反应器细胞培养技术在疫苗生产中的应用和发展 王建超、张韧、陈文庆、阎杰 北京天和瑞生物科技有限公司，北京市昌平科技园白浮泉路11号，邮编:102200 摘要我国疫苗市场正迅速发展，疫苗生产技术也正经历着一场深刻的技术革新：从大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变。这种疫苗工艺技术的转变，合乎世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗生产技术正逐步与世界生物制药技术发展主流接轨。反应器细胞培养技术不仅提高我国疫苗生产工艺水平和疫苗质量，推动生物反应器、反应器细胞培养技术在我国疫苗行业中的研发应用和技术发展，将促使我国从疫苗生产大国向疫苗生产强国的发展。本文从反应器细胞培养技术的历史发展、应用现状、关键技术因素，以及核心设备——生物反应器的发展、应用等方面进行了综述，分析并探讨了国产生物反应器以及反应器细胞培养技术在我国疫苗生产中的应用前景。 我国是世界疫苗产品的最大使用国和最大生产国。因为SARS、流感、禽流感、蓝耳病等疾病的发生，我国疫苗市场增长迅速，每年以平均15％的速度递增，远远高于全球10%的水平, 预计到2012年包括兽用疫苗在内的中国疫苗市场规模可超过100亿元。目前人用、兽用等疫苗生产企业近百家，疫苗品种数量与发达国家差距较小，但关键生产工艺以及部分疫苗质量存在较大差距。涉及动物细胞培养生产的疫苗，大部分疫苗生产企业采用的转瓶培养动物细胞，因不同转瓶是一个独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，而且操作劳动强度大，隐性污染引起高内毒素等缺点。 我国政府高度重视疫苗在疾病防治中的作用，国家政策和科研基金等对企业疫苗生产和研发工作给予重要的支持。我国扩大了国家计划免疫规划范围，将甲肝、流脑等15种可以通过接种疫苗有效预防的传染病纳入国家免疫规划。口蹄疫、蓝耳病、禽流感、猪瘟、狂犬病等动物疾病疫苗都纳入了国家强制性免疫计划。另外，科技部和发改委在“863”计划、重大新药创制国家重大科技专项、国家科技支撑等计划中，对疫苗的研究开发与产业化都做出了重点安排和支持。 中国具有人口优势，经济也在迅猛的增长，农牧副业也保持良好的发展势头。谁能掌握和应用不断发展创新的疫苗生产技术，谁才能在市场中脱颖而出并持续发展。这就需要国内生物制药企业要加强在疫苗生产关键技术的创新和应用，比如使用适合疫苗生产的个性化培养基，严格控制原材料的品质；升级自身的疫苗生产工艺，采用先进的反应器悬浮培养细胞工艺，提高生产效率，增强生物制品的安全性和有效性。 本文将从疫苗生产过程的关键生产技术——反应器培养动物细胞技术在疫苗生产中
麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）生产工艺的建立(一) 【摘要】目的研制麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）。方法用麻疹病毒长-47株接种人二倍体细胞，经培养，收获病毒液并加适量稳定剂后冻干制成疫苗。疫苗按2005年版《中国药典》三部进行检定。结果麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞）各项技术指标均符合2005年版《中国药典》三部的要求。结论人二倍体细胞为基质可以制备麻疹减毒活疫苗，疫苗质量稳定，收获率较高。【关键词】麻疹减毒活疫苗；人二倍体细胞；收获率 麻疹是由麻疹病毒引起的主要罹及婴幼儿急性传染病。在我国麻疹减毒活疫苗应用已有近40年的历史，制备疫苗均以鸡胚细胞为基质，作为异源细胞，具有携带禽病毒的可能，而人二倍体细胞为人源细胞〔1〕，在国外早已用来生产麻疹减毒活疫苗。人二倍体细胞（2BS 株）现已广泛应用于疫苗生产，如甲肝减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗等，已证明其具有安全性。我们用人二倍体细胞为基质制备出符合2005年版《中国药典》三部要求的麻疹减毒活疫苗，本文就此做如下报告。 1材料 1.1细胞 生产用细胞为人二倍体细胞2BS株，用于生产的细胞世代限定在43代以内。 1.2毒种 鸡胚细胞为培养基质制备的麻疹减毒活疫苗毒种长47株27代适应于人二倍体细胞，33℃和35℃培养，收获制成，经检定后用于生产，并已有多个代次毒种制备疫苗，证明此毒种具有良好的传代稳定性。 1.3培养液及维持液 MEM为基础液，加入适当比例的灭能小牛血清，碳酸氢钠调pH值。 1.4疫苗液 199液，pH值为7.4～7.5。 2方法 2.1单层法制备麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞） 单层人二倍体细胞2BS株按1：2～1：4传代，接种2L克氏瓶，加入细胞培养液，180ml/瓶，置37℃培养。当人二倍体细胞长成单层时，换成细胞维持液，200ml/瓶，再加入毒种，毒种的感染剂量（MOI）为1：100。将感染病毒的细胞瓶置35℃培养，此方法称为单层法。当细胞病变达50%以上时，用400mlEarle’s液冲洗细胞面，去除小牛血清，加入疫苗液，200～500ml/瓶，置35℃培养。当细胞病变达90%以上时，收到4℃冷库。在4℃冷库释放病毒1周，按0.3%加入人血白蛋白作保护剂，抽样检定。检定合格后，加入蔗糖明胶稳定剂及长8号微量保护剂，采用适宜的冻干曲线冻干。 2.2同时法制备麻疹减毒活疫苗（人二倍体细胞） 单层人二倍体细胞2BS株按1：2传代，毒种的感染剂量（MOI）为1：1000。将细胞、病毒和培养液同时分装到10L瓶中（即同时法），2000ml/瓶，置35℃旋转培养，转瓶机转速为7～8r/h。当细胞病变达50%以上时，用3000mlEarle’s液冲洗细胞面，去除小牛血清，加入疫苗液，2000～5000ml/瓶，置35℃旋转培养。当细胞病变达90%以上时，收冷到4℃冷库转瓶机上。在4℃冷库释放病毒1周，按0.3%加入人血白蛋白作保护剂，抽样检定。检定合格后，加入蔗糖明胶稳定剂及长8号微量保护剂，采用适宜的冻干曲线冻干。 2.3无菌试验、鉴别试验、异常毒性试验、水分、物理检查 按2005年版《中国药典》三部进行常规检定〔2〕。 2.4牛血清白蛋白残留量检测 采用放射免疫法。应不高于50ng/剂。 2.5病毒滴度及热稳定性试验（37℃7d）
细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安 全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞 接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻 拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消
化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁， 呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例 传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml 全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合 时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及 生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。 取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）
粒细胞： 白细胞根据形态差异可分为颗粒和无颗粒两大类，无颗粒的白细胞有淋巴细胞和单核细胞两种。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏染料染色可分辨出三种颗粒白细胞即中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞；绝大部分的粒细胞是中性粒细胞 粒细胞——细胞质中有特殊染色颗粒，根据颗粒对染料选择性的不同可分为： 嗜中性粒细胞：简称中性粒细胞，是白细胞中数量最多的，约占全部白细胞的53%左右，呈圆形，胞质淡红色，内含有多量的紫红色微粒（不易看清）。胞核随细胞成熟的程度而不同，幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见，老龄的有8－9叶或更多。 嗜酸性粒细胞：细胞质内含深红色大型颗粒，颗粒内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶。其细胞核的形状与嗜中性白细胞相似，通常有2－3叶，约占白细胞总数的4%。 嗜碱性粒细胞：数量很少，约占0.6%，大小与嗜酸性颗粒细胞基本相同。胞质内含有大的蓝紫色颗粒，胞核也分叶。 淋巴细胞： 淋巴细胞：白细胞的一种。由淋巴器官产生，机体免疫应答功能的重要细胞成分。淋巴器官根据其发生和功能的差异，可分为中枢淋巴器官（又名初级淋巴器官）和周围淋巴器官（又名次级淋巴器官）两类。前者包括胸腺、腔上囊或其相当器官（有人认为在哺乳动物是骨髓）。它们无须抗原刺激即可不断增殖淋巴细胞，成熟后将其转送至周围淋巴器官。后者包括脾、淋巴结等。成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。 白细胞： 白细胞（WBC），旧称白血球。血液中的一类细胞。白细胞也通常被称为免疫细胞。在显微镜下可以看到，血细胞中体积比较大、数量比较少。具有细胞核。其主要作用是吞噬细菌、防御疾病。 （嗜）中性粒细胞： 中性粒细胞在瑞氏染色血涂片中，胞质呈无色或极浅的淡红色，有许多弥散分布的细小的（0.2～0.4微米）浅红或浅紫色的特有颗粒。细胞核呈杆状或2～5分叶状，叶与叶间有细丝相连。中性粒细胞具趋化作用、吞噬作用和杀菌作用。绝大部分的粒细胞属中性粒细胞。每微升血液中约有4500个中性粒细胞。由于这些细胞的细胞核的形态特殊，又称为多形核白细胞。中性粒细胞来源于骨髓的造血干细胞，在骨髓中分化发育后，进入血液或组织。中性粒细胞属多形核白细胞的一种，由于其数量在粒细胞中最多，因此有人将多形核白细胞指中性粒细胞。 核呈深染的弯曲杆状（马蹄铁形）或分叶状，分叶核一般为2～5叶，叶间有纤细的缩窄部相连，正常人以2～3叶者居多。核的叶数与细胞在血流中停留的时间成正变。当机体受细菌严重感染时，大量新生细胞从骨髓进入血液，杆状核与2叶核的细胞增多，称为核左移；若4～5叶枝的细胞增多，称为核右移，表明骨髓的造血功能发生障碍。中性粒细胞的胞质呈浅粉红色，含有许多细小颗粒，其中浅紫色的为嗜天青颗粒，浅红色的为特殊颗粒。 中性粒细胞具有活跃的变形运动和吞噬功能，起重要的防御作用。其吞噬对象以细菌为主，也吞噬异物。中性粒细胞在吞噬、处理了大量细菌后，自身也死亡，成为脓细胞。中性粒细胞从骨髓进入血液，约停留6～8小时，然后离开，在结缔组织中存活2～3天。 单核细胞： 单核细胞是体积最大的白细胞。其细胞核常偏位，呈多形性，如卵圆形、肾形、马蹄形、不规则形等，常有折叠感；染色质呈疏松网状，着色较浅。胞质较多，嗜碱性，但因含大量细小的嗜天青颗粒而染成灰蓝色。
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸(人二倍体细胞) Jisuihuizhiyan Jiandu Huo Yimiao Tangwan (Ren Erbeiti Xibao) Poliomyelitis Vaccine in Dragee Candy (Human Diploid Cell), Live 本品系用脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、III型减毒株分别接种于人二倍体细胞，经培养、收获后制成糖丸，用于预防脊髓灰质炎。 1 基本要求 生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物应符合“凡例”有关要求。 2 制造 2.1 生产用细胞 生产用细胞为人二倍体细胞（2BS株或经批准的其他二倍体细胞株）。 2.1.1 细胞库管理及检定 应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。 主细胞库细胞世代应控制在第23代以内，工作细胞库细胞世代应控制在第27代以内，生产用细胞世代应控制在第44代以内。 2.1.2细胞制备 从工作细胞库之细胞种子开始培养,连续传代,至足够数量的细胞培养物。长成单层的细胞用0.25%胰蛋白酶消化，分散均匀后以适宜的分种率传代，于37℃±0.5℃℃贴壁静置或旋转培养。 2.2 毒种 2.2.1 名称及来源 生产用毒株为脊髓灰质炎病毒Ⅰ、Ⅱ、III型减毒株，可用Sabin株、Sabin 株或经批准的其他毒株。 纯化株、中III 2 2.2.2种子批的建立 应符合“生物制品生产和检定菌毒种管理规程”规定。 2.2.2.1 原始种子批 株均由毒种研制者制备和保存。 Sabin株原始毒种Ⅰ、Ⅱ、III型及中III 2 2.2.2.2 主种子批 除WHO赠送的Sabin株外，其他经批准的毒种由原始毒种在胎猴肾细胞或人二倍体细胞上传1～2代制成的成分均一的一批病毒悬液称为主种子批。 株主种子批的传代水平为中Sabin株主种子批的传代水平为SO＋1；中III 2 1代； III型pfizer株主种子批为RSO1。 III 2 2.2.2.3 工作种子批 取主种子批毒种在人二倍体细胞上传1-2代制备的组成均一的一批病毒悬液称为工作种子批。
多倍体育种 一、阅读案例材料 鱼圣——刘筠（yún） 湘云鲫、湘云鲤（原名工程鲫、工程鲤）是以湖南师范大学生命科学院教授、中国工程院院士刘筠为首的课题组，应用细胞工程技术和有性杂交相结合的方法培育出来的三倍体新型鱼类，其核心技术世界独一无二。湘云鲫生长速度超过母本（日本白鲫）40%，是普通鲫鱼的3～5倍；母体当年鱼苗最大生长个体为0.75千克，湘云鲤则可达1.7千克。“湘云鱼”肉质鲜美、营养价值高，同时细刺少、内脏少，可食部分比一般鲫、鲤鱼高出15%，深受消费者欢迎。由于它具有食性广、抗病力强、耐低温低氧、网捕率高、高度不育等优良经济性状，适应各类淡水水体养殖，可以进行池塘混养、单养。 据悉，全国推广湘云鲫、湘云鲤产生的经济效益已达30亿元。刘筠院士因湘云鲫、湘云鲤的培育成功等成果被尊称为“鱼圣”，2004年成为湖南省首届科学技术杰出贡献奖的唯一获奖者。现在，让我们来探寻科学家成功的足迹吧！ 敢于质疑，精于研究 说起湘云鲫（鲤），如果没有刘筠的离经叛道之举，人们至今也享受不了这个口福。1979年10月，湘阴县东湖鱼塘捕到了一条从未见过的“怪”鱼，个头特别大，像鲤又像鲫，刘筠从中发现与教科书不一样的东西。 根据遗传学原理，不同种属之间的物种杂交难度较大，自然形成的更为罕见。20世纪50年代，日本、前苏联学者更是提出鲫、鲤杂交雄性不育的理论。照此说来，杂交鱼再好看再好吃也没什么用。刘筠敢于质疑还精心设计了实验框架。经过反复实验，他终于发现鱼类远缘杂交具有正常的受精，打消了国内水产界的疑问。精子不仅能激活卵子的发育，而且能和卵子一道生儿育女。这一发现震惊了国际鱼类研究界。 通过努力，刘筠和他的课题组成功实现了鲫鲤（均是二倍体）之间的远缘杂交，其间可谓一波三折。在杂交第一代（湘鲫）中，4.6%的雄性和44.3%的雌性是能生育的，由于生长速度快得到了推广养殖。深入研究的刘筠还发现，在二倍体（即体细胞含两个染色体组）杂交第二代中，有些能够产生二倍体精子和卵子（通常情况下，二倍体只能产生单倍体精子和卵子），它们的受精使得在第三代中产生了雌、雄两性都可育的异源四倍体（指不同的种杂交产生的杂种后代，经染色体加倍含四个染色体组的个体）鲫、鲤鱼，经过长期的研究发现，这些四倍体鲫、鲤鱼在人工和自然环境下都能自然繁殖。课题组利用这个宝贵的四倍体鱼（父本）资源和正常的二倍体鲫（鲤）鱼（母本）杂交，便获得了三倍体鲫鱼和三倍体鲤鱼，这便是享誉世界的湘云鲫、湘云鲤。 毕生痴鱼，锲而不舍 刘筠院士1953年从湖南师范大学生物系毕业至今，从事鱼类繁殖研究52年，从一个初出道的青年成长为著名的生物学家，其间经历了多少艰难！但他“痴鱼”不改，终成大器。 在攻克四大家鱼池塘繁殖的难题中，刘筠和他的同行及弟子深入全省36个县市的江河、池塘、湖泊，采集了上千份实物标本。20世纪的五六十年代，交通极不方便。祁东县是课题组的主基地，鱼苗繁殖季节时间就是生命，不管狂风暴雨，还是烈日当空，刘筠一行往往早上在县渔场做完实验后，又马不停蹄步行35公里赶往归阳渔场进行另一组实验，做完后
甲型肝炎灭活疫苗（人二倍体细胞） Jiaxing Ganyan Miehuoyimiao （Ren Erbeiti Xibao） Hepatitis A Vaccine(Human Diploid Cell), Inactivated ???本品系用甲型肝炎病毒（简称甲肝）接种人二倍体细胞，经培养、收获，病毒纯化、灭活和氢氧化铝吸附后制成。用于预防甲型肝炎。 1．基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。 2.制造 2．1生产用细胞 生产用细胞为人二倍体细胞（2BS株、KMB17株或其他经批准的细胞株）。 2.1.1 细胞库管理及检定 应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”的有关规定。取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。2BS细胞株原始细胞库应不超过第14代，主细胞库应不超过第31代，工作细胞库次应不超过第44代。KMB17株原始细胞库应不超过第6代，主细胞库应不超过第15代，工作细胞库应不超过第45代。 2．1．2 细胞制备 取工作细胞库中的1支或多支细胞管，经复苏、扩增制备的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个消化批。 2. 2毒种 2．2．1名称及来源 ????生产用毒种为甲型肝炎病毒TZ84株、吕8株或其他批准的人二倍体细胞适应的甲型肝炎病毒株。 2．2．2种子批的建立 应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。 甲型肝炎病毒TZ84株原始种子批不超过第20代，主种子批为第22代，工作种子批为第23代，生产的疫苗代次应不超过第24代。吕8株原始种子批应不超过第24代，主种子批不超过第25代，工作种子批不超过第30代，生产的疫苗病毒代次应不超过第31代。 2．2．3种子批的检定
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
课题54：二倍体、多倍体、单倍体的比较及应用【课标要求】染色体结构变异和数目变异。 【考向瞭望】染色体结构变异和数目变异可能会出现大的实验设计题目，考查环境污染对染色体变异的影响。 【知识梳理】一、低温诱导植物染色体数目变化的实验 （一）实验原理：低温抑制纺缍体的形成，以致影响染色体被拉向两极，细胞不能分裂成两个子细胞，于是染色体数目改变。 （二）方法步骤：洋葱根尖培养→固定→制作装片（解离→漂洗→染色→制片）→观察。 （三）试剂及用途 1、卡诺氏液：固定细胞的形态。 2、改良苯酚品红染液：使染色体着色。 3、解离液[15%的盐酸和95%的酒精混合液（1︰1）]：使细胞分散。 二、二倍体、多倍体与单倍体 （一）二倍体、多倍体、单倍体的比较 1、单倍体与二倍体、多倍体是两个概念系统，主要区别在于是由什么发育而来的，单倍体的概念与染色体组无关。单倍体一般含一个染色体组（二倍体生物产生的单倍体），也可以含两个、三个甚至更多个染色体组，如普通小麦产生的单倍体，就有三个染色体组。 2、二倍体、多倍体与染色体组直接相关，体细胞含有两个染色体组的个体叫二倍体，含有三个或三个以上的叫多倍体。 【思考感悟】（1）改良苯酚品红染液可以用什么试剂替代？（2）实验中的情况在自然界中能发生吗？ （1）可以用龙胆紫、醋酸洋红等碱性染料替代。（2）能，特别是在高原植物中。 【基础训练】 1、下面所列材料中，最适合用于“低温诱导植物染色体数目的变化”实验的是（C） A、洋葱鳞片叶表皮细胞 B、洋葱鳞片叶叶肉细胞 C、洋葱根尖分生区细胞 D、洋葱根尖成熟区细胞 2、低温和秋水仙素都能诱导染色体数目加倍，起作用的时期是（ B） A、细胞分裂间期 B、细胞分裂前期 C、细胞分裂中期 D、细胞分裂后期 3、果蝇的卵原细胞在减数分裂形成卵细胞过程中常常发生同源染色体不分开的现象，因此常常出现性染色体异常的果蝇，出现不同的表现型，如下表所示。
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
1口服I 型III 型脊髓灰质炎减毒活疫苗（人二倍体细胞） 2Koufu I Xing III Xing Jisuihuizhiyan Jiandu Huoyimiao（Ren Erbeiti 3Xibao） 4Poliomyelitis (Live) Vaccine Type I Type III (Human Diploid 5Cell), Oral 6本品系用脊髓灰质炎病毒I、III 型减毒株分别接种于人二倍体细胞，经培养、7收获病毒液制成二价液体疫苗，用于预防I 和III 型脊髓灰质炎。 8 1 基本要求 9生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有10关要求。 11 2 制造 12 2.1 生产用细胞 13生产用细胞为人二倍体细胞（2BS 株、KMB17 株或经批准的其他人二倍体细14胞）。 15 2.1.1 细胞管理及检定 16应符合“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 17每批原液的生产应来自复苏扩增后的同一细胞批。 18各级细胞库代次应不超过批准的限定代次。 19 2.1.2 细胞制备 20取工作细胞库中的细胞，经复苏、消化、置适宜温度下静置或旋转培养制备21的一定数量并用于接种病毒的细胞为一个细胞批。 22 2.2 毒种 23 2.2.1 名称及来源 24生产用毒种为脊髓灰质炎病毒I、III 型减毒株；可用I、III 型Sabin 株，I、25III 型Sabin 纯化株，中III2 株或经批准的其他毒株。各型Sabin 毒株和Pfizer 株26来源于世界卫生组织（WHO）。 27 2.2.2 种子批的建立 28应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
名词解释： 1.群体倍增时间：细胞指数增长期时，细胞群倍增所需的时间。是由于表示群体细胞指数生长期内细胞分裂活动的程度，是判断细胞生长是否旺盛的重要指标。 2.接触抑制（contact inhibition）：细胞相互接触后失去运动的现象。 3.密度抑制（density inhibition）：由于细胞密度过大，培养液营养耗尽，代谢产物过多和生存空间消失所引起的细胞增殖的抑制现象。 4.肿瘤干细胞(tu mor stem cells，TSC)表现为一种特殊类型的干细胞，具备高度增殖能力与自我更新能力，也具备多向分化的潜能。TSC增殖过程中，通过不均一分裂，一个TSC分裂形成一个新的TSC和另一个可最终分化为包括肿瘤细胞在内的各种细胞的子细胞，其结果是维持TSC数目稳定并产生肿瘤。 5.细胞汇合(Confluent)：指细胞增殖生长相互连接成片占据所有底物面积现象。 6.饱和密度(Saturation density)：在特殊培养条件下，每平方厘米(单层培养)或每毫升细 胞悬液内可达到的最大细胞数。 7.二倍体细胞系或株(Diploid cell line or strain)：具有二倍体染色体数的细胞系或株。 8.二倍体(Diploid)：指双倍数的染色体数或具有此数的细胞系。 9.组织工程：是应用生命科学和工程学的原则及方法，在正确认识正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科。 10.细胞融合(Cell fusion)：指两个独立的细胞借媒介物(PEG等)融合成杂种细胞的过程。 11.细胞富集：当细胞分离纯化并不完全彻底，培养物中能达到以某种细胞为主（占绝大多数）的程度。 12.三维培养：把细胞悬液接种在一定立体形态的支架上，使细胞生长在三维环境中的培养方法。 13.平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS）：简称盐溶液，集缓冲液的缓冲能力、生量盐水的等渗性以及培养液的营养供应特点于一体。兼具缓冲和调节溶液的酸碱度、维持渗透压、同时供给细胞生存所需的能量和无机离子成分的作用。 14.生长基质（growth substratum）：培养器皿表面包被的一层能改善生长表面的特性，促进细胞粘附和贴壁的物质。 15.去分化（dedifferentiation）：指已成熟的细胞和组织倒退分化，返回原始幼稚的状态。 16.消化液：在原代细胞培养和细胞传代时，都要用消化液，最常用的是胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA），其次是一些特殊的组织细胞培养用的各型胶原酶。在原代细胞培养中，使用消化液从组织块中分离（散）出单个的细胞；在进行细胞传代时，消化液使细胞脱离生长表面并离散成单个细胞。 17.消毒 disinfection 杀死物体上病原微生物的方法。 灭菌 s terilization 杀灭物体上所有微生物的方法，包括病原微生物和非病原微生物、繁殖体和芽胞。 18.转化细胞系：指细胞发生了不可逆转的遗传改变而引起恒定的表型改变的细胞系。 19.杂交瘤技术：又称单克隆抗体制备技术，是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴 细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。 20.指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 21.干细胞：是指具有无限或较长期的自我更新能力、多种分化潜能和高度增殖能力的细胞。 22.全能干细胞，如ES细胞。全能干细胞可以分化成人体的各种细胞，这些细胞构成人体的 各种组织和器官。
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
人二倍体细胞建株、检定及制备疫苗规 程 人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。 [B]A细胞株的要求[/B] 用于疫苗生产的人二倍体细胞株（以下简称细胞株）须按下列规定进行全面检定。新建立细胞株，应按《新生物制品审批办法》进行审批。 1 建立细胞株必须具备下列资料 1.1 建立细胞株所用的胎儿的胎龄和性别，中止妊娠原因。 1.2 建立细胞株所用胎儿的父、母年龄、职业及健康状况，胎儿父、母系三代应无明显遗传缺陷和肿瘤疾病历史。在取胎儿组织时，应作出详细调查，报卫生部审批前，应进行一次重复调查。 1.3 原始组织种类，原代培养的数量与生长状况。 1.4 细胞培养史和生长特征，细胞寿命、世代数。 1.5 细胞生长液的成分。 2 细胞株的检定 2.1 染色体的鉴定和制片 细胞原系建株过程，每8～12世代*应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有4～5次染色体检查结果。 每次染色体检查，应从同一世代不同细胞培养瓶中取细胞混合再培养，制备染色体标本片。染色体标本应长期保存（直至褪色不能用为止），以备复查。 每次染色体检查，至少应随机取1000个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作出有助于复查的记录，其中至少选择50个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析。并应粗数500个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。 可以G分带或Q分带技术检查50个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。以显带技术检出的核型异常（假二倍体、倒位、易位等）发生率应用比现用上限更宽的基本数据进行评价，合格上限尚未定出。 2.1.1 合格要求
各种血细胞模式图
各种血细胞模式图 1.红细胞 2.嗜酸性粒细胞 3.嗜碱性粒细胞 4.中性粒细胞 5.淋巴细胞 6.单核细胞 7.血小板 红细胞聚集分布 成熟红细胞随机呈块状或束状聚集在一起，临床主要表现为以下病症： 1.多种抗体暴露； 2.溶血性贫血（自身免疫性）； 3.非典型肺炎； 4.金葡菌感染； 5.冷凝集疾病。
靶形红细胞 红细胞中央色深，外周以苍白圈，在近红细胞边缘处又较深。形同射击之靶，在正常情况下靶形细胞极少见。但在黄疸、肝病、脾切除后，缺铁性贫血，尤其是在地中海贫血的血涂片上颇为常见。 镰状红细胞 这种红细胞两端尖锐，长而狭，形如镰刀样，见于先天性镰状红细胞贫血和Hb-C病等
Bite Cell 红细胞 由于细胞内血红蛋白变性或沉淀成块，使细胞呈半圆形，提示可能有红细胞膜的缺乏，如G-6-PD缺乏症。 水滴形红细胞 红细胞形态如梨形或水滴形，见于各种增生性贫血及骨髓纤维化，以及地中海贫血、脾功能亢进或肾病等。 固缩红细胞 红细胞中有一侧清晰区，而血红蛋白浓缩偏向另一侧，临床上常见于婴儿固缩红细胞增多症。 半月形红细胞 胞体巨大，呈月形，淡红色。为衰老红细胞在制片时人工造成，或见于某些增生性贫血、血小管球性肾炎。
刺毛红细胞 亦称锯凿细胞。包括刺细胞、钻细胞及距细胞。往往见于微血管病性溶血性贫血、丙酮酸激酶缺乏症、PNH，距细胞多见于肝脏疾病，钻细胞也见于尿毒症。 球形红细胞 此种红细胞直径缩短，厚度增加，细胞中心区的血红蛋白比周围多，呈小球形状。常见于遗传形红细胞增多症、自身免疫性溶血性贫血、异常血红蛋白病（如Hb-S等）。 椭圆形红细胞