第三讲
Working with nucleic acids
一、核酸的分离和印迹检测
1，DNA和RNA的分离
得到大片段DNA分子是基因克隆的关键步骤。
破碎细胞
释放核酸
核酸与其他细胞组分的分离
得到纯化的核酸。
细胞破碎后，用苯酚或酚氯仿混合物除去蛋白质。
Cell disruption------deproteinisation, extraction with phenol or phenol chloroform mixtures。
离心后，蛋白质沉淀集中到水相和有机相界面处，而核酸保留在上层水相中，然后可以用异丙醇或乙醇进行沉淀。
提取DNA时用RNase（ribonuclease）降解样品中的RNA。
Affinity chromatography 亲合层析
在反转录合成cDNA时，首先需要提取mRNA。
由于mRNA分子3′端具有polyA尾, 可用oligo(dT)-纤维素（cellulose ）柱进行纯化。
与rRNA和tRNA不同，高等生物细胞的绝大部分mRNA在其3’端均有一个poly(A)尾，尾的长度(几百甚至上千)一般足以使mRNA吸附到寡聚脱氧胸苷酸[oligo(dT)]一纤维素上。用亲和层析法从总RNA样品中分离mRNA，得到mRNA分子的总体，它们实际上编码某一时期细胞能够表达的所有多肽。
寡聚（dT）纤维素亲和层析柱在含0.5M NaCl缓冲液平衡时，可以oligo-(dT)吸附mRNA的poly(A)尾，而其它没有poly(A)尾的RNA则从柱中流出。
然后用不含NaCl的缓冲液将mRNA洗脱下来。用这种方法纯化的mRNA，可以用作构建cDNA文库时的模板。
Plasmid DNA（pDNA ）的纯化：
氯化铯（caesium chloride ）密度梯度离心（gradient centrifugation ）：
高速离心48小时后形成密度梯度。在离心管底部刺孔，通过紫外观察收集DNA组分，经透析（dialysis）得到纯化的DNA。
凝胶排阻层析---size exclusion chromatography---gel filtration。DNA片段先通过柱子，核苷酸等小分子后下来。
2，核酸的保存和定量
microgram------微克
nanogram------纳克
picogram------匹克
核酸定量一般采用260nm的吸收值（absorbance）进行。
Spectrophotometer---分光光度计
A260=1.0---------50μg/ml 双链DNA。
A260=1.0---------40μg/ml 单链DNA或RNA。
equivalent to a concentration of 50μg/ml for double-stranded DNA, or 40μg/ml for single-stranded DNA or RNA.
A260/ A280 ratio should be around 1.8 for pure DNA and 2.0 for pure RNA preparations.
小于以上数值说明有蛋白质污染，DNA样品该值如果大于1.8说明有RNA污染。
溴化乙锭（ethidium bromide）可以嵌入碱基之间，使DNA在紫外光下发出橙色荧光。binds between the DNA bases (intercalates) and fluoresces orange under ultraviolet light.
通过比较样品DNA与分子量标准中相当条带的亮度可以估计DNA浓度。
在0.2M盐浓度下，加入2倍体积乙醇（ethanol）或异丙醇（isopropanol）可以引起核酸沉淀。
一般在-20℃进行，但这一过程与温度关系不大。
沉淀用TE（tris-EDTA）buffer溶解。Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸），-20℃保存。
EDTA：络合镁离子，抑制DNA酶活性。
3，核酸的放射性标记（radiolabelling）---跟踪DNA分子和探针制备。
dNTP (deoxynucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸) labelled with 3H or 32P.
scintillation counter---液体闪烁计数器
radioactive probes--hybridisation experiments
比活度（specific activity ）：标记后单位质量核酸所具有的放射性活性。
追踪实验采用低比活度，探针制备采用高比活度。
for tracing purposes, a low specific activity will suffice , but for probes a high specific activity is necessary.
探针制备一般用32P，可以发射高能量β射线。
In probe preparation, the radioactive label is usually the high-energy β-emitter 32P.
①末端标记法---End labelling，[γ-32P]A TP
polynucleotide kinase---多核苷酸激酶：将A TP的末端磷酸基团转移到核酸分子的5′羟基末端。
如果ATP被放射性标记，这一过程可以产生比活度相对较低的标记核酸，因为只有末端被标记。
②切口平移法---Nick translation，[α-32P]ATP
DNaseⅠ
DNA polymerase Ⅰ
通过切口平移法标记DNA分子，可制备高比活的探针。
在镁离子存在下，用低限量的DNA酶Ⅰ处理双链DNA，使之产生切口。
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ以此作为催化DNA合成的引物，将单核苷酸加到切口处的3′羟基端。
由于大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′外切酶活性，它可以从切口的5′端除去核苷酸。5′端核苷酸去除与3′端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，即切口平移。如果用高放射性活度的核苷酸置换原有的核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数／分钟?μg的32P标记的DNA，这样标记的DNA分子可用作杂交探针（probe）。
③引物延伸标记法
Labelling by primer extension，[α-32P]A TP
Klenow fragment，6核苷酸随机引物。
random oligonucleotide，usually hexadeoxyribo-nucleotide molecules, sequences of six deoxyribonucleotides.
将DNA分子加热变性，然后与随机引物退火。
由Klenow酶催化延伸反应，将放射性标记的核苷酸掺入DNA分子，得到高比活度探针。用Pasteur pipette柱可将标记探针与剩余底物分开。
非放射性标记
Non-radioactive methods------fluorescent label
Digoxin—化学发光
生物素、荧光素
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）：
1956年，Kornberg首先从大肠杆菌细胞中分离出此酶，它是由单一多肽组成的球蛋白，分子量为10.9×104 D（道尔顿）。
该酶具有以下三种不同的催化活性。
(1)5’→3’DNA聚合酶活性
以单链DNA为模板，作化单核苷酸结合到DNA引物的3’－OH末端，沿5’→3’的方向按模板顺序合成DNA链。
5’-CpCpGOH
3’-GpGpCpTpApTpCpGpAp…5’
dATP,dTTP,dGTP,dCTP,Mg2+↓大肠杆菌DNA聚会酶Ⅰ
5’-CpCpGpApTpApGpCpT…3’
3’-GpGpCpTpApTpCpGpA…5’
(2) 5’→3’DNA外切酶活性
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ能从5’端降解双链DNA，使之成为单核苷酸；也可降解RNA∶DNA杂交体中的RNA成分。
5’-CpGpCpApTpCpT…3’
3’-GpCpGpCpGpTpApGpA…5’
↓Mg2+大肠杆菌聚合酶Ⅰ
CpApTpCpT…3’
3’-GpCpGpCpGpTpApGpA…5’＋5’pC，5’pG
(3) 3’→5’外切酶活性：
大肠杆菌聚合酶Ⅰ还能从3’－ＯＨ末端降解双链DNA或单链DNA分子成为单核苷酸. 它对双链DNA的外切酶活性可被5’→3’DNA聚合酶活性抑制，也可被带有5’－磷酸的dNTP所抑制。
5’…CpGpCpApTpCpT…3’
3’…GpCpGp
Mg2+↓大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
5’…CpGpCOH
3’…GpCpGp +5’pA + 5’pC + 5’pT
大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）：
该酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）经枯草杆菌蛋白酶处理后，产生的分子量为7.6×104的大片段分子，叫做Klenow片段或Klenow酶。
大肠杆菌聚合酶Ⅰ的5’→3’外切核酸酶活性在使用时经常引起一些麻烦:
它可以降解结合在DNA模板上的引物的5’端;
从作为连接底物的DNA片段的末端上除去5’磷酸。
Klenow片段丧失了全酶的这一活性，但5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’外切酶活性仍然保留。
Klenow片段在分子克隆中有以下几个主要用途：
①补平经限制性内切酶消化DNA所形成的3’粘性凹端，对3’粘性末端进行放射性标记；如EcoRⅠ(5’-G↓AATTC)等产生的末端。
②在cDNA克隆中，用以合成cDNA第二链。
③用于Sanger双脱氧末端终止法进行的DNA序列分析。
4，核酸杂交------Nucleic acid hybridization
核酸杂交的目的：通过杂交从DNA片段群体中鉴定出目的片段（Picking out specific DNA sequences from complex mixtures ）.
探针------热变性；DNA样品------碱变性
Denatured probe (heating)
DNA sample (alkaline denaturation)。
Nitrocellulose
Nylon
65-68℃，several hours
autoradiogram------放射自显影图，X-ray film
5，凝胶电泳------Gel electrophoresis
power supply---电源
gel---凝胶
Buffer------缓冲液
Platinum electrode---铂电极
一般性检测采用琼脂糖凝胶电泳：SAGE------submerged agarose gel electrophoresis
核酸样品从负极向正极移动。
Nucleic acid samples placed in the gel will migrate towards the positive eletrode from negative electrode in horizontal direction. - +
在中性pH条件下，核酸带负电荷，主要来自磷酸二酯键骨架上的磷酸基团。
Nucleic acids are polyanionic at neutral pH. multiple negative charges due to the phosphate groups on the phosphodiester backbone.
样品的分离效果与凝胶基质的孔隙度有关。
The degree of separation depended on the porosity of the matrix.
Agarose琼脂糖凝胶
Polyacrylamid聚丙烯酰胺凝胶
一、电泳
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。1937年瑞典化学家Tiselius首先开发了蛋白质电泳技术，并成功地将血清蛋白质分成几个组分。
带电颗粒在一定电场强度下单位时间内在介质中的迁移距离称为泳动率，或迁移率。
泳动率与样品所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比。
与样品的分子大小、介质粘度及电阻成反比。
不同大小的带电分子具有不同的泳动率。这是电泳分离的理论基础。
影响泳动率的因素：
1，样品的物理性状
影响泳动率的物理性状包括分子大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。
颗粒带电荷的密度越大，泳动速度越快。
颗粒物理形状越大，与支持物介质摩擦力越大，泳动速度越小。
对于线性双链DNA分子，在凝胶电泳中，相对分子质量的常用对数与泳动率成反比关系。利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，可以方便准确地测定DNA片段的分子量。
相对分子质量相同的DNA分子如果它们的空间构型不同，其迁移率也不同。
质粒DNA存在闭环（Ⅰ型，CC）、单链开环（Ⅱ型，OC）和线性（Ⅲ型，L）三种构型，三者之间的迁移率一般为Ⅰ型> Ⅲ型> Ⅱ型
2、电泳介质
DNA凝胶电泳常使用两种支持材料，琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶。
通过调整这两种介质的浓度变化所形成的具有不同分子筛网孔大小的凝胶，可分离不同相对分子质量的核酸片段。
琼脂糖凝胶可以分离长度为100bp至60kb的DNA分子。
聚丙烯酰胺凝胶可分离5-500bp的小片段DNA分子，所以手工测序一般只能读出500个碱基。
DNA的迁移率的对数与凝胶浓度之间存在反平行线性关系。
3，电场强度
电泳场两极间单位支持物长度的电压差称为电场强度，单位是V/cm（伏特/厘米）。
电场强度越大，带电颗粒的泳动速度越快。但是凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。4，缓冲液离子强度
通常采用的缓冲体系有3种：Tris.乙酸（TAE）、Tris.硼酸（TBE）和Tris.磷酸（TPE）。TAE缓冲能力很低，长时间电泳会导致电泳槽阴极变为碱性，阳极变为酸性，从而使缓冲能力降低。
TBE与TPE均有较强的缓冲能力，但从TPE凝胶回收的DNA片段中含有较高的磷酸盐，容易与DNA一起沉淀，进而影响一些酶反应，如限制性酶切反应。
缓冲液的pH值直接影响DNA解离程度和电荷密度，缓冲液pH值与DNA样品的等电点相距越远，样品所携带的电荷量越多，泳动速度越快。
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳的分辨力较低，但它操作简便、应用范围广、适合于较大分子的分析。
DNA分子在电泳后短时间内位置可以保持不变，该技术已成为DNA、RNA分离和检测的重要手段。
（一）恒定电场强度下的琼脂糖凝胶电泳
1，DNA的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶可以制成不同大小的孔隙度，具有分子筛的效应。恒定场的琼脂糖凝胶电泳适于分离100bp-60kb的DNA片段。
DNA片段的迁移率主要和分子大小、高级结构有关。
不同浓度的琼脂糖凝胶可分离线性DNA分子的有效范围
（指能够清楚地分开）
2，RNA的琼脂糖凝胶电泳（变性胶）
RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可以按大小不同而相互分开。
变性指利用变性剂破坏RNA的二级结构，消除二级结构对电泳迁移率的影响，使RNA分子的泳动由分子大小来决定。
常用的变性剂有甲醛、乙二醛和二甲基亚砜等。
（二）脉冲场琼脂糖凝胶电泳
大分子DNA在电场作用下挤过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行，这样才能通过凝胶。
这时大分子通过凝胶的方式均相同，迁移率无差别，不能达到分离的目的。
当电场方向改变时，电场内的DNA分子构象也发生改变，并重新定向，沿新的方向伸直. 其转向时间与其粘弹性弛豫时间有关，并显著地依赖于分子大小。
DNA分子越大，这种构象改变需要的时间越长。
在脉冲场琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子在两个不同方向的均一或不均一电场中不断随电场方向改变分子本身的构象，并挤过凝胶。
DNA分子构象改变时间小于脉冲电场周期，DNA分子便可以按其分子大小，得到较好的分离效果；
反之，DNA分子变换时间大于脉冲电场周期，则凝胶中DNA分子松弛变形与电场更替时间不相等，达不到分离目的。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和甲叉丙烯酰胺在催化剂过硫酸胺和加速剂TEMED的作用下聚合而成。
在光照下，核黄素也能催化聚合。
聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成不溶于水的凝胶。
根据待分离物质的分子大小，应选用合适的凝胶浓度。
被分离物质与凝胶浓度之间的关系
（一）缓冲体系的选择
缓冲液的pH应偏离分离蛋白的等电点，使其处于最大的电荷状态，使样品中各种蛋白质分子表现出最大的迁移率变异。
缓冲液的pH分为中性、酸性和碱性三类。
最常用的蛋白质分离体系为pH8.9的碱性缓冲液体系.
因为大多数蛋白质的等电点略偏酸性或中性，在pH8.9的碱性缓冲体系中带负电荷，向正极移动。
（二）解离和非解离体系
在有些情况下，需要在缓冲体系中加入解离剂，将分子内的非共价键破坏，这种体系称为解离体系。
常用的解离剂有SDS、尿素等，它们同时也是某些蛋白质（如膜蛋白）的促溶剂。
解离剂可以减弱分子空间构象的差别，有利于了解分子的大小与迁移率之间的关系。（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的应用
PAGE分为连续电泳体系和不连续电泳体系。
连续电泳体系指整个电泳体系中的缓冲液、pH值和凝胶孔径大小相同，主要用于核酸分析。不连续电泳体系中，除了电泳槽中的缓冲体系和pH值与凝胶中不同外，凝胶本身也由缓冲
体系、pH值和凝胶孔径不同的两种凝胶堆积而成，该体系主要用于蛋白质样品的分离。
不连续电泳体系制胶比较麻烦，但它对样品有高效浓缩效应，可以大大提高分辨能力。
1，蛋白质分子的分离鉴定
采用不连续电泳体系进行，在电泳时除具有电荷效应和分子筛效应外，还有浓缩效应。
浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶pH为6.9。
在浓缩胶中，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一狭小的中间层，并按其蛋白质所带负电荷量多少依次排列成带。
浓缩的样品进入分离胶后，胶的孔径变小，pH值升高，电场强度恒定，蛋白质的分离取决于它们的电荷性质、分子大小和形状。
2，SDS-PAGE与蛋白质分子量的测定
SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在溶液中能与蛋白质分子的疏水部分定量结合，把大多数蛋白质拆分成亚单位，并带上阴离子。这些阴离子掩盖了蛋白质分子本身所带的电荷差异。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳消除了电荷效应，只有分子筛效应，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子量，迁移率与分子量对数呈线性关系。
3，核酸分析（非解离体系）
用于核酸分离的聚丙烯酰胺凝胶的缓冲体系是连续体系，主要分离较小的核酸（5-500bp），迁移率与分子大小和构型（如线性、缺口环化、超螺旋）有关。
如果样品中所有的DNA分子均为线性分子，可用迁移率比较其大小（以标准核酸片段作标准对照）。
4，核酸序列测定（解离体系）
以尿素为解离剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。
构型相同、但相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样，在电泳过程中可以彼此分开。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅能分离大小不同的分子，
而且能分离大小相同但构型不同的分子。
以pUC19质粒为例，有超螺旋的共价闭合环状质粒DNA（covalently closed circular DNA, 简称cccDNA）、共价闭合环状质粒DNA一条单链断裂的开环质粒DNA（open circular DNA, 简称ocDNA）、共价闭合环状质粒DNA两条单链断裂的线性质粒DNA（linear DNA, 简称L DNA）三种构型。
电泳时cccDNA移动最快，其次为线性DNA，开环质粒DNA最慢，所以电泳结果为三条分开的带。
限制性酶切的质粒DNA为线性分子。
Potential difference---电压差
Marker dye------bromophenol blue，溴酚蓝
Intercalating dye------ethidium bromide溴乙锭，orange bands
Calibration curve，标准曲线------migration is inversely proportional to the log10 of the number of base pair.
Restriction mapping---限制性作图
PAGE------polyacrylamide gel electrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。
SDS-PAGE------SDS(sodium dodecyl sulphate, 十二烷基硫酸钠) is used to denature multisubunit proteins and cover the protein molecules with negative charges. The inherent charge of the protein is masked, and the charge/mass ratio becomes constant, and proteins can be separated according to their size in a similar way to DNA molecules.
M 1 2 3
21kb
5.1
4.9
4.2
3.5
2.0
1.9
1.5
1.3
0.94
0.83
M：DNA相对分子质量标准物（marker）；
1：pUC19质粒DNA经EcoRⅠ完全酶切；
2：pUC19质粒DNA经EcoRⅠ部分酶切；
3：未酶切的pUC19质粒DNA，提取结果好时，为一条带，以超螺旋质粒DNA为主，有时结果为三条带，从下向上分别为超螺旋质粒、线性质粒和开环质粒。
6，DNA序列分析------DNA sequencing
基本原理：将DNA的序列测定转化为DNA片段的长度分析。
(1)化学法测序---Maxam-Gilbert (chemical) sequencing
Allan Maxam and Walter Gilbert （1977）
用化学物质在特定碱基位置断裂DNA分子，产生总体上只差一个碱基的一套DNA片段。chemicals are used to cleave the DNA at certain positions, generating a set of fragments that differ by one nucleotide.
DNA片段的一条链在5′端用32P标记。
然后进行特定的化学修饰。
将修饰的碱基从脱氧核糖分子上除去后用哌啶断裂（piperidine）。
The reaction conditions are chosen so that,on average, only one modification will be introduced into each copy of the DNA molecule.
化学法使用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链；通过四组不同的特异反应，就可以将末端（3’-或5’-端）带有放射性标记的DNA分子切
成不同长度的寡核苷酸片段。
这些寡核苷酸的长度相当于从特异反应引起的切点到标记末端之间的长度。
用分辨力极高的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些不同长度的寡核苷酸片段分离开来并进行自显影。
在四组反应中，整体上相邻的两条带仅相差一个碱基，由此可读出所测定的DNA的序列。
①G反应
用硫酸二甲脂（dimethyl sulfate，简称DMS）使鸟嘌呤上的N7原子甲基化。
甲基化的鸟嘌呤与脱氧戊糖之间的糖苷键在中性环境中加热而断裂，鸟嘌呤碱基脱落，多核苷酸骨架在鸟嘌呤处发生断裂。
②G+A反应
用甲酸使A和G嘌呤环上的N原子质子化，使糖苷键变得不稳定，再用哌啶使嘌呤脱落。
③T+C反应
用肼（hydrazine）使T和C的嘧啶环断裂，再用哌啶除去碱基。
④C反应
当有NaCl存在时，只有C与肼发生反应，T不发生反应。断裂的C可用哌啶除去。哌啶也可使脱去碱基处的磷酸二酯键断裂。
上述四组反应中，应控制时间只让很小一部分碱基被修饰，这样在一种DNA分子形成的群体中，每个相关位点都有可能被切断形成一种末端带标记的寡核苷酸片段。
但用哌啶切断链的反应必须是定量的。
反应完毕后，一般用尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（7mol/L尿素，8%胶）进行分析。
电泳时电压在4000V左右，凝胶的温度保持在65℃，以保证DNA在变性状态下进行电泳。电泳完毕后，将胶抽干，进行放射自显影，从胶片上可读出DNA序列。
图化学法测定DNA序列时的G反应（A）和化学法测定DNA序列图解（B）
(2)酶法测序
Sanger-Coulson (dideoxy or enzymatic) sequencing
Fred Sanger and Alan Coulson
Klenow fragment,
single-stranded DNA,
a primer
ddNTPs---dideoxynucleoside triphosphates
dNTPs,[α-35S]A TP
用M13噬菌体载体制备单链DNA。
DNA molecule was cloned into a vector such as the bacteriophage M13 to produce single-stranded DNA.
测序胶------6-20% polyacrylamide
7M urea which acts as a denaturant to reduce the effects of DNA secondary structure.
英国生物化学家F. Sanger（1918—）第一个完成了胰岛素的氨基酸序列测定。
19世纪前叶人们就知道蛋白质，并了解其水解产物中有一些氨基酸。
到了20世纪初，科学家发现蛋白质是氨基酸通过肽键连接而成的长链，1940时基本弄清了组成蛋白质的20种不同氨基酸，但对于这些氨基酸在蛋白质中如何排列一无所知。Sanger从1945年起，选择当时已知的最小蛋白质胰岛素作为研究对象，经过十年的艰苦奋斗，终于测出了牛胰岛素所含的51个氨基酸的排列顺序，于1958年获得第一个诺贝尔奖。双脱氧法（dideoxy method），也称酶法（enzyme method）或链终止法（the chain termination
method），由Sanger于1977年建立。
以35P、35S替代32P作为标记物。
该方法的原理是利用2’,3’-双脱氧三磷酸核苷酸（2’,3’-ddNTP，dideoxynucleotide ）来终止DNA的复制反应。
DNA聚合酶（如Klenow片段）在DNA复制过程中催化多核苷酸链的延伸，单核苷酸被连接在延伸链的3’-OH上；
如果掺入的一个2’,3’-ddNTP，延伸反应就会停止。
根据这一原理设计四组反应，每组反应中都含有:
正常的四种脱氧核苷酸dNTP（其中一种带有32P标记）
单链DNA模板（即待测DNA，一般通过M13丝状噬菌体制备）
DNA聚合酶I
引物（可以根据载体序列人工合成）
另外每一组反应还加入一种2’,3’-ddNTP。
也可以标记引物或ddNTP.
以A管为例，凡聚合反应进行到模板的T碱基时，2’-dATP和2’,3’-ddATP都有可能掺入.
如果掺入2’-dATP，聚合反应可以继续进行。
如果掺入2’,3’-ddATP，链延伸反应即告终止，这样在反应产物中就会产生末端为A的单链DNA片段群体。
将四组反应产物用凝胶电泳进行分析，在整体上四个泳道中自显影产生的相邻条带只有一个碱基的差异，由此可读出DNA的序列。
应用35S标记的dNTP替代32P标记的dNTP，电泳图谱更加清晰，分辨力更高，每次实验可以读出更多的碱基序列。
目前双脱氧测序反应一般利用双链DNA模板通过聚合酶链式反应进行，并采用四种不同颜色的荧光素分别标记四种双脱氧核苷酸。
这使得四组测序反应可以在一个Eppendorf管进行，分析时通过毛细管电泳在DNA自动测序仪即可读出相应的DNA序列。
基本的原理为DNA聚合酶不能区分dNTP和ddNTP，一旦ddNTP被作为底物连接至新生链，DNA的延伸合成会终止，从而产生单链的DNA片段；
由于存在很多模板分子，以及dNTP和ddNTP连接的随机性，DNA合成反应可以在任一碱基位置终止。
经过一段时间后可得到一个不同长度的单链DNA群体，电泳时它们可以按大小分开，并且相邻条带之间仅差一个碱基。
从胶的下面开始向上可以读出DNA分子的核苷酸序列。越靠近引物端的位置产生的片段越小。
链终止法中用于测序的DNA聚合酶必须满足3个条件：
①高酶活性，即与模板结合能力强，可合成足够长的DNA单链；
②无5′→3′外切核酸酶活性，5′→3′核酸酶活性可将新合成的DNA链的5′端除去，改变合成产物的长度，给顺序的阅读造成误差；
③无3′→5′外切酶活性，原因与②相同。
所以用于测序的DNA聚合酶都经过了人工的修饰。
第一个用于测序的DNA聚合酶为Klenow片段，不具有5′→3′外切酶活性，但仅能合成长约250个核苷酸的DNA分子，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会形成一些阴影条带，说明有许多终止反应由酶活性造成。
现在广泛采用的DNA聚合酶由T7噬菌体编码，又称sequenase，即测序酶。Sequenase工作效率高，无外切酶活性。
链终止法测序时可通过以下几种方法制备模板：
①插入质粒载体的双链DNA，可以采用碱变性或热变性使双链DNA变为单链，能够进行双向测序；
②用M13载体制备单链DNA——M13载体是根据复制型M13基因组改进的双链DNA，可以和质粒一样进行操作，用它感染宿主菌可产生单链模板，但只能制备小片段DNA；
③用噬菌粒（phagemid）制备单链DNA——噬菌粒含有两个复制起始位点，一个为大肠杆菌质粒起始位点，一个是来自M13、fd等单链DNA噬菌体基因组的复制起始点。当大肠杆菌中同时含有噬菌粒和辅助噬菌体时，因后者携带编码噬菌体复制酶及外壳蛋白的基因，因此可激活噬菌粒DNA复制，产生单链模板。
④PCR产生单链模板——两个引物中一个连接有很小的磁珠，可用吸磁的办法从扩增产物中得到单链模板。不对称PCR。
DNA聚合酶在延伸多聚核苷酸时只有3′核苷酸配对正确才能进行，这可能是为何完全单链模板在无引物时不能起始复制的原因。
因为在缺少引物的情况下，聚合酶不能确定3′核苷酸配对正确与否，无法确定下一步反应。大肠杆菌基因组复制时，每个冈崎片段长1000-2000核苷酸，约需4000个引物。
(3)光点测序（pyrosequencing）
焦磷酸测序涉及四种酶：
DNA聚合酶（DNA polymerase）
硫酸化酶(ATP sulfurylase)
荧光素酶(luciferase)
双磷酸酶(apyrase).
反应体系:
DNA单链
测序引物。
dNTP
反应底物:
APS (adenosine 5′phosphosulfate)
荧光素(luciferin)
在每一轮测序反应中，只能加入四种dNTP（dATP S，dTTP，dCTP，dGTP）之一;
如该dNTP与模板配对，聚合酶就可以催化该dNTP掺入到引物链中并释放焦磷酸基团（PPi）。
掺入的dNTP和释放的焦磷酸是等摩尔数目的.
dATP S (deoxyadenosine alfa-thio triphosphate) 是dATP的替代物;
因为DNA聚合酶对dA TP S的催化效率比对dATP的催化效率高，且dA TP S不是荧光素酶的底物。
硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，A TP和焦磷酸的摩尔数目是一致的。
ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素(oxyluciferin) 的转化;
氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。
光信号由CCD摄像机检测。
每个峰的高度(光信号)与反应中掺入的核苷酸数目成正比。
ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。
然后就可以加入下一种dNTP。
每次只加入一种dNTP。当反应液中发出亮点时，可知核苷酸已掺入，仪器可以记下反应。如无亮点出现，表明该核苷酸不与模板链配对，则不会出现记录。
连续快速地依次加入，周而复始，随着链的不断延伸，相应的顺序也被阅读。
(4)DNA芯片测序
将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播在面积很小的芯片上，每个点的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。
将待测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定的位置发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸的顺序进行对比组装，拼接成完整DNA顺序。
根据统计，可测DNA片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。假如寡聚核苷酸的长度为8个碱基，则其可能的排列顺序为48=65536，而可读的片段长度仅为65536的平方根，等于256bp。
即使一个芯片可容纳1048576个不同的10碱基寡聚核苷酸，可读片段长也仅为1kb。
如果要完成1Mb的测序，以20个寡聚核苷酸的数目计算，芯片需携带的组合数目将达1012，只有采用极微量的电子操作才能完成。
(5)自动化测序
①荧光标记物：用不同荧光色彩的化合物标记ddNTP，ddATP标记红色荧光、ddCTP标记蓝色荧光、ddTTP标记绿色荧光、ddGTP标记黄色荧光。
这4种标记的ddNTP混合加入到一个反应中，聚合反应完成后，可以获得末端分别带有A、C、T、G标记的DNA单链。电泳分离的单链DNA条带通过监测仪时，发出不同的颜色信号，由计算机读出碱基顺序。
自动测序的原理仍然为链终止法，但将4个反应合并为一个，在一个泳道中进行电泳。
②毛细管电泳：用毛细管电泳取代聚丙烯酰胺凝胶平板电泳，可大大提高测序的速度。
人类基因组测序中使用的电泳装置有96个泳道（一束并列的充满凝胶的毛细管），每次可同时进行96次测序，每轮实验不到2小时，一天可完成近千次反应。
序列读取采用共聚焦荧光扫描显微镜，可将核苷酸的荧光标记信号放大并由计算机读取碱基顺序。
Fluorographic detection------荧光检测
(6)RNA序列测定
尽管DNA序列分析技术已相当成熟，但有的时候也需要直接测定RNA的序列，尤其是对tRNA和rRNA分子中存在的被修饰的核苷酸位置的确定。
RNA序列分析的困难是RNA分子极易被RNA酶降解，有关RNA的实验都需要在十分严格的条件下进行。
首先将RNA分子的5′末端进行标记，然后用专一性RNase断开特殊核苷酸的3′端。
用适当的酶量和消化时间，可产生一个RNA片段梯度，相邻片段之间只有一个碱基的差别，PAGE电泳后即可读出RNA的序列。
RNase T1可在G碱基后断裂RNA分子；
RNase U2可在A碱基后断裂RNA分子；
RNase Phy M可在A和U碱基后断裂RNA分子；
芽孢杆菌Bacillus cereus RNase可在U和C碱基后断开RNA分子。
第2节基因工程及其应用 孝义三中高一生物组张文 一、教材内容分析 基因工程是现代四大生物工程之一。《基因工程及其应用》是人教版高中生物必修2第6章第2节内容。本节内容主要包括三个方面，分两课时讲授。第1课时简要介绍“基因工程的原理”，第2课时介绍“基因工程的应用”及“转基因生物和转基因食品安全性”。本节内容是对前面所学育种内容的补充，是即贴近生活又远离生活的微观内容。由于在选修3中还有基因工程的介绍，因此本节的要求相对简单一些。 二、学情分析 对于基因操作的工具和基本步骤，内容抽象和复杂，学生接触少，会出现掌握不好，甚至理解错误的情况。虽然经过必修1的学习，学生的生物基础知识较扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立。但基因工程一节对学生来说难点较多，如果处理不好，会变成简单的死记硬背。因此在教学过程中，尽量通过生活化打比喻的方式和模型建构活动及采用多媒体动画形象化教学，并在教师引导下适时加强学生解决问题和运用图解等生物学语言归纳结论等方面的能力。切记不可讲的太多。 三、教学目标 1、简述基因工程的基本概念； 2、简述基因工程的基本工具； 3、简述基因工程的基本操作步骤； 4、通过基因工程的简介，鼓励学生积极探索新知和科学创新，树立一分为二的辩证唯物主义思想； 四、教学重点、难点分析 教学重点：基因工程的基本原理（概念、工具、操作步骤） 教学难点：基因工程的基本原理 五、教学思路 本节课主要解决如下几个问题：1）什么是基因工程？2）基因工程的主要原理是什么？3）基因工程的操作过程如何？4）基因工程有哪些方面的应用？如何看待转基因食品？由于本节内容和前面的育种内容联系比较紧密，因此可以让学生回顾前面几种育种方法的成果，再通过情景展现传统育种方法所不能达到的地方，进而引出基因工程，通过列举生活中的转基因成果让学生知道基因工程就在我们身边。而后通过与学生们所熟知的器官移植做对比，让学生理解基因工程的本质和操作过程。通过对转基因食品的讨论让学生树立辩证唯物主义观念。 六．教学策略及教学媒体 根据激趣原则，通过展示色彩绚丽的转基因生物图片入手，引出基因工程的概念，采取“引导—互动—探究”模式，即采用师生互动探究式教学，借助老师生活化打比喻和多媒体动画并安排学生制作模型活动从而使抽象的课程内容具体化，直观化和形象化。 七、教学设计流程图第1课时“基因工程的原理”
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程及其应用 学习目标 1．简述基因工程的基本工具 2．简述基因工程的基本操作步骤 3．说出基因突变和基因重组的意义 基础知识 一、基因工程的原理 1. 基因工程的概念： 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，地改造生物的。 基因工程是在上进行的水平的设计施工，需要有专门的工具。 2.基因工程的工具 （1）基因的“剪刀”：__________（简称__________），作用： （2）基因的“针线”：__________，作用： （3）基因的：作用：，目前常用的运载体有________、________和______________等。 3. 基因工程操作的一般步骤为：__________________目的基因与___________结合将目的基因导入________________目的基因的________和________。 二、基因工程的应用 1、基因工程在作物育种方面的事例有：、、超级绵羊等； 抗虫基因作物的优点，不仅减少了__________，大大降低了生产成本，而且还减少了__________。 2、基因工程生产药品有__________、__________、__________等。 3、目前关于转基因生物和转基因产品的安全性，有两种观点，一种观点是转因生物和转基因食品不安全，____________________；另一种观点，应该大范围推广。
1.看课本P103图6-6，由图中过程怎么操作？用到什么工具？ ①从人的细胞中分离出DNA ； ②用限制酶切取胰岛素基因片断 ③分离大肠杆菌中的质粒并用同种限制酶切断 ④用DNA 连接酶将胰岛素基因与质粒DNA 重组 ⑤将重组质粒导入大肠杆菌进行转化 ⑥培养大肠杆菌，复制大量胰岛素基因并表达分泌出胰岛素； 过程属于基因工程的第一步：； 过程属于基因工程的第二步：； 过程属于基因工程的第三步：； 过程属于基因工程的第四步：； 2.此过程的目的基因是_____________，供体是，受体是_________； 3.细菌和人是差异非常大的两种生物，为什么通过基因重组后，细菌能够合成人的胰岛素呢？ 二、请模仿转基因大肠杆菌生产人胰岛素的过程，写出培育转基因抗虫棉的过程。 4.请写出过程 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
《基因工程及其应用》说课稿 一、说教材 《基因工程及其应用》是人教版生物必修2第六章第二节内容。学生们在几章中已经学习了基因的本质,基因的表达,对基因有一定的感性认识。为学生学习本节内容做到铺垫的作用。 本节的教学内容是在学生对基因有一定的理解的基础上,引入基因工程,让学生了解基因工程在生活中的运用,激发学生的求知欲。在教学内容的组织上体现了学科内在逻辑性与学生认识规律的统一。 二、说教学目标 根据本教材的结构和内容分析,结合着学生他们的认知结构及其心理特征,我制定了以下的教学目标: 1、知识目标:掌握基因工程的概念、原理;基因操作的工具及其操作过程。 2、能力目标:培养学生分析、推理、归纳、总结的能力。 3、情感目标:培养学生实事求是的科学态度及从微观到宏观,从现象到本质的科学 的研究方法;培养学生严谨的学习态度和思维习惯。 三、说教学的重、难点 本着高二新课程标准,在吃透教材基础上,我确定了以下的教学重点和难点 1、教学重点
基因工程的基本原理,基因操作的工具,基本步骤及其应用。 2、教学难点 基因工程的基本原理,基因工程的应用及其安全性。 四、说教法 围绕本节课的教学目标和教学重点,采用了观察法、演示法、讨论法、实践法等多种教学方法,积极创设一个可以让学生在轻松愉快的氛围中,去主动探求知识的过程。在教学过程中,开展师生互动、生生互动,体现出以学生为主体,教师为主导的主动探究式教学理念。 五、说学法 在本节课中,学生将通过多种途径,如:观察、阅读、思考、分析、讨论、实践等等,来开展学生之间的协作学习和自主学习,形成以学生为主体的教学模式。 六、说教学过程 在这节课的教学过程中,我注重突出重点,条理清晰,紧凑合理。各项活动的安排也注重互动、交流,最大限度的调动学生参与课堂的积极性、主动性。 1、导入新课: 提问:各种生物间的性状千差万别这是为什么呢? 引导:生物体的不同性状是通过基因特异性表达而形成的。 列举:几种生物的不同性状:够吐出丝;豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气;
6-2 基因工程及其应用 【学习目标】 1、简述基因工程的基本原理。 2、举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用。 3、关注转基因生物和转基因食品的安全性。 【新知预习】 一基因工程的原理 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种里，地改造生物的。 基因工程是在上进行的水平的设计施工，需要有专门的工具。基因工程最基本的工具有：“”、“”、“”。 二基因工程的工具 1、基因的“剪刀” (1)它指的是限制性内切酶，简称为，正是伴随它的发现，以人类定向改造生物遗传性状为目的的才应运而生。 (2) 限制性内切酶主要存在于中，限制性内切酶是不是就是一种？ (3) 限制性内切酶的特点是a: ；b： (4)不同的限制性内切酶切割DNA的切点相同吗？ 2、基因的“针线” 把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，然后让两者的黏性末端黏合起来，问： (1)两者的黏性末端能黏合起来遵循的原则是。 (2)DNA连接酶的作用是。 3、基因的运载体 (1)要将一个外源基因，送入受体细胞内，还需要有运输工具，这就是 (2)通常使用的运载体有、和等。 (3)质粒它存在于及等生物中，是细胞染色体(有的细胞中没有染色体)外能的很小的环状分子。 三基因工程的操作步骤
1、提取 2、与结合 将与结合的过程，实际上就是不同来源的DNA 的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的切割质粒，使质粒出现一个切口，露出黏性末端。然后用限制酶切断，使其产生相同的。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，质粒的黏性末端与目的基因的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，再加入适量的，这样就形成了一个重组DNA分子。 3、将导入 4、目的基因的表达和检测 基因的表达是指通过和合成的过程。 四基因工程的应用（见书） 1.获得高产、稳产和具有优良品质的农作物和具有抗逆性的作物新品种。 2.高效率的生产出高质量、低成本的药品，如胰岛素、干扰素和乙肝疫苗等 3.利用转基因细菌降解有毒有害的化合物，保护环境。 五转基因生物和转基因食品的安全性 【知识细目表】 1.概念 2.原理基因重组 3.基因工程的基本工具 （1）基因的“剪刀”（限制性内切酶） 限制性内切酶能够对DNA分子进行切割，它具有专一性和特异性。即一种内切酶只对DNA 分子内特定的碱基序列中的特定位点发生作用，把它切开。 （2）基因的“针线”（DNA连接酶） 能够将限制酶切开的黏性末端连接起来，从而使两个DNA片段连接起来。 注：限制酶与连接酶作用的位点都是磷酸二酯键 （3）.基因的运载体作用：将外源基因送入受体细胞 种类：质粒、噬菌体和动物病毒。其中质粒是基因工程中最常用的运载体，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。 特点：是细胞染色体外能自主复制的很小的环状DNA 分子，存在于许多细菌及酵母菌等生物中。
基因工程及其应用文件管理序列号：[K8UY-K9IO69-O6M243-OL889-F88688]
第2节基因工程及其应用（第1课时）知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA 重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究
传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的 水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是 指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？ 七、基因重组与基因工程比较
课型：新授主备：同备审批: 7/13/2013 第6章从杂交育种到基因工程 第2节基因工程 【学习目标】1.简述基因工程的基本原理 2.举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 3.关注转基因生物和转基因食品的安全性 【学习重点】1. 基因工程的基本原理 【学习难点】基因工程的基本原理 【学习过程】 一、基因工程的基本原理 （一）、基因工程的概念 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的。 【思考】 为什么不同生物的基因可以相互转移？转基因生物是否产生了新基因和新型蛋白质？ （二）、基因工程的工具 基因的“剪刀”—— 一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在的切点上切割DNA分子。【思考】 要获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？ 【练一练】试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端 基因的“针线”—— “缝合”__________和_________交替连接而构成的DNA骨架上的缺口。 【思考】DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸分子的什么部位？
基因的运载体目前常用的运载体有________、________和______________等。 质粒存在于中,是拟核或细胞核外能够________的______________分子。 （三）、基因工程的操作步骤 目的基因、目的基因与结合、将目的基因、目的基因的和 【思考】 目的基因和质粒为什么要用同一种限制酶切割？限制酶和DNA连接酶作用的位点相同吗？用DNA连接酶讲目的基因与运载体结合时，有其他不同的结合情况吗（两两结合时）？ 二、基因工程的应用 1、基因工程与作物育种 人们培育出的转基因作物和转基因动物主要有 ___________________________ ___ _____ ____ ____________________________________ __ 2、基因工程与药物研制 转基因药物有：________、________、________、________、________、________、________、________、________。 三、转基因生物和转基因食品的安全性 两种观点：__________________________________和_______________________________ ［课堂小结］ 【自我检测】 1．不属于基因工程方法生产的药物是（） A.干扰素 B.白细胞介素 C.青霉素 D.乙肝疫苗 2．质粒是基因工程最常用的运载体，它的主要特点是（） ①能自主复制②不能自主复制③结构很小④蛋白质⑤环状RNA分子 ⑥环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
植物基因工程的重要意义 关键词：植物基因工程技术，转基因 正文： 作为21世纪科技的重要发展项目，基因工程技术在植物方面应用的意义主要体现在以下五个方面。 1．植物基因工程技术可以实现超远缘育种,克服不亲和障碍 我们知道，在作物育种中最早应用的是植物组织培养技术，这种技术已在花卉、药材、森林和农作物育苗得到广泛的应用，我国已在甘蔗、人参和马铃薯等方面收到显著经济效益。此外，还可从培养细胞或再生植株选择所需要的突变体。如Shepard(1983)从马铃薯培养物中选出一种能抗腹疫病(Phytophthorainfectans)的抗性植株以及利用培养细胞生产诸如喜树碱等化合物。但以上方法只是同类植株的基因改变。此外人们还对植物原生质体融合进行了研究。但是植物细胞融合后性状的表达，取决于它在以后有丝分裂时染色体是否发生交换或丢失情况。[1]但到目前为止，由融合的细胞而能培养成植株者容寥寥无几，这可以说是克服远缘杂交不亲和障碍的最早例子。如果说细胞融合可以克服种属之间不亲和性，而基因重组则可在更大范围内进行了。动物基因如萤火虫的发光蛋白基因,寒带鱼的抗冻蛋白基因,蛇、蝎的毒液基因等也已转移给作物,分别获得能发光的转基因烟草,抗寒的转基因甜菜、转基因番茄和抗虫的转基因棉花等。[2]由此可见，外源基因导入植物细胞后引发的改变是巨大的。 2．植物基因工程技术可以增强作物改良力度,促进品种更新换代 作物改良基本有两方面，其中提高作物品种的光合与养分效率、病害与虫害抗性正在成为植物基因工程的研究重点,促使作物品种适应低温、干旱、雨涝、土壤瘠薄和盐碱以及温室效应等新旧灾害从而提高作物产量，也已成为基因工程育种的主要内容。 农业生产中，增加粮食产量无非依靠两种途径:一是提高作物品种的生产能力;二是减轻环境因素对作物生长的不利影响。据报道，全世界每年因虫害、病害、草害以及寒冷、干旱、盐碱等灾害对粮食生产所造成的损失令人惊叹：全球每年因虫害与病害所造成的作物减产达30%以上，因杂草所损失的粮食至少在10%以上，再加上低温、干旱和盐碱等各种因素，全世界每年至少要损失粮食产量的一半以上。[3～5] 同时，为了防治病虫害及杂草等，还要施用大量的化学农药，这不仅消耗大量的能源，更严重的是对生态环境造成了极大的甚至是不可逆的破坏。为了摆脱上述困境，从20世纪80年代起，人们开始研究和利用转基因抗性植物来预防病虫害和杂草等，并收到了良好的效果。与传统作物育种技术相比，利用基因工程技术进行遗传育种有其自身的优势，一方面由于它可以将特定的抗性基因定向转移，因而成功率较高，可大大提高选择效率，在很大程度上避免了传统育种工作的盲目性；另一方面是其基因来源打破了种属的界限，除了植物基因以外，动物和微生物的抗性基因都可以作为外源基因转人植物基因组中，并获得表达。[6] 3．植物基因工程技术可以拓宽应用研究,扩大生产领域 随着转基因植物技术日益成熟,利用植物的生物反应器作用,进行贵重药品、人畜疫苗和精细化工等的生产,因具有成本低,竞争力强的吸引力,正在成为高技术及其产业化的新兴热门领域。现已成功地将干扰素、胰岛素、多肽抗体、人血清白蛋白等基因转给植物进行这些药物的生产。美国现已得到多肽抗体转基因烟草,美国还在通过转基因植物研制麻疹、乙肝、艾滋病等疫苗,甚至成功地获得了口服植物疫苗。现国际上正在出现研制营养药物的新思路。此外,现还大量进行用于塑料、染料、涂料、洗涤、香料、润滑剂等的转基因植物研究。据
基因工程及其应用集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
第2节基因工程及其应用（第1课时） 知识链接及考试地位 本知识与“DNA分子的结构与复制”、“基因突变和基因重组”、“DNA重组技术的基本工具”、“基因工程的基本操作程序”等内容相联系，考试过程中常设计基因工程的原理、基本工具等基础知识，多以个别填空或选择题的形式呈现。 知识回顾 1、DNA分子的结构特点是什么？ 2、什么是基因重组？ 学习目标 1、简述基因工程的诞生。 2、简述基因工程的原理及技术。要明确基因工程操作的基本步骤和最基本的工具。 重难点 1．教学重点 基因工程的基本原理。 2．教学难点 基因工程的基本原理 新知探究 传统育种的方法一般只能在生物中进行，很难将一种生物的优良性状移植到生物身上。基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿地改变生物，培育出。 一、基因工程的原理 基因工程又叫做或。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以，然后放到另一种生物细胞里，地改造生物的遗传性状。基因工程是在DNA上进行的水平的设计施工，基因的剪刀是指，简称限制酶。其作用特点是一种限制酶只能识别一种序列。基因的针线是指。目前常用的运载体有、和等。质粒存在于许多以及等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的小型分子。 基因工程的操作步骤是：、目的基因与运载体结合，目的基因导入受体细胞、目的基因的和。 二、基因工程的原理、操作对象各是什么？ 三、限制性内切酶的分布、特点、作用部位和作用结果如何？ 四、作为基因的运载体，需具备哪些条件？ 五、DNA连接酶的作用对象、位置和结果如何？ 六、基因工程的优点是什么？
人教版高中生物《基因工程及其应用》教学设计 一、总体设计指导思想 本节课突出对学生技能和科学素质的培养，通过精心设计课堂教学环节，来培养学生的信息提取能力、识图能力、语言表达能力、实际操作能力及培养学生的科学精神和科学素养。 二、教材分析 基因工程是现代生物科技中的热点，逐渐对人类的生产和生活产生了巨大的影响，学习这一内容既有利于学生对这一前沿科技的了解，也能让学生对科学技术社会三者的关系有更深入的理解，还能为学生的人生规划提供一种新的视角。而对这一专题的教学，首先要考虑基础性，高中阶段的教学不是培养专家，而是要全面提高学生的科学素养，因此着力点应瞄准对学生的发展起根本作用的知识能力思想情感上，针对本节内容即简述基因工程的基本原理，举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用，关注转基因生物和转基因食品的安全性；关注基因工程的发展，认同基因工程的应用促进生产力的提高；运用所学DNA重组技术的知识，模拟制作重组DNA模型，而本课知识、能力上主要解决基因工程操作的原理及基本步骤以及模型构建。 三、教学目标 （一）知识目标 简述基因工程的基本原理 举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用 关注转基因生物和转基因食品的安全性； （二）情感态度价值观目标 关注基因工程的发展，认同基因工程的应用促进生产力的提高 （三）能力目标 运用所学DNA重组技术的知识，模拟制作重组DNA模型。 四、教学重难点 重点：①基因工程的主要步骤 ②基因工程的应用 ③转基因生物和食品的安全性 难点：①基因工程的基本原理。 ②转基因生物与转基因食品的安全性。 五、教学过程：
六、学案设计： 6.2基因工程---课堂探究案 一．学习目标 1.简述基因工程的基本原理 2.通过模型制作理解基因工程的关键步骤 二．合作探究 1.核心概念：基因工程 又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。别名_________________ 原理____________________________ 结果__________________________________________________________________ 2.信息提取：阅读以下资料，找出能代表培育转基因大肠杆菌关键步骤的三个动词。 美国人在1978年用大肠杆菌生产出了胰岛素，大肠杆菌产生胰岛素并进行批量生产的原理是运用到了现代生物技术的转基因技术，它是先将人胰岛素基因从人的染色体DNA上剪切出来，插入从细菌细胞中提取出来的质粒（作为载体）中，再将这个合并起来的、带有胰岛素基因的质粒，转移入大肠杆菌的细胞中，随后该胰岛素基因会指导大肠杆菌细胞产生胰岛素，人类即可将这些胰岛素提取并收集出来，用于治疗糖尿病病人，给糖尿病患者带来了福音. 能代表培育转基因大肠杆菌关键步骤的三个动词分别是________、_________、__________。 3.合作探究：阅读课本102页最后一段至103页第二段，探讨以下问题 （1）限制酶的分布、作用及特性 思考一：限制性核酸内切酶切割的是DNA分子的哪个部位_______________ （2）DNA连接酶的作用、作用对象和作用部位 思考二：DNA连接酶与DNA聚合酶有何区别？___________________________________ （3）运载体的常见种类、作用 4.读图说话：读下图，用自己的话描述基因工程操作的一般步骤。
2019湖南高考生物知识点：基因工程及其应用 1.概念 按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。 2.原理 基因重组 3.工具 A.基因的”剪刀”：限制性内切酶 ①分布：主要在微生物中。 ②作用特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，切割特定切点。 ③结果：产生黏性未端(碱基互补配对)。 B.基因的”针线”：DNA连接酶 ①连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。 ②结果：两个相同的黏性未端的连接。 C.基因的”运载工具”：运载体 ①作用：将外源基因送入受体细胞。 ②具备的条件：a、能在宿主细胞内复制并稳定地保存。b、具有多个限制酶切点。 c、有某些标记基因。 ③种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。 ④质粒的特点：质粒是基因工程中最常用的运载体。
4.基因操作的基本步骤 ①提取目的基因：人们所需要的特定基因，如人的胰岛素基因、抗虫基因、抗病基因、干扰素基因等 ②目的基因与运载体结合(以质粒为运载体)：用同一种限制酶分别切割目的基因和质粒DNA(运载体)，使其产生相同的黏性末端，将切割下的目的基因与切割后的质粒混合，并加入适量的DNA连接酶，使之形成重组DNA分子(重组质粒) ③将目的基因导入受体细胞常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌、动植物细胞 ④目的基因检测与表达 检测方法如：质粒中有抗菌素抗性基因的大肠杆菌细胞放入到相应的抗菌素中，如果正常生长，说明细胞中含有重组质粒。 表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因完成了表达过程。如：抗虫棉基因导入棉细胞后，棉铃虫食用棉的叶片时被杀死;胰岛素基因导入大肠杆菌后能合成出胰岛素等。
6.2基因工程及其应用教学设计案例 基因工程及其应用 --案例 一、教学目标的确定 课程标准中与本节内容相对应的具体内容标准是："关注转基因生物和转基因食品的安全性"，这也是本节要达成的主要教学目标。课程标准并未明确指出本章要讲述基因工程的内容，考虑到本章教材知识体系的完整性，以及学生达成上述目标所需要的知识基础，本节还将"简述基因工程的基本原理"，"举例说出基因工程在农业、医药等领域的应用"作为教学目标。 二、--思路 第一课时--流程图如下。 第二课时--流程图 如下。 三、教学实施的程序 教师组织引导 学生活动 教学意图 教师通过图 片和音像资料展示基因工程产品，如种子、水果、疫苗或药物等，
引入课题。教师利用"问题探讨"，提出问题，组织学生讨论、交流看法。 ·为什么能把一种生物的基因"嫁接"到另一种生物上？ ·推测这种"嫁接"怎样才能实现？ ·这种"嫁接"对品种的改良有什么意义？ 教师小结：从杂交育种的局限性切入，人类可以利用基因工程技术按照自己的意愿直接定向改变生物。说明本节教学目标。 教师肯定学生合理的想法，引发思考。 "你的想法很好，可是用什么样的方法才能实现你的设想呢？" 教师用类比的方法引导学生思考基因工程的大致步骤和所需要的工具：剪刀、针线、运载体等。并用问题启发学生："你能想像这种‘剪刀加浆糊’式的‘嫁接’工作在分子水平的操作，其难度会有多大吗？" 以ecor i为例，构建重组dna分子模型，体会基因的剪切、拼接、缝合的道理。教师交代清楚ecor i是已发现的500多种限制性内切酶中的一种，它是一种从细菌中发现的能在特定位置上切割dna分子的酶。它的特殊性在于，它在dna 分子内部"下剪刀"，专门识别dna分子中含有的"gaattc"这样的
基因工程及其应用》教学设计 一、总体设计指导思想 本节课突出对学生科学素质的培养，精心设计课堂教学，将科学探究的过程作为本节课的教学主线，以求让学生亲身参与、体验科学探究的过程，从而培养学生的科学精神和科学素养。 二、教材分析 基因工程是现代生物科技中的热点，逐渐对人类的生产和生活产生巨大的影响，所以该内容被录入了现行的高中生物必修教材中，并且在选修教材中有更详细的阐述。学习这一内容，既有助于学生对这一前沿科技的了解，也能让学生对科学、技术、社会三者的关系有更深入的理解，还能为学生的人生规划和发展提供一种新的视角。本课学习的基因工程操作的原理及教材概括的基本步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的表达与检测这四个步骤，都可以在必修1和必修2中找到理论基础。但基因工程是在分子水平的操作，操作过程细微，抽象，实验现象看不见也摸不着，只凭教师讲述是很枯燥并较难讲清，学生也难以理解。教学内容的呈现还具有一定的开放性，展示了对转基因食品安全性问题认识的不同观点，引导学生对转基因生物和转基因食品的安全性问题的关注、思考和交流。 三、教学目标 （一）知识与技能 ①知道基因工程的概念 ②掌握基因工程操作的基本工具 ③理解基因工程操作的基本步骤 ④举例说出基因工程的应用 （二）过程与方法 ①通过对概念、原理、方法的理解和掌握，逐步形成分析、综合等思维能力，具备运用学到知识评价和解决实际问题的能力。 ②通过引导学生网上探究，引导学生主动参与，培养收集处理信息的能力、分析和解决问题的能力及交流与合作的能力。 （三）情感态度与价值观 ①形成结构与功能相统一的基本观点。 ②培养理论联系实际的良好学风，培养爱国主义热情。 ③关注科学与社会。 四、教学重难点
高一（生物）基因工程及其应用(第1课时)学案 编制人初审人审核人编制时间 5月20日 班级姓名第小组 【学习目标】: 1.简述基因工程的基本原理； 2.说出基因工程的基本工具 3 简述基因工程的基本操作步骤 【问题导学】: 学点1.基因工程的概念：阅读课本P102第2段回答下面的问题: 1. 基因工程又叫技术或技术。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的提取出来，加以，然后放到另一种生物的细胞里，地改造生物的。 2.精读概念，想一想基因工程为什么又叫基因拼接技术”？ 学点2. 基因工程的工具: : ﹙1﹚基因的“剪刀”：学习课本P102第3段回答下面的问题 ①基因的“剪刀”是指：（简称__________） 一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在的切点上切割DNA分子。 ②EcoRⅠ限制酶识别的特定序列是什么?在哪个部位将序列切开? ③什么是黏性末端？不同的酶切出的黏性末端是否相同?这体现了酶的哪种特性? 【试一试：】试写出下列序列受EcoRⅠ限制酶作用后的粘性末端 CTTCAT GAATTC CCTAA GAAGTA CTTAAG GGATT （2）、基因的“针线”：阅读课本P103第1段回答下面的问题 ①基因的“针线”是指_______ 它可以“缝合”和交替 连接而构成的DNA骨架上的缺口。 ②DNA连接酶作用的部位是氢键吗？ 【试一试：】请在右图中标出DNA连接酶连接的部位。 （3）、基因的“运载体”：阅读课本P103第2段回答下面的问题 ①基因工程中，目前常用的运载体有________、________和______________等。 质粒存在于中，是拟核或细胞核外能够的分子。 ②运载体的作用是什么？质粒的本质是什么？ 学点3. 基因工程的操作步骤：阅读课本P103第3段思考下面的问题 ①什么是目的基因? ②提取目的基因时需要对目标DNA切割几次才能获得目的基因？ ③目的基因与运载体结合时需要对质粒切割几次？ ④切取目的基因和运载体时是否需要使用相同的限制酶？为什么？ ⑤基因工程操作的一般步骤为：__________________、目的基因与___________结合、将目的基因导入_________________、目的基因的________和________。 【小试牛刀】：重组DNA分子的模拟操作(以小组为单位,合作完成)
第2课时 ●教学过程 ［课前准备］ 1.教师准备 （1）教师将听证会规则、程序、角色扮演的程序和具体要求以及评价标准复印好，分发给各学习小组。 （2）教师整理《转基因生物和转基因食品利弊争论的要点》，印发给各学习小组。 （3）收集转基因生物和转基因食品安全性的资料信息，转基因生物技术的利弊关系的资料，请有关专家学者到学校做有关基因工程知识的讲座。 （4）教师设计并参与制作计算机教学课件，在校园网上制作网页，查找大量资料，完善网页内容，建立内容丰富的“基因工程知识资源库”。 （5）教师根据学生的资料准备状况、知识的准确性、抢答的积极性、讲述的条理性、姿态的自然性、课件的美观性编制《学生听课记录和评价表》。 （6）教师编制《研究性学习课题研究专题报告》。 2.学生准备 （1）学生预习教材，对教材中的内容做宏观地了解。 （2）利用课余时间，通过看书、看报及看电视，收集有关基因工程的成果与发展前景的资料或信息并制成课件，也可以走访有关的专家、学者了解该内容。 （3）分组预习并完成教师下发的有关资料。 （4）按听证会的要求摆好课桌椅，根据各小组的选择按辩论的正方和反方分成左右两个大组。 ［情境创设］ 教师：通过课件向学生展示基因工程给人类带来巨大成就的图片。同时述说如下：基因工程自1973年诞生后，由于基因工程技术具有可以直接控制基因，将基因从一个物种转移至另一个物种，创造出新的物种或新的品种的显著特点，也就是说，可按照人们的主观愿望，创造出自然界中原先并不存在的新的生物类型，使人类从单纯地认识生物和利用生物的传统模式跳跃到随心所欲改造生物和创造生物的新时代。经过30多年的发展历程，取得了惊人的成绩，特别是近10年来，基因工程的发展更是突飞猛进。基因转移、基因扩增多技术的应用，不仅使生命科学的研究发生了前所未有的变化，而且在实际应用领域中，为农牧业、食品工业、医药卫生、环境保护等方面开拓了广阔的发展前景。 今天就由同学们来阐述自己的认识和看法。 ［师生互动］ 教师：首先请各小组汇报课前收集到的有关基因工程应用的事例资料。 学生分组汇报并交流课前收集资料的情况。 学生1：基因工程在农业上的应用主要表现在两方面： （1）通过基因工程技术获得高产、稳产和具有优良品质的农作物。 （2）用基因工程的方法可培育出具有各种抗逆性的作物新品种。现在已培育出一批分别具有抗病、抗虫、抗除草剂、抗盐碱、抗病毒、抗干旱等性状的转基因农作物。1996至2000年的短短五年间，全球转基因作物从170×104 hm2发展到4 420×104 hm2，其推广速度是前所未有的…… 学生2：基因工程在畜牧养殖业中的应用 基因工程在畜牧养殖业上的应用也具有广阔的前景，科学家将某种特定基因与病毒DNA构成重组DNA，然后，通过感染或显微注射技术将重组DNA转移到动物受精卵中，并由这种受精卵发育成新个体，这就是我们在前面提到的转基因动物。通过转基因动物人们
五种常用的植物转基因技术 杂粮作物2010 . 30(3):186～189RainFedCrops''…… 文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04 五种常用的植物转基因技术 汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞 (1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167) 摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管 通道法等5种常用的植物转基因技术进行了简要介绍. 关键词:农杆菌介导法;基因枪法;超声波介导法;子房注射法;花粉管通道法;原理;基本步骤;优缺点 中图分类号:$336文献标识码:B 植物转基因技术是通过各种物理的,化学的和生物的 方法将从动物,植物及微生物中分离的目的基因整合到植 物基因组中,使之正确表达和稳定遗传并且赋予受体植物 预期性状的一种生物技术方法.1983年,首例抗病毒转 基因烟草的成功培育标志着人类开始尝试利用转基因技 术改良农作物.目前,植物转基因技术已在作物改良和育 种领域发挥了重要作用.通过植物转基因技术,一些来自 于动物,植物及微生物的有益基因如抗病/虫基因,抗非生 物胁迫性状基因及特殊蛋白基因已被转化到农作物中以 改良现有的农作物和培育新的农作物品种.以DNA重组 技术为基础的植物转基因技术极大地扩展了基因信息的 来源,打破了远缘物种间自身保持遗传稳定性的屏障.植
物转基因技术已应用到玉米,水稻,小麦,大豆和棉花等许多农作物.同时,该技术也正在被尝试用于茄子和草莓等其它的作物中"J.目前,根据转基因植物的受体类型, 植物转基因方法可以分为3大类:以外植体为受体的基因转化方法,如农杆菌介导法,基因枪法和超声波介导法;以原生质体为受体的基因转化方法,如聚乙二醇法,电击法, 脂质体法及磷酸钙?DNA共沉淀法;以种质系统为受体的基因转化方法,如子房注射法和花粉管通道法j.由于以 原生质体为受体的基因转化方法有原生质体培养难度大, 培养过程繁杂,培养工作量大且培养技术不易掌握;原生质体再生植株的遗传稳定性差,再生频率低并且再生周期长;相关的转化方法的转化率低,效果不理想等缺点,所以该类基因转化方法未被作为植物转基因的常规方法广泛使用.本文将对农杆菌介导法,基因枪法,超声波介导 法,子房注射法和花粉管通道法的原理,基本步骤和优缺点作以简要介绍. 1以外植体为受体的基因转化方法 1.1农杆菌介导法 农杆菌介导法是最早应用,最实用有效并且具有最多 成功实例的一种植物转基因方法J.农杆菌是一类普遍 存在于土壤中的革兰氏阴性细菌.目前,用于植物转基 因介导的农杆菌是根癌农杆菌和发根农杆菌.某些根癌 农杆菌和发根农杆菌分别含有大小为200—800bp的结构和功能相似的质粒和Ri质粒J.Ti质粒和Ri质粒含 有3个功能区:参与农杆菌侵染植物过程的vir区,参与农杆菌基因整合到宿主植物基因组过程的T-DNA区,在农杆菌中启动质粒复制的orj区.在vir区上的vir操纵子群作用下,rrj质粒和Ri质粒能将自身的T-DNA转入宿主植物细胞内,而后将T—DNA整合到植物基因组中J.T-