化工学院
食品微生物学实验指导
目录
实验一培养基的制备 ······························································································- 1 - 实验二微生物的接种与培养技术 ············································································- 9 - 实验三普通光学显微镜的使用及细菌的革兰氏染色··············································- 15 - 实验四酵母菌的形态观察、细胞大小测定及细胞计数 ··········································- 22 - 实验五霉菌的形态观察·························································································- 26 - 实验六食品中细菌总数的测定 ··············································································- 29 - 实验七食品中大肠菌群的测定 ··············································································- 33 - 实验八微生物菌种的分离筛选 ··············································································- 36 - 实验九细菌的生理生化实验··················································································- 39 - 附录I 染色液的配制······························································································- 42 - 附录Ⅱ培养基的配制 ····························································································- 42 - 附录Ⅲ试剂和溶液的配制 ·····················································································- 43 - 附录Ⅳ实验报告要求 ····························································································- 45 -
- 1 - 实验一 培养基的制备
背景知识
一、实验目的
1．了解并掌握培养基的配制、分装方法。
2．掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是人工配制的，供微生物生长、繁殖、代谢的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物，或者积累代谢产物。由于微生物种类繁多，营养类型多样，对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。
微生物细胞化学组成包括水分、有机化合物（蛋白质、核酸、碳水化合物和类脂）、矿物盐类及生长素，因此为了满足微生物生长和代谢需要，培养基中必须含有这些基本的营养物质，即碳源、氮源、能源、无机盐和微量元素、生长因子以及水分等。培养基中各营养成分的浓度与配比要合理，具有适宜的碳氮比和无机盐离子浓度等。
另外，培养基还应具有适宜的pH 值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。不同微生物对pH 要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基pH 一般为中性或微碱性的（嗜碱细菌和嗜酸细菌例外）。
三、实验材料
1．试剂 牛内膏、蛋白胨、氯化钠、酵母膏、葡萄糖、PDA 琼脂、琼脂粉、6mol/L 氯化钠、10%氢氧化钠等。
2．仪器与其它材料 天平、电炉、灭菌锅、干燥箱、称量纸、牛角匙、pH 试纸、量筒、烧杯、试管、试管塞、三角瓶、三角瓶塞、移液管、培养皿、玻璃棒、棉花、线绳、牛皮纸、报纸等。
四、实验步骤
（一）操作流程
称药品→溶解→调pH 值→液体培养基→融化琼脂→固体培养基→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查
（二）操作方法
1．器皿的准备
⑴玻璃器皿的清洗
新购置的玻璃器皿含有较多的游离碱，应用2%盐酸浸泡数小时后冲洗。
用过的器皿可用肥皂洗
- 2 - 衣粉等洗涤剂刷洗，装有固体培养基的器皿应先将其刮去再洗涤。带菌的器皿先浸在2%煤酚皂（来苏尔）或0.25%新洁尔灭消毒液内24h 或煮沸0.5h ，再去洗涤，带病原菌的培养物及器皿等洗刷前应进行高压蒸汽灭菌。载玻片、盖玻片、吸过菌液的吸管应浸入2%煤酚皂、0.25%新洁尔灭或5%石炭酸溶液中24h 后，再于洗涤剂热水中清洗。载片用自来水冲洗后，浸于95%乙醇中保存备用。若器皿上沾有油污，可先用有机溶剂（苯、二甲苯、丙酮等）擦拭，或用加热方法使之熔化揩去。
⑵器皿的包扎
平皿 将洗净干燥后的几套培养皿顺式叠在一起，用旧报纸将之卷成一包，双手同时折报纸往前卷，并边卷边收边，使纸贴于平皿边缘，最后的纸边折叠结实即可；或者将几套培养皿直接置于特制的不锈钢带盖圆筒内，置于干燥箱中进行干热灭菌。
移液管 用伸直的曲别针将上端塞少许棉花，棉塞长度1cm 左右，距管口5mm ，以免唾液浸湿，造成通气不良，然后用报纸包紧。先将报纸裁成宽5cm 左右的长纸条，然后将吸管尖端以30~45度角放于纸条的一端，折叠纸条包住尖端，用一手握住管身，一手将吸管压紧在桌面上向前流滚动，以螺旋式包扎起来，上端剩余纸条折叠打结，并用记号笔在纸上标明毫升数，再用线绳分批捆扎好，以备干热灭菌。也可将包装好的吸管放于特制的带盖不锈钢圆筒内，加盖密封后灭菌。
图1-1 移液管的包扎过程
三角瓶与试管 口先塞好棉花塞，棉塞长度的1/3在管口外，2/3在内，外包一层牛皮纸，用线绳扎好。
棉塞的制作 视试管和三角瓶的大小取适量棉花（选纤维长的新棉花，不可选脱脂棉），分成数层，互相重叠，使其纤维纵横交叉，然后将其折叠卷起，塞进瓶口，注意不可塞得过松或过紧，棉塞与管壁间不留缝隙和皱纹。制作好的棉塞经干热灭菌高温定型后，再用一方块纱布包裹起来。目前也有采用金属或塑料试管帽或耐高温硅胶塞代替棉塞。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，可用八层纱布，或在两层纱布间均匀铺一层棉花代替棉塞包于三角瓶口上，既保证通气良好，过滤除菌，又操作简便。
图1-2 棉塞的制作方法（A ．正确 B 、C ．不正确 ）
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⑶干热灭菌 160℃，2h 。
2．培养基的制备
⑴称量和溶解 先取所需水量的一半放于烧杯中，再按配方的顺序逐一称取并溶解各成分。药品完全溶解后，停止加热，补足水分。加料过程中，各种成分溶解的顺序是先加缓冲化合物，然后是主要元素、微量元素，最后加维生素等。
⑵调pH 值 将溶液冷却至室温，先用试纸测试溶液的原始pH
值，再根据要求的pH 值确定需加酸或加碱，用10%NaOH 或6N HCl
溶液调至所需pH 值。
⑶融化琼脂 琼脂加入后，在烧杯上划一水面刻度线，置电炉上
一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足蒸发
的水分（水需预热）。
⑷过滤分装 固体分装量为管高的1/5，液体分装量为管高的
1/4，半固体以试管高度的1/3为宜；三角瓶装量不超过其容积的
50％为宜。
⑸包扎标记 分装后加好棉塞，再包一层防潮纸，以防灭菌时冷
凝水润湿棉塞，其外再用棉绳系好。标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
⑹灭菌 培养基的灭菌时间和温度，应按各种培养基的规定要求进行，以保证灭菌效果和不破坏培养基的营养成分。通常对普通营养培养基用0.10Mpa （121℃）高压蒸汽灭菌20-30min 。注意培养基中有糖类、尿素、氨基酸、酶、维生素、抗生素、血清等成分时，因之它们在高温下易分解、变性，故应单独使用滤菌器过滤除菌，再按规定的温度和用量加入已灭菌的培养基中。
⑺倒平板摆斜面
倒平板：左手持三角瓶，右手反转手掌用中指和无名指拔出棉塞（或不翻转手掌用小指和手掌拔出棉塞），同时将三角瓶转换至右手，左手拿平皿，以大拇指和食指将皿盖打开一缝，至瓶口刚好伸入。三角瓶经火焰灼烧后，倾入灭菌培养基约15mL （勿使瓶口靠在平皿壁上，以免沾染皿壁），迅速盖好皿盖，置于桌上轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿底部，冷凝后即为平板培养基。为防止冷凝水过多，应将培养基冷却至50℃左右再倒平板。有时凝固后的培养基表面有冷凝水，可将平皿盖打开，倒置于37℃温箱中，以除去冷凝水，否则将影响平板分离培养效果。
图1-4 倒平板
图1-5 摆斜面
图1-3培养基分装装置
摆斜面：将冷却至50℃左右的灭过菌的试管固体培养基趁热斜置于桌面，使其凝固形成斜面，注意温度不可过高，以免形成过多冷凝水，斜面长度不超过试管总长的一半。如制作半固体或固体高层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
⑻无菌检查将灭菌培养基于37℃下培养24~48h，若无菌生长，可保存备用。
五、注意事项
1．牛肉膏用玻棒挑取，一种药品用一个药匙，不可混用，称完药品要及时盖紧瓶盖以免吸潮。
2．溶解时要不断搅拌，以防液体溢出。在配制高氏一号这样的合成培养基时，其中含有的多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。有时还须将个别成分单独灭菌，使用时再按比例混合。配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加入其他原料。
3．调pH值时待溶液冷至室温后再调。根据溶液的原始pH逐渐调节，避免调过头再回调而影响培养基内各离子的浓度。一般加热灭菌后培养基的pH值会下降，因此要将pH值调高0.2。
4．融化琼脂时要不停的搅拌，并且注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5．过滤分装时注意勿使培养基沾在管口上，以免沾污棉塞。
6．灭菌：灭菌前要检查锅内的水是否在水位线，以防干锅；降压时不能过早过急地打开排气阀，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
六、结果
1．记录本实验配制培养基的名称、类型及数量，并分别说明其用途。
2．对培养基的配制效果进行评价（如装液量是否合格、瓶口是否污染、斜面是否平整是否有过多的冷凝水、是否染菌等）。
七、问题讨论
1．如何在培养基配制过程中尽量避免或减少对各种成分的破坏？
2．培养基中加琼脂的作用是什么？固体培养基加琼脂后加热溶化时要注意哪些问题？
3. 如何检查培养基灭菌是否彻底？
4．干热灭菌和湿热灭菌哪一种效果更好，为什么？影响培养基灭菌效果的因素有哪些？
附1：操作内容
1．培养基制备
A组（实验一至六用）
①牛肉膏蛋白胨培养基250mL 斜面5mL/支×4；固体（80mL/250mL△瓶×1；
100mL/250mL△瓶×1）P42 II 一
②YEPD 20mL 液体5mL/支×4；P42 II三
③PDA琼脂100mL 80mL/250mL△瓶×1；P42 II二
④生理盐水（0.85%NaCl）350mL 225mL/500mL L△瓶×1（加玻璃珠10个）；9mL/支×10 - 4 -
B组（实验六至八用）
①生理盐水300mL 225mL/500mL△瓶×1（加玻璃珠），9mL/支试管×5；
②BGLB培养基：120mL/250mL△瓶；P42 II 四1
③结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）60mL：5mL/支试管×12（加杜氏小管）；P43 II 四2
④葡萄汁固体平板：80mL/250mL△瓶；P43 II 五2
⑤TTC上层培养基：80mL/250mL△瓶；P43 II 五3
2．其它玻璃器皿干热灭菌：平皿20套，移液管1 mL×6
附2：培养基的种类及灭菌方法介绍
1．培养基的种类
根据微生物的种类和实验目的的不同，有多种分类方法。
⑴按营养物质来源分天然、合成、半合成培养基。
①天然培养基
是利用含有丰富营养的天然有机物质制成的培养基，如马铃薯、玉米粉、豆饼粉、豆芽汁、牛肉膏、蛋白胨、血清等。配制方便，营养丰富，经济实用，但其具体成分不清楚也不恒定。
②合成培养基
用化学成分完全了解的纯化学药品试剂配制而成的培养基，如高氏Ⅰ号培养基，察氏培养基等。适用于定量工作的研究，如微生物的形态观察、营养代谢、分类鉴定、菌种选育、遗传分析等，重复性好，但一般微生物在合成培养基上生长缓慢，而且对于一些营养要求复杂的微生物，在合成培养基上还不能生长。
③半合成培养基
在以天然有机物作为微生物营养来源的同时，适当补充一些成分已知的化学药品所配制的培养基叫半合成培养基。大多数微生物都能在此种培养基上生长，应用广泛。例如常用的马铃薯葡萄糖培养基，很多霉菌都生长良好。
⑵按用途分基础、增殖、鉴别、选择培养基。
①基础培养基
含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质，如牛肉膏蛋白胨培养基。它可以作为一些特殊培养基的基础成分。
②增殖培养基（加富培养基）
在基础培养基中加入某些特殊营养物质，用以培养某些有特殊营养要求的微生物，如纤维素酶生产菌株的筛选培养基中加入纤维素粉或滤纸条作为唯一碳源。
③鉴别培养基
在普通培养基中加入某种特定化合物或试剂，某些微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以
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将某种微生物与其他种微生物区别开来。主要用于不同类型微生物的快速鉴定，如用来检查细菌能否产生硫化氢的醋酸铅培养基。
④选择培养基
利用微生物对某种或某些化学物质的敏感性不同，在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利于所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如在分离放线菌时，于培养基中添加10%酚数滴，可抑制细菌和霉菌的生长；分离酵母菌和霉菌时，在培养基中加氯霉素、青霉素等以抑制细菌的生长。
⑶按培养基的物理状态分固体、半固体、液体培养基。
三种培养基的凝固剂含量不同，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅胶。理想的凝固剂应具备以下条件：不被微生物液化分解和利用；在微生物的生长温度范围内能保持固体状态；凝固剂的凝固点温度对微生物无害；不会因培养基灭菌而被破坏；透明度好，粘着力强；配制方便，价格低廉。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98~100℃下融化，45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。另外，在较低的pH值条件下由于发生水解作用也会影响其凝固性。
半固体培养基是在液体培养基中加入0.2-0.8%的琼脂，固体培养基加1.5-2%的琼脂。
此外，发酵工业中常选用小米、大米、麸皮等植物性原料制作固体培养基，进行固态发酵。营养丰富，质地疏松透气，表面积大。
⑷按生产要求分种子培养基和发酵培养基。
2．消毒与灭菌方法及其对培养基成分的影响
由于配制培养基的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养菌使用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
⑴消毒与灭菌的定义消毒一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体，灭菌则指杀灭一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒与灭菌方法有物理法（加热、过滤、照射）与化学法。
⑵灭菌方法分类
⑶灭菌对培养基成分的影响培养基灭菌时常常发生有害的变化，只有极少数的培养基对热是完全稳定的。通常培养基成分、pH值及物理状态等都对灭菌或消毒效果有直接的影响。
①pH值普遍下降。
②产生混浊或沉淀，这主要是由于一些离子发生化学反应而产生混浊或沉淀。例如Ca+2与PO4-3化合，就会产生磷酸钙沉淀。
③不少培养基颜色加深(形成氨基糖和焦糖)。
④体积和浓度有所变化。
⑤营养成分有时受到破坏。
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附3： HVE-50高压灭菌锅使用说明
操作步骤：
1． 将开/关杠杆设在左侧，然后按下“POWER ON/OFF ”键开机。
2． 将开/关杠杆调向右侧，把盖打开，向灭菌锅内注水直到看到水漫过
底盘中心的孔（大 约需要2.0升水）。
3． 放置待灭菌的物品，盖上盖子到磁封条封好，将开/关杠杆调向左侧
把盖锁住。
4． 选择运行模式：
按“MODE ”键，会依次出现“MODE1，2，3，1……”，其中：
“MODE1”为对琼脂类半固体的灭菌方式（有保温使其不凝结的功能）；
“MODE2”为对液体类物质的灭菌方式；
“MODE3”为对器具类物质的灭菌方式（如玻璃器皿、陶瓷器皿、不锈钢器皿等）。
5． 更改设定数值（依用户要求而定）：
(1) 按“SET/ENT ”键选择设置；
(2) 按“NEXT ”键选择要更改的项目；
(3)通过按“▲，▼”键更改数值；
(4)按“SET/ENT”键保存修改后的设置，或者按“MODE”键取消修改后设置的保存。
6．启动灭菌程序：
(1)确定放气瓶内的水位在“HIGH”和“LOW”之间；
(2)确定排水瓶内的水位足够低，不会碰到排气管的顶端；
(3)确定放气阀是关着的；
(4)按“START/STOP”键启动灭菌程序。
7. 灭菌完成后，将开/关杠杆调到右侧，打开盖子，拿出灭好的物品。
8. 按“POWER ON/OFF”键断开电源（如果放气阀开了，将其关上）。
9. 若需要在程序运行过程中中断灭菌，按“START/STOP”键。
保持与维护：
1．当放气瓶中的水位高于“HIGH”标记时，在灭菌前将水倒出至“LOW”标记。
2．为避免阻塞管系，应每两周清洗内腔并换水一次；该设备准备长时间停用时，要将灭菌锅内的水排空。（注意清洗时不要损伤下面的温度探头）
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实验二微生物的接种与培养技术
一、实验目的
1．学习掌握微生物的几种接种技术。
2．建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节。
二、实验原理
1．接种
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术，无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。
2．无菌操作
培养基经灭菌后，用灭菌的接种工具，在无菌的条件下接种含菌材料于培养基上，这一过程的操作称为无菌操作。
为了获得微生物纯培养物，首先应创造无菌操作条件，一般接种操作在无菌室、超净工作台和酒精灯火焰旁进行。其次操作时须注意以下操作要点：所有使用器皿均须严格灭菌；接种用的培养基均须事先做无菌培养试验；双手用酒精棉或新洁尔灭擦拭消毒；操作过程不离开酒精灯火焰；操作要正确、迅速；接种工具使用前和后须经火焰烧灼灭菌，才能接种或放在桌上；棉塞不能乱放，操作时始终夹持于手指中，棉塞回塞时应松紧适宜。
三、实验材料
1．菌种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌斜面，酿酒酵母斜面，青霉、曲霉、根霉、毛霉斜面。
2．培养基肉膏蛋白胨培养基（斜面、固体）、YEPD液体培养基、PDA培养基（斜面）。
3．仪器与其它材料培养箱、酒精灯、玻璃铅笔、火柴、试管架、接种环、接种针、标签纸等。
四、实验步骤
（一）操作流程
贴标签→点酒精灯→擦手和桌面→旋松棉塞→烧环→拔塞→接种→加塞→烧环
（二）操作方法
1．接种前准备
⑴接种室定期熏蒸，或用5%煤酚皂或75%酒精擦拭桌面、地面。
⑵要接种的全部物品贴好标签移入无菌室，连同工作服、鞋帽，开紫外灯照射20~30min。
⑶接种后清理物品，在缓冲间脱去工作服鞋帽，将物品移出，打开紫外灯灭菌。接种前先点燃酒精灯，再用75%酒精棉球擦拭手、操作台。
2．接种操作
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将菌种管（置于外侧）与待接种管（置于内侧）持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，掌心和斜面向上，管口对齐朝向酒精灯火焰，斜持试管呈0°~45°角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平以免管底凝集水浸湿培养基表面。用右手在火焰旁转动管塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。先将环端烧热，然后将接种环提起垂直放在火焰上，以使火焰接触金属丝的范围广一些，待接种环烧红，再将接种环斜放，沿环向上，烧至要伸入试管的所有部分，再移向环端，如此很快地通过火焰数次。尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拔出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能玷污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。
将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环勿碰管壁，也不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。
⑴斜面接种在试管中由下往上做S形划线。划线时环要平放，勿用力，否则会使培养基表面划破。酵母菌采用中央划直线法接种。霉菌常采用点种法，在斜面的中部偏下方处点种。
⑵平板接种将已灭菌的琼脂培养基充分加热溶化，待冷却至50℃左右后，用无菌操作法倒平板，待培养基冷却后接种。用三区划线法用接种环在培养基表面划折线。
⑶穿刺接种用笔直的接种针，向培养基中心穿刺，一直插到接近管底，再沿原路抽出接种针。
⑷液体接种①由斜面培养物接种至液体培养基：若接种量小，可用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次使菌体分散到液体中。如接种量较大，可先在斜面菌种管中注入定量无菌生理盐水，用接种环将菌苔刮下并研开，再将菌悬液倒入液体培养基中。②由液体培养物接种液体培养基：用接种环蘸取少许液体培养物移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器定量吸取培养液移至新液体培养基。
接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，烧灼管口，迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞，将试管放入试管架，即可进行培养。
3．培养
细菌：37℃，2~3d；霉菌：28℃，3~7d。
4．结果观察
（三）操作内容
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五、注意事项
1．接种前要对手及操作台进行消毒处理，先点酒精灯后擦手。
2．接种环要彻底灭菌，尤其是接镍铬丝的螺口部分。
3．接种时打开皿盖的时间要尽量短，试管应倾斜，且应在火焰区的无菌范围内（酒精灯火焰中心半径5cm）操作，动作要迅速。
4．挑取菌苔前先将接种环在管壁或无菌培养基表面冷却，挑取菌苔后应勿使接种环碰触管壁。
5．划线时勿用力，以免划破培养基表面。
6．注意勿使棉塞烧着。
7．穿刺接种时要直上直下，勿使接种针在培养基内左右移动，勿穿透培养基。
六、结果
1．分别评价各细菌在不同培养基中的接种效果和生长情况，并描述其在平板固体培养基中的培养特征。
2．描述霉菌在PDA平板培养基上的接种效果、生长情况和培养特征。
七、问题讨论
1．试述如何在接种过程中贯彻无菌操作的原则？
2．谈谈如何根据不同的实验目的选择合适的接种方法？
附：微生物接种方法、接种工具与培养特征介绍1．微生物的接种方法
根据不同的目的和使用的培养基不同可将接种方法分为斜面接种法、平板接种法、液体接种法和穿刺接种法等。
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- 12 - ⑴斜面接种 是从已长好的菌种培养物中挑取少许菌种移植至另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法，又分为点接法、中央划线法、稀波状蜿蜒划线法、密波状蜿蜒划线法、分段划线法、纵向划线法等，可根据所接微生物的种类和目的不同进行选择。
a b c
图2-1 斜面接种法示意图
a.中央划直线法；
b.稀波状蜿蜒划线法；
c. 密波状蜿蜒划线法
①点接法 把菌种点接在斜面底部中央，利于在一定时间内暂保藏菌种。对于菌落为扩散性生长的根霉和毛霉等常采用此法。
②中央划线法 在斜面的中央自下而上划一直线。酵母菌及菌落为局限性生长的曲霉、青霉等霉菌的菌种保藏，以及比较细菌的生长速度、观察菌体形态与培养特征时采用此法。
③稀波状蜿蜒划线法 易扩散的细菌常用此法。
④密波状蜿蜒划线法 可以充分利用斜面，获得大量的菌体细胞，是最常用的细菌接种法。 ⑵平板接种 是用接种环将菌种接种到平板培养基上，或用无菌吸管将定量菌液接种至平板培养基上的方法，主要用于观察微生物的菌落形态特征、分离纯化菌种和平板菌落计数，包括点接、划线接种、涂布接种、倾注接种。点植接种适用于观察霉菌的菌落特征，方法为先将灭菌的接种环蘸少许无菌生理盐水，以免接种时霉菌孢子飞逸，再挑取斜面上少量菌丝或孢子，以三个角三点的形式轻轻点种于平板培养基上，亦可先做成浓孢子悬液，再进行接种。接种时最好倒置平皿，以免霉菌孢子飞扬。
图2-2 平板划线接种示意图
- 13 - ⑶液体接种 是将斜面或液体培养物接种到液体培养基（如试管或三角瓶）中的方法，多用于观察细菌、酵母菌的生长特性、生化反应特性及发酵生产中菌种的扩大培养。
图2-3 液体接种示意图 图2-4 穿刺接种示意图
⑷穿刺接种 是将菌种接种到半固体高层培养基中的方法，只适用于细菌和酵母菌，用于菌种保藏或检查细菌的运动能力。有两种手持操作法，一种是水平法，它类似于斜面接种法；另一种是垂直法。
2．微生物接种工具
常用的接种工具有接种针、环、钩，接种圈，涂布器，吸管，移液器等。接种针、环、钩，最早都是用白金制作，通称为白金耳，因价格昂贵，现多用镍铬合金制作。选择材料的原则是软硬适度，能经受火焰反复烧灼，又易冷却。
接种针 长度为8cm ，直径0.5mm ，呈直线状，固定在长约20cm 的金属柄上，多用于半固体培养基的穿刺接种。
接种环 在接种针末端用镊子卷成直径为2mm 的密封圆圈，将圆环平面与金属柄之间弯成160-170o 角，常用于细菌和酵母菌的斜面、平板等的接种。
接种钩 在接种针末端弯成一个长约3mm 的直角，即成接种钩，其丝的直径约1mm ，常用于接种某些不易和培养基分离的放线菌和真菌。
涂布器 在火焰上将直径3~4mm ，长20cm 的玻璃棒一端弯成边长3cm 的等边三角形，最后将该平面与柄之间弯成140 o 角。用于菌种分离或平板活菌计数时涂布平板。
图2-5 微生物接种种工具（A ．接种环；B ．接种针；C ．接种钩；D ．接种铲；E 、F ．玻璃涂布器）
3．微生物的培养特征
微生物的培养特征是指微生物在固体、半固体培养基上和液体培养基中生长后所表现出的群体形态特征。它取决于微生物的细胞结构和生长行为。
- 14 - 菌苔 如果将某一纯种细胞大量密集地接种于固体培养基表面，菌体生长形成的各菌落连接成片，则称菌苔。
⑴菌落特征
将单个微生物细胞或多个同种细胞接种于固体培养基表面，经适宜条件培养，以母细胞为中心在有限空间中大量繁殖，扩展成一堆肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞群落，称为菌落。
各种微生物在一定条件下形成的菌落，其形态特征有一定的稳定性和专一性，因而可以作为识别、鉴定菌种的一个依据。但它也受某些因素的影响，如细胞表面状况、排列方式、代谢产物、邻近菌落、培养基成分、培养时间、培养温度等，观察时应加以注意。
⑵斜面培养特征
培养在固体斜面表面，可以呈丝线状、刺毛状、念珠状、疏展状、树枝状或假根状。
⑶液体培养特征
培养在液体培养基中，可以呈混浊状、絮状、形成菌膜、上层清晰而底部显沉淀状。
⑷穿刺培养特征
培养在半固体培养基中，可以沿接种线向四周蔓延或仅沿线生长，也可上层生长很好，甚至连成一片，底部很少生长或底中长得好，上层甚至不生长。
图2-6 细菌的培养特征
实验三普通光学显微镜的使用及细菌的革兰氏染色
一、实验目的
1．复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。
2．学习并掌握油镜的工作原理和使用方法。
3．了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
4．学习掌握革兰氏染色技术，巩固光学显微镜油镜的使用方法。
二、实验原理
1．油镜的工作原理
在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响显微镜的分辫率。油镜的放大倍数最大，使用时需浸在香柏油中，这有两方面的原因：
⑴增加照明亮度油镜的放大倍数大，焦距短，镜头直径很小，进入镜头的光线也少，因此所需要的光照强度最大。而当以空气作为介质时，会有一部分光线因空气与玻璃的折射率不同而被折射不能进入镜头，使视野更暗，物像不清晰。在镜头与标本片之间滴上与玻璃折射率相仿的香柏油，可以消除光由一种介质进入另一种介质时发生的散射和折射，从而提高照明度。
⑵提高显微镜的分辨力显微镜的分辫率或分辫力(resolution or resolving power)是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。
分辨率（最小可分辨距离）=λ/2NA
式中λ为光波波长（0.4~0.7μm），NA为物镜的数值孔径值（NA＝n·sinα）。α为光线最大入射角（镜口角）的半数，它取决于物镜的直径和焦距。一般在实际应用中最大只能达到120，而n 为介质折射率。由于香柏油的折射率(1.515)比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2~1.4）要高于低倍镜和高倍镜(NA都低于1.0)。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.42μm的物体，而数值孔径值在 1.25的油镜的分辨率却可达到0.22μm左右。大部分细菌的直径在0.5μm以上，所以油镜更能看清细菌的个体形态。酵母菌和霉菌的直径为几到几十微米，因此用低倍镜或高倍镜便可清晰观察。
2．微生物染色的基本原理
由于微生物细胞呈透明状，含有大量的水分（一般在80~90%），对光线的吸收和反射与水溶液的差别很小，与周围的背景没有明显的明暗差，因而在普通的光学显微镜下不易识别。除观察活体微生物的运动性和直接计算菌体数外，必须对它们进行染色。利用染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用。物理因素如细胞及细胞质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而使之发生各种化学反应。影响染色的其它因素还有
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菌体细胞的构造和其外膜的通透性、培养基的组成、菌龄、染色液中的电介质含量和pH、温度、药物的作用等。
3．染色的一般操作程序
涂片→（干燥→固定）→染色→水洗→干燥→镜检
染色前必须固定细菌，其目的有三：一是杀死细菌，固定细胞结构；二是使菌体牢固地粘附于玻片上，防止被水冲掉；三是改变染料对细胞的通透性，增加细胞对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法，化学固定用于血液、组织脏器等，常用甲醇固定。固定时尽量维持细胞原有的形态。
4．革兰氏染色法
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法。经此方法染色后，可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G＋)和革兰氏阴性菌（G—）两大类，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料
1．菌种大肠杆菌与未知菌液体培养物。
2．试剂结晶紫染色液、卢哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液、香柏油、乙醇与乙醚（3：7）混合物。
3．仪器与其它材料显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水。
四、实验步骤
（一）操作流程
涂片→（干燥→固定）→[染色（初染→媒染→脱色→复染）→水洗→干燥]→镜检
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图3-2 涂片、干燥和热固定
（二）操作方法
1．涂片取保存于95%酒精中的洁净无油的载玻片用洁净滤纸擦酒精，然后在酒精灯火焰上烤几次，再用滤纸擦拭干净，用记号笔注明菌名。采用“三区”涂片法。干燥、固定。
⑴固体材料在载玻片上滴一滴无菌生理盐水，用接种环以无菌操作从斜面或平板培养物上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
⑵液体材料直接用接种环取2~3环菌液于载片中央，涂抹均匀。
2．干燥、固定将涂片的涂面朝上，以钟摆速度通过火焰3~4次，略微加热固定。
3．初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于玻片的涂面上，染色0.5~1 min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。自然干燥或用滤纸吸干水分。
4．媒染滴加碘液媒染约1 min，水洗。
5．脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。脱色时间一般为20~30 s。
6．复染在涂片上滴加番红液复染1~2 min，水洗，然后用吸水纸吸干。
7．镜检用滤纸吸干水分，油镜检查。显微镜的使用流程为，安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检（低倍镜→高倍镜→油镜）→擦镜→复原，具体方法如下：
⑴观察前准备
a. 显微镜的安置将显微镜置于平整的实验台上，镜座距台边约10cm。左眼观察，右眼绘图或记录，两眼同时睁开，以减少眼睛疲劳。
b. 光源调节调节安装在镜座上的电流调节螺旋或聚光器、光圈以获得适当的照明亮度。检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强，可通过光圈、聚光器调节适宜的光线。
c. 双筒显微镜的目镜调节根据使用者个人的情况，调节两筒间距及左筒屈光度，以适应眼距或两眼视力不同的观察者。
d. 聚光器数值孔径值的调节聚光器的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，通过调节使其与物镜的数值孔径值相符或略低。其目的是使入射光所展开的角度正好与物镜镜口角相一致，以充分发挥物镜的分辨力，并把超过物镜所能接受的多余光挡掉，否则会发生干扰，影响清晰度。调节方法：取下目镜，直接向镜筒内观察，先将可变光阑缩到最小，再慢慢地打开，使聚光器的孔径与视野恰好一样大，然后放回目镜。
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⑵显微观察
一般情况下，特别是初学者，应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。因为低倍数物镜视野相对较大，易发现目标和确定检查的位置。
a. 低倍镜观察将标本玻片置于载物台上，用弹簧夹固定，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10倍物镜接近标本，以粗螺旋调节，使载物台缓慢下降，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节螺旋调节使物像清晰。慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。
b, 高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标，并将其移至视野中心后，将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节螺旋使物像清晰，利用推进器移动标本找到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。
c. 油镜观察在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将载物台下降，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将载物台上升，使镜头浸在油中，并几乎与标本接触时止（注意：切不可将油镜镜头压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。将聚光器升至最高位置并开足光圈（若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能），调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将载物台徐徐下降，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。然后用相同的方法观察其他样本。
⑶观察后的处理
下降载物台，取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸沾取少许乙醚—乙醇混合液擦去镜头上的残留油迹，尔后用擦镜纸擦去残留的乙醚—乙醇，最后用绸布清洁显微镜的金属部件。将各部分还原，物镜转成“八”字形，再将载物台降至最低，降下聚光器以免与接物镜发生碰撞。套上镜套，放回原处。
五、注意事项
1．载玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
2．滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不宜过厚，否则脱色不完全造成假阳性。
3．热固定温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4．水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急过大，以免涂片薄膜脱落。
5．革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，革兰氏阴性菌被误染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌被误染成革兰氏阴性菌。
6．在染色的过程中，不可使染液干涸。
7．选用适龄培养物(18~24h)，菌龄过长则细菌的死亡或自溶也常使阳性菌呈阴性反应。
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实验一食品中细菌总数的检验 一、实验目的要求 1、了解细菌总数检验的意义。 2、掌握样品稀释处理的方法和菌落总数计数的方法 3、掌握国标法测定菌落总数的方法和技能 4、熟练无菌操作技术。 二、原理 菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落总数。菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。 菌落总数并不表示样品中实际存在的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材（清洗、烘干、包扎、灭菌） 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个配制生理盐水 3、250ml三角瓶2个配制营养琼脂 4、18×180mm试管3支稀释样品 5、1ml移液管 5 支 6、直径为90mm平皿10套倒营养平板 7、250ml量筒1支 8、玻璃珠：直径约5mm （二）应灭菌、消毒的器材 剪刀1把不锈钢药匙1把称量纸：适量 酒精消毒的器材：吸耳球1个，滴管胶头4只，开瓶器
（三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1、0.85%NaCl生理盐水1瓶300ml/瓶500ml三角瓶 2、平板计数琼脂（PCA）培养基：2瓶100ml/瓶250ml三角瓶 四、实验内容 （一）、基本操作过程： 样品称量→→样品稀释→→倾注平皿→→培养48小时→→计数报告。 （二）、样品的稀释（样品的处理） 样品：袋装乳粉 外包装消毒→→无菌称样品25g→→加无菌生理盐水→→加盖振荡摇均匀 1、用75%酒精棉球擦拭消毒袋口，用无菌剪刀开封取样。称取检样25g，放入装有适量玻璃珠的灭菌广口瓶子中，然后用225mL温热的灭菌生理盐水徐徐加入（先加入少量生理盐水将乳粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结团），采用振摇法（用力快速振摇50次,振幅不小于40cm）振摇均匀，即为1:10的稀释液。固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000~10000r/min的速度处理1min，制成1：10的均匀稀释液。 2、用1ml灭菌吸管，吸取1∶10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成1∶100稀释液。 3、另取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用另一支1ml灭菌吸管。 4、根据对检样污染情况的估计，选择2～3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的稀释液1ml于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。 5、用1ml生理盐水作空白对照试验，做2个平皿。 注意： ①吸管尖端不要触及瓶口或试管口外部，也不得触及管内稀释液。 ②吸管插入检样液内取样稀释时，插入深度要达2.5cm以上,调整时应使管尖与容器内壁紧贴。 ③进行稀释时，应使吸管内的液体沿管壁小心流加入，以免增加检液。 ④每递增稀释一次，即换用一支1ml灭菌吸管。
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
实验九黄豆酱的制作 一、黄豆酱的制备 （一）实验目的 （1）学会如何利用霉菌进行发酵食品制备。 （2）掌握米曲霉在豆酱制备过程中所起的作用。 （3）掌握豆酱制备过程米曲霉的变化。 （4）了解豆酱制备过程中常见的异常现象。 （二）实验原理 黄豆酱在发酵过程中起主要作用的是曲霉菌。自然发酵酱曲中每克干曲的细菌总数超过106个,占分离出微生物总数的38.46%,酵母菌占分离出微生物总数的12.09%,霉菌占分离出微生物总数的49.45%。 （三）实验材料及容器 1、黄豆、面粉。黄豆400g，要求无半粒、烂粒等，面粉250g，黄豆与面粉比例8：5。 3、制曲匾一个。 4、纱布1-2块。 5、酱坛一个。 6、粗粒盐： 96g。 （三）主要步骤要求 主要分两个主要步骤，即： 1.制曲 1）黄豆处理：将浸泡好的400g黄豆,滤干水后，用纱布包住放入高压锅中，在121℃的条件下蒸煮20-30分钟（由于时间问题我们并未做这一步
骤）。等黄豆冷却到45℃左右，放在盆子里。 2）接种：向黄豆加入三分之二的面粉，拌匀，用剩下三分之一的面粉混3.5g的曲精，接着把面粉和曲精全部混进黄豆中，拌匀，制成曲，将曲放入曲匾，用纱布盖好，放入室内常温培养。 3）培养：在常温下培养1天后，均匀地翻曲。然后继续在常温下培养1天，进行第二次翻曲，再培养1天，做第三次翻曲，可得初态的酱曲。 2.曲料发酵 1）把成熟的酱曲放进酱坛中，加入600ml 70℃的12%食盐水，然后搅拌，加盖，放在常温下培养。培养两天后，再加入200ml 12%的食盐水。（四）结果要求 1、制曲结果 1）每组每天两次来实验室观察曲的变化，详细记录并拍照（时间与变化要 对应记录，并写在报告中由于时间和实验室的原因，我们没有进行这一步骤） 2）对制好的曲进行感官评价。 注：事先对制曲变化及曲的质量提前查资料。 2、下酱发酵 2）发酵过程的现象，感官变化记录。 3）产品灭菌条件或若想制备配方豆酱如加辣椒等都可自查资料。 4）感观指标：色泽：红褐色或棕褐色，有光泽不发乌。 香气：具体黄豆酱特有的香气和酯香气，无其他不良气味。 滋味：鲜美、咸淡适口、味柔醇厚，无苦、酸、涩、焦糊等味道 体态：鲜艳有色泽，表面无白点，有豆瓣，稀稠适度。 结果记录表：
实验二实验器具的灭菌 一、实验目的 1.学习并初步掌握和各种实验器具的包扎及高压蒸汽灭菌的方法。 2.了解其他灭菌方法。 二、基本原理 高压蒸汽灭菌法可杀灭包括芽胞在内的所有微生物，是灭菌效果最好、应用最广的灭菌方法。其基本原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加，在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃，在此温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 三、器材 1、高压蒸汽灭菌锅 2、牛皮纸 3、棉绳 4、仪器和其他用具 四、操作步骤 1、包扎 将各种实验器具进行合理规范包扎后，要用牛皮纸覆盖，最后用棉绳系紧。 2、加热烧开 待高压锅内的水烧开，将包扎好的器具放入锅内的桶内，最后放入高压锅。 3、升压 完全排除锅内空气后，关闭放弃阀，待压力上升到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1~0.15MPa 20分钟。 4、减压，取出器具 到达保压时间后，即可切断电源，压力降到0.5MPa时，可缓慢放出蒸汽，注意不要使压力降低太快，以致引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体四溢。当压力降到零后，才能开盖。 五、思考题 （1）、你认为那些环节会影响高压灭菌的效果？如果影响，请简述其中最关节的环节是什麽？
实验三牛肉膏蛋白胨培养基的配制 —、目的要求 1、明确培养基的配制原理 2、通过对基础培养基的配制，掌握培植基的一般方法和步骤。 二、基本原理 牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下： 牛肉膏 3.0g 蛋白胨10.0g NaCI 5.0g 水1000mI pH 7.4～7.6 三、器材 1、溶液和试剂牛肉膏，蛋白胨，NaCI,琼脂，1 moI/L NaOH, 1 moI/L HCI。 2、仪器和其他用品试管，三角瓶，烧杯，量筒，破棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 1、称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨，NaCI放入烧杯中。牛肉膏常用破棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水融化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时，如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。 （蛋白质很易吸湿，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。） 2、溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5％~2.0％的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。 3、调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LnaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。 4、分装 按照实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角瓶内。 5、加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞），以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 6、包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
食品微生物检验技术课程文献综述 题目: 常见致病菌导致的食物中毒及其检测姓名: 木日西提江 学院: 新疆农业大学食品科学与药学学院专业: 食品科学 班级: 071班 学号: 074031156 指导教师: 王伟 2010年12 月7 日
常见致病菌导致的食物中毒及其检测 摘要:食品安全与食源性疾病已成为一个全球性的重大公共卫生问题，而食物中毒作为最典型的一大类食源性疾病更得到了世界各国政府的广泛关注与重视。凡是导致机体正常生理功能破坏，引发机体病理改变甚至死亡的物质被称为毒物。毒物随食物或毒物被当作食物进入人体引起的中毒被称为食物中毒。本文以常见致病菌导致的食物中毒为出发点，对常见食物中毒分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性三大类，叙述其中毒原理及常见症状，描述食物中毒的发病原理，发病症状，检验方法（包括快速检验）。并详细描述微生物的快速检测。 关键字致病菌沙门氏菌检验快速检验 正文 食物中毒是指吃了不洁或有毒食物而导致的疾病。通常在吃了有问题的食物1至72小时内发病，病情严重者可以致命。食物中毒一般分为化学性、有毒动植物中毒、微生物性（包括细菌性和真菌性食物中毒）。 一、化学性食物中毒 化学性食物中毒是指误食有毒化学物质，如鼠药、农药、亚硝酸盐等，或食入被其污染的食物而引起的中毒。发病率和病死率均比较高。中毒症状急性中毒有心悸，面颈、四肢肌肉颤动，有手抖甚至不能站立，头晕，乏力，原有心律失常的患者更容易发生反应，心动过速，室性早搏，心电图示S-T段压低与T波倒置。其中常见的化学性食物中毒有： （一）毒鼠强中毒：毒鼠强毒性极大，对人致死量5—12毫克。一般在误食10－30分钟后出现中毒症状。轻度中毒表现头痛、头晕、乏力、恶心、呕吐、口唇麻木、酒醉感。重度中毒表现突然晕倒，癫痫样大发作，发作时全身抽搐、口吐白沫、小便失禁、意识丧失。 （二）亚硝酸盐中毒：俗称“工业用盐”。摄入亚硝酸盐0.2-0.5克就可以引起食物中毒，3克可导致死亡。发病急，中毒表现为口唇、舌尖、指尖青紫等缺氧症状，重者眼结膜、面部及全身皮肤青紫。自觉症状有头晕、头痛、无力、心率快等。急救处理：催吐、洗胃和导泻以消除毒物；应用氧化型亚甲蓝（美蓝）、
《食品微生物学实验》课程标准 一、课程概述 本课程注重理论与实践环节的结合，根据课程的性质、任务、要求及学习对象，将课程内容分二个层次：基础性实验、专业性实验。基础性实验主要围绕着微生物学的基本理论而设计，要求学生掌握微生物学的基本实验技术和基本实验方法；专业性实验主要围绕着微生物学在食品方面的应用而设计，要求学生能把微生物学的基本实验技术和基本实验方法应用到食品生产、加工、检测中去。 二、课程目标 《食品微生物实验》是继《微生物学》课程之后而开设的独立实验课程，是理论教学的深化和补充，具有较强的实践性和专业性，可作为食品工程、发酵工程专业学生的必修课程。 作为食品工程、发酵工程专业的大学生不仅需要掌握微生物学方面的基本理论知识，更需要掌握基本的实验技能、实验方法及一定的科学研究能力。通过该课程的学习，使学生巩固和加深微生物学的理论知识，掌握一定的实验技能和实验方法及这些方法在食品中的应用，进一步加强学生独立分析问题和解决问题的能力，并提高学生的实验动手能力，同时注重培养学生实事求是、严肃认真的科学作风和良好的实验习惯，为今后工作打扎实的基础。 三、课程内容和教学要求
四、课程实施 （一）课时安排与教学建议 食品微生物学实验是食品类必修课，系主干实验课程。一般情况下，每周安排2课时，
（二）教学组织形式与教学方法要求 1、本课程实验单独设课，开课时，任课教师需要向学生讲清课程的性质、任务、要求、课程安排和进度、实验守则及实验室安全制度等。 2、实验前要求学生必须先预习实验技术指导，进入实验室后，由实验教师讲解完有关实验内容之后，方可开始做实验。 3、实验2～5人为1组，实验由学生独立完成，出现问题，教师要积极引导，但不得包办代替。 4、实验一律在相关实验室进行，实验教师和实验人员要做好实验前的准备工作。 5、任课教师要认真上好每一堂课，实验前清点学生人数，实验中按要求做好学生实验情况及结果记录，实验后认真填写实验开出记录。 五、教材编写与选用 《食品微生物学实验》教材要在课程标准的统一要求下，实行多样化。可以选用高等学校教材[如沈萍主编的《微生物学实验》（高等教育出版社2000年版）]，也可以选用公认的水平较高的其它教材或自编教材。 六、课程评价 本课程采用平时实验成绩、总结报告成绩来综合评定学生的学习成绩，其中平时实验成绩占70%，总结报告成绩占30%。 实验成绩分：优、良、中、及格、不及格五个等级。量化标准详见有关规定。
食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？ 答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？ 答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察 答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。 答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对
微生物学实验讲义 Document serial number【KKGB-LBS98YT-BS8CB-BSUT-BST108】
《生物学实验Ⅰ——微生物》 （2008级基地班） 任课教师：熊芳 教学时数： 15学时 实验周数： 4周 生物学实验教学中心 微生物实验目录（15学时） 微生物实验基础知识介绍 实验一：培养基的配制与灭菌（4学时） 实验二：土壤自生固氮菌的分离纯化（5学时） 实验三：显微镜的使用和简单染色（3学时） 实验四：革兰氏染色和荚膜染色（3学时） 第一次实验： 微生物学实验基础知识 一、实验目的 1.熟悉实验室规则和安全守则，正确应对实验中出现的意外事故； 2.认识微生物学实验室常用仪器和有关试剂的基本知识； 3.掌握实验报告的正确书写。 二、实验内容 1.实验室规则； 2.实验室安全守则； 3.实验室中意外事故处理； 4.常用器皿及用具； 5.显微镜及有关知识；
6.实验预习、实验记录和实验报告。 实验一培养基的配制和高压蒸汽灭菌 配置培养基的基本流程如下： 原料称量→溶解→调节pH值→过滤澄清→分装→塞硅胶塞和包扎→灭菌 培养基的配制原则 一、营养成分 1. 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基，如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微生物的培养基至少需要含有一种有机物质。 碳源物质的功能：构成细胞物质；为机体提供整个生理活动所需要的能量（异养微生物）。 氮源(nitrogen source) 凡是提供微生物营养所需的氮元素的营养源，称为氮源。氮源物质的主要作用是合成细胞物质中含氮物质，少数自养细菌能利用铵盐、硝酸盐作为机体生长的氮源与能源，某些厌氧细菌在厌氧与糖类物质缺乏的条件下，也可以利用氨基酸作为能源物质。 能源指能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。 2. 注意各种营养物质的浓度与配比 营养物的浓度：在一般情况下，浓度合适的营养物质才对微生物表现出良好作用，浓度大时对微生物生长起抑制作用，浓度小时不能满足微生物生长的需要。 各营养物质之间的浓度比：培养基中各营养物质之间的浓度比直接影响微生物的生长与繁殖和（或）代谢产物的形成与积累，尤其是碳氮比（C／N）（碳氮比一般指培养基中元素碳与元素氮的比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白两种成分含量之比）的影响更为明显。 二、控制培养基的PH值 各类微生物生长的最适pH各不相同，细菌与放线菌生长的pH在之间，酵母菌与霉菌生长的pH值在4-5之间。 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，常会改变培养基的pH值，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式： 内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。 外源调节：按实际需要流加酸或碱液 三、渗透压
一、《食品微生物》教学内容 （一）目的和任务 1．教学的目的 学生在学习了解有关食品微生物基本理论知识（微生物的定义、微生物的分类、微生物的形态结构、微生物的生理生化特性等）的基础上，能熟练掌握微生物的显微镜观察技术、微生物培养基的制作技术和微生物的接种操作技术，进一步掌握利用微生物进行常见发酵食品生产的技术，并能有效进行发酵过程中的质量控制。 2．教学的要求 1）标准的校内小型生产型实训室，面积200㎡，并配备相应的配套设施设备。其中，包括：光学显微镜、不锈钢锅、水浴锅、超净工作台、杀菌锅、恒温培养箱、玻璃器皿（试管、三角瓶、培养皿、移液管等）。 2）配备一名实训指导教师。 3）相关教学软件、影像及图片资料。 4）铅笔、彩色染料笔、图画纸、坐标纸等 （二）实训所需设备设施及实验地点 1、校内生产型实训环境 标准的校内小型生产型实训室，面积200㎡，并配备相应的配套设施设备。其中，包括：光学显微镜、不锈钢锅、水浴锅、超净工作台、杀菌锅、恒温培养箱、玻璃器皿（试管、三角瓶、培养皿、移液管等）。 生产设备先进，配套良好，使用效率高，效果好。 2、校外实训基地： 千禾食品有限公司、苏东坡酒业有限公司、吉香居食品有限公司、蒙牛乳业眉山公司等。 （三）教学项目及学时分配 1
2 （四）考核方式及成绩评定 1、考核实行过程考核和结果考核相结合。其中过程考核占60%，包括平时表现和任务考核；结果考核占40%，主要是期末综合技能考核。 （五）教材及参考资料 1唐艳红，王海伟．《食品微生物》． 2.无锡轻工业学院编写：调味品酿造加工技术 二、附录
（一）《食品微生物》理论教学教案 1、《微生物概论》
20 -20 学年第学期 食品微生物检验学（适合食品质量与安全、食品科学与工程专业使用） 实验 学院： 专业： 年级： 姓名： 任课教师： 教师所在单位： 河北农业大学食品科技学院 2010-05-05制 实验须知
食品微生物检验学（本科）实践教学的目的是：使学生掌握食品微生物检验的最基本的操作技能；了解食品微生物检验学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些食品微生物检验学理论知识。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。 为了上好食品微生物检验学实验课，并保证安全，特提出如下注意事项： 1、每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。 2、认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。 3、实验室内应保持整洁、勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。 4、实验时小心仔细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。 5、实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，应先关掉火源，再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。 6、使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放回原处。 7、每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐。擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去。如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间：凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮捧等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒： 8、每次实验需进行培养的材科，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养：实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外： 9、每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中，力求简明准确，并连同思考题及时汇交教师批阅： 10、离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗、灯、火、煤气等。
什么是食品微生物检验 吴崇食质12级1班学号：20122629 微生物是个体难以用肉眼观察的一切微小生物之统称。微生物包括细菌、病毒、真菌、和少数藻类等。（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。根据存在的不同环境分为空间微生物、海洋微生物等，按照细胞机构分类分为原核微生物和真核微生物。 微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行。在人类疾病中有50%是由病毒引起。微生物导致人类疾病的历史，也就是人类与之不断斗争的历史。在疾病的预防和治疗方面，人类取得了长足的进展，但是新现和再现的微生物感染还是不断发生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治疗药物。一些疾病的致病机制并不清楚。大量的广谱抗生素的滥用造成了强大的选择压力，使许多菌株发生变异，导致耐药性的产生，人类健康受到新的威胁。一些分节段的病毒之间可以通过重组或重配发生变异，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都与前次导致感染的株型发生了变异，这种快速的变异给疫苗的设计和治疗造成了很大的障碍。而耐药性结核杆菌的出现使原本已近控制住的结核感染又在世界范围内猖獗起来。 微生物千姿百态，有些是腐败性的，即引起食品气味和组织结构发生不良变化。当然有些微生物是有益的，它们可用来生产如奶酪，面包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必须通过显微镜放大约1000 倍才能看到。比如中等大小的细菌，1000个叠加在一起只有句号那么大。想像一下一滴牛奶，每毫升腐败的牛奶中约有5千万个细菌，或者讲每夸脱牛奶中细菌总数约为50亿。也就是一滴牛奶中可能含有50 亿个细菌。 微生物能够致病，能够造成食品、布匹、皮革等发霉腐烂，但微生物也有有益的一面。最早是弗莱明从青霉菌抑制其它细菌的生长中发现了青霉素，这对医药界来讲是一个划时代的发现。后来大量的抗生素从放线菌等的代谢产物中筛选出来。抗生素的使用在第二次世界大战中挽救了无数人的生命。一些微生物被广
课程简介 课程号：0432904 课程名称：食品微生物英文名称：Food Microbiology 周学时：5.0 学分：5.0 预修要求：无 内容简介：本书主要阐述了与食品有关的微生物的形态、培养及生理特征；微生物遗传变异与优良菌种的选育与保藏；微生物与食品的相互关系及其生态条件；与食品有关的微生物的活动规律；各种有益微生物为人类制造的不同种类的食品及其功能；食品中污染微生物的种类、给人类带来的危害；防止食品腐败变质的措施；微生物及其毒素污染食品引起的人和畜禽类食物中毒的种类及预防措施等。课程教学内容包括理论教学和实验教学二部分。 选用教材： 朱乐敏．食品微生物学．第二版．北京：化学工业出版社，2011 参考教材： 万萍．食品微生物基础与实验技术．第二版．北京：科学出版社，2010 董明盛，贾英民．食品微生物学．第一版．北京：中国轻工业出版社，2008 陈红霞，李翠华．食品微生物学及实验技术．第一版．北京：化学工业出版社，2008 吕嘉枥．食品微生物学．第一版．北京：化学工业出版社，2007 无锡轻工大学，天津轻工业学院．食品微生物学．第一版．北京：中国轻工业出版社，2006 张文治．新编食品微生物学．第一版．北京：中国轻工业出版社，2006 周德庆．微生物学教程．第二版．北京：高等教育出版社，2002 何国庆，贾英民．食品微生物学．第一版．北京：中国农业大学出版社，2002
《食品微生物》教学大纲 一、课程的教学目的和基本要求 教学目的：食品微生物是食品营养与检验专业的一门重要专业课。这是一门交叉性学科，它以微生物学、生物化学、食品营养学、无机化学、有机化学等学科的理论基础知识和技能作为基础，研究食品微生物检测的技术和方法。通过本课程的学习，使学生可胜任食品检验中的有关微生物的检测工作。 基本要求：通过对《食品微生物基础与实验技术》的学习，使学生掌握微生物及其生命活动规律和应用，能够检测微生物，结合微生物的营养组成和生长的理论，掌握微生物培养、接种等操作技能；学习微生物的遗传和变异知识，掌握菌种的保藏。通过微生物的基础理论知识的学习，明确其应用的广泛性，帮助学生深入自学食品卫生等质量控制，对今后从事食品卫生方面的检验工作起到重要作用。 二、相关教学环节安排 1．采用多媒体投影教学及演示教学。 2．实验课单列，每周4学时。 3．每周布置复习重点，主要针对基本概念、基本规律。 三、课程主要内容及学时分配 理论课每周3学时，共16周；实验课每周2学时，共16周。 理论课主要内容： 第一章绪论1 第一节微生物概念及其特性1 一、微生物的概念1 二、微生物与人类的关系1 三、微生物在生物学分类中的地位2 四、微生物的特点2 第二节微生物的发现与微生物学的发展4 一、微生物形成前的历史4 二、微生物学的形成4 第三节微生物与食品微生物5 一、微生物学的概念及研究对象5 二、微生物学的主要分支学科5 三、食品微生物学的概念及研究内容6 四、食品微生物学研究任务6 第四节微生物的应用与前景7 一、微生物资源的开发和利用7 二、微生物与环境7 三、微生物菌体食品（食用蕈菌）7 四、微生物风味物质8 五、微生物与食源性感染8 第二章微生物的主要类群9 第一节原核微生物9 一、细菌9 二、放线菌17 三、其他原核微生物19 第二节真核微生物22 一、酵母菌22 二、霉菌26 第三节非细胞型微生物30
食品微生物学检验GB 4789 系列知识点汇总 GB 4789.1-2016 食品卫生学检验总则 一、2016版总则变更内容 1.删除了标准中的英文名称、起草单位变更为中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会国家食品药品监督管理总局。 2.删除了规范性引用文件。 3.修改了实验室基本要求： 微生物专业教育或培训经历（如生物学、植 物学、医学、食品科学与工程、食品质量与安全等与微 生物有关的相关专业），具备相应的资质（应有岗位上岗 证、生物安全上岗证和压力容器上岗证），能够理解并正 确实施检验。 ①人员修改为检验人员实验室生物安全操作和消毒知识（相关标准及培训， 如GB 19489-2008 实验室生物安全通用要求、消毒技术 规范（2002））。 品。 确保自身安全。
有颜色视觉障碍的人员不能从事涉及辨色的实验（即无颜 色视觉障碍）。 ②环境与设施--突出温度、湿度和洁净度。 生物危害程度应与实验室生物防护水平相适应: 灭的微生物，如天花病毒。 间传播如霍乱弧菌。 病原微生物分类 沙门氏菌、单增李斯特氏菌。 第四类：通常不会引起人或动物疾病的微生物。 BSL-1）：操作第四类病原微生物（属于正压，适用 ） 实验室生物安全级别BSL-2）：操作第三类病原微生物（属于负压，适用 II级生物安全 ） BSL-3）：操作第二类病原微生物
四级（BSL-4）：操作第一类病原微生物 消毒：是杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其中的孢子。 灭菌：是杀死和去除所有微生物及其中孢子的过程。 蒸法消毒） 消毒剂表面消毒 微生物实验 高压灭菌 干热灭菌（180℃1h或170℃2h） 培养基和试剂灭菌 过滤除菌 紫外线消毒法：紫外灯管放射一定波长，破坏细菌或病毒的DNA和RNA，使他们丧失生存能力和繁殖能力，从而达到灭菌目的。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，但细菌芽孢和霉菌芽孢对其抵抗力大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。
实验一水中细菌的分离、培养、鉴定及菌落总数的测定 1 培养基的配制及灭菌 【目的要求】 1．了解培养基的概念、种类及用途 2．了解培养基的配制原理及其常规配制程序 3．学习和掌握细菌培养基的配制方法。 【基本原理】 培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质，主要用于微生物的分离、培养、鉴定、菌种保藏等方面。自然界中微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基种类很多。不同培养基一般都应含有微生物生长繁殖所需的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖的要求，还必须控制培养基的pH值。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种用于培养细菌的培养基，属于半合成培养基。 【材料与用品】 1．材料与试剂 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、NaCl、NaOH溶液（1mol/L）、pH试纸。 一、肉膏蛋白胨培养基的配制 1．培养基成分 牛肉膏0. 3g 蛋白胨1g NaCl 0.5g 琼脂 1.5g 水100mL pH 7.2~7.4 2．配制方法 （1）称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量的2／3左右的蒸馏水；用玻璃棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量。然后加入少量蒸馏水于小烧杯中，加热融化，倒入上述烧杯中。 （2）定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 （3）加琼脂：将所需量的琼脂先放到三角瓶中，再将定容后的培养基倒入三角瓶中。 （4）调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2~7.4。 （5）分装、加塞、包扎。 （6）高压蒸汽灭菌20分钟。 待培养基冷却至60℃左右时，倒入已灭菌的培养皿中，等到培养基完全凝固后，放入冰箱中保存。 【思考题】 1.制作平板培养基的注意事项是什么？ 2.培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌？如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？ 3.如何检查灭菌后的培养基是否无菌？ 2 细菌的分离和培养 【目的要求】 1．掌握细菌稀释分离技术。
食品微生物学实验课程教学改革与尝试 摘要实验教学是培养大学生实践、创新和综合能力的关键性环节。食品微生物学实验是食品相关专业的主要课程之一。针对传统实验教学现状及存在问题，重点阐述调整教学内容和改进教学方法的改革尝试。通过优化和改革实验教学，充分发挥学生的主观能动性，提高学生学习兴趣和积极性，提高学生的综合素质，培养出理论、实践俱佳的高素质专业人才。关键词食品微生物学；实验教学；教学改革 中图分类号：G642.0 文献标识码：B 文章编号：1671-489X（2017）24-0142-04 Discussion on Teaching Reform and Practice of Food Micro-biology Experiment Course//ZHU Ling Abstract Experimental teaching is the key to the cultivation of stu- dents’practice，innovation and comprehensive ability. Food Micro-biology Experiment Course is an important part of food related majors. Considering the present problems of the traditional experimental tea- ching，reforming measures of adjusting teaching contents and refor- ming teaching method are primarily proposed and implemented in this paper. Optimizing and reforming experimental teaching were de- signed to explore the students’subjective initiative，enhance the stu- dents’activity and comprehensive quality and help them solve prac-tical problems.
实习一食品的微生物学检验 实验目的：了解食品微生物检验的过程，常用指标及检验结果评价。 实验内容： （一）细菌总数的测定 1 定义：细菌总数是指1g或lml食品，经过处理，在pH7．4～7．6的普通营养琼脂平板上,35～370C培养24土2小时生长出来的细菌菌落总数。 2.实验试剂（1）琼脂（2）生理盐水（3）蛋白陈（4）牛肉膏（5）氯化钠 3.实验仪器：1）采样瓶（2）平皿（3）吸管（4）试管（5）孵箱 4.操作方法 （1）样品的采集与处理： 在采样和样品处理时，必须严格遵守无菌原则，采样后尽快检验。样品在室温下放 置最好不超过2小时，否则应置于冰箱内，在冰箱放置最长也不要超过12小时。 A 肉与肉制品的采集及处理： （1）样品的采集 ①生肉与内脏：如系屠宰场的猪，可于开腔后立即用灭菌刀采取两腿内侧肌肉509 左右；如果是鲜肉和冻肉，可用灭菌刀采取腿肉或其它部位肌肉5吨左右；，如系脾、肾,可取其全部;如系肝脏，则取靠近肝门带有淋巴结部分。样品采后用无菌镊子夹入灭菌玻璃容器或塑料袋内立即送检，样品内不得放人任何防腐剂。 ②熟肉及灌肠类：一般可取有代表性样品30～50克，肥瘦共存的肉，宜取瘦的，肥瘦难分或量不多时，要随机取样，灌肠类横断采样3～5块，样品取后放入灭菌容器内立即送检。 （b）样品处理。 凡由大块样品中采取一部分，，一般均须在表面，以一烙板灭菌或沸水进行表面灭菌。再用灭菌剪子剪掉表面部分，在无菌条件下，取深层肌肉或内脏10g放人灭菌
容器内，用灭菌剪子剪碎，加入灭菌河沙和灭菌生理盐水100ml研磨混匀制成1：10混悬液。熟肉及灌肠也可不用表面灭菌处理，而直接用无菌操作称取10g 放入灭菌容器内研磨或剪碎，再按上法制成1:10混悬液。 b．乳与乳制品（鲜乳、炼乳、奶粉、酸奶等）。 (a)样品的采集 1.鲜乳：如在畜牧场直接取样，先将牛乳头用酒精棉球表面擦拭消毒，弃去开始挤下的头两把奶，然后再用灭菌容器接取，同一头牛应在各乳头上各取一部分。如在奶站或销售点，可用灭菌采样器采取不同部位有代表性的样品，采后不加防腐剂，立即送检。若为同一批瓶装奶则随机取2～5瓶送检。 2.乳制品。最好采取原装样品，如无原装者，要用灭菌容器取不同部位有代表性的样品送检。 （b）样品处理： 1. 鲜乳：以无菌操作，直接用吸管取10ml加入90ml生理盐水作成1： 10稀释液（需用原液者例外）。 2. 奶粉：无菌称取10g样品，放入预温至450C的生理盐水90m1，溶后混匀制成1： 10稀释液。 3. 炼乳、酸乳：将瓶口或铁筒的表面用点燃的酒精棉球消毒，然后用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开罐器开封，无菌称取10g样品放入灭菌容器内，加灭菌生理盐水90ml振摇均匀，制成1:10稀释液。 4. 奶油；将块状样品用灭菌刀取10g，加90ml生理盐水，放入450C 水浴中熔化，摇匀制成1:10稀释液。 C．蛋品: （a）样品采集： 鲜蛋：取完整的鲜蛋放入无菌袋内送检。 干全蛋，于蛋黄和干蛋白:将包装箱开口处用75％酒精棉球消毒后打开,用无菌采样器斜角插入箱底，使样品填满采样器，抽出采样器，用灭菌匙分上、。中、下各取 50g装人250ml广口瓶，混匀，送检。
微生物实验教案 实验一显微镜油镜的使用和细菌形态的观察 一、实验目的 以染色玻片为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、实验原理 1显微镜油镜使用的原理 （1）光学部分 : 接目镜、接物镜、照明装置 ( 聚光镜、虹彩光圈、反光镜等 ) 。它使检视物放大 , 造成物象。（ 2）机械部分 : 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转 移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。 2 显微镜的放大倍数和分辨 率（ 1）放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公 式表示为： D=λ /2n ·sin(α/2 ) 式中 D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55 μ m） n:物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。 3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。三、实验材料1显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒 精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。 2枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的玻片染色标本。 四、实验方法与步骤 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （ 2）调节光亮度。 （ 3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。 （ 4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （ 5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油， 使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （ 6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （ 7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。