噻虫胺残留时间分辨荧光免疫分析研究
李明，盛恩泽，袁玉龙，刘晓凤，施海燕，华修德，王鸣华*
（南京农业大学植物保护学院农药科学系，江苏南京210095）
摘要：本研究以铕离子（Eu3+）作为荧光标记物对羊抗兔IgG进行标记，建立了一种基于多克隆抗体高灵敏检测农业样品中噻虫胺残留的间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法（TRFIA）。在最佳优化条件下，建立了噻虫胺的TRFIA标准曲线，抑制中浓度（IC50）为2.07μg/L，最低检测浓度（LOD，IC10）为0.0220 μg/L。建立的TRFIA除了对呋虫胺有较大交叉反应外（9.7%），与噻虫胺结构类似化合物没有明显的交叉反应。水、甘蓝和大米中的平均添加回收率为74.1-115.9%，相对标准偏差为 3.7-11.7%。真实样品的检测结果表明TRFIA与气相色谱法具有高度的相关性（R2= 0.9902）。研究说明建立的TRFIA能够高灵敏地检测农产品中噻虫胺的残留。
关键词：噻虫胺；铕；多克隆抗体；时间分辨荧光免疫分析方法
Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for quantitative
determination clothianidin
LI Ming, SHENG Enze, YUAN long, LIU Xiaofeng, SHI Haiyan, HUA Xiude, WANG Minghua* (Department of Pesticide Science, College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095, China)
Abstract: Europium (Eu3+)-labeled antibody was used as a fluorescent label to develop a highly sensitive indirect competitive time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA) for determination of clothianidin residues based on polyclonal antibody in agricultural samples. Under optimal conditions, the half-maximal inhibition concentration (IC50) and the limit of detection (LOD, IC10) of clothianidin were 2.07 and 0.0220 μg/L for the TRFIA, respectively. The TRFIA was no obvious cross-reactivities with the analogues of clothianidin except for dinotefuran (9.7%). Analysis of clothianidin-fortified samples (water, cabbage and rice) by the TRFIA showed average recoveries from 74.1-115.9% with relative standard deviations of 3.7-11.7%. The results of TRFIA for the authentic samples were largely consistent with gas chromatography (R2 = 0.9902). The optimised TRFIA might become a sensitive and satisfactory analytical method for the quantitative monitoring of clothianidin residues in agricultural produces.
Keywords: clothianidin; europium; plyclonal antibody;time-resolved fluoroimmunoassay 噻虫胺（clothianidin）是含噻唑环的新型烟碱类杀虫剂，以其新颖的作用机制、广谱高效的杀虫活性、灵活的使用方法，被广泛应用于防治危害水稻、蔬菜、果园、茶叶等作物的半翅目、鞘翅目、双翅目和某些鳞翅目害虫[1]。随着人们对环境和食品安全关注程度增强[2]，对噻虫胺在农产品和环境中残留检测方法的研究也广泛开展。我国尚未制订噻虫胺的允许残留量标准，本研究旨在建立快速灵敏检测噻虫胺残留的分析方法，为标准的制订提供依据。目前，噻虫胺残留检测以高效液相色谱法(HPLC) 和气相色谱法(GC) [3-6]为
作者简介：李明(1986-)，男，山西吕梁人，博士研究生，E-mail:2010102148@https://www.doczj.com/doc/487801095.html,；
*通讯作者(Author for correspondence)：王鸣华(1961-)，男，山西垣曲人，博士，教授，主要从事农药残留与环境毒理研究，电话：025-********，E-mail: wangmha@https://www.doczj.com/doc/487801095.html,
基金项目：江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（NO. CXZZ13-0305）
主。尽管仪器分析方法灵敏，准确，但样品前处理较繁琐，难以满足大量样品快速检测的需要。免疫分析方法以其高灵敏度、高选择性、简便快速、分析成本低等优点，在大量样品快速筛选监测中展示出显著的优势，有望成为仪器分析方法的替代或补充方法。以镧系元素作为荧光标记物的时间分辨荧光免疫分析方法（TRFIA）是荧光免疫分析方法中灵敏度最高的分析方法[7]。镧系元素以其独特的荧光特性（如：荧光寿命长，时间分辨延迟检测，Stokes位移大和解离增强作用）为实现TRFIA的超灵敏，低干扰检测提供了可能性[8-10]。近年来，已经有许多TRFIA在农业和环境污染物方面的研究报道[7,11,12]。目前，已有关于噻虫胺的酶联免疫分析研究报道[13,14]，国内外尚未见利用TRFIA检测噻虫胺的报道。本研究采用铕离子（Eu3+)作为荧光标记物，建立了一种超灵敏检测噻虫胺的间接竞争时间分辨荧光免疫分析法。用TRFIA和气相色谱法测定了真实样品中的噻虫胺残留，并对两种方法进行了相关性分析。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
SpectraMax M5 多功能读板机（Thermo公司）；Wellwash Plus 型洗板机（Thermo公司）；DNP-9052型新型电热恒温培养箱（宁波江南仪器厂）；XW-80A 漩涡混合器（上海青浦沪西仪器厂）；Nanodrop-1000 紫外分光光度仪（Thermo公司）；Agilent 7890气相色谱仪（Agilent公司）；R-3 旋转蒸发仪（BUCHI公司）；96孔聚苯乙烯荧光板和荧光增强液（江苏原子医学研究所）。噻虫胺（97.0%）和烟碱类农药标准样品（江苏农药研究所）；牛血清蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA），羊抗兔IgG（Sigma公司）；DTTA-Eu3+（天津放射医学研究所）；Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶（北京奇松生物科技有限公司）；其他常规试剂均为分析纯。碳酸盐缓冲液（CBS，0.05 mol/L, pH 9.6）；Tris-HCl缓冲液（TBS，0.05 mol/L, pH 8.0，0.9% NaCl）和洗涤缓冲液（TBST ，0.05% Tween-20的Tris-HCl缓冲液）为实验室自制。
1.2 抗原与抗体的制备
噻虫胺半抗原的合成方法参照先前报道[14]，合成路线如图1。采用活泼酯法将半抗原分别与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备免疫抗原和包被抗原。
图1半抗原合成路线
Fig. 1 Synthetic route for preparation of the hapten
用免疫抗原免疫新西兰雄性大白兔制备多克隆抗体[15]。将免疫抗原用生理盐水稀释到适当浓度，与等体积的弗氏佐剂混合，充分乳化后免疫。初次免疫用等量弗氏完全佐剂乳化免疫原，免疫剂量为1.0 mg/kg（按BSA量计），3周后用弗氏不完全佐剂乳化加强免疫，免疫剂量为1.5 mg/kg，以后每间隔2周加强免疫一次，总共加强免疫4次。免疫结束后，采心脏全血，分离抗血清。采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，冷冻干燥后，-20℃保存。1.3 铕标记物的制备与纯化
铕标记物的制备与纯化参照报道方法[7,12]。将羊抗兔IgG用碳酸盐缓冲液（0.05 mol/L，pH 8.5）在4℃下透析后，调整抗体浓度到1mg/mL。取1.0mL稀释的抗体，加入0.5 mg的DTTA-Eu3+，4℃避光搅拌反应24小时。反应结束后，以Tris-HCl缓冲液作为洗脱剂，用Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶柱进行纯化，分段接收洗脱液。将同时具有荧光特
性和紫外吸收的部分合并作为纯化的铕标羊抗兔IgG，加入等体积的甘油和0.2%BSA，-20℃保存。
1.4 噻虫胺TRFIA的建立
（1）包被：用CBS缓冲液将包被抗原稀释，100 μl/孔，4℃包被过夜；
（2）封闭：加入1%OVA 的TBS封闭液200 μl/孔，37℃温育1h；
（3）加样：加入系列浓度的噻虫胺标准溶液或者待测物溶液，50 μl/孔，再加入经TBS稀释的兔多克隆抗体溶液50 μl/孔，37℃温育1 h；空白对照加入TBS缓冲溶液；
（4）加标记二抗：加入TBS稀释铕标羊抗兔IgG，100μL/孔，37℃温育1h（以上每一步结束都用TBST洗涤5次）；
（5）加增强液：荧光板洗涤后，加入荧光增强液200 μL/孔，避光放置5min；
（6）测定：用SpectraMax M5 多功能读板机测定荧光计数。（检测条件：激发波长为340 nm，发射波长为615 nm，延迟时间为400 μs）。
每个样品设置三次重复。用四参数方程拟合S形标准曲线（软件：Origin Pro7.0），计算抑制中浓度（IC50）和最低检测浓度（LOD，IC10）。
1.5分析条件优化
通过考察实验参数（包被抗原，抗体浓度，甲醇含量，离子强度和pH值）对TRFIA 的灵敏度的影响，选取免疫反应的最佳测定条件。用F0/IC50作为评价TRFIA的关键标准，比值越高表明灵敏度越高；同时，兼顾考虑IC50和F0值。
1.6交叉反应率的测定
配制系列浓度的噻虫胺和其结构类似化合物的标准溶液，采用TRFIA建立类似化合物的标准曲线，计算IC50和交叉反应率（CR%），交叉反应率越低，抗体反应的特异性越强，对噻虫胺测定的干扰越小。
CR% = [ IC50 (噻虫胺) /IC50 (类似化合物)] ×100
1.7添加回收率的测定
通过噻虫胺的添加回收率和相对标准偏差（RSD）评价TRFIA的准确度和精密度。
取10mL过滤后的河水样品添加1、5、10、100 μg/L的噻虫胺，放置过夜。用TRFIA 法测定样品中噻虫胺浓度。
取10g粉碎后的甘蓝和大米样品，添加10，50，100，500 μg/kg的噻虫胺，混匀，放置过夜。加入10ml甲醇，超声10min，4000rpm离心10min，取上清液用TBS缓冲液稀释后用TRFIA进行测定。
每个浓度设3个重复，每个重复设3个平行，并设空白对照。
1.8基质影响的评价
用含甲醇的TBS缓冲液对提取样品进行0到20倍的稀释，不同程度基质影响的标准曲线与不含基质的标准曲线比较进行基质影响评价。
1.9真实样品检测
采集当地施用过噻虫胺的样品（包括河水，甘蓝和大米），采用TRFIA和气相色谱分析法-电子捕获检测器（GC-ECD）对样品中的噻虫胺浓度进行测定。TRFIA的提取和检测方法同上所述。GC-ECD分析时，样品用20mL乙腈超声10min进行两次超声萃取，然后4000 rpm离心10min，取上清液过无水硫酸钠，浓缩。用2mL丙酮定容后，GC-ECD测
定[3]。GC条件：DB-17毛细管色谱柱（30m×320μm×0.25μm）；载气为氮气；柱温：在180℃下保持1min，然后以15℃/min升温至220℃，并保持3分钟。对两种检测结果进行相关性分析。
2 结果和分析
2.1 TRFIA的工作浓度与条件优化
以F0/IC50和IC50作为评价参数，包被抗原，兔多克隆抗体与铕标羊抗兔IgG的工作浓度分别为为0.25，0.7和0.6 μg/mL。
TRFIA反应的优化实验表明：当甲醇体积分数为10 %，Na+浓度为0.5 mol /L，pH值为7.4 时，F0/IC50最高，IC50值最低，灵敏度最高（表1）。
表1甲醇含量、Na+浓度和pH值对TRFIA体系灵敏度的影响
Table 1 Effect of buffer percentage of methanol, ionic strengths and pH values on the TRFIA sensitivity
参数F0/IC50IC50 (μg/L)
甲醇(v/v,%) 0% 14387.3 10.4 5% 10695.9 12.4 10% 22711.5 6.0 20% 10978.4 12.6 30% 4901.8 27.7 40% 6589.2 22.6
Na+ (mol/L) 0.1 11865.3 11.9 0.2 10144.2 12.8 0.3 19085.7 6.5 0.4 21888.9 5.6 0.5 42079.0 3.0 0.6 31002.9 4.5
pH value 4.5 22772.2 4.5
5.5 29268.6 3.7
6.5 27874.8 4.0
7.4 30025.4 3.2
8.5 24244.8 5.1
9.5 32431.2 4.7
2.2 标准曲线的建立
在优化条件下，建立噻虫胺TRFIA标准曲线（图2），IC50值为2.07 μg/L，LOD为0.0220 μg/L，线性范围为为0.0220-444 μg/L。
通过比较得出建立的TRFIA灵敏度比先前报道的ELISA高出2-23倍[13,14]。此外，美国规定噻虫胺的最大残留限量（MRL）为50 μg/kg，已经报道的HPLC和GC对噻虫胺的最低检测限为4 and 10 μg/L [5,6]。综上所述，本研究建立的噻虫胺TRFIA灵敏度更高，检测限更低。
1E-30.01
0.1110100100010000
20
406080100Concentration of clothianidin (μg/L)
F /F 0 (%)
Data: Data1_B,Data1_C Model: Logistic
Equation: y = A2 + (A1-A2)/(1 + (x/x0)^p) Weighting:y(1)No weighting y(2)No weighting
Chi^2/DoF = 1.819R^2= 0.9992 A196.58847?.54623A2 3.37744?.40902x0 2.34545?.30754p 0.48076?.03082A1_2-403.34985?081159.86843A2_2 3.40265? 5.93177x0_29.2981E-7?.03556p_20.33938?9.09181
图2 噻虫胺TRFIA 标准曲线 Fig. 2 TRFIA curve for clothianidin
2.3 特异性分析（交叉反应）
用TRFIA 测定对噻虫胺结构类似化合物的交叉反应（表2），计算各自的IC 50和交叉反应率。结果表明得到的抗体对噻虫胺有较高的特异性，除与呋虫胺有较大交叉反应外（9.7%），对其它噻虫胺结构类似化合物没有明显的交叉反应。对呋虫胺有较大的交叉反应可能由于噻虫胺和呋虫胺相同的N -甲基-N'-硝基胍基团是抗体识别的关键抗原决定簇。
表 2 噻虫胺结构类似化合物对TRFIA 的交叉反应
Table 2 Cross-reactivity of analogs related to clothianidin by the TRFIA 化合物名称Compound 化合物结构 Structure
抑制中浓度 IC 50(μg/L)
交叉反应率 CR (%)
噻虫胺
Clothianidin
2.07
100
呋虫胺 Dinotefuran 21.4 9.7
吡虫啉 Imidacloprid
398.1 0.5
氯噻啉 Imidaclothiz 492.9
0.4
噻虫啉 Thiacloprid
>10000 <0.03
噻虫嗪 Thiamethoxam
>10000 <0.03
啶虫脒 Acetamiprid
>10000 <0.03
烯啶虫胺 Nitenpyram
>10000 <0.03
2.4 基质影响
基质影响是免疫分析时常遇到问题，样品稀释法是减少基质影响的最简单最直接的方法。水样中的基质效应可以忽略不计，可以不用稀释直接进行检测；从图 3 不同程度基质影响曲线可知，甘蓝样品稀释10倍，大米样品稀释20倍时基质影响可以降低到对TRFIA 灵敏度影响很小的程度。研究得到的样品稀释倍数用于后期实验样品的稀释。
1E-30.01
0.11101001000100000
20406080
100F /F 0 (%)
Concentration of clothianidin (μg/L)
Cabbage matrix
standards curve without dilution 1/10 dilution 1/20 dilution
1E-30.01
0.1110100100010000
20
406080
100 standards curve without dilution 1/10 dilution 1/20 dilution
Concentration of clothianidin (μg/L)
F /F 0 (%)
Rice matrix
图 3 基质效应对TRFIA 灵敏度的影响
Fig. 3 The matrix effect of samples on the sensitivity of the TRFIA
2.5 添加回收率与方法的精密度
噻虫胺添加回收率结果见表3。在1-500 μg /kg 添加水平和相应的稀释倍数下，TRFIA 平均添加回收率为74.1%-115.9%，相对标准偏差为3.7%-11.7%，符合农药残留实验准则要求[16]。
表 3 噻虫胺的添加回收率
Table 3 Recovery of clothianidin in spiked samples
2.6 方法相关性验证
样品
Sample 添加浓度Spiked concentration (μg/kg)
稀释倍数Dilution times
添加回收率Mean recovery ± SD (% , n=3) 相对标准偏差RSD (%)
河水 River water
1
0 82.6±4.3 5.2 5 77.2±6.1 7.9 10 90.8±2.2 6.4 100 95.8±3.7 3.9 甘蓝Cabbage
10
10 74.1±7.2 11.7 50 81.4±4.5 5.5 100 89.3±3.2 3.6 500 89.7±2.8 4.1 大米 Rice
10
20 104.5±4.6 6.4 50 115.9±3.9 4.4 100 99.3±7.8 7.8 500
103.7±2.8
3.7
用TRFIA 对采集的真实样品进行检测，并通过GC 进行验证。图4比较了TRFIA 和GC 检测结果的相关性，相关性方程为y= 0.8825 x + 1.4154，相关系数为R 2 = 0.9902。TRFIA 和GC 对真实样品中噻虫胺残留检测结果的高度相关性，进一步验证了TRFIA 的准确性和可靠性。
y = 0.8825x + 1.4154
R 2 = 0.9902
01530456075
900
15
304560
75
90
GC(μg/kg)
T R F I A (μg /k g )
图 4 TRFIA 与GC 对噻虫胺真实样品检测结果的相关性分析 Fig. 4 Correlation between the TRFIA and GC for the authentic samples
3 结论
本研究建立的噻虫胺间接竞争时间分辨荧光免疫分析是在噻虫胺酶联免疫吸附分析研究基础上对噻虫胺免疫分析方法的进一步深入研究。选择铕离子作为荧光标记物，对包被浓度、抗体浓度及免疫反应参数（甲醇含量，离子强度和pH ）进行了优化。本研究建立的噻虫胺间接竞争时间分辨荧光免疫分析方法相比已经报道的方法在灵敏度方面得到了进一步提高，最低检测限更低，背景干扰低，使用溶剂量减少，操作简单。将该方法应用与添加样品和实际样品的分析，并用气相色谱法验证了方法的相关性，结果表明方法的精密度、准确度可以满足噻虫胺残留分析。本研究建立的噻虫胺残留间接竞争时间分辨荧光免疫分析是一种超灵敏，高通量，快速，廉价，可以应用于大量农产品中噻虫胺的筛查和检测。
参考文献
[1] 程志明. 杀虫剂噻虫胺的开发[J]. 世界农药， 2004， 26(6): 1-3.
[2] Motohiro, T., John, Y.C. Neonicotinoid insecticide toxicology: mechanisms of selective action.
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2005, 45, 247-268. [3] Li L, Jiang G.Q., Liu C.Y., et al. Clothianidin dissipation in tomato and soil, and distribution in
tomato peel and flesh[J]. Food Control , 2012, 25: 265-269. [4] 陈雁君，王艳，李宁，等. HPLC 法测定小白菜中噻虫胺农药残留量的方法研究[J]. 中
国热带医学， 2009， 9(2): 361-362.
[5] 侯如燕，卞红正，赵秀霞，等. 固相萃取-液相色谱测定复杂基质蔬菜中9中烟碱类残
留[J]. 分析测试学报， 2011， 30(1): 58-63.
[6] Kim, B.M., Park, J.S., Choi, J.H., et al. Residual determination of clothianidin and its
metabolites in three minor crops via tandem mass spectrometry. Food Chem . 2012, 131, 1546-1551.
[7] Zhang, Z., Liu, J.F., Feng, T.T., et al. Time-resolved fluoroimmunoassay as an advantageous
analytica method for assessing the total concentration and environmental risk of fluoroquinolones in Surface Waters. Environ. Sci. Technol. 2013, 47, 454-462.
[8] Gui, W.J., Jin, M.J., Sun, L.F., et al. Residues determination of carbofuran in vegetables based
on sensitive time-resolved fluorescence immunoassay. Food Agric. Immunol. 2009, 20, 49-56.
[9] Hagan, A.K., Zuchner, T. Lanthanide-based time-resolved luminescence immunoassays. Anal.
Bioanal. Chem. 2011, 400, 2847-2864.
[10] Zhou, Y.L., Xia, X.H., Xu, Y., et al. Application of europium(III) chelates-bonded silica
nanoparticle in time-resolved immuno?uorom etric detection assay for human thyroid stimulating hormone. Anal. Chim. Acta 2012, 722, 95-99.
[11] Huang, B., Zhao, L.L., Sun, J.M., et al. Establishment and validation of a time-resolved
fluoroimmunoassay for chlorpromazine. Food Anal. Methods 2012, 5, 625-630.
[12] Xu, Z.L., Dong, J.X., Yang, J.Y., et al. Development of a sensitive time-resolved
?uoroimmunoassay for organophosphorus pesticides in environmental water samples. Anal.
Methods 2012, 4, 3484-3490.
[13] Uchigashima, M., Watanabe, E., Ito, S., et al. Development of immunoassay based on
monoclonal antibody reacted with the neonicotinoid insecticides clothianidin and dinotefuran.
Sensors 2012, 12, 15858-15872.
[14] Li, M., Sheng, E.Z., Cong, L.J., et al. Development of immunoassays for detecting
clothianidin residue in agricultural products. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 3919-3623. [15] Cao, M.M., Li, M., Yan, X., et al. Stereoselectivity of an enzyme-linked, immunosorbent
assay for S-bioallethrin. Anal. Methods 2012, 4, 534-538.
[16] NY/T 788-2004. 农药残留实验准则[S]．北京:中国农业出版社，2004.