环境与健康杂志2010年3月第27卷第3期J Environ Health,March 2010,Vol．27,No．3
注：预期扩增片段长度分别为*84和#486bp 。
表1
两种PCR 方法所用引物序列
方法
普通PCR 巢式PCR 引物名称L5forward L5reverse
MC forward
MC reverse MD forward MD reverse
核苷酸序列(5'-3')
TATAGCGATTTGGAACCACCTGATAC ATGAGGAAGCCTCACACTATCATTG GCTACAGACAAGGATAAGTTG GTTTTGTATGACTTTAATTCA ATTGGTGCCGATTTGGGGAA GGCCATATGCAAGACCTGAG
扩增基因
5s rRNA *
Mip #自1976年首次报告军团菌病（Legionnaires ’disease,LD ）以来，其多次暴发均与受军团菌污染的冷却塔水、淋浴水等水体产生的气溶胶密切相关[1]。
然而，多数军团菌病为散发病例，其感染途径并不明确[2]。军团菌的生态学分布广泛，各种自然和人工水环境（例如河、湖、池塘和淤泥）中存在军团菌，随后在冷却塔水、市政水系统和土壤中检出军团菌，近年出现的部分军团菌散发病例是因为接触受嗜肺军团菌污染的土壤而引起，但土壤中军团菌的来源并不清楚[3-5]。目前，我国尚未见土壤中军团菌污染的调查。笔者采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR ）方法检测嗜肺军团菌培养法阳性的冷却水附近的土壤及远离冷却塔的居民区土壤中军团菌和嗜肺军团菌的污染状况，探讨土壤中军团菌和嗜肺军团菌的可能来源，为军团菌的扩散传播途径提供研究依据。1材料与方法1.1
仪器与试剂
LD5-2B 型离心机（北京京立离心机有限公司），5415R 型低温离心机（德国Eppendrof 公司），PTC -200型PCR 仪（美国BIO -RAD 公司），EPS300型琼脂糖凝胶电泳仪（上海天能科技有限公司），Gel Doc2000型凝胶成像系统（美国BIO -RAD 公司）。
E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit （美国Omega 公司），2×Taq PCR 一管便携式反应体系（北京天根公司）。嗜肺军团菌Ⅰ型
ATCC33152菌株（美国疾病预防控制中心），金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株（江苏省疾病预防控制中心）。本实验所有引物（表1
）均由上海生物工程技术有限公司合成。1.2样品采集
2009年7—9月，选择江苏省南京市冷却塔水军团菌培养法阳性的公共场所冷却塔<2m 范围内及距离冷却塔>2km 的居民区中心采集样品，每个冷却塔和居民区设两个采样点，使用灭菌钢勺采集表层土壤后置于灭菌离心管内，共采集20件冷却塔旁土壤和10件居民区土壤。1.3DNA 模板的制备
称取1g 土壤样品，采用E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit 试剂盒的缓冲液去除土壤中腐植酸和金属离子等杂质，经苯酚-氯仿-异戊醇抽提DNA ，抽提后的DNA 经DNA 结合柱纯化后，溶于试剂盒自带的100μl DNA 储存液中，置于-20℃保存备用。1.4PCR 扩增1.4.1
军团菌普通PCR 检测方法
以嗜肺军团菌Ⅰ型
ATCC33152菌株为阳性对照，金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株
文章编号：1001-5914（2010）03-0195-03
土壤中的军团菌和嗜肺军团菌PCR 检测研究
刘凡1，张宝莹1，陈晓东2，梁晓军1
摘要：目的调查土壤中军团菌的污染状况并探讨土壤中军团菌的污染来源。方法
于2009年7—9月，在江苏省南
京市冷却塔水军团菌培养法阳性的公共场所集中空调冷却塔0~2m 处及距离冷却塔>2km 的居民区分别采集20件和10件土壤样品。普通聚合酶链反应（PCR ）方法扩增军团菌属5S rRNA 基因，巢式PCR 方法扩增嗜肺军团菌种Mip 基因，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果
冷却塔旁土壤和居民区土壤中军团菌阳性率分别是80%(16/20)和70%(7/10)；嗜肺军
团菌阳性率分别是55%(11/20)和0。冷却塔旁土壤中军团菌的阳性率与居民区土壤比较，差异无统计学意义(χ2=0.373，P =0.542)。结论环境土壤中存在军团菌，受集中空调冷却塔水污染的土壤中可检出嗜肺军团菌。
关键词：聚合酶链反应；军团菌；嗜肺军团菌；土壤中图分类号：
R117文献标识码：A
Detection of Legionella and Legionella pneumophila in Soil by PCR LIU Fan,ZHANG Bao -ying,CHEN Xiao -dong,et al.Institute of Environmental Health and Related Product Safety,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100050,China.
Abstract:Objective To investigate the contamination condition and source of Legionella in soil.Methods The samples of soil were collected in the vicinity of cooling tower and the residential area.PCR based on 5S rRNA gene was used to detect Legionella .Nested -PCR based on Mip gene was used to detect Legionella pneumophila .Results The positive rate of Legionella in the soil samples in the vicinity of cooling tower and the residential area were 80%(16/20)and 70%(7/10)respectively.The positive rate of Legionella pneumophila was 55%(11/20)and 0respectively.There was no significant difference in the positive rate of Legionella between soil in the vicinity of cooling tower and the residential area (χ2=0.373,P =0.542).Conclusion Soil in the vicinity of cooling tower of the central air conditioning system can be contaminated by Legionella pneumophila .
Key words:Polymerase chain reaction;Legionella ;Legionella pneumophila ;Soil 基金项目：国家“十一五”科技支撑课题（2006BAI19B04）作者单位：1.中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所卫生工程室（北京100050）；2.江苏省疾病预防控制中心环境疾病防治科（江苏南京21009）作者简介：刘凡（1954-），男，研究员，从事环境与健康研究。
【集中空调生物污染与健康研究专栏】
195··
环境与健康杂志2010年3月第27卷第3期J Environ Health,March 2010,Vol．27,No．3
为阴性对照，使用针对军团菌属5s rRNA 基因的引物L5进行扩增，引物序列见表1[6]。在灭菌PCR 管中依次加入2×Taq PCR 反应体系基础12.5μl ，上游和下游引物各1μl(10μmol/L)，模板1μl ，补足双蒸水至25μl 。
扩增条件：95℃预变性3min ，按94℃变性30s 、60℃退火并延伸1min ，循环45次，扩增产物-20℃保存，待测。
取5μl 扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，采用Gel Doc2000型凝胶成像系统进行观察。可见到84bp 条带的为军团菌，未出现条带的则不是军团菌。1.4.2
嗜肺军团菌巢式PCR 检测方法
以嗜肺军团菌Ⅰ型
ATCC33152菌株为阳性对照，金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株为阴性对照，使用针对嗜肺军团菌种Mip 基因的引物MC 和MD 进行扩增，引物序列见表1[7]。两次扩增的反应体系均为2×Taq PCR 反应体系基础12.5μl ，上下游引物各1μl(10μmol/L)，模板1μl ，补足双蒸水至25μl 。首先使用MC 组引物进行扩增，扩增产物经无核酸酶的去离子水100倍稀释后作为模板，然后使用MD 组引物进行第2次扩增。
两次扩增条件：94℃预变性5min ；按93℃变性30s 、50℃退火30s 、72℃延伸1min ，循环35次；72℃复延伸5min 。扩增产物-20℃保存，待测。
取5μl 二次扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，采用Gel Doc2000型凝胶成像系统进行观察。可见到486bp 条带的为嗜肺军团菌，未出现条带的则不是嗜肺军团菌。1.5
统计学分析
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，检验水准为α=0.05，采用卡方检验分析数据。2结果2.1一般情况
普通PCR 和巢式PCR 检测结果见图1和2。
2.2土壤样品中军团菌PCR 结果
冷却塔旁土壤样品中军团菌的阳性率为80%(16/20)，与居民区土壤样品军团菌阳性率70%(7/10)比较，经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.373，P =0.542）2.3土壤样品中嗜肺军团菌PCR 结果
居民区10件土壤样品中均未检出嗜肺军团菌，冷却塔旁土壤样品中嗜肺军团菌的阳性率为55%(11/20)。3讨论
自1980年Timothy 首次从土壤中分离出军团菌以来[8]，美国[9]、日本[5,10]、澳大利亚[4]和欧洲[11,12]先后通过培养法或PCR 法从各种土壤样品中检出军团菌，我国尚未见对土壤环境中军团菌污染状况的调查。土壤样品中军团菌含量相对较低，杂菌含量相对较高，且土壤中普遍存在的阿米巴原虫是军团菌的宿主之一，这些因素使培养法易出现假阴性结果[8,11,12]。PCR 法灵敏度高，普通PCR 的检出限在102~103cfu/ml ，而巢式PCR 方法的检出限可达到100cfu/ml [7]，并可检出活的不可培养细菌以及阿米巴体内的军团菌[11,12]。
本研究结果显示，集中空调冷却水嗜肺军团菌阳性的冷却塔旁土壤中嗜肺军团菌的阳性率为55%(11/20)，而远离冷却塔的居民区土壤中未检出嗜肺军团菌，这可能是因为冷却塔水中的嗜肺军团菌可污染其附近的土壤，在合适的温度、湿度等条件下，嗜肺军团菌生长繁殖，并有可能通过悬浮形成气溶胶，成为军团菌的二次污染源。居民区土壤中未检出嗜肺军团菌，但是军团菌阳性率高达70%(7/10)，土壤存在非嗜肺军团菌污染，这是出现军团菌病散发病例的重要来源之一，日本和澳大利亚的军团菌病散发病例的患者因接触长滩军团菌污染的花盆土而感染[5,8,13]，随后美国、
荷兰均在花盆土中检出军团菌[9,10]。Steely 等[13]研究显示澳大利亚73%的花盆土受到军团菌污染，Casati 等[14]对瑞士的46份花盆土的调查显示，军团菌阳性率46%，嗜肺军团菌阳性率20%，虽然土壤中军团菌的来源还有待进一步研究，但可以确认除冷却水外，土壤也成为军团菌潜在的主要污染源之一。
虽然目前我国土壤中军团菌的污染状况不明，但本研究已经通过PCR 方法在南京市公共场所冷却塔附近土壤中检出嗜
肺军团菌，且污染状况不容乐观，这为军团菌污染源追踪及扩散传播途径研究提供了新的内容。但由于本调查的样本量较少，不足以说明我国土壤中军团菌和嗜肺军团菌的污染状况，需进一步增大样本量进行军团菌污染的现况调查。由于PCR 方法亦能检测到样品中的死菌，因此仍需要通过培养法确认土壤中嗜肺军团菌的存活情况，当土壤中活的军团菌悬浮成为二次污染源，可能造成人群感染，引起军团菌病散发甚至是暴发。另外，亦需要建立环境样品中军团菌绝对定量检测方法，为探讨土壤中军团菌含量对人群健康的影响以及进一步建立公共场所军团菌定量风险评价方法提供有效手段。参考文献：
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图1军团菌5s rRNA 基因扩增产物电泳图
1~7，10~12—环境样品；8—嗜肺军团菌Ⅰ型ATCC33152菌株；
9—金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株；M —DNA
maker
123
4
56
7
8
9101112
M
84bp
图2嗜肺军团菌Mip 基因扩增产物电泳图
1~5，7~10—环境样品；6—金黄色葡萄球菌ATCC6538菌株；11—嗜肺军团菌Ⅰ型ATCC33152菌株；M —DNA maker
12345
6
78
91011M
486bp
196··
环境与健康杂志2010年3月第27卷第3期J Environ Health,March 2010,Vol．27,No．3
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（收稿日期：2009-12-07修回日期：2010-02-01）
（本文编辑：高申）
文章编号：1001-5914（2010）03-0197-03
集中空调通风系统空气净化装置PM10净化效果
实验室评价方法
张宝莹，陈逊，叶丹，刘凡
摘要：目的建立集中空调通风系统空气净化消毒装置PM10净化效率实验室评价方法。方法
以空气动力学实验
风洞为研究平台，发生单分散相人工实验粒子，测定空气净化消毒装置对于不同粒径实验粒子的一次通过分级净化效率，通过典型环境PM10质量浓度和分级净化效率回归方程计算集中空调系统空气净化消毒装置PM10净化效率。结果在
风速≥4m/s 时，
与自然PM10尘净化效率相比，空气净化装置计算PM10净化效率的相对偏差<10%。结论该评价方法
具有可行性并为制定集中空调通风系统空气净化装置PM10净化效率评价标准提供实验手段。
关键字：PM10；空气净化装置；净化效果；集中空调通风系统中图分类号：R122.2
文献标识码：A
Evaluation Method for PM10Removal Efficiency of Air -cleaning Device in Central Air -conditioning Ventilation System
ZHANG Bao -ying,CHEN Xun,YE Dan,et al .Institute of Environment Health and Related Product Safety,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Bei jing 100050,China Corresponding author:LIU Fan ,E -mail:lf9910@https://www.doczj.com/doc/4f3965796.html,
Abstract:Objective To establish an experimental evaluation method for PM10removal efficiency of air -cleaning device in the central air conditioning ventilation system.Methods The classification efficiency of air -cleaning device was measured by generating monodisperse aerosol in the wind tunnel.PM10removal efficiency of air -cleaning device in the central air -conditioning ventilation system was calculated.Results The relative deviation of PM10removal efficiency of air -cleaning device was less than 10%at the airflow velocity of no less than 4m/s.Conclusion The method is applicable to the evaluation of PM10removal efficiency of air -cleaning device.
Key words:Inhaleble particles;Air -cleaning device;Removal efficiency;Central air -conditioning ventilation system 基金项目：国家“十一五”科技支撑课题（2006BAI19B04）
作者单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所（北京100050）作者简介：张宝莹（1982-），女，研究实习员，从事环境与健康研究。通讯作者：刘凡，E -mail:lf9910@https://www.doczj.com/doc/4f3965796.html, 空气净化装置颗粒物净化效果评价技术主要包括3个方面：实验粒子、实验平台和评价指标，一般通风系统空气过滤器及室内空气净化器的净化效果均有成熟的评价标准，但集中空调通风系统空气净化装置的PM10净化效果评价方法仍存在实
验粒子尚不能满足PM10代表性及评价方法单一等局限[1-4]。GB/T 18801—2002《空气净化器》和ANSI/AHAM AC -1-2006《便携式家用室内空气净化器性能测试方法》均是采用空气舱，污染物循环通过净化装置，以洁净空气量为评价指标评价净化效果，它不适用评价净化装置一次通过的净化效率[2,3]。DIN EN 779-2003
《一般通风用空气过滤器》采用空气动力学实验台评价空气过滤器的颗粒物一次通过净化效率，但它以≥0.5μm 实验粒子的计径效率和平均效率来评价其净化效果，并非PM10净化效率[4]。ANSI/ASHRAE 52.2《通过粒度测量通用通风系统空气净化装置净化效率的方法》评价通风系统空气过滤器(包括静电过滤器)
【集中空调生物污染与健康研究专栏】
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细胞内抗嗜肺军团菌药物有效浓度测定 【摘要】目的：探讨红霉素。环丙沙星。左氧氟沙星。莫西沙星4种抗菌药物对细胞内嗜肺军团菌的抗菌活性。方法：分别采用E-test法和有限稀释法 测定上述4种药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞外抗菌活性,再用噻唑蓝比 色法(MTT法)测定上述药物对嗜肺军团菌ATCC 33152的细胞内抗菌活性。结果：细胞外抗菌活性E-test法:红霉素0.047 μg/mL。环丙沙星0.38 μg/mL。左 氧氟沙星0.125 μg/mL。莫西沙星0.125 μg/mL;有限稀释法:红霉素0.125 μg/mL。环丙沙星0.03 μg/mL。左氧氟沙星0.016 μg/mL。莫西沙星0.016 μg/mL。4种药物的细胞内抗菌活性分别为:红霉素0.25 μg/mL。环丙沙星 0.016 μg/mL。左氧氟沙星0.016 μg/mL。莫西沙星0.004 μg/mL。结论： 氟喹诺酮类药物在U937细胞模型中对嗜肺军团菌ATCC 33152具有很强的细胞 内抗菌活性。其中莫西沙星的细胞内抗菌活性最强。MTT法是一种行之有效的 用于检测药物对细胞内嗜肺军团菌抗菌活性的方法,可同时检测并对比各种药物样本的细胞内抗菌活性。 【关键词】嗜肺军团菌; U937细胞; 抗菌活性 Abstract: Objective： To explore the intracellular antimicrobial activities of erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin against Legionella pneumophila. Methods： The minimum inhibition concentration (MIC) of each antibiotic was evaluated by E-test method and microdilution method respectively. The minimal extracellular concentration inhibiting intracellular multiplication (MIEC) of each antibiotic was evaluated by the MTT colorimetric assay system. Results： The MIC concentration for each drug by E-test method were: erythromycin, 0.047 μg/mL; ciprofloxacin, 0.38 μg/mL; levofloxacin, 0.125 μg/mL; moxifloxacin, 0.125 μg/mL, the MIC concentrations for each drug by microdilution method were: erythromycin, 0.125 μg/mL; ciprofloxacin, 0.03 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.016 μg/mL. The MIEC concentration for each drug were: erythromycin, 0.25 μg/mL; ciprofloxacin, 0.016 μg/mL; levofloxacin, 0.016 μg/mL; moxifloxacin, 0.004 μg/mL. Conclusions： Fluoroquinolones have superior activity than erythromycin in U937 cells infected with L. pneumophila. Moxifloxacin is the most potent drug among the four tested antimicrobials. Our results indicated that the MTT assay system allows comparative and quantitative evaluations of the intracellular activities of antibiotics against L. pneumophila and efficient processing of a large number of samples. Key words: Legionella pneumophila; U937 cells; antimicrobial activities
公共场所环境样品中嗜肺军团菌定量检验方法 1 范围 本标准规定了公共场所空气、水、土等不同类别环境样品中嗜肺军团菌的定量检测方法。 本标准适用于公共场所环境样品中嗜肺军团菌的定量检测，其他环境样品中嗜肺军团菌的定量检测可参照执行。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18204.3 公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物 GB/T 18204.5 公共场所卫生检验方法第5部分：集中空调通风系统 3 空气中嗜肺军团菌定量检测 3.1 原理 采用液体冲击法采样、叠氮溴乙锭（EMA）前处理结合定量聚合酶链反应(qPCR)方法定量检测室内空气和集中空调送风中存活的嗜肺军团菌。 3.2 仪器和设备 3.2.1 微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，3.0μm以上粒子的捕集效率≥80%（或浓缩比≥8）。 3.2.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min，0.5μm以上粒子的捕集效率≥90%。 3.2.3 便携式冷藏箱。 3.2.4 冷冻离心机：温度4?C。 3.2.5 恒温水浴锅或金属浴：温度范围50?C～99?C。 3.2.6 荧光定量PCR仪：非耦合6色激发光片和6色检测滤光片通道，4°C–100°C温度范围。 3.2.7 卤素灯：500W。 3.2.8 涡旋震荡器：调速范围0~3000 rpm。 3.3 材料和试剂 3.3.1 酵母浸出粉。
3.3.2 蒸馏水。 3.3.3 EMA固体粉：5mg/管。 3.3.4 无核酸酶去离子水。 3.3.5 矿物油，用于减少气溶胶采样时的吸收液蒸发。 3.3.6 核酸提取试剂盒：DNA产量15～30μg，A260/A280在1.7～1.9之间。 3.3.7 引物：上游引物5’-GAAAATAAAGTAAAAGGGGAAGCC-3’； 下游引物5’-ATCAATCAGACGACCAGTGTATTC-3’。 3.3.8 探针：5’-FAM-AGGCGTTGTTGTATTGCCAAGTGGTT-TAMRA-3’。 3.3.9 标准品质粒。 3.3.10 荧光定量PCR反应体系。 3.3.11 离心管：1.5mL透明离心管和1.5mL棕色离心管。 3.3.12 离心管：15mL，50mL。 3.4 样品的采集 3.4.1 采样吸收液成分： 酵母浸出粉12 g 蒸馏水1000 mL 3.4.2 采样吸收液制法：将酵母浸出粉（3.3.1）12g加蒸馏水至1000mL，121 ℃下高压灭菌15 min，每20mL采样吸收液分装于灭菌后的50mL离心管（3.3.12）中备用。 3.4.3 采样点：室内空气按GB/T18204.3中6.4.1规定，集中空调送风按GB/T18204.5 中9.5.1规定。 3.4.4 将装有采样吸收液的离心管置于便携式冷藏箱（3.2.3）中送到现场，开始采样前将采样吸收液（3.4.2）20mL倒入微生物气溶胶采样器（3.2.2）中，然后用吸管加入矿物油（3.3.5）1滴~2滴。 3.4.5 将微生物气溶胶浓缩器（3.2.1）与微生物气溶胶采样器（3.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。 3.4.6 按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3~2m3；并记录环境温度、大气压力和总采气体积或采样流量、采样时间。 3.4.7 采集的样品倒入离心管置于便携式冷藏箱中避光保存，4h内送实验室检验。 3.5 样品处理方法与条件 3.5.1 样品的离心浓缩：将采集的气溶胶样品（3. 4.7）于4℃下8000×g离心20min（3.2.4），小心吸取弃去上清，剩余1mL左右沉淀全部转移至1.5mL的透明离心管中，再次4℃下8000×g离心20min，弃去上清，剩余0.5mL沉淀。
深圳市空调冷却塔水军团菌污染状况调查 摘要:目的了解深圳市宾馆、大型写字楼、地铁等各类建筑物的空调冷却塔水军团菌污染状况。方法随机采集中央空调冷却塔水样品并进行细菌培养和鉴定，再以聚合酶链式反应（PCR）等方法加以验证。结果共采集水样28件，分离到1株军团菌，经鉴定为嗜肺军团菌Lp1型。结论深圳市中央空调冷却塔存在军团菌的污染，需引起重视，防止军团菌病发生。 关键词:军团菌;嗜肺军团菌;冷却塔;污染状况 Detection of Legionella pneumophila in cooling tower water of central air conditioning system in Shenzhen City.ZHANG Ran，CHEN Gui-bing，SHI Xiao-lu，et al.（Shenzhen Municipal Center for Disease Control and Prevention，Shenzhen518020，Guangdong，P.R.China） Abstract:Objective To investigate the contamination status of cooling water of central air conditioning syatem with Legionella pneumophila in in hotels，buildings and subways in Shenzhen City. Methods Cooling tower water samples from central air condi-tioning system were randomly taken，cultured and then Legionella pneumophilia was isolated.Pobymerase chain reaction（PCR）was used for confirmation of the differentiation. Results Twenty-eight cooling water samples were collected and a strain of Legionella pneumophilia serovar Lp1was isolated. Conclusion The water in cooling tower of central air conditioning system in Shenzhen City has been contaminated with Legionella pneumophilia and measures be taken for preventing infection with Legionella pneumophilia. Key words:Logionella;Leginella pneumophilia;Cooling tower;Contamination status 军团菌是引起军团菌病的一种急性呼吸道传染病的病原体，于1977年在美国首次发现并证实。现已分离到军团菌属（Legionella）共有42个种，64个血清型，其中与人类关系最为密切的是嗜肺军团菌，由它引起的肺炎，如未及时治疗，病死率很高［1］。空调机的冷却塔水、喷水池水、淋浴池和宾馆的养鱼池水，甚至游泳池水均是军团菌其生存定居的小环境，如果该小环境中的微型生物群落结构能与其构成共生关系，军团菌就可以大量繁殖，
公共场所嗜肺军团菌污染状况调查分析 ［摘要］目的应用PCR技术对奉贤地区部分公共场所空调冷却塔水及其他环境（淋浴设施等）进行军团菌污染状况调查。方法于2010年5月和10月，分别采集中央空调冷却塔水样品及环境样品用聚合酶链（PCR）对其进行嗜肺军团菌检测，同时用常规法进行分型鉴定。结果采集的125份样品中，PCR法检出嗜肺军团菌45份，阳性检出率为36%，水样检出率远高于环境（分别为67.19%和3.28%）。在检出的59株军团菌中共鉴定出6种不同菌型，其中LP1为重点菌型，占50.85%。且在同一样品中检出不同菌型有2株以上的占35.29%。结论奉贤地区中央空调冷却塔及环境中存在军团菌污染，需引起重视，以防止军团菌所致的疾病暴发或流行。 军团菌是一种革兰阴性杆菌，能引起急性呼吸道传染病[1]，军团菌已被发现存在40个种，60多个血清型。经流行病学调查研究，这种细菌存在于各种自然界水源以及空调水管道，供水系统等人工水源中，在引进空调冷却塔做冷却水时，随空调器把细菌散布于室内空气中，被人吸入而引发肺炎。 我国自1982年南京首次证实军团菌病例以来已有多起军团菌爆发流行［2］，上海在近几年内也从患者和环境中分离到军团菌［3］。而上海地区健康人血清抗体水平调查也证明军团菌早已存在，并对人群构成潜在威胁［4］。近年来从军团菌的流行可以看出军团菌对人类健康的威胁已达到不容忽视的程度，因此对该病的研究也越来越受到人们的重视。 目前用于军团菌检测的常规培养约7～10d，不仅花费大量时间和精力，还具有敏感性、特异性差的缺点，且操作复杂，易造成漏检和误检。分子生物学技术的发展为军团菌检测提供了新的契机，该课题应用聚合酶链（PCR）技术，检测环境中的军团菌，以分析奉贤地区军团菌的污染状况。 1．材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验菌株大肠埃希菌（A TCC25922）、肠炎沙门菌（ATCC13076）均购于美国典型微生物菌种中心保藏中心提供标准菌株。米克达德军团菌、杜莫夫军团菌由市疾控中心提供。 1.1.2 样品来源2010年分别在5月和10月以单纯随机抽样方式选取奉贤地区具有集中式中央空调设备的各大型超市，酒店共10家。以无菌方式采集空调冷却塔水于无菌广口瓶中，每件约200 ml（根据《公共场所集中空调通风系统卫生规范》），共采集64件。以沾湿生理盐水的棉签反复涂抹空调出风口以及酒店浴室莲蓬头出水口表面，剪去棉签接触手部位，将棉签置5 ml生理盐水中，共采集61件，采样后即送实验室检验。 1.1.3 培养基GVPC平板由柯玛嘉公司提供，血琼脂平板，各反应试剂由上海市疾病预防控制中心提供，均在有效期内使用。 1.1.4 诊断血清军团菌诊断血清由上海市疾病预防控制中心提供,均在有效期内使用。1.1.5 PCR扩增仪Techne Flexigene；全自动数码凝胶成像系统Tanon GIS-2010。 1.1.6 PCR试剂盒嗜肺军团菌（LP）PCR检测试剂由上海健益生物科技有限公司提供。 1.2 方法 1.2.1 分离培养鉴定样品经负压过滤后,剪碎放入蒸馏水中,混合振荡后吸取1毫升进行酸处理,静置5分钟后同时接种GVPC平板和血平板.36℃，5%CO2培养72 h后进行鉴定[5]。 1.2.2 PCR检测方法样品经负压过滤后,剪碎放入5 ml蒸馏水中，混合后取500 μl,12 000 rpm/min离心5 min,弃上清液，加100 μl DNA提取液入沉淀中，振荡混匀，置100℃水浴加热10 min,12 000 rpm/min离心5 min，保留上清液待用。取4 μl上清液加入26 μl PCR反应液中,同时做阳性对照。振荡混匀，将PCR反应管放入PCR扩增仪中。首先预变性94℃5 m
HKCDC/JL-WJ-040 上海市虹口区疾病预防控制中心检验原始记录 （嗜肺军团菌） 样品编号：第页共页样品名称: 样号标记: 收样日期: 检验完成日期: 检验项目和检验依据： 嗜肺军团菌卫生部《公共场所集中空调通风系统检验卫生规范》2006.3（附录A） 设备：CO2培养箱（仪器编号：S/N 305529-461） 生物安全柜（仪器编号：S/N 102589-95） 环境温度（℃）: 环境湿度（%）: 检测结果及记录： 样品形状： 1 材料：GVPC选择性平板：有效期，BCYE平板：有效期， 血平板：有效期，军团菌分型血清：有效期 （法国生物梅里埃公司提供），血平板（科玛嘉制备）分型血清（SCDC制备） 2 方法与步骤： 2.1无菌方法将500ml水样全部通过μm滤膜，取下滤膜仔细剪碎，置入一 含15ml原水样的大试管中，涡旋震荡充分洗脱后，备用。 2.2酸处理：取5ml洗脱样品，用0.01mol/L HCL调PH至2.2，混匀后静置5分钟。 2.3热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。 2.4取2.1洗脱样品，2.2酸处理样品，2.3热处理样品各0.1ml，置入GVPC平 板，用L型玻璃棒将其在琼脂表面推开。 2.5将上述接种好的GVPC平板置入36℃ 2.5% CO2含量的二氧化碳培养箱中（有 湿盘）培养，每日观察GVPC平板上有无可疑菌落生长。 3 培养结果： 3.1三天后GVPC平板若有表面光滑，整齐，灰白，灰蓝或紫色呈典型毛玻璃状， 在紫外光灯下，有荧光的可疑菌落，做革兰氏染色镜检。 3.2结果记录： 3.2.1平板培养每日可疑菌落观察记录（有无可疑菌落分别以“+”，“-”表示 测试人：复核人：审核人： 年月日年月日年月日
２０１３年１月第２０卷第２期 儿童嗜肺军团菌肺炎30例临床分析 黄爱萍 嗜肺军团菌肺炎在临床症状和影像学上的表现与其他 病原体肺炎相比无特异性，很难鉴别［１］。本组儿童嗜肺军团 菌肺炎肺内症状虽无特异性，但咳嗽以刺激性干咳为主，寒战、胸痛、咯血不明显；且肺外症状明显，特别是消化道症状，部分病例肺外表现还于肺炎之前或肺炎成功治愈之后出现，需引起注意；血Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）和血沉升高为明显，重要脏器功能损害不明显；大片高密度阴影为主，两肺下叶特别是右肺下叶为主要病变部位。本文回顾３０例儿童嗜肺军团菌（Ｌｐ）感染肺炎的临床资料，分析儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、诊断及愈后，以便为临床预防和诊断提供参考。报道如下：1 临床资料 １．１ 一般资料 我院２０１０年１月至２０１１年１２月收治的３０例嗜肺军团菌肺炎患儿，男１８例，女１２例。年龄＜２岁１例（３．３％），２～３岁８例（２６．７％），４～８岁８例（２６．７％），９～１３岁１３例（４３．３％）。３０例均无基础疾病。本地居民子女１８例（６０．０％），外地民工子女１２例（４０．０％）；夏秋季１８例（６０．０％），冬春季１２例（４０．０％）。住院时病程＜７ｄ１例（３．３％），７～１４ｄ １９例（６３．３％），＞１４ｄ １０例（３３．３％）。对照组３０例，选择同期住院支气管肺炎（非Ｌｐ感染），男１７例，女１３例。年龄２～３岁９例（３０．０％），４～８岁９例（３０．０％），９～１２岁１２例（４０．０％）。３０例均无基 础疾病。本地居民子女１５例（５０．０％），外地民工子女１５例（５０．０％）；夏秋季１８例（６０．０％），冬春季１２例（４０．０％）。住院时病程＜７ｄ １例（３．３％），７～１４ｄ ２１例（７０．０％），＞１４ｄ ８例（２６．７％）。 １．２ 儿童嗜肺军团菌肺炎诊断标准 ①发热、咳嗽等呼吸道症状；②胸部Ｘ线有渗出性阴影；③血清酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）抗嗜肺军团菌抗体ＩｇＭ阳性；④阿奇霉素或红霉素治疗有效。 １．３ 实验室检查与辅助检查 所有病例进行血、尿常规，血ＣＲＰ、血沉、血生化、心肌酶谱、痰培养、血气分析，副流感病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体ＩｇＭ抗体。ＥＬＩＳＡ试剂由德国欧蒙医学实验诊断股份公司提供。所有病例治疗前或治疗后１～２周行胸部Ｘ线或胸部ＣＴ检查。１．４ 统计方法 本文资料均为两独立组计数资料。其中非等级资料行卡方检验或精确概率检验。其他等级计数资料行秩和检验。多次比较则适当调整显著性水平。2 结果 ２．１ 临床表现 ３０例（１００．０％）患者均有发热，体温＞３９℃，热型不定；咳嗽３０例（１００．０％），其中刺激性干咳２４例，咳痰６例；呼吸困难１例（３．３％）；抽搐１例（３．３％）；肺部闻及干湿啰音１５例（５０．０％）；肝脾大２例（６．７％）。所有病例无胸痛、寒战、咯血、相对缓脉。两组间比较，除皮疹外，其余多项肺外表现差异均有统计学意义，嗜肺军团菌 组的肺外表现症状明显严重。见表１。 ２．２ 实验室检查结果 外周血白细胞＞１２×１０９ /Ｌ ９例 作者单位：317600 浙江玉环县人民医院儿科通信作者：黄爱萍，Email:hap_huang@https://www.doczj.com/doc/4f3965796.html, 【摘要】 目的 了解儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、诊断及预后。方法 回顾分析我院２０１０年１月至２０１１年１２月经酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）检测嗜肺军团菌血清抗体ＩｇＭ诊断明确的３０例儿童嗜肺军团菌肺炎的临床特点、实验室检查、影像学改变及预后。结果 ①临床特点：发热、干咳、恶心、呕吐、腹痛、腹泻、肌肉酸痛。２９例（９６．７％） 血Ｃ反应蛋白（ＣＲＰ）＞８ｍｇ/Ｌ，９例（３０．０％）血白细胞＞１２×１０９ /Ｌ。部分病例有低钠血症。心肌酶谱、肾功能等 均正常。②３０例无重症肺炎。③胸部影像学改变，大片高密度阴影或云雾状阴影；胸腔积液３例；病变以两肺下叶多见。④３０例经阿奇霉素或红霉素治疗痊愈，咳嗽持续时间较长。结论 儿童嗜肺军团菌肺炎无基础疾病，为普通型肺炎，临床症状轻，病死率低。儿童肺炎肺外表现明显时考虑嗜肺军团菌肺炎可能。儿童慢性咳嗽可能与嗜肺军团菌感染有关。 【关键词】 儿童；嗜肺军团菌；肺炎
集中空调通风系统中嗜肺军团菌采集方法 一、概述 为了预防公共场所集中空调通风系统传播传染病，保护公众身体健康，卫生部组织制定了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》 WS394-2012，并于2013年4月1日正式实施。规范对中央空调送风中可吸入颗粒物（PM10）浓度及嗜肺军团菌检出量做出了规定，并在检测方法中明确了对检测设备性能和质量要求。由于微生物气溶胶具有传播距离远，对人体危害严重，在浓度很低时便可以造成人群感染，因而检出困难，本文将介绍一种微生物气溶胶浓缩器与标准生物采样器BioSampler联合采样方法，通过提高单位时间内的采气量，经分离浓缩后送入标准生物采样器，可大大缩短采样时间，避免长时间采样对微生物活性的损伤，因而提高低浓度病原微生物气溶胶检出率。可广泛用于空气环境中病原微生物的采样与监测。 二、联合采样系统构成（图1） 1.浓缩采样头 2.KW-1型微生物气溶胶浓缩器主机 3.标准生物采样器BioSampler 4.干燥瓶 5. 外置抽气泵 图1 KW-1型微生物气溶胶浓缩器构成的浓缩采样系统 1.浓缩采样头 3.BioSampler （内装吸收液） 2.KW-1型微生物气溶胶浓缩器主机 4．干燥瓶 （内装干燥剂）
三、联合采样系统的工作原理 KW-1型微生物气溶胶浓缩器的“浓缩采样头”是基于虚拟冲击浓缩法原理设计。带有微生物气溶胶的空气通过总气流进口进入到“浓缩采样头”中，总气流经加速板加速后进入加速板和接收板之间，其中，小于切割粒径的气溶胶粒子随主流量发生偏转，通过主气流出口流出。而大于切割粒径的微生物气溶胶粒子由于惯性大，直接向前运动进入接收喷嘴，形成小气流通过“浓缩采样头”浓缩气流出口流出，从而达到微生物气溶胶的浓缩；总气流流量与浓缩气流流量之比即为浓缩比。浓缩后的气体进入装有吸收液液体冲击式微生物采样器（BioSampler）被采集，采集的样品可以用于后续的微生物检测。总气流与浓缩气流的流量由“KW-1型微生物气溶胶浓缩器”主机控制和显示。 四、KW-1型微生物气溶胶浓缩器的特点及主要技术指标 1.触摸屏控制，汉字显示 2.可设定定时采样、定体积采样、手动控制采样 3.双路采集流量及累计体积实时显示 4.采样时间、平均流量等数据可保存和回放 5.流量可手动校准 6.灵活的采样方式：可利用内置云台采样也可以使用外置云台高位采样。 7.总气路流(110～130) l/min可调，允许误差±5%。 8.接标准生物采样器后浓缩气路流量（7～10.5）l/min可调，允许误差±5%。 9.总气路流量及浓缩气路流量重复性误差±2%。 10.理论浓缩比1:10 11.定时功能:（1～40） min 五、现场安装与使用方法 使用内置云台构成的浓缩采样系统见图2。 当需要在呼吸带采样时，可使用内置云台方式： 1.将三角架调整至1.2m高度左右，调平并锁紧。 2.将KW-1放置到三角架上。 3.打开KW-1后面板上的内置云台，分别放入标准生物采样器BioSampler及干燥瓶。 4.在BioSampler中放入吸收液，干燥瓶中放入干燥剂。
了采样的效率。三是混杂物质和环境的干扰,国外的 研究发现空气中细菌和真菌等混杂物质的干扰会降低撞击法的采样效率,通过添加高效过滤网,可以提高采样效率[12]。此外环境的温湿度对流感病毒的采集效率也有一定的影响[13] 。 本实验证实了使用新型静电场采样装置采集分析流感病毒是可行性的,可以进一步改进目前的采样器,通过延长气溶胶在采样器中的停留时间,提高其采集的效率。 [参考文献] [1] Lesne J ,Bert het S ,Binard S ,et al.Changes in culturability and virulence of Salmonella typhimurium during long 2term starvation under desiccating condition[J ].International Journal of Food Mi 2crobiology ,2000,60(223):1952203. [2] Lipsitch M ,Cohen T ,Cooper B ,et al.Transmission dynamics and cont rol of severe acute respiratory syndrome [J ].Science ,2003,300(5627):196621970. [3] Lee KS ,Bartlett KH ,Brauer M ,et al.A field comparison of four samplers for enumerating fungal aerosols I.Sampling charac 2teristics[J ].Indoor Air ,2004,14(5):3602366. [4] Mainelis G ,Grinshpun SA ,Willeke K ,et al.Collection of air 2 borne microorganisms by electrostatic precipitation [J ].Aerosol Science and Technology ,1999,30(2):1272144. [5] Yao MS ,Mainelis G ,An HR.Inactivation of microorganisms u 2 sing electrostatic fields[J ].Environmental Science and Technolo 2gy ,2005,39(9):333823344. [6] Agranovski I ,Safatov A ,Sergeev A ,et al.Rapid detection of airborne viruses by personal bioaerosol sampler combined with the PCR device [J ].Atm ospheric Environment ,2006,40(21):392423929. [7] Drosten P ,Seifried E ,Rot h W K.TaqMan 5’2nuclease human immunodeficiency virus type IPCR assay wit h phage 2packaged competitive internal control for high 2t hroughput blood donor screening[J ].Clinic Microbiology ,2001,39(12):430224308.[8] Agranovski I ,Safatov A ,Borodulin A ,et al.Inactivation of vi 2 rus in bubbling processes utilized for personal bioaerosol monito 2ring[J ].Applied Environmental Microbiology ,2004,70(12):696326967. [9] Hermann J R ,Hoff S J ,Y oon K J ,et al.Optim ization of a sampling sys 2 tem for recovery and detection of airborne porcine reproduction and re 2spiratory syndrome virus and swine influenza virus[J ].Applied and En 2vironmental Microbiology ,2006,72(7):481124818. [10] K ell DB ,K aprelyants AS ,Weichart D ,et al.Viability and activity in readily culturable bacteria :A review and discussion of the practical is 2sues[J ].Antonie van Leeuwenhoek ,1998,73(2):1692187. [11] 吕阳.动物吸入染毒气溶胶发生系统的研究[J ].中国比较医学 杂志,2003,13(3):1692171. [12] Neumann HD ,Becker G ,Lohmeyer M ,et al.Preventive meas 2 ures to reduce bioaerosol exposure during refuse collection ;re 2sult s of field studies in t he real 2life situations[J ].Science of t he Total Environment ,2005,341(123):1213. [13] Kalogerakis N ,Paschali D ,Lekaditis V ,et al.Indoor air quali 2 ty 2bioaerosol measurement s in domestic and office premises[J ].Aerosol Science ,2005,36(526):7512761. ?专题论著? 嗜肺军团菌荧光定量PCR 检测方法的建立 张琦1,陈晓东1,2,张宝莹3,钱乐4,司朝宗4,张秀珍2,甄世祺2,刘凡3,陈连生2 (1.南京医科大学公共卫生学院, 江苏南京 210029;2.江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 3.中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京 100050; 4.东南大学公共卫生学院, 江苏南京 210009) DOI :10.3969/j.issn.1006-9070.2010.03.002 基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAI19B04)收稿日期:2010-03-22 作者简介:张琦(1984— ),女,内蒙古赤峰人,硕士研究生在读。 【摘 要】 目的:建立嗜肺军团菌mip 基因荧光定量PCR 检测方法。方法:利用Primer Express 软件设计特异性引物和探针,对质粒标准品、嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他菌株进行检测,验证方法的特异性、敏感性和重复性,最后采集环境样本进行检测。结果:该方法特异性好,嗜肺军团菌呈现阳性结果,而非嗜肺军团菌及其他菌株均为阴性结果。检测灵敏度达 293copies/μl ;重复性较好,Ct 值变异系数较小;检测的12份环境样本中5份阳性。结论:该方法快速且具有较好的特异性、 敏感性、重复性,适于外环境嗜肺军团菌污染调查及应急事件的快速检测。 【关键词】 嗜肺军团菌;荧光定量PCR 检测;mip 基因 【中图分类号】 R -331 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-9070(2010)03-0003-04
军团菌 军团杆菌，系需氧革兰氏阴性杆菌，以嗜肺军团菌最易致病。广泛存在于自然环境中，其传染源是水源和空调系统，通过空气传播。根据细胞壁组成、生化反应和DNA杂交研究，军团菌和过去已知的病原菌无关，故构成单独一个科。军团菌科仅有一个属，即军团菌属。 现已提出了超过30种军团杆菌，至少19种是人类肺炎的病原。其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似，具有共同的生化特征，引起类似疾病。 发现历史 1976年美国费城退伍军人协会会员中曾爆发急性发热性呼吸道疾病，是已知的首次爆发；221人感染疾病，其中死亡34人。由于大多的死者都是军团成员，因此称为军团病或退伍军人症。 早在1965年7～8月华盛顿特区圣伊丽莎白医院就曾有一次类似流行，81例罹病，14例死亡（17.3%)。1968年7～8月密执安州庞堤阿克市曾发生一次不明原因的疾患，累及144人，特点为发热、头痛、肌痛、腹泻及呕吐，无一例死亡；后称庞堤阿克热。 此后，军团病在全球共发生过50多次，近几年在欧洲、美国、澳大利亚等国家和地区均有流行。 近年来我国也发生了小规模疫情爆发，2000年1月北京市通州区某新兵训练营地发生了一起呼吸道感染疫情，流行病学和血清学检查证实，这是一起由博杰曼军团菌所引起的军团菌暴发流行. 2000年7月某写字楼多名员工出现发热、咽喉痛、肌肉痛，在312名员工中共发病193人。经检查证实,这是一次由空调系统冷凝水导致的上呼吸道感染型军团菌暴发流行。同时国内许多地区均有报道散发的军团病病例和亚临床感染。2000年北京20多所医院的129例肺炎患者，采用一般抗生素治疗无效，难以确诊，经血清学检查，33份为军团菌抗体阳性。可见在肺炎感染病人中,军团菌肺炎占一定的比例。我国1995年12月～1996年1月在驻京某部新兵集训营地新兵战士中发生了6例军团菌病，其中1例死亡。1999年4月份，在某新兵大队中又发生了21例军团菌病的暴发流行。 经研究,发现一种细菌命名为嗜肺军团菌。随后，许多有关细菌暂被列入这一属,且追溯研究发现早在1943年即有军团人员病的病例.现已提出了超过30种军团杆菌,至少19种是人类肺炎的病原。其中最常见病原体为嗜肺军团菌(占病例的85%~90%),其次是 L.micdadei(占5%~10%),再次是L.bozemanii和L.dumoffii.此类细菌形态相似，具有共同的生化特征,引起类似疾病。