济南大学研究生课程考查试卷
课程编号：QZ283001课程名称：信息与文献检索学时16 学分 1 学号：20172120470 姓名牛浩学科、领域生物工程
学生类别：全日制专业学位成绩：任课教师（签名）
1、考核形式(采用大作业、论文、调研报告、实验报告等)：
课程论文
2、考查（内容、目的等）具体要求：
写一篇与所从事专业相关的综述性论文
字数在3000字左右
书写格式规范，论述清晰，层次分明
3、成绩评定说明（含平时成绩、考核成绩）：
平时成绩主要包括考勤和平时作业，考勤共计10分，平时作业共计20分，占总成绩的30%。
期末课程论文共计70分，占总成绩的70%。
总成绩为平时成绩与课程论文成绩的加和，即100分。
合成生物学在生物燃料领域的研究
摘要：本文简要介绍了合成生物学的概念，生物燃料的研究现状、研究前景以及未来可能会遇到的一些挑战。探讨了合成生物学在生物燃料研究中的应用进展包括提高生物质原料的转化特性、开发绿色高效生物催化剂、构建微生物细胞工厂以及设计合成多种生物燃料产品。最后对合成生物学在生物燃料领域的研究做出了展望。
关键词：合成生物学；生物燃料；研究现状；前景；挑战；应用进展
1 合成生物学概述
合成生物学(synthetic biology) 是综合了科学与工程的一个崭新的生物学研究领域。它既是由分子生物学、基因组学、信息技术和工程学交叉融合而产生的一系列新的工具和方法，又通过按照人为需求( 科研和应用目标)，人工合成有生命功能的生物分子( 元件、模块或器件)、系统乃至细胞，并自系统生物学采用的“自上而下”全面整合分析的研究策略之后，为生物学研究提供了一种采用“自下而上”合成策略的正向工程学方法[1]。它不同于对天然基因克隆改造的基因工程和对代谢途径模拟加工的代谢工程，而是在以基因组解析和生物分子化学合成为核心的现代生物技术基础上，以系统生物学思想和知识为指导，综合生物化学、生物物理和生物信息技术与知识，建立基于基因和基因组、蛋白质和蛋白质组的基本要素( 模块) 及其组合的工程化的资源库和技术平台，旨在设计、改造、重建或制造生物分子、生物部件、生物系统、代谢途径与发育分化过程，以及具有生命活动能力的生物部件、体系以及人造细胞和生物个体。
2 生物燃料研究现状与挑战
2.1 生物燃料的研究现状
生物燃料主要包括纤维素生物燃料(乙醇、丁醇等)、微藻生物燃料(生物柴油、航空生物燃料等)，以及最近两年研究较热的新型优质生物液体燃料(高级醇、脂肪醇、脂肪烃等)和利用新技术路线合成的生物乙醇与生物柴油(蓝藻乙醇、微生物直接利用纤维素水解糖体内合成生物柴油等)等。“可持续性”是生物燃料的核
心特征，其具体表现为：作为原料的生物质资源不与食物资源竞争;能量高，生
产过程减少对水、土地和肥料的消耗;不对环境或当地人口造成负面影响;产量大，成本低廉。
目前，为了提高生物燃料的可持续性、推进生物燃料的研发与应用，人们开展了各种新兴领域的研究与探索工作，并不断取得阶段性突破。从生物燃料的产业化现状来看，目前全木质纤维素类能源作物和藻类等原料类的应用颇具前景。目前美国已有数十家纤维素乙醇中试工厂在运行，预计第一家大规模纤维素乙醇示范工厂也将很快投入运营;高级生物柴油在芬兰和新加坡已经有大规模的工厂
开始生产，目前产量还相对较低，但在不远的将来有望实现完全商业化生产;微
藻制油技术由于成本较高，目前仍处于中试阶段，但在技术发展和商业运作方面已经有了一些有益的尝试，未来实现产业化的可能性很大[2]。
2.2生物燃料的前景与挑战
与太阳能、风能等可再生能源相比，生物燃料更适合直接用于交通运输燃料。预期至2050年，生物燃料将占总交通运输燃料的27%，尤其在替代柴油、煤油和喷气燃料方面将发挥重要作用，预计使用生物燃料每年将减少21亿吨二氧化碳排放。为达到此目标，许多传统技术需要改良以提高转化效率、降低成本，提升可持续性。美国生物技术工业组织(BIO)发的《基于RFS的纤维素和高级燃料的价值定位》政策白皮书中指出[3]，由于纤维素乙醇和其他高级生物燃料技术仍处于新兴阶段且成本昂贵，纤维素乙醇和高级生物燃料的技术仍处于研发和市场化前期阶段。事实上，已经有70多个先导项目的生物精炼示范工厂在美国北部实验性地运行，用以促进该技术的进一步提升。
当前，随着经济全球化趋势的不断深化和人类对于可持续发展的迫切要求，世界各国正在积极努力转变经济增长方式、调整经济和产业结构，并强化开发节能降耗措施，这给生物燃料的发展提出了综合环境与经济效益的新的标准。因此，各国从政策扶持、企业行动和技术集成等多方面入手，正在大力推进生物燃料的研发与应用[4]。为了跨越先进生物燃料从基础研发到技术应用的“死亡之谷”，核心途径是要突破生物技术领域的创新。合成生物学位于未来生物技术革命的前沿，融合了生物燃料从原料开发到转化加工等多个层面的技术创新，无疑是重要的突破点之一。
3 合成生物学在生物燃料研究中的应用进展
3.1 提高生物质原料的转化特性
合成生物学应用于植物生物工程学，辅助生物质原料作物的筛选和分子设计，有助于提高单位产量和抗菌抗病能力，进而提高生物质原料作物的光能利用效率，将其设计改造为高效的植物生物反应器。Mariam Sticklen 等发现了能够降解玉
米茎和叶片中纤维素的关键酶基因，并通过对玉米基因进行修饰，使玉米在收割后，其自身产生的酶能够对细胞壁进行自我降解[5]。
法国农业科学研究院(INRA)证实了漆酶确有参与拟南芥的木质化过程。在
茎中表达的漆酶基因若是未表达，木质素含量只会微量降低;但若是被删除，则
在导致木质素含量减少40%的同时，促进细胞壁的糖化作用，这为科学家利用合成生物学改造能源作物减少木质素含量提供参考依据。
近年来，芒类植物由于其生长快、产量高、易繁殖的特点，已作为一种具有重要开发利用前景的能源作物而受到高度关注。美国能源部和农业部联合资助的基因组学研究发现，其中“加快芒属植物驯化”项目对芒属植物的基因组结构、功能和组织的研究为进一步进行遗传改良和优质品种选育奠定了基础。
3.2 开发绿色高效生物催化剂
酶的定向进化和新型酶与多酶体系的构建是与合成生物学相关的重要研究
内容，能够帮助提高生物燃料的生物催化转化过程的效率，并有效降低成本。美国加州理工大学和基因合成公司DNA2.0 的研究人员在从纤维素原料中提取酶
方面迈出了新的一步，所提取的糖能够轻易地被转化为乙醇和丁醇等可再生燃料。德国RWE电力公司和BRAIN公司联合利用合成生物学技术[6]，开发由二氧化碳转化为微生物质和生物分子的技术。两家公司期望通过微生物改造以产生新的酶，并开发创新的合成路径。
此外，自然界中资源丰富，还有很多高效酶有待于挖掘，设计高通量的筛选策略，从生物体(主要指微生物)中分离出具有更好性能的酶为下一步合成生物学改造提供材料。近年来兴起的宏基因组技术和比较基因组学为分离众多未培养微生物所产的新酶提供了有力的工具。例如，通过构建极端微生物的宏基因组文库可有效鉴定具有多种性能的新型酯酶;利用宏基因组技术从白蚁和牛胃中发现一
些纤维素酶，为构建纤维素高效利用提供了材料。
3.3 构建微生物细胞工厂
微生物在数十亿年的进化中形成了与人类日常生产生活关系密切的生物化
学途径，几乎能合成地球上所有的有机化学品。认识并改造微生物自然代谢能力，提高微生物利用各种生物质的能力，并经过人为的重组和优化，重新分配微生物细胞代谢的物质流和能量流，使其成为服务于生物炼制的细胞工厂。这样，丰富的生物质资源才有可能真正成为替代石油的工业原料，高效地制备生物能源和替代石油化工原料的平台化合物。大肠杆菌、酵母和微藻等模式微生物由于其结构简单、遗传背景清楚、遗传操作手段成熟，被广泛用做合成生物学研究宿主。
美国加州大学伯克利分校的化学家们将一套酶系统的5个酶中的2个替换成来源于其它生物体的同源酶(来自丙酮丁醇梭菌、齿垢密螺旋体和富养罗尔斯通
氏菌)，然后再转化到大肠杆菌，进而避免正丁醇被重新转化成最初的化学原料。新改造的大肠杆菌每升原料可生产近5g的正丁醇，与野生梭菌产能量相近，是现有工业化微生物系统产量的10倍[7]。通过提高少数几个瓶颈处的酶活性，可
以将产量再增加2 ～3倍，并可以考虑扩大到工业化规模。同时研究小组还在调整新的合成途径以适应于酵母细胞。Tsai等在酵母中首次成功地构建人造纤维小体，与含有许多天然纤维小体的细菌相比，它对乙醇的耐受性更强。酵母纤维小体可使由酶催化纤维素水解同时进行发酵的一步法生物加工过程生产效率更高。因此，利用工程化酵母菌株使生物质生产生物乙醇的工艺流程更有效，更具经济价值。
科学家们希望通过对微生物群落的合成生物学改造，充分利用微生物群落的各种合成能力，用于生物燃料和其他有用产品的生产。而微生物群落一旦形成，组成菌群的细菌并非各个体的简单组合，而更像一个微生物的超级组织，可以完成更为复杂和高效的转化任务。
3.4 设计合成多种生物燃料产品
随着合成生物学研究用于第二代生物乙醇、生物柴油等生物燃料产品的研发，并取得越来越多的技术进展，一些有发展前景的生物燃料产品已经步入准商业化生产进程。基于微生物代谢的合成生物学研究对于设计和制造多种新型生物燃料产品具有重要意义。
美国加州大学洛杉矶分校的研究人员通过改变大肠杆菌的氨基酸生物合成
途径，使其更加适于长链醇燃料的生产，这是研究者首次成功合成长链醇。与乙醇相比，长链醇含有更多碳原子，能量密度更大，更易从水中分离，有望成为理想的替代生物燃料。Keasling等利用合成生物学原理敲除了大肠杆菌DH1菌株
脂肪酸分解基因fadD增加以脂肪酸供应，并表达硫酯酶TesA、脂酰-CoA连接酶ACL、酯合成酶AtfA，从而构建了脂肪酸乙酯(生物柴油)生物合成途径。通
过对生物合成途径对优化改造将进一步提高脂肪酸乙酯产量。
美国Gevo 公司集合了化学、发酵、加工和基因工程等多个领域的研究[8]，近年重点研发异丁醇及其衍生物的生产平台与技术，其中三项关键技术已经帮助公司开始进行商业规模的生产。2011年，Keasling 研究组以合成生物学的方式
构建出一种大肠杆菌与一种酿酒酵母，成功生产没药烷型倍半萜烯，这种没药烯进行加氢反应生成的没药烷可作为新型的绿色生物燃料，有潜力成为D2柴油的替代品。
此外，在生物燃料生产过程中产生的副产品和废弃产品的再利用和转化方面，合成生物学研究也有一定的发展空间和前景。人们已经开始在相关研究中引入了基因工程的实践。例如，美国莱斯大学开发利用基因改造的大肠杆菌把生物柴油生产的副产品甘油转化为高价值的化学制品的技术，所得到的琥珀酸等有机酸可作为生产塑料、制药和食品添加剂等产品的重要原料，能够提高燃料制造商的效益。
4 展望
合成生物学在过去的十年中得到了飞速发展。大量高效而实用的合成生物学工具被开发和应用于生物燃料的微生物合成。通过在不同层面(酶、代谢途径和
基因组) 对微生物合成过程进行设计、调控和优化，人们不仅能够生产全新的生物燃料，而且能够使目标产物的产量达到最大化。随着各国对合成生物学研发投入的增加及研究人员的关注，生物燃料的未来将充满希望。
参考文献
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[8]Atsumi S,Hanai T,Liao J C.Non‐Fermentative Pathways for Synthesis of Branched-Chain Higher Alcoholsas Biofuels,Nature,2008,451,86-89．
合成生物学与中药资源的可持续利用 ——香山科学会议第510次学术讨论会综述 中药资源是中医药的物质基础，是大自然和传统文化赋予我们的珍贵宝藏，几千年的积累为人们的生产生活提供了丰富的药物基础保障。但是随着社会的发展、需求量不断增大，加之对合理开发利用中药资源的认识不足，使中药资源的可持续发展和利用面临巨大的压力。分子生物学和生物化学技术的不断发展，使得药用植物次生代谢产物生物合成途径逐渐得以解析，通过挖掘活性成分生物合成的相关元件，利用合成生物学方法对植物中现有的、天然的生物系统进行重新设计，实现药用植物的定向遗传育种，通过培育高产目标活性成分的药用植物，能有效降低中药制剂生产过程的提取成本并缓解对药用植物资源的压力。同时，利用生物系统整合优化在微生物体内重建药用植物次生代谢产物的生成模块，可以实现珍稀活性成分的异源高效合成，为单一成分中药以及中药提取物生产提供原料，缓解其对中医临床用药以及中药资源的压力。2014年11月11~12日，香山科学会议在北京香山饭店召开了主题为“合成生物学与中药资源的可持续利用”的第510次学术讨论会。中国中医科学院黄璐琦研究员、中科院上海植物生理生态所陈晓亚研究员、中科院上海生物工程研究中心杨胜利研究员、中科院天津工业生物技术研究所张学礼研究员担任
会议执行主席。来自大专院校、科研院所的40多位专家学者围绕（1）药用植物次生代谢途径及其调控研究；（2）合成生物学研究方法和思路；（3）合成生物学在药用植物活性成分生产中的应用等中心议题进行深入的探讨。 黄璐琦研究员作了题为“合成生物学与中药资源的可持续利用”的主题评述报告，结合正在开展的中药资源普查试点工作认真阐述了中药资源的重要性以及中药资源事业发展所面临的重大科学问题，他指出“供不应求”是导致目前中药原料市场种种问题的根本原因之一，也从某种程度上制约了整个中医药行业的发展，给自然环境带来了巨大的生态压力，急需要采取相关措施予以改善。随后从种源、种群、种植、新药资源开发及生物技术五个方面介绍了目前为保障中药资源可持续利用所做的相关工作。报告针对合成生物学在中药资源活性成分合成中的应用，介绍了国内外科学家在青蒿素、紫杉醇、丹参酮等生物合成途径中的最新进展，以及发展中药资源合成生物学研究的关键环节。最后，黄璐琦研究员探讨了中药资源未来的发展，提出了未来的方向是中药材饮片以“道地”为基础的定点栽培、中成药工业原料以“有效成分”为目标的定向培育以及合成生物学“不种而获”的协同发展。 一、药用植物次生代谢途径及其调控研究
合成生物学中DNA的合成、组装和应用 摘要 近年来，以微芯片为基础的基因合成技术发生了令人振奋的新发展,基因合成技术具有显著增加产量和降低基因合成成本的潜力，连同更高效的酶促修复技术和基因组装技术，这些新技术正推动合成生物学走向更高水平。 1.基因合成(不确定的地方全部原文标黄) 传统的寡核苷酸合成是用微升体积的溶液在小柱上进行合成。化学物和溶剂过柱后，逐步诱导核苷酸单体添加，形成增长的寡核苷酸链。依据标准的亚磷酰胺化学法，每轮反应包括以下四个步骤：1).脱保护；2).偶联；3). 封闭；4).氧化。过去几十年，商业上主要用固相亚磷酰胺化学法合成DNA。但由于化学反应效率上的局限，合成的寡核苷酸长度大部分不能超过150-200个碱基。如果超过这一长度，每步化学反应的副反应和低效率都会显著影响到序列的完整和产物 的产率。 传统上，以DNA聚合酶或连接酶为基础的装配方式的基因构建以柱合成的寡核苷酸为（Traditionally, column-synthesized oligos are used as building blocks for gene construction using either DNA polymerase based or DNA ligase based assembly methods.）目前对基因装配技术有许多细节上的评价在文献里都能找到。能在一些综述里找到对当前基因装配技术更详细的评估。但是，由于柱基础的寡核苷酸合成花费高、生产量有限，这些都使大规模的基因合成和基因组装配
在这个新的合成生物学时代遇到瓶颈。 微阵列芯片作为一个不昂贵的寡核苷酸高密度阵列近年来引起了广泛的关注。 在微阵列芯片上进行合成允许小型化和平行方式产生大量的独特寡核苷酸序列（Synthesis on microarrays allow large numbers of unique oligo sequences to be generated in a miniaturized and parallel fashion），而且在产量、试剂消耗、花费上都有很大优势。与早期的微阵列合成寡核苷酸池进行基因装配相比，后来的微阵列在质量、效率、寡核苷酸合成与基因组装自动化上都有了令人激动的发展。图1总结出了进步之处。 用微阵列技术进行基因合成也有一定的挑战性。最大的挑战就是微阵列产生序列相对质量较差。在平面表面合成的寡核苷酸更容易出错，通常错误率大于柱合成的寡核苷酸。其中一个原因是脱保护剂/脱三苯甲基剂造成的迁延照射（即延长的暴露）使得“脱嘌呤”。通过优化试剂流动和反应条件，安捷伦科技的Leproust小组改进了反应过程，使高保真合成寡核苷酸池提高到200个碱基。另一个（错误率高的）原因是微阵列芯片合成中所谓的“边缘效应”。微阵列芯片合成大体上依靠于硅晶片上的直接且有空间性限制反应的具体机制。比如，安捷伦公司用喷墨印刷技术分配微微升溶剂到芯片上指定的位置。联川生物（LC Sciences）和美国昂飞公司（Affymetrix）在微流体系统中用激发光化学控制解封步骤（deblocking step）。CombiMatrix 公司用可编程的微电极阵列在需要的点上进行氧化还原反应。这些例
合成生物学之生物部件 622 （山东大学生命科学学院，济南，250100） 摘要：合成生物学强调“设计”和“重设计”，其目的是通过人工设计和构建自然界中不存在的生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题，其工程化的思想和标准化的工具一经兴起变得到全世界范围的广泛关注。生物系统的层次化结构是合成生物学本质化的典型体现，合成生物学系统中最简单最基本生物模块被称为生物部件（part），它是自下而上的研究策略中基础部分，本文回顾了合成生物学中常用的生物部件级标准化使用方法，着重介绍了启动子和核糖开关的相关研究进展。 关键词：合成生物学生物部件生物元件 1953年，年轻的J.D.Watson和F. Crick从DNA的X射线的X衍射图上解读了双螺旋结构，隐藏了几十亿年的生物密码逐渐露出端倪。2003年人类基因组计划顺利完成，此后包括人类在内的各种生物的图谱纷纷出炉，生物遗传密码的神秘面纱正在被迅速揭开。生物学由定性描述转向定量计算，从分析到设计，进入系统和合成生物学（synthetic biology）的的时代。 目前合成生物学的定义还处于多元化阶段，比较全面地可以概括为：合成生物学是指按照一定的规律和现有的知识，设计和建造新的生物部件、装置和系统，或重新设计已有的天然系统为人类的特殊目的服务。从这个定义来看，合成生物学包含自下而上的研究策略和自上而下的研究策略，对于前者的探索是艰深而富有划时代意义的。合成生物学最终期望是借鉴电子学的方法能能像“搭积木”一样构建基因线路，而这最基本的就是模块化元件。 我们称具有标准接口、功能相对独立生物大分子、信号转导路径、基因线路等为“模块”（module）或生物积块（BioBrick），模块的规模可大可小，大致可分为部件（part）、装置（device）、系统（System）及多细胞体系等几个层次，其中最基础的就是生物部件。模块化设计体现了合成生物学的精髓，模块往往具有信息隐藏，内聚耦合，封闭性开放性的特性。常见的生物部件按照功能可以分为启动子（promoter）、核开关（Riboswithch）、RBS、终止子、操纵子、蛋白编码基因（CDS）、报告基因、标签组件、操纵子等，当然这些分类层侧不是绝对的。
济南大学研究生课程考查试卷 课程编号：QZ283001课程名称：信息与文献检索学时16 学分 1 学号：20172120470 姓名牛浩学科、领域生物工程 学生类别：全日制专业学位成绩：任课教师（签名） 1、考核形式(采用大作业、论文、调研报告、实验报告等)： 课程论文 2、考查（内容、目的等）具体要求： 写一篇与所从事专业相关的综述性论文 字数在3000字左右 书写格式规范，论述清晰，层次分明 3、成绩评定说明（含平时成绩、考核成绩）： 平时成绩主要包括考勤和平时作业，考勤共计10分，平时作业共计20分，占总成绩的30%。 期末课程论文共计70分，占总成绩的70%。 总成绩为平时成绩与课程论文成绩的加和，即100分。
合成生物学在生物燃料领域的研究 摘要：本文简要介绍了合成生物学的概念，生物燃料的研究现状、研究前景以及未来可能会遇到的一些挑战。探讨了合成生物学在生物燃料研究中的应用进展包括提高生物质原料的转化特性、开发绿色高效生物催化剂、构建微生物细胞工厂以及设计合成多种生物燃料产品。最后对合成生物学在生物燃料领域的研究做出了展望。 关键词：合成生物学；生物燃料；研究现状；前景；挑战；应用进展 1 合成生物学概述 合成生物学(synthetic biology) 是综合了科学与工程的一个崭新的生物学研究领域。它既是由分子生物学、基因组学、信息技术和工程学交叉融合而产生的一系列新的工具和方法，又通过按照人为需求( 科研和应用目标)，人工合成有生命功能的生物分子( 元件、模块或器件)、系统乃至细胞，并自系统生物学采用的“自上而下”全面整合分析的研究策略之后，为生物学研究提供了一种采用“自下而上”合成策略的正向工程学方法[1]。它不同于对天然基因克隆改造的基因工程和对代谢途径模拟加工的代谢工程，而是在以基因组解析和生物分子化学合成为核心的现代生物技术基础上，以系统生物学思想和知识为指导，综合生物化学、生物物理和生物信息技术与知识，建立基于基因和基因组、蛋白质和蛋白质组的基本要素( 模块) 及其组合的工程化的资源库和技术平台，旨在设计、改造、重建或制造生物分子、生物部件、生物系统、代谢途径与发育分化过程，以及具有生命活动能力的生物部件、体系以及人造细胞和生物个体。 2 生物燃料研究现状与挑战 2.1 生物燃料的研究现状 生物燃料主要包括纤维素生物燃料(乙醇、丁醇等)、微藻生物燃料(生物柴油、航空生物燃料等)，以及最近两年研究较热的新型优质生物液体燃料(高级醇、脂肪醇、脂肪烃等)和利用新技术路线合成的生物乙醇与生物柴油(蓝藻乙醇、微生物直接利用纤维素水解糖体内合成生物柴油等)等。“可持续性”是生物燃料的核
合成生物学与工业生物技术 ◆杨 琛 姜卫红 杨 晟 赵国屏 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所,上海200032 收稿日期:200928210 修回日期:200929227联系作者:姜卫红,研究员,whjiang@sibs .ac .cn 。 摘 要 合成生物学是近年来发展起来的新 兴学科,因其具有重要的研究意义和巨大的应用开发潜力而备受关注,发展极为迅速。本文对合成生物学的国内外研究概况、发展方向及其对工业生物技术领域的推动作用进行了概述。 关键词:合成生物学 工业生物技术中图分类号:Q812 文献标识码:A 文章编号:100922412(2009)0520038203 近年来,系统生物学理论与工程生物技术的发展使得合成生物学这一新兴研究领域应运而生,并取得重要进展。合成生物学是在基因组技术为核心的生物技术基础上,以系统生物学思想为指导,综合生物化学、生物物理和生物信息技术,利用基因和基因组的基本要素及其组合,设计、改造、重建或制造生物分子、生物体部件、生物反应系统、代谢途径与过程乃至具有生命活力的细胞和生物个体。合成生物学研究既是生命科学和生物技术在分子生物学和基因工程水平上的自然延伸,又是在系统生物学和基因组综合工程技术层次上的整合性发展。其主要目标,一方面是希望可以根据人类的意愿从头设计,合成新的生命过程或生命体;另一方面,是利用合成生物学的方法,将“综合、整体”的思路真正引入现代工业生物技术和生物医学等领域,通过对现有生物体的有目标的改造,以有助于解决人类发展面临的若干重大挑战,譬如合成新医药材料和新药品、生产生物燃料、清理有毒废物、减少二氧化碳排放等。因此,合成生物学具有重要的研究意义和巨大的应用开发潜力。 一、国内外研究概况 合成生物学首先被应用在天然药物的生物合 成、生物能源和生物基化学品领域,如:美国杜邦公司利用大肠杆菌合成了重要的工业原料1,32丙二醇;L iao 等在大肠杆菌中重构了异丁醇产生途径[1]; 2006年,美国加州大学Berkeley 分校的Keasling 实 验室将多个青蒿素生物合成基因导入酵母菌中产生了青蒿酸,并通过对代谢途径(网络)不断改造和优化,使产量实现了若干数量级的提高,具有了工业生产的潜力[2],该重要进展是合成生物学在工业应用中的一个标志性突破。 近年来,利用人工化学合成的手段合成生物遗传物质的研究进展非常迅速。2002年,美国W i m mer 实验室首次化学合成了脊髓灰质炎病毒的c DNA ,并反转录成有感染活性的病毒RNA ,开辟了利用已知基因组序列,不需要天然模板,从化学单体合成感染性病毒的道路[3]。2008年Venter 实验室合成了有 582970个碱基对的生殖道支原体(M ycoplas m a gen i 2ta lium )全基因组 [4] 。为了突出这是人工合成的基因 组,他们在基因组的多处插入了“水印”序列。至此,人工化学合成病毒和细菌基因组均已实现,这为运用合成生物学方法改造、构建新型细菌,以合成目标产物、降解有害物质等方面开辟了新的途径。 目前,美国约有20个实验室从事生命系统设计和合成生物学相关的研究,主要包括开发特殊和通用的标准合成元件、反向工程和重新设计已知的生物部件、发展设计方法和工具以及人工重新合成简单的微生物等。从2004年开始,每年召开合成和系统生物学的会议,促进了交流与合作,推动了这个新兴学科的迅速发展。欧盟国家中的剑桥大学和苏黎世大学的两个实验室也在开展合成生物学研究,目前正积极呼吁更多的实验室参与同美国的竞争。 我国科学工作者自20世纪70年代以来大力推进基因工程、蛋白质工程和代谢工程等技术的发展。近10年,又启动了基因组和生物信息的研究以及系统生物学的研究工作。因此,我们有条件及时进入合成生物学的研究领域,发展合成生物学技术,服务于我国生命科学和社会经济的发展。但是,如上所述,合成生物学并非简单的生物技术或生物工程的
合成生物学相关文献（免费共享） 摘要：通过将组成生物系统的各类单元模块化、标准化，合成生物学希望达成一种新的生物技术发展模式：即从主要开发里欧那个天然生物系统既有功能，变为用人工设计合成的生物系统来完成天然系统不能完成或者完成效率低的功能。合成生物学通过开展生物元件或者器件、生物途径等多个层次的工程化研究来实现上述目标。 ◆综述: 1.Boyle PM,Silver PA.2009. Harnessing nature’s toolbox: regulatory elements for synthetic biology. J R Soc Interface, doi；10.1098.rsif.f8.0521.focus 2.McArthur IV GH，Fong SS.2010. Toward engineering synthetic microbial metabolism. J Biomed Biotechnol,doi:10.1155/2010/459760。 综述了元器件工程（components engineering）、和途径工程（pathway engineering）的进展。 3.Andrianantoandro E,Basu S,Karig D,et al.2006.Synthetic biology:new engineering rules for an emerging discipline. Mol Syst Biol,2:14-27。 ◆合成生物学元器件工程： 利用不同调控机制的人工调控器件: 4.Boyle PM,Silver PA.2009. Harnessing nature’s toolbox: regulatory elements for synthetic biology. J R Soc Interface, doi；10.1098.rsif.f8.0521.focus。 系统的综述了国际上相关工作研究:细胞中的转录调控、RNA调控、蛋白质信号转导等生物调控机制都已经被成功的用于构建合成生物调控元件。 转录调控
一、名词解释： 1代谢工程：应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。 代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。它属于基因工程的一个重要的分支。2代谢控制发酵技术：利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵。 3生物技术：是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品来为社会服务的技术。 4代谢网络的节点（Node）：微生物代谢网络中的途径的交叉点（代谢流的集散处）称作节点。在不同条件下，代谢流分布变化较大的节点称为主节点。根据节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、弱刚性、强刚性三种。 5柔性节点（Flexible Node）：是节点的一种类型，是流量分配容易改变并满足代谢需求的一类节点。（指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加）。 6强刚性节点：若一个节点的一个或多个分支途径的流量分割率受到严格控制，那么这类节点就称为强刚性节点。（指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。） 7弱刚性节点：若一个节点的流量分配由它的某一分支途径的分支动力学所控制，则称该节点是弱刚性节点，介于柔性节点和强刚性节点之间。 8代谢流（Flux）：定义为流入代谢物被途径加工成流出代谢物的速率。 9途径工程（Pathway Engineering）：是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。 10合成生物学：简单地说，合成生物学是通过设计和构建自然界中不存在的人工生物系统来解决能源、材料、健康和环保等问题的一门新兴学科。 11底物：培养基中存在的化合物，能被细胞进一步代谢或直接构成细胞组分。 12代谢产物：由细胞合成并分泌到细胞外培养基中的化合物，可以是初级代谢产物（如二氧化碳、乙醇等），也可以是次级代谢产物或蛋白质。 13胞内代谢物（Intracellular Metabolite）：细胞内其它的化合物，包括不同代谢途径的中间代谢物和用于大分子合成的结构单元等。 14生物基质要素：构成生物基质大分子池的一类物质，包括RNA、DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等。 15途径：是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其他细胞功能的酶促反应的集合。 16通量/物流：是指物质或信息通过途径被加工的速率，它与个别反应速率不同。 （名词解释不全……） 二、问答题： 1．代谢工程的基本原理: ①涉及细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱和 生化反应的分子机理； ②涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理， 这是代谢途径修饰的理论依据； ③涉及途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、变构抑制效应、修饰激活效应
合成生物学在工业微生物菌种优势最小基因组改造中的应用 随着许多生物体全基因组测序的完成，兴起了最小基因组的研究，即一个能独立生活的生物体最少需要多少个基因。对最小基因组的研究将深入了解生命起源、生物进化和生物代谢调控；并在此基础上，以人类的意愿合成自然界不可能产生的生命体。依据核糖体RNA 序列，现存的生命形式被分为3个域，即真细菌、古细菌和真核生物。这些生物的遗传物质都是核酸，其基因组大小变化很大，从数十万碱基对到几十亿碱基对不等；所含基因数目则为数百乃至数万。而原核生物的基因组较小，基因结构和基因调控网络相对简单。因此最小基因组的研究主要以原核生物为研究对象。 细胞是生命活动的基本单位，细胞生命的3大特征是维持正常代谢平衡、进行繁殖（自我复制）以及进化。所谓最小基因组就是维持细胞三大特征的必需基因数，尽管不同物种间总基因数目变动很大，但维持自由生活细胞的必需基因数目大约为300个左右，相应的基因组大小约为300~400 kb。随着技术的进步，以大规模高通量分析为特征的各种组学应运而生，包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等，这些新生的研究体系将基因组复制、基因转录、翻译和基因调控网络、蛋白质相互作用和物质能量代谢等不同层次的的信息相互关联，以揭示错综复杂的生命活动。生物信息学、计算生物学和系统生物学就是为整合和诠释这些海量的数据而产生的，其重要性也日益突出。在人类基因组测序完成的后基因组时代，最小基因组的确切大小仍是未解之谜。与此同时，人工建立最小基因组的工作已经开始进行，其中最为突出的成果是“人造细胞”的诞生。 1 鉴定必需基因和最小基因组的方法 在一个生物体包含的全部基因中，有一部分是必需基因，必需基因是现代生物学研究的重中之重。必需基因是指在一定环境条件下，维持某种生物体的生命活动所必不可少的基因。这些基因所编码蛋白质的功能被认为是生命的基础，其突变通常是致死性的。由于细菌自身的特性，细菌特定基因的必要性还取决于环境条件。因为寄主细胞内环境条件稳定，营养供应充足，由此使得细胞内共（寄）生细菌细胞结构和代谢途径通常极度简化，细胞壁退化乃至消失。目前发现细菌Carsonellaruddii的基因组最小，仅为160 kb，基因分布非常致密，有182 个开放阅读框，90％的相邻开放阅读框间有所重叠。总体而言，细菌的必需基因是合成细胞结构成分、信息传递和加工不可或缺的基因。确定必需基因和最小基因组的方法主要有比较基因组学和系统性基因失活法。 1.1 比较基因组学方法 相对而言，原核生物基因组简单，重复序列较少，因此短枪测序法适合于微生物基因组测序。其基本思路是必需基因应该是在细菌基因组中非常保守的基因，而非必需基因则不会在所有基因组中出现。美国国家生物技术信息中心（NCBI）的Mushegian和Koonin通过对流感嗜血杆菌和生殖支原体基因组的比较分析，发现大约256个基因为两者所共有的保守基
DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.05.007 · 综述· 合成生物学的关键技术及应用进展 邢玉华，谭俊杰，李玉霞，凌焱，刘刚，陈惠鹏 20 世纪的生物学研究一直着眼于对生物系统的不断分解，解剖至细胞中单个蛋白或基因，研究其结构和功能来解释生命现象。但随着当代分子生物学技术的迅猛发展，以系统化设计和工程化构建为理念的合成生物学成为新一代生物学的发展方向。合成生物学旨在对多种天然的或人工设计的生物学元件进行合理而系统的组合以获得重构的或非天然的“生物系统”，其涵盖的研究内容可以大体分为 3 个层次：一是利用已知功能的天然生物模体（motif）或模块（module）构建成新型调控网络并表现出新功能；二是采用从头合成（de novo synthesis）的方法，人工合成基因组 DNA 并重构生命体；第三个层次则是在前两个研究领域得到充分发展之后，创建完整的全新生物系统乃至人工生命体（artificial life）。合成生物学强调利用工程化的设计理念，实现从元件到模块再到系统的“自下而上”设计。利用生物系统最底层的 DNA、RNA、蛋白质等作为设计的元件，利用转录调控、代谢调控等生物功能将这些底层元件关联起来形成生物模块，再将这些模块连接成系统，实现所需的功能。这是一门涉及微生物学、分子生物学、系统生物学、遗传工程、材料科学以及计算科学等多个领域的综合性交叉学科。它有别于传统的基因工程，其目的在于组装各种生命元件来建立人工生物体系，让它们能像电路一样在生物体内运行，使生物体能按预想的方式完成各种生物学功能。合成生物学的最高境界是灵活设计和改造生命，重塑生命体。 本文就目前合成生物学采用的关键技术和研究应用进展两方面进行综述。 1 基因组的人工合成技术 2010 年 5 月 20 日，Science报道了 Venter 研究组采用化学方法合成了一个 1.08 Mb 的蕈状支原体基因组，并将其移植入一个山羊支原体受体细胞，从而创造了一个仅由合成基因组控制的新的蕈状支原体细胞[1]。这项成果在合成生物学的发展史中具有里程碑的意义。在此之前，也有许多基因组合成的成功报道。2002 年，纽约州立大学 Wimmer 实验室合成了脊髓灰质炎病毒，这是人类历史上第一个人工合成的病毒。多年来，Venter 等一直致力于合成基因组的研究。2003 年，合成了长达 5386 bp 的ΦX174 噬菌体基因组，实现了用寡核苷酸合成的方法精确合成了 5 ~ 6 kb 的 DNA 序列；2008 年，Venter 实验室又合成了生殖支原体基因组，该基因组全长 582970 bp，是已知的生物体中独立生存的最小基因组[2]；2010 年 10 月他们又发明了迄今最简单有效的基因合成技术，并以此合成了实验小鼠的线粒体基因组[3]。Dymond 等[4]的研究更进了一步，他们于 2011 年报道成功设计合成了酿酒酵母的部分染色体，这是酿酒酵母基因组人工合成计划（SC2.0 Project）取得的第一个成果，该项目的最终目标是人工合成构建酿酒酵母基因组。酵母基因组人工合成将是合成生物学发展史上又一重要的里程碑。 DNA 合成是支撑合成生物学发展的核心技术，它不依赖于 DNA 模板，可根据已知的 DNA 序列直接合成，在基因及生物元件的合成、基因回路和生物合成途径的重新设计组装，以及全基因组的人工合成中发挥重大作用。由于化学合成的 DNA 片段长度有限，要合成长的 DNA 片段需要先合成短的寡核苷酸，然后再将寡核苷酸进行拼接。因此，基因组合成的基本思路为：①按照原始基因组序列设计合成寡核苷酸；②利用各种方法将寡核苷酸拼接成较长的 DNA 序列；③以较长的序列为基础，进一步拼接得到更长的DNA 序列，拼接成完整的基因组；④将合成的基因组移植到细胞中，并验证其功能。 1.1 寡核苷酸的合成 目前寡核苷酸一般采用固相亚磷酰胺三酯法合成。寡核苷酸的长度是一个重要的参数，随着长度的延长，产率下降，纯度也降低，积累的合成错误大大增加。较短的寡核苷酸会有较少的错误，但是需要增加组装所需的重叠序列，使合成成本增加。使用 60-mer 的寡核苷酸，可以最大程度地降低错配率和生产成本[5]。 1.2 由寡核苷酸拼接成较长的 DNA 片段 寡核苷酸可以通过各种方法拼接成几百 bp 到几千 bp 的 DNA 片段。常用的体外拼接方法有以下两种：连接酶链式反应（ligase chain reaction，LCR）和快速聚合酶链式组装法（polymerase chain assembly，PCA）。 LCR 法利用 Taq 连接酶将首尾相连、重叠杂交的寡核苷酸片段连接起来，连接反应在较高温度下进行，因而可以排除 DNA 二级结构的干扰；但是基因合成的成本大大增加。 PCA 法是两条具有部分重叠的寡核苷酸互为引物互为模板进行聚合酶的延伸，延伸得到的序列再通过与其他寡核苷酸退火、延伸，进行多次循环后，最终合成目的序列。PCA 法合成成本较连接酶法大大降低。这种方法逐渐得到广泛使 基金项目：国家高技术研究发展计划（863 计划）子课题（2012AA 022001-03D） 作者单位：100071 北京，军事医学科学院生物工程研究所（邢玉华、谭俊杰、李玉霞、凌焱、刘刚、陈惠鹏）；130012 长春，吉林大学生命科学学院（邢玉华） 通讯作者：刘刚，Email：jueliu@https://www.doczj.com/doc/452819641.html, 收稿日期：2012-07-16
《应用微生物学》课程作业 姓名：学号：班级： 合成生物学：产化学物质和生物燃料的微生物的设计工具Synthetic biology Tools to design microbes for the production of chemicals and fuels 文献来源：Biotechnology Advances 31 (2013) 811–817 ABSTRACT The engineering of biological systems to achieve specific purposes requires design tools that function in a predictable and quantitative manner. Recent advances in the field of synthetic biology, particularly in the programmable control of gene expression at multiple levels of regulation, have increased our ability to efficiently design and optimize biological systems to perform designed tasks. Furthermore, implementation of these designs in biological systems highlights the potential of using these tools to build microbial cell factories for the production of chemicals and fuels. In this paper, we review current developments in the design of tools for controlling gene expression at transcriptional, post-transcriptional and post-translational levels, and consider potential applications of these tools. Keywords: Synthetic biology Expression control Metabolic engineering Biofuel Biochemical Microbial cell factory 摘要 为实现一些特定目的，微生物系统工程需要一些设计工具，这些工具以某种可预测的、定量的方式起作用。在合成生物学的领域，特别是多水平调控基因表达的可编程控制方面的进展，这使我们设计、优化完成设计任务的生物系统的能力增强了。此外，这些设计在生物系统中的实现，凸显了利用这些工具建造用于生产化学物质和生物燃料的微生物细胞工厂的潜力。在这篇论文中，我们回顾了和在转录、转录后、翻译后三个水平调控基因表达的设计工具相关的内容的最新进展，并且这些工具的潜在应用价值。 关键词：合成生物学表达调控代谢工程生物燃料生物化学微生物细胞工厂 1、介绍 由于天然化石资源的有限性和当前的环境问题，生物合成化学物质和生物燃料作为一种可选择的工业化合成途径，正在稳固地引起人们的兴趣(Ganesh et al., 2012; Jang et al., 2012; Zhang et al., 2012b)。为解决这些问题，合成生物学在重新设计现有的生物系统
1.(生命的起源)三界的分类：古细菌、细菌、真核生物 2.小分子：氨基酸、糖类、核苷酸 77% 3.大分子：核酸、蛋白质、脂质 23% 4.古细菌更类似于真核细胞，原核细菌是真正的细菌 5.合成生物学的定义：设计和构建自然界中没有发现的生物功能和生物系统。构造生物零件装置和能量，药物以及科技系统中应用工程原则和数学模型。 组装各领域专业知识的研究领域为了理解，构建，修饰生物系统。 合成生物学的目标：①操纵基因元件，将基础生物分子整合到基因线路上，来创造新性状，表达复杂的生物功能。②从稳定、标准、已经改良好的基因模块来构建生物体系。 合成生物学的目的：改造系统、系统化构建 .合成生物学与其他学科的不同：抽象性、模块性、标准化、设计和模型 6.根据进化树，古细菌和真核生物都来自细菌。 7.生物膜的作用：隔离、储存能量、物质传递、信号传导、阻断毒性 8.内共生学说：古细菌的真核细胞吞噬异样细菌，成为它的线粒体。 吞噬自养细菌，成为它的叶绿体。 9.基因的概念：基因是生物有机体遗传的分子单元 基因在染色体上 是有机体中可以编码多肽和RNA的DNA序列 10.DNA的结构和功能： 遗传信息在DNA链的核苷酸序列中 遗传信息指导合成蛋白质 基因两条链碱基配对以氢键链接 一条链模板、半保留复制5-3、3端游离羟基、糖在外，碱基在内 11.染色体结构与基因表达： 染色质的基本组成单位是核小体 核小体是组蛋白八聚体2H2A 2H2B 2H3 2H4 H1与核小体间DNA链接 染色质改造：连接DNA长度可变，结合DNA结构可变 12.三个重要的DNA序列：端粒、复制起始区、着丝点 13.核小体的N端修饰（共价修饰）： DNA甲基化和组蛋白去乙酰化协同作用共同参与转录阻遏。 磷酸化使生物学过程发生 14.转录抑制与异染色质有关 15.第三章总结：间期染色质解旋很难看见 基因表达loop结构处 常染色质结构疏松表达活跃，能编码蛋白质。 异染色质粘稠不编码。如端粒、中心粒、着丝粒 有丝分裂染色体是压缩的，有序的，染色体在细胞核中的存放时空间有序的 16.分子机器：调节DNA的蛋白质 DNA：连接酶、解旋酶（95℃）、拓扑异构酶 钳蛋白、结合蛋白
合成生物学的前景展望 目录： 前言 科学定义 学科特征 发展现状 前景展望 结语 前言 当今方兴未艾的合成生物学，是一门建立在生物信息学、DNA化学合成技术、遗传学和系统生物学之上的交叉学科。近十年来，该学科在病毒全基因组合成、标准化遗传回路和最小基因组研究中取得了巨大的突破，也展现了其在生物科学应用中扮演的重要角色。本文将通过介绍与分析合成生物学的相关信息展望合成生物学的发展前景。 科学定义 目前合成生物学研究涵盖范围广泛，对其定义的表述不尽相同：合成生物学领域知名的网站（http://syntheticbiology. org）这样描述该领域的主要研究内容：“设计和构建新型生物学部件或系统以及对自然界的已有生物系统进行重新设计，并加以应用。”2010年12月，美国13位知名专家共同完成了一份名为《新的方向》的研究报告，专门探讨合成生物学问题，文中将合成生物学的研究目标定位为：“将标准化的工程技术应用于生物学，以此创造出新型或具有特定功能的生命体或生物系统，以满足无尽的需求。”合成生物学组织(Synthetic Biology Community)网站上公布的合成生物学的定义则强调合成生物学的两条技术路线：(1)新的生物零件、组件和系统的设计与建造；(2)对现有的、天然的生物系统的重新设计。 综合起来，合成生物学可被理解为基于系统生物学的遗传工程从基因片段、人工碱基DNA子、基因调控网络与信号传导路径到细胞的人工设计与合成，类似于现代集成型建筑工程，将工程学原理与方法应用于遗传工程与细胞工程等生物技术领域，合成生物学、计算生物学与化学生物学一同构成系统生物技术的方法基础。 学科特征 1.多学科交叉性： 作为一个以多学科为基础的综合性交叉研究领域，对于生物学家，合成生物学打开了一扇探索生命奥秘的大门；工程学家更关注的是该如何将实验流程和各类生物学元件进行模块化、标准化，以及如何有效地控制多个元件的相互协调；而如何将标准化的生物学模块进行数字化、定量化评价，更好地为人造“软件”进行模拟计算从而指导生物系统的构建，则是计算科学在生命科学中应用的突出体现；化学家和药物学家则更愿意将合成生物学看作多种用途的新型工具，用于高效地生产新型燃料和药物。 2.超越传统技术的革新： 合成生物学改变了过去的单基因转移技术，开创综合集成的基因链乃至整个基因蓝图设计，并实现人工生物系统的设计与制造。从分子结构图式、信号传导网络、细胞形态类型到器官组织结构的多基因系统调控研究的系统遗传学，以及纳米生物技术、生物计算、
第!期中!国!科!学!基!金"# !! !学科进展与展望! 合成生物学研究的进展 !!"中国科学院院士$ 本文于!%%&年’!月!"日收到$张春霆" !天津大学生命科学与工程研究院"天津(%%%)!# "摘!要#!本文简要介绍了合成生物学发展的历史背景与定义"它的主要研究内容"包括基因线路$合成基因组$合成药物与生物基产品或材料等%探讨了合成生物学与基因工程的异同"介绍了合成生物学在中国的发展情况"讨论了伦理道德与安全问题"最后展望了合成生物学的发展前景% "关键词#!合成生物学!基因线路!合成基因组!合成药物!合成生物基产品或材料!合成*+,序列 !!合成生物学的历史背景与定义 ’--%年人类基因组计划启动!随后模式生物基因组计划也快速实施!产生了大量的基因组*+,序列信息"由于新技术的出现!又促进了转录组学#蛋白质组学和代谢组学等的产生和发展"这一切又催生了一系列新兴交叉学科!如生物信息学和系统生物学等"基础研究的成果最终要转化为生产力!而合成生物学在!’世纪初的出现则是上述学科发展的一个合乎逻辑的结果"那么什么是合成生物学呢$合成生物学网站是这样介绍的%合成生物学包括两重意义%&’’新的生物零件&./01’#组件&234563’和系统的设计与构建(&!’对现有的#天然存在的生物系统的重新设计!以造福人类社会&711.%))89:; 173156<5=>=?9$=0?)’"维基百科全书是这样描述的%合成生物学旨在设计和构建工程化的生物系统!使其能够处理信息#操作化合物#制造材料#生产能源#提供食物#保持和增强人类的健康和改善我们的环境&711.%))3:$@5A5.325/$=0?)@5A5)B9173156*<5=>=; ?9’" "!合成生物学的主要研究内容 "#!!基因线路$$%&%’())(*)+(’% 说起基因线路或基因回路!最早可追溯到C/6=<和D=:=2关于半乳糖操纵子模型的经典工作" !"#$%&杂志在!%%%年发表了基因振荡和基因双稳态两个基因线路!被认为是奠基性的工作"现在则 已发表了大量的有关基因线路的工作!本文不拟详加介绍"一个典型的基因线路是基因双稳态线路+’,!由两个蛋白质编码基因与两个相对应的启动子组成"线路是这样设计的%蛋白质’的表达抑制了蛋白质!的表达!系统只有蛋白质’存在(反之!蛋白质!的表达抑制了蛋白质’的表达!系统只有蛋白质!存在"可在双稳态线路中加入诱导物!促使系统在两个稳定状态之间任意翻转"基因线路有广泛的应用!因篇幅所限不能展开介绍!下面只介绍(个应用例子" &’’大肠杆菌照相术+!, 首先从集胞兰细菌基因组中克隆两个基因并转入大肠杆菌!使之能生成对光敏感的藻青素!简称E F G"接着利用大肠杆菌中双组份信号转导系统’()*+,-./!将与E F G共价结合的脱辅基蛋白与’()*的组氨酸激酶结构域融合构成一个嵌合体!成为一个光敏部件"同时!将0-.1基因与2"3*基因融合!通过在2"3*基因上游引入0-.1启动子使其表达依赖于,-./"通过这一基因线路!2"3*基因的表达就会受光调控"当有红光照射时&相当于被摄物体的光亮部分’!’()*的自磷酸化被抑制!从而,-./不能被磷酸化激活!2"3*基因关闭!由涂抹在琼脂基片上的菌苔形成的底片保持原色"当没有红光照射时&相当于被摄物体的黑暗部分’!过程正好相反!’()*的自磷酸化被激活!从而使2"3*基因被磷酸化的,-./激活而表达!其产物为半乳糖苷酶!催化菌苔中的B;?/>&一种化合物’反应生成
收稿２００９－０２－０４修定 ２００９－０３－０５ 资助国家“8６３”计划（２００６ＡＡ１０Ｚ１１０）和国家自然科学基金（３０７７１２３７）。 ＊ 通讯作者（Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈａｉｙｏｕｒｏｎｇ１＠１６３．ｃｏｍ； Ｔｅｌ： ０２３－６８２５０７４４）。 原花青素的生物合成途径、功能基因和代谢工程 赵文军， 张迪， 马丽娟， 柴友荣＊ 西南大学农学与生物科技学院， 重庆４００７１６ Biosynthetic Pathway, Functional Genes and Metabolic Engineering of Proanthocyanidins ZHAO Wen-Jun, ZHANG Di, MA Li-Juan, CHAI You-Rong * College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China 提要： 原花青素（ＰＡ）广泛分布于高等植物中， 与农作物的多种品质性状密切相关。虽长期受到关注， 但其生物合成途径和主要功能基因的解析则是近年来随着拟南芥等植物突变体研究的深入才取得突破的。ＰＡ经公共苯丙烷－核心类黄酮－原花青素复合途径而合成， 先后涉及１２个关键酶（ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、４ＣＬ、ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３Ｈ、Ｆ３’H 、ＤＦＲ、ＬＤＯＸ／ＡＮＳ、ＬＡＲ、ＡＮＲ、ＬＡＣ）的催化反应和３种转运蛋白（ＧＳＴ、ＭＡＴＥ、ＡＴＰａｓｅ）的胞内转运， 并有６种转录因子（ＷＩＰ－ＺＦ、ＭＹＢ、ｂＨＬＨ、ＷＤ４０、ＷＲＫＹ、ＭＡＤＳ）参与调控ＰＡ的合成与积累。这些基因在拷贝数、表达特征、蛋白亚细胞定位、蛋白互作、突变体表型等方面具有显著特点。ＰＡ的代谢工程在牧草品质改良、农产品脱涩、油菜黄籽材料创新、葡萄和葡萄酒品质改良、茶多酚分子育种、作物抗病虫性提高、新型作物拓展等方向具有重要的应用前景， 目前仅在少数方向有所启动， 更待广泛关注和深入研究。 关键词： 生物合成途径； 功能基因； 代谢工程； 原花青素 原花青素（ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ， ＰＡ）又叫缩合单宁（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｔａｎｎｉｎ， ＣＴ）， 是高等植物特有并广泛存在的聚多酚类化合物， 以ＰＡ单体、寡聚物或多聚物的形式存在。ＰＡ对于植物具有抗紫外线、抗病、抗虫、清除自由基、调节种子休眠和萌发等生理功能， 并影响作物的适口性、可消化性、保健价值等品质性状。ＰＡ提取物具有多方面的医疗价值， 可用于抗衰老、防治心血管疾病、防治肿瘤等（Ｄｉｘｏｎ等２００５）。近年来， 随着对拟南芥等植物一系列种皮色泽突变体的分子研究的深入， ＰＡ的生物合成途径、主要功能基因、分子调控机理等已基本阐明， 为通过代谢工程进行ＰＡ相关性状的植物改良奠定了基础（Ｘｉｅ和Ｄｉｘｏｎ ２００５； Ｌｅｐｉｎｉｅｃ等２００６）。 １ 植物原花青素的生物合成途径 如图１所示， ＰＡ的生物合成是由公共苯丙烷途径、核心类黄酮－花青素途径、ＰＡ特异途径这３个连续的代谢途径构成的一个复合途径完成的。１．１ 公共苯丙烷途径 公共苯丙烷途径是指从苯丙氨酸到对羟基肉桂酸（香豆酸）的合成途径， 共有３个酶。苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）脱去苯丙氨酸的氨基，使其转化为反式肉桂酸。肉桂酸－４－羟化酶（Ｃ４Ｈ）催化反式肉桂酸４位上的羟基化， 使其转化为反式－ ４－香豆酸。４－香豆酸辅酶Ａ连接酶（４ＣＬ）催化香豆酸与辅酶Ａ的酯化结合， 使香豆酸得以活化， 可用于类黄酮、木质素等下游分支途径进一步合成各种次生物质（Ｃｈａｐｐｌｅ等１９９４）。 １．２ 核心类黄酮－花青素途径 类黄酮是高等植物中普遍存在的次生代谢物质， 拟南芥中主要为花青素、黄酮醇和ＰＡ这三大类， 营养器官中积累花青素和黄酮醇， 种胚中积累黄酮醇， 种皮中积累ＰＡ（Ｃｈａｐｐｌｅ等１９９４）。作为苯丙烷途径的一个重要分支途径， 植物类黄酮途径又包含黄酮醇、花青素苷、ＰＡ、异黄酮、橙酮、鞣红等多个重要的分支途径。自查尔酮直到花青素的步骤是花青素苷分支途径和ＰＡ分支途径都必须经过的公共途径， 本文称为核心类黄酮－花青素途径。作为所有类黄酮合成的起始步骤， 查尔酮合酶（ＣＨＳ）将１分子香豆酰辅酶Ａ与３分子丙二酰辅酶Ａ合成为１分子四羟基查尔酮， 再由查尔酮异构酶（ＣＨＩ）将其转变为柚皮素， 随后由黄烷酮３－羟化酶（Ｆ３Ｈ）和类黄酮３’-羟化酶（Ｆ３’H ）分别在３和３’位进行羟化并生成黄烷酮