： 上皮细胞受到损伤，其表面的C3b受体会进一步诱使大量免疫复合物沉积至上皮下，导致膜型肾病的产生。如果光学显微镜下仅有肾小球上皮细胞肿胀，电子显微镜下可见上皮细胞足突广泛融合变平，则为微小病变肾病，绝大多数病例预后良好。 2、免疫复合物沉积在肾小球系膜区： 大量的免疫复合物沉积肾小球系膜区，吸引炎性介质浸润，产生炎性反应。导致肾脏系膜细胞损伤，使系膜细胞增殖、收缩。系膜细胞增生、系膜基质增多，这就是系膜增生性肾小球肾炎，此时如果再有内皮细胞的增生，就是毛细血管内增生性肾小球肾炎。随着细胞分泌的介质、基质增多，毛细血管管腔狭窄，造成缺血缺氧，同时系膜细胞在炎性介质与基质的作用下表型转化为肌成纤维细胞，大量细胞外基质产生，病情恶化，肾脏纤维化进展;系膜细胞收缩，导致滤过面积较少，滤过的分数降低，基底膜受到损伤，通透性增加，有用物质漏出;再有系膜细胞的吞噬功能下降，使得免疫功能下降，大分子物质不能被吞噬，大量堆积最终使得系膜细胞表型转化为肌成纤维细胞，分泌不易被降解的ECM，健康肾脏功能的细胞逐步丧失。总之，受损的系膜细胞在肾脏纤维化中占据了中心位置。随着损伤细胞的扩大和蔓延，肾脏的健康肾单位愈少，肾脏纤维化逐步进展。 3、免疫复合物沉积在肾小球内皮下： 正常健康的肾小球内皮细胞有其正常的功能，当内皮细胞受到损伤，结构发生变化，功能也相应的产生变化。受损后的内皮细胞抗凝活性下降，促进了血小板的粘附与聚集，导致肾小球毛细血管微血栓形成，局部缺血缺氧;再者由于受损，NO(一氧化氮)、PGI2(前列环素)等血管扩张因子减少，分泌的血管紧张素增加，导致血管收缩，产生肾内高压;此外，受损后电荷滤过屏障产生障碍，基底膜受伤通透性增加。内皮细胞受损后的三种结果交互作用，进一步导致肾脏局部微循环障碍，部分肾小球硬化，并出现血尿、蛋白尿等临床表现。 研究表明，肾小球肾炎患者发病的机制有很多，主要为抗原抗体反应引起的变态反应。 由于各类感染以及药物等，抗原抗体结合形成免疫复合物，根据自身不同的体积以及所携带电荷的影响沉积在肾脏不同的固有细胞区域，分别沉积在内皮下、系膜区、上皮下位置，免疫复合物不断的沉积，对肾脏不同的固有细胞形成损伤。根据肾脏病变的性质、部位以及范围，分为不同的病理类型，微小病变肾病，膜性肾小球肾炎、新月体性肾小球肾炎等。 肾小球肾炎的三大发病机理。肾小球肾炎发病机理很多，大多数都是由肾小球肾病疾病演变而来，常规检查时肾病病人会有很多检查，主要表现特征是面色苍白、乏力、生长发育迟缓等就诊，确诊时常已伴有不同程度的肾功能不全。希望大家能够注意多多预防肾病疾病，做好肾小球肾炎的预防与治疗工作。
学科：生物 教学内容：细胞膜的结构和功能 【学习目标】 1．理解细胞膜的化学成分、分子结构以及流动性的结构特点。 2．理解细胞膜的主要功能、物质出入膜的两种方式及功能特点。 3．建立细胞膜的结构模型，了解细胞膜的其他功能。 4．能用膜的流动性、选择透过性等特点进行分析和解释相关的现象。 【学习障碍】 1．理解障碍 如何理解细胞膜的结构以及结构特点；如何理解膜的结构与功能之间的关系；如何理解膜的结构特点与功能特性之间的联系。 2．解题障碍 用膜的结构特点以及膜的选择透过性的原理去分析解释有关细胞的融合、物质出入细胞(包括内吞与外排、主动运输等)等相关的生命现象。 【学习策略】 1．理解障碍的突破 (1)用“模型法”理解细胞膜的结构。 生命是物质的，生命活动需要一定的结构来保障，因此，学习过程中经常会遇到生物体的结构问题，尤其是更微观层次上的结构，这就要求学习者能将微观问题转变成宏观的问题，而建立一个简单、直观的模型来辅助，为思维创建一些支点，是解决此类问题的有效方法之一。这就是所谓的“模型法”。如下图。 在细胞膜中每一个磷脂分子头部因含有磷酸和碱基，极性强，是亲水性的；尾部的碳氢链为非极性的，具疏水性。如通过实验将磷脂加入水中，在一定浓度下，磷脂分子相互聚集，亲水性的极性头部朝向水相，而疏水的非极性尾部则避开水向内聚集，从而形成微小的球形
磷脂分子团。若继续用超声波处理，则形成不易溶于水且在水相对稳定存在的磷脂双分子层结构。因此，膜中的磷脂分子正如模型中的那样排列。而磷脂分子的这种性质对于构成稳定的膜结构具有重要意义。 从模型中还可以看出，磷脂双分子层是细胞膜的主要结构支架；膜蛋白为球蛋白，分布于磷脂双分子层表面或嵌入磷脂分子中，有的甚至横跨整个磷脂双分子层；组成细胞膜的各种成分在膜中的分布是不均匀的，即具有不对称性。例如：膜蛋白在磷脂双分子层中不对称地、不同程度地嵌入磷脂双分子层中或分布于膜表面。同时不同部位膜蛋白的种类和数量也不同；另外，细胞膜上的糖被只存在于膜外表面，与外层蛋白质结合形成糖蛋白。所以，糖类在细胞膜中的分布具有显著的不对称性。这些特点对于膜的功能的实现具有更直接的意义。 [例1]根据细胞膜的化学成分和结构特点，分析下列材料并回答有关问题： (1)1895年Overton在研究各种未受精卵细胞的透性时，发现脂溶性物质容易透过细胞膜，不溶于脂质的物质透过细胞膜十分困难。这表明组成细胞膜的主要成分中有_________。 (2)1925年Gorter Grendel用丙酮提取红细胞膜的类脂，并将它在空气、水界面上展开时，这个单层分子的面积相当于原来红细胞表面积的两倍。由此可以认为细胞膜由_______________组成。 解析：用“联想对照法”来解。 答案：(1)脂质分子(2)两层磷脂分子 点评：此题以考查细胞膜的结构和功能为线索，兼学科内综合及跨学科知识于一体。取材于书外，回答的内容却在书内，即“题在书外，理在书内”，是一道科技含量高，分析推理较强的试题。 (2)用“借比法”理解膜的结构特点。 “借比法”就是把难于想象或很抽象的生物学内容，通过借助我们所熟知的一些事例或现象进行比喻，以达到对问题真正理解的一种科学思维方法。 根据细胞膜的结构，巧妙地利用“借比法”帮助理解。细胞膜的结构特点是具有一定的流动性。膜的流动性是细胞膜结构的基本特征之一，同时也是细胞膜表现其正常功能的必要条件。膜的流动性是指膜结构分子的运动性，它包括膜磷脂分子的运动和膜蛋白的运动。我们可以联想细胞就好比地球，假设地球上没有陆地而全被大海所覆盖，那么磷脂双分子层就好比海水，蛋白质分子就好比海上的各种船只，它们都是可以运动的，这样就很容易理解细胞膜的结构特点——具有一定的流动性。 (3)用“结构与功能相统一”的观点去理解细胞膜的结构与功能之间的关系、结构特点与功能特性之间的联系。 结构与功能相统一的观点包括两层意思：一是有一定的结构就必然有与之相对应的功能存在；二是任何功能都需要有一定的结构来完成。 细胞膜的基本结构是：①由磷脂双分子层构成细胞膜的基本支架，这种结构的存在就必然有与之相对应的功能存在——脂溶性物质能够以自由扩散的方式优先通过膜，其他不带电荷的小分子也可以以自由扩散的方式通过膜。②在磷脂双分子层中，镶嵌有蛋白质分子，这一结构的存在，也必然有与之相对应的功能存在——蛋白质可以作为物质运输的载体，从而使膜具有主动运输的功能；糖被的存在，与细胞保护、润滑、识别等功能有关。因此，细胞膜的结构使其具有保护、物质交换、识别、分泌、排泄、免疫等功能；而细胞膜的以上这些生理功能的实现必定有一定的结构来完成，这就是细胞膜磷脂双分子层。 细胞膜的结构特点是具有一定的流动性，细胞膜的功能特性是具有选择透过性，这是两个不同而又有联系的概念。膜的流动性的存在，就既可使膜中各种成分按需要调整其组合分布而利于控制物质进出细胞，又能使细胞经受一定程度的变形不至破裂而具有了保护细胞内
Annexin V-FITC细胞凋亡检测详细步骤及说明 1. 对于悬浮细胞： a. 在进行完细胞凋亡刺激后，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS 轻轻重悬细胞并计数。注意：PBS重悬不能省 略，PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-FITC的结合。 b. 取5-10万重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞。 c. 加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。 d. 加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。 e. 室温(20-25oC)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。 f. 如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测，Annexin V-FITC为绿色荧光，碘化丙啶(PI)为红色荧光，流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。初次进行流式细胞仪检测时，建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和Annexin V-FITC单染这3个对照。如果用于荧光显微镜检测，1000g 离心5分钟，收集细胞，用50-100μl Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，涂片后，荧光显微镜下观察。注意：细胞在染色后须尽快完成检测，通常宜在1小时之内完成检测。用于流式细胞仪检测时，如果发现Annexin V-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-FITC稀释3-10倍后再进行检测。 2. 对于贴壁细胞的消化后检测：
、细胞膜的结构和功能 （一）基础扫描 1 、生物体结构和功能的基本单位是，阐明细胞是一切动植物生命活动的基本单位的理论观点是。判断：细胞是生物体结构和功能的基本单位（）细胞是一切生物体结构和功能的基本单位（）细胞是一切动植物结构和功能的基本单位（） 2 、细胞的原核细胞：没有，如、细菌、蓝藻、放线菌 类型真核细胞：有，如绝大多数生物（酵母菌、衣藻、草履虫、变形虫） 判断：①成熟的哺乳动物的红细胞，因为没有细胞核，所以是原核细胞（） ②生物界可能存在这样的生物：体内既有原核细胞，又有真核细胞（） 3 、细胞膜的成分：含有、和，其中，和是主要成分 4、细胞膜的分子结构：层磷脂分子形成磷脂双分子层，是细胞膜的基本支架（磷脂分子的头部 是的，因此在表面；尾部是的，因此在中间）；蛋白质以不同深度结合在磷脂双分子层上。 5 、细胞膜的膜外结构：糖被（由组成），消化道和呼吸道上皮细胞表面的糖被有 和作用；糖被还与有关。（请课后试绘：细胞膜结构模式图） 结构特点是：构成细胞膜的磷脂和蛋白质分子不是静止的，而是流动 的 6 、细胞膜生理特性是：即水分子能自由通过（自由扩散）、细胞要选择吸收的离 的特点子（主动运输）、小分子（O2、CO2、甘油、乙醇、苯是自由扩散，葡萄糖 除进入红细胞以外是主动运输，氨基酸是主动运输）也可以通过，而其他的离子、 小分子、大分子则不能通过（指细胞膜总量不变的情况下） 7 、细胞壁：在植物细胞外表面有一层细胞壁，主要成分是和，起支持和保护作用，是全透性结构；一般的原核细胞的表面也有一层细胞壁，主要成分是。判断：在由细胞构成的生物中，只有人和动物的细胞外面才没有细胞壁（） 8 、细菌细胞的基本结构有：、、、 细菌细胞的特殊结构有：、、 （二）难点突破 1 、物质基础：构成生物体的和
高考生物复习细胞膜专项练习试题（含答案）细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。以下是细胞膜专项练习试题，希望考生可以查缺补漏。 1.科学家在用电子显微镜清晰地观察到细胞膜之前，已经能够确定细胞膜的存在了。你认为当时确定细胞膜存在的依据最可能是()A.动物细胞有明确的边界 B.植物细胞有明显的固定形态 C.细胞能够分裂 D.物质进出细胞受到控制 解析从题目的四个选项分析可知，D项能够体现出细胞膜的特性;植物细胞具有明显的固定形态是因为具有细胞壁;动、植物细胞都有明确的边界;细胞能够分裂不能体现细胞膜的存在。 答案 D 2.研究发现，脂溶性物质能够优先通过细胞膜，细胞膜会被溶解脂质的溶剂溶解。它证明了() A.构成细胞膜的物质是脂质和蛋白质 B.细胞膜具有流动性 C.磷脂双分子层是细胞膜的基本骨架 D.组成细胞膜的物质中有脂质 解析易错选C项，尽管C项叙述本身正确，但由题目信息
只能确定组成细胞膜的物质中有脂质。答案 3.单纯的磷脂分子在水中可以形成双层脂分子的球形脂质体(如图)，它载入药物后可以将药物送入靶细胞内部，下列关于脂质体的叙述正确的是()A.在a处嵌入脂溶性药物，利用它的流动性将药物送入细胞 B.在b处嵌入脂溶性药物，利用它的流动性将药物送入细胞 C.在a处嵌入水溶性药物，利用它与细胞膜融合的特点将药物送入细胞 D.在b处嵌入水溶性药物，利用它与细胞膜融合的特点将药物送入细胞 解析球形脂质体的双层脂分子的亲水端朝外，疏水端朝内，所以图中a处可嵌入水溶性物质，b处可嵌入脂溶性物质，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，将药物送入靶细胞内部。 答案 C 4.图为细胞间信息交流的一种方式，下列有关叙述不正确的是() A.图中反映了细胞膜具有细胞间信息交流的功能 B.图中乙细胞表示靶细胞 C.图中a表示信号分子(如激素) D.图中b表示细胞膜上的载体 解析题图为细胞间进行信息交流的间接传递方式。甲细胞
细胞膜的结构与功能复习卷 1．下列关于细胞膜的流动性和选择透过性的叙述，不正确的是（） A．流动性的基础是组成细胞膜的磷脂分子和蛋白质分子大多是流动的 B．选择透过性的基础是细胞膜上的载体蛋白和磷脂分子具有特异性 C．细胞的胞吞和胞吐体现了细胞膜的流动性 D．钾离子通过主动运输的形式进入细胞体现了细胞膜的选择透过性 【答案】B 2．春天，很多植物同时开花，花粉在空气中传播后，也很容易黏附到其他植物的柱头上。但这些花粉不能萌发，而同种植物的花粉可以萌发，这依赖于花粉和柱头细胞的细胞膜之间信号分子与受体的识别，下面选项中与此实例表现的细胞膜功能不同的是（） A．胰岛B细胞分泌的胰岛素与组织细胞识别，以降血糖 B．精子和卵细胞融合需要先经过细胞膜之间的信息交流 C．细胞膜间搭建的胞间连丝能够传递信息 D．细胞能识别的物质能进入细胞，不识别的物质无法进入细胞 【答案】D 3．细胞膜在细胞的生命活动中具有重要作用，下列相关叙述正确的是（） A．载体蛋白是镶嵌在细胞膜外表面的蛋白质 B．细胞膜内外两侧结合的蛋白质种类有差异 C．磷脂双分子层不能体现细胞膜的选择透过性 D．细胞膜上的受体是细胞间信息交流所必需的 【答案】B 4．下列关于动物细胞生物膜的叙述，错误的是（） A．细胞膜主要由脂质和蛋白质组成 B．兴奋时，Na＋进入神经细胞不消耗A TP C．溶酶体清除进入细胞的病原体的过程与生物膜的选择透过性有关 D．细菌再次刺激引发记忆细胞增殖分化的过程体现了细胞膜的信息交流功能 【答案】C 5．下列与细胞膜相关的叙述，正确的是（） A．神经细胞的树突和轴突能显著增大细胞膜的面积 B．构成细胞膜的脂质有磷脂和脂肪，其中含量最丰富的是磷脂 C．癌细胞膜上的糖蛋白和甲胎蛋白含量减少
细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活 化（Caspase ）→进入连续反应过程 细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开 关的开启或关闭，不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说对细胞凋 亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，比较清楚的通路主要有： 1）细胞凋亡的膜受体通路：各种外 界因素是细胞凋亡的启动剂， 它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号， 引起细胞凋亡，我们以 Fas -FasL 为例：Fas 是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家 族成员，它与 FasL 结合可以启动凋亡信号 的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡 诱导复合物，这个复合物中包括带有死亡结构域的 Fas 相关蛋白 FADD 。Fas 又称CD95，是由325个氨基 酸组成的受体分子， Fas 一旦和配体 FasL 结合，可通过 Fas 分子启动致死性信号转导，最 终引起细胞一系 列特征性变化，使细胞 死亡。 Fas 作为一种普遍表达的受体分子，可出现于多种细胞表面，但 FasL 的表达 却有其特点，通常只出现于 活化的 T 细胞和NK 细胞，因而已被活化的杀伤性免疫细胞，往往能够最有效 地以凋亡途径置靶细胞于死地。 Fas 分子胞内段带有特殊的死亡结构域（DD,deathdomain ）。三聚化 的 Fas 和FasL 结合后，使三个 Fas 分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同 死亡结构域的 蛋白FADD 。FADD 是死亡信号转录中的一个连接蛋白， 它由两部分组成：C 端（DD 结构域）和N 端（DED ） 部分。DD 结构域负责和Fas 分子胞内段上的 DD 结构域结合，该蛋白再以 DED 连接另一个带有 DED 的后 续成分，由此引起N 段DED 随即与无活性的半胱氨酸蛋白酶 8（caspase8）酶原发生同嗜性交联，聚合多 个caspase8的分子，caspase8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的 级联反应，即 Caspases ，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应。细胞发生凋亡。因而 TNF 诱导的细胞凋亡途径 与此类似2）细胞色素C 释放和Caspases 激活的生物化学途径线粒体是细胞生命活动控制中心， 它不仅是 细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验 表明了细胞色素 C 从线粒体释放是细胞 凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C 在dATP 存在的条件下能与凋亡相关 因子 1（Apaf-1）结合， 使其形成多聚体，并促使caspase-9与其结合形成凋亡小体， caspase-9被激活，被激活的 caspase-9 能激 活其它的caspase 如caspase-3 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡 诱导因子，如 AIF ，参与 激活caspase 。可见，细胞凋亡小体的相关组份存在于正常细胞的不同部位。 促凋亡因子能诱导细 胞色素 C 释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素 C 从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的 关键问题。 多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途经。有人认为受体介导的凋亡途 经也有细胞色素 C 从线粒体 的释放。如对Fas 应答的细胞中，一类细胞（ type1）中含有足够的胱解酶 8（caspase8）可被死亡受体 活化从而导致细胞凋亡。在这类细胞中高表达 Bcl-2并不能抑制Fas 诱导的细胞凋亡。在另一类细胞 （type2） 如肝细胞中，Fas 受体介导的胱解酶 8活化不能达到很高的水平。因此这类细胞中的凋亡信号 需要借助凋 亡的线粒体途经来放 大，而 Bid-- 一种仅含有BH3结构域的Bcl-2家族蛋白是将凋亡信号从胱解酶 8 向线 粒体传递的信使。尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚， 但是已经确定Caspase 即半胱天冬蛋白 酶在凋 亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是 Caspase 不可逆有限水解底物的级联放大反应 过程，到目前为止，至 少已有 14种Caspase 被发现，Caspase 分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱 氨酸家族蛋白酶，根据功能可把Caspase 基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β 和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括 caspase2,3,6,7,8,9.10。Caspase 家族一般具有以下特征：1)C 端同源区存在半胱氨酸激活位点，
P21在肾小球系膜细胞的表达变化及意义△ 柳飞，唐万欣，黄颂敏* 四川大学华西医院肾内科，四川 成都 610041 摘 要：目的：探讨高糖、胰岛素对肾小球系膜细胞中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21表达的影响及其在糖尿病肾病（DN）发病机制中的作用。方法：将培养的大鼠1097系膜细胞株分为8组：正常对照组，高糖组，甘露醇组，不同浓度胰岛素组，高糖加不同浓度胰岛素组。用RT-PCR法检测各组系膜细胞P21mRNA表达。流式细胞仪定量检测各组系膜细胞前向角度散射光（FSC）大小。结果：正常对照组系膜细胞中P21mRNA有一定表达。高糖组P21mRNA表达明显增加为正常对照组的3.89倍(p<0.01)；FSC为正常对照组的1.42倍(p<0.01)。不同浓度胰岛素组系膜细胞P21mRNA表达及FSC大小随胰岛素浓度增加而增加，但无统计学意义（p>0.05）。结论：(1) P21mRNA在正常肾小球系膜细胞有一定表达。(2) 高糖刺激可使系膜细胞P21mRNA表达上调，且与渗透压无明显关系。(3) P21mRNA表达上调可导致系膜细胞肥大，在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。 关键词：糖尿病肾病 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P21 细胞肥大 糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy, DN）是糠尿病主要的微血管并发症之一。在西方发达国家，DN已成为终末期肾功衰（End-stage Renal Failure, ESRD）的首位病因。在我国，随着糖尿病的逐渐增加，糖尿病肾病也呈上升趋势。因此，深入研究DN的发病机制，制定更加有效的防治措施已成为肾脏病工作者面临的重要问题。 DN的发病机制尚未完全阐明，一般认为是多种因素共同作用的结果。DN早期即出现肾小球高滤过以及肾小球肥大。肾小球肥大可导致肾脏结构不可逆的变化，如肾小球硬化和肾小管间质纤维化，最终导致终末期肾功衰。近年来的研究证实各种因素对细胞生长的影响最终发生在细胞周期水平[1]。细胞周期调控依赖于一系列细胞周期调控蛋白。其中，P21是目前已知的具最广泛活性的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂。P21的过度表达与许多细胞增殖抑制和肥大有关[2-4]。有研究表明，糖尿病早期肾脏肥大至少部分与肾皮质P21蛋白表达增加有关[5]。而系膜细胞肥大在早期肾小球肥大中起关键作用，这已在糖尿病患者和糖尿病大鼠动物模型研究中得到证实[6、7]。P21在肾小球系膜细胞肥大中发挥什么作用，目前国内外研究甚少。 本研究采用半定量RT-PCR法，观察高糖刺激，不同浓度胰岛素作用下，鼠1097系膜细胞中P21mRNA的表达及其变化。相应条件下，用流式细胞仪测量细胞前向角散射光大小，从而获得系膜细胞体积大小，从细胞分子水平探讨高糖、胰岛素干预下，P21在系膜细胞肥大-肾小球肥大的关系，为DN的防治寻求新的治疗靶。 1 材料和方法 *通讯作者△教育部博士点基金资助项目，编号20020610078
细胞凋的亡概念 细胞凋亡(apoptosis)是指为维持内环境稳定，在一定的条件下，细胞遵循的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 从细胞功能上看，细胞凋亡对多细胞生物体具有重要的意义。一方面在生物发育过程中细胞凋亡可以清除没有功能的、不需要的、不正常的和有害的细胞，优化组织器官的结构和细胞数目，确保正常个体发育。另一方面在生物体整个生命过程中，每天都会产生许多功能异常的细胞，如癌变细胞、衰老细胞、被微生物侵袭的细胞等。细胞凋亡可以将这些细胞清除，并且由新诞生的功能正常的细胞替换。因此，体内细胞的诞生和死亡处于动态平衡，从而维持机体组织器官中细胞数量稳定和功能正常。 细胞凋亡信号转导通路 细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活(Caspase)→进入连续反应过程。由于细胞凋亡启动阶段的不同，其可分为三条主要通路，即线粒体通路、内质网通路、死亡受体通路。 线粒体通路，即通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活 Caspase。线粒体是细胞生命活动控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。此通路由含BH3 结构域的Bcl-2 家族成员(Bid、 Bad、 Bim、 Harikari 、Noxa等)与另外的结合在线粒体外膜面或存在于胞浆的Bcl-2家族成员(Bax亚家族成员Bax，Bak 等) 相互用，导致后者的寡聚并插入线粒体膜，从而引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素 C (Cytc)和其他蛋白。Cytc 的释放是线粒体凋亡路径的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素 C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子 1(Apaf-1)结合，使其形成多聚体，而后通过 Apaf-1 氨基端的 Caspase 募集结构域(caspase recruitment domain CARD)募集胞质中的Caspase-9 前体，并促使 caspase-9 与其结合形成凋亡小体，被激活的 caspase-9能激活其它的 caspase 如caspase-3 和 caspase-7 等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子，如 AIF，参与激活 caspase，促凋亡因子能诱导细胞色素C 释放和凋亡小体的形成。 内质网通路，即由内质网失常引起，而非以细胞膜或线粒体为靶点的凋亡信号触发。内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网Ca2+平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累是关键步骤，它们会诱导位于内质网膜的Caspase-12 的表达，同时诱导胞质的 Caspase-7 转移到内质网表面。Caspase-7 可激活Caspase-12，而激活的Caspase-12 可进一步剪Caspase-3 从而引发细胞凋亡。 死亡受体通路：由各种外界因素作为细胞凋亡的启动剂，然后通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受(TNFR)基因超