DOI:10.16409/https://www.doczj.com/doc/4a2940053.html, ki.2095-039x.2011.02.002
27(2)145-151 中国生物防治学报 Chinese Journal of Biological Control 2011年5月木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展
陈捷,朱洁伟,张婷,王秉丽
(上海交通大学农业与生物学院,上海200240)
摘要:木霉菌Trichode rma是国际上应用非常普遍的生防真菌。随着植物免疫的MAMPs(微生物互作分子模式)理论的发展,利用木霉菌防治病害和提高作物抗逆性机理研究进入了一个新阶段,尤其是系统生物学方法的应用,使得人们在“组学”尺度上认识木霉菌与植物和病原菌互作的本质成为可能,这将极大丰富木霉菌生物防治植物病害的理论基础。在我国建立木霉菌多样化应用技术途径是发挥木霉菌在农业可持续发展中作用的重要发展方向。本文重点介绍木霉菌生物防治分子机理研究的新进展。
关 键 词:木霉菌;生物防治;植物病害;微生物互作分子模式
中图分类号:S482.292;S476 文献标识码:A 文章编号:1005-9261(2011)02-0145-07
Progress on Mechanism and Applications of Trichoderma as a Biocontrol Microbe
CHE N Jie,ZHU Jie-wei,ZHANG Ting,WANG Bing-li
(School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiao Tong Universit y,Shanghai200240,China)
A bstract:Trichoderma is widely used as a biocontr ol microbe against plant diseases in the world,which is mainly ap-plied for contr olling a variety of soil borne plant diseases and some plant aboveground diseases.With the advent of MAMPs (microbe-associated m olecular patterns)theory,the study on mechanism of plant disease contr ol and impr oved plant resis-tance to stress factors with T richoderma as a biocontr ol agent has come into a new stage,especially as the development of tec hnologies based on systems biology,it has become possible to understand the nature of interaction of plant-T richode rma-pathogen fr om point of“omics”vie w,whic h therefor e would intensively enrich the theory basis of T richoderma as bioc ontrol a gent.Meanwhile,a diversified technical system for applying T richoderma pr oducts developed in national a gricultural in-dustry would provide great pro motion to sustainable development of a griculture in the future.This revie w will focus on new research progress on bioc ontrol mechanism with T richoderma against plant diseases at molecular level.
Key words:Trichode rma;biocontr ol;plant disease;MAMPs
木霉菌Tric hoderma是自然界广泛分布的生防真菌,至少对18个属20余种病原真菌和多种病原细菌有拮抗作用[1]。目前国际上五大洲60多个国家使用100多种含有木霉菌成分的生物制剂产品[2],年销售额达2.5亿美元。木霉菌主要用于防治各类植物的土传病害,以及部分叶部和穗部病害。木霉菌不仅能防病,还具有促进植物生长、提高营养利用效率,增强植物抗逆性和修复农化污染环境等功能[3]。随着基因工程和系统生物学技术的应用,尤其是植物免疫理论———微生物相关分子模式(microbe-associated molecular patterns, MAMPs)的发展,极大推动了木霉菌生物防治基础理论研究,促进了木霉菌在农业中更加广泛的应用。
1 木霉菌“组学”研究
近年来木霉菌基因组、转录组、蛋白质组和代谢组方面研究发展迅速,基因组和EST测序、基于微阵列(microarray)和宏阵列(macr oarra y)的表达谱分析已成为挖掘木霉菌基因和研究作用机理的重要工具。在基因组学研究方面,已构建了哈茨木霉T.har zianum等木霉菌的EST的cDNA文库,鉴定出多种新基因[2]。完成了3个木霉菌种(里氏木霉T.reesei、绿木霉T.virens和深绿木霉T.atroviride)的基因组测序。里氏木霉的
基金项目:现代农业产业技术体系专项(CAR S-02);上海市重点项目(09391910900);上海市农业科技成果转化项目(103919N2100)作者简介:陈捷(1959-),男,教授,E-mail:jiechen59@s https://www.doczj.com/doc/4a2940053.html,。
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基因组为34Mb、9129个编码基因,绿木霉为38.8Mb、11643个基因,深绿木霉为36.1Mb、11100个基因。估计哈茨木霉和绿色木霉T.viride的基因组分别为31Mb和39Mb[2]。Martinez等[4]研究表明:木霉菌基因组中的相关基因以家簇形式存在,呈现有规律的定位和组合,而且与种有特异关系。
Hernández-Ońate等[5]通过高通量基因测序技术,在深绿木霉中发现了12个转录因子、DNA修复酶、分子伴侣和一系列分子化伴侣,鉴定出与分生孢子产生相关的光响应和机械损伤激发活性氧诱导的相关基因。通过实施TrichoEST功能基因组项目,已测序25000个表达序列标签(EST),描述了13814个特异转录本,鉴定出编码几丁质酶、葡聚糖酶、蛋白酶、疏水蛋白和锌指蛋白的基因以及沃鲁宁体(woronin body)形成相关基因和多种抗逆相关基因。通过抑制差减杂交文库(SSH)或快速差减杂交文库(Ra SH)方法鉴定出多种在病原菌和环境胁迫因子作用下上调表达的基因,如hex1、A BC、H SP和编码单加氧酶、疏水蛋白、棒曲霉素类蛋白(expansin-like pr otein)、MAPK的基因等。Ihr mark等[6]研究了深绿木霉与病原菌互作相关的几丁质酶基因家簇成员表达变化和分子共进化位点网络。目前克隆的木霉菌基因多数与重寄生作用和诱导植物抗性有关[7],如Sm1、几丁质酶基因(20～36个几丁质酶基因,如chit42、chit33和c hit18等)、葡聚糖酶基因(gluc78)、蛋白酶基因(pr1和p6281)、细胞壁疏水性类蛋白基因(qid74)和木聚糖酶基因(xyn2),其中p6281和qid74为新基因。我国在木霉菌基因组学方面也有一些研究。哈尔宾工业大学通过建立棘孢木霉T.asperellum T4 cDNA文库,获得了3114个EST,鉴定出15个基因在木霉菌与核盘菌Sclerotinia sclerotiorum和立枯丝核菌Rhi-zoc tonia solani对峙培养中差异表达[8]。在木霉菌蛋白质组学研究方面,主要研究了上述3种基因组已测序木霉菌在病原菌细胞组分和宿主植物诱导下的差异表达蛋白[2]。它们的线粒体蛋白质组、分泌蛋白质组、细胞膜蛋白质组和抗菌肽组已得到鉴定。木霉菌-病原菌、木霉-植物、植物-木霉菌-病原菌互作的相关蛋白质组研究是近年研究的热点。在代谢组学研究方面,主要利用LC/MS/MS等方法鉴定木霉菌代谢产生的大量酶、激素、信号分子和抗生素等[2]。
2 木霉菌生物防治机理研究
2.1 木霉菌次生代谢与抗生作用
木霉产生的挥发性和非挥发性抗菌次生代谢产物多达几百种[2]。如哈茨木霉可产生12种,绿色木霉、康宁木霉和钩状木霉分别可产生10、9和7种。主要有蒽醌类、烷基吡喃酮类、聚酮类、异腈类、二酮哌嗪类、倍半萜烯类、类固醇类和肽醇类等。目前只有少数次生代谢物,如胶毒素(gliotoxin)、二甲氧基木霉素(dimethoxy gliotoxin)、绿粘帚霉毒素(glioviren)、heptelidic acid、绿胶霉素(viridin)、绿毛菌醇(viridiol)和抗菌肽等得到鉴定。上海交通大学对6株拮抗性较好的木霉菌进行了peptaibols类抗菌肽检测,共检测得16种pep-taibols类抗菌肽,发现菌株间在抗菌肽种类上存在差异。研究发现立枯丝核菌、终极腐霉菌Pythium ultimum 和灰霉菌Botrytis cinerea的培养物可激发哈茨木霉T22和T39菌株产生次生代谢物[9]。铁载体(siderophores)已证明是深绿木霉防治镰孢菌枯萎病的重要功能因子。Segarra等[10]发现棘孢木霉T34菌株只有在10μmol·L-1Fe3+条件下才能有效抑制番茄镰孢菌枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycoersici)。哈茨木霉对菜豆锈病(Uromyc es appendic ulatus)的防治作用也主要是依靠其次生代谢物的抗生作用[11]。
随着木霉菌基因组测序的完成,发现大量基因与次生代谢有关,例如绿木霉基因组中500多个基因以家簇形式存在,参与次生代谢[12]。高通量基因敲除方法成为鉴定控制次生代谢相关基因的主要技术,通过基因敲除克隆,获得了木霉素合成酶基因Tri5和Tbtri5[13]。近年来抗菌肽研究较多,peptaibols是线状的具有亲水和疏水性的多肽片段,其穿膜的三维构象对功能的影响是研究重点;现已提出一些新的作用模型[14]。已发现哈茨木霉存在抗菌肽合成酶。奥地利学者建立了抗菌肽数据库,收集了800多个抗菌肽和300多个氨基酸序列,为开展肽生物体(peptaibiotics)研究及鉴定新抗菌肽结构提供了重要工具[15]。
2.2 植物-木霉菌-病原菌互作与诱导植物抗性
美国康奈尔大学应用哈茨木霉T22包衣玉米种子防治由Colletotric hum graminicola引起的炭疽病[3,16],上海交通大学利用哈茨木霉H6包衣玉米种子诱导玉米对大斑病、弯孢霉叶斑病的抗性,说明木霉菌可通过诱导植物免疫系统基因表达,实现对病害的防治。随着植物免疫学理论的发展,MAMP已成为木霉菌诱导植物抗性的重要理论基础。木霉菌诱导植物抗性可通过以下3个途径实现:(1)增强MAMPs分子激发的免疫反146
第2期 陈捷等:木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展
应(MAMPs-triggered immunity,MTI);(2)减少效应因子诱发的感病性(effector-triggered susceptibility,ETS);(3)提高效应因子激发的免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)。
2.2.1 木霉菌-病原菌互作 木霉菌识别病原真菌过程中分泌一系列细胞壁降解酶(如β-1,6-葡聚糖酶、Chit42、Chit33、nag-1)和次生代谢物,形成侵入结构,最终完成重寄生过程。这一过程受G蛋白和MAPK信号调控。多个MAPK基因(tmk1和tvk1)和G蛋白途径相关基因(tga1、tgaA、tgaB和tga3)已被克隆[17～19]。Mar kus等[20]研究了G蛋白和cAMP信号对深绿木霉与病原菌互作的调控作用,其中Tga1和Tga3(即两种G 蛋白的α亚基)调控了分生孢子的形成、重寄生作用和c AMP产生,同时影响了抗菌物质和几丁质酶的形成;利用基因沉默的方法证明了cAMP的G偶联受体蛋白基因gpr1参与调控了对病原菌的重寄生过程,但没有发现Gpr1与Tga3直接互作。Reithner等[21]等在转录组水平上研究了立枯丝核菌对深绿木霉基因表达的影响,发现木霉菌244差异表达基因中,有13个基因与防御反应、信号转导、次生代谢物生物合成、运输和分解代谢有关,其中胰蛋白酶、铁还原酶、NADH/NADPH氧化酶和1种相关蛋白的转录表达明显依赖立枯丝核菌的诱导;但大多数基因表达类型和强度变化与立枯丝核菌的诱导或阻遏无关。
2.2.2 木霉菌-植物互作 一般而言,木霉菌诱导植物的MTI将超过病原相关分子模式激发的免疫反应(PTI)效应,主要是由于木霉菌可产生大量的MAMPs分子(植物效应分子),例如丝氨酸蛋白酶、22kD木聚糖酶、几丁质脱乙酰基酶、几丁质酶Chit42、SnodProt蛋白(SnodPr ot1、Sm1和EPI)、脂肽、棒曲霉素类蛋白、无毒基因蛋白等[22]。此外,植物MAPK基因(TIPK)发现可受木霉菌特异诱导[23]。有关Sm1(small protein)等小分泌蛋白(SSPs)的研究已成为国际上的研究热点。
Sm1是Djonovic等[24]从绿木霉分泌物中分离到的一种富含半胱氨酸的疏水蛋白(12.6kD),与ceratao-pla-tanin基因家簇有很高的同源性,不仅对植物和微生物无毒,还能诱导水稻、棉花和玉米活性氧的释放以及多种防御反应基因的表达。Mukherjee等[25]鉴定出13种与已知Sm1特性不完全相同的SSPs。研究表明:3种木霉菌(绿木霉、深绿木霉和里氏木霉)之间SSPs同源性不高,说明SSPs在木霉菌中存在较高的多样性,或SSPs进化速度较快,目前人们正在研究SSPs在木霉菌-植物(如玉米等)互作或诱导抗性中的作用。上海交通大学通过与美国康奈尔大学合作,利用蛋白质组学技术从哈茨木霉T22菌株发酵液中发现无毒基因蛋白Avr4/Avr9的同源蛋白[1],同时克隆出Chit42、Chit33、Sm1等效应因子相关基因,其中Sm1蛋白可诱导拟南芥对丁香假单胞菌番茄变种(Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000)的抗性,并证明与活性氧信号转导有关(未发表数据)。Shoresh和Harman[26]通过蛋白质组学方法和E ST文库鉴定了哈茨木霉T22与玉米互作后玉米中27个内切几丁质酶基因和4个外几丁质酶基因的变化规律,发现了1个新的特异几丁质酶(95kD)。
Rubio等[27]利用高密度寡核苷酸(HDO)微阵列技术检测和生物信息学分析发现:钩状木霉T7-番茄互作20h后有200个差异表达基因,其中166个上调表达,34个下调表达;43.14%的基因与分子功能有关, 56.86%与生物过程有关,32.0%与细胞组分形成有关。哈茨木霉T34-番茄互作20h中有615个基因差异表达,其中33.5%与分子功能有关,34.5%与生物过程有关,32.0%与细胞组分形成有关。而绿木霉T87-番茄互作20h中有370个基因差异表达,其中与分子功能、生物过程和细胞组分形成相关的基因分别占31.4%、42.3%和26.3%[27]。只有7个基因在3种木霉菌中共同表达。
木霉菌次生代谢物也参与了抗性的诱导。Viterbo等[28]研究表明:木霉菌预先接种可诱导植物40多种化合物的上调表达,可能与系统防御反应有关。木霉菌-植物互作不仅能诱导抗性,还能提高植物对非生物胁迫因子(盐、高温、紫外线等)的抗性。棘孢木霉T203处理黄瓜种子提高了植株的耐盐胁迫能力,植株Mn/ Cu SOD和过氧化氢酶(CAT)的活性及还原性抗坏血酸的含量明显增加[28]。
2.2.3 木霉菌-其它微生物互作 在土壤中木霉菌与多种病原和非病原微生物发生互作,对木霉菌种群数量和生防作用产生明显影响。Stewart等[29]研究表明:有6种真菌(链格孢菌Alte rnaria alternata、淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus、黑曲霉Aspergillus niger、球毛壳菌Chaetomium globosum、金龟子绿僵菌Metarhizium aniso-pliae和光轮层炭壳菌Daldinia esc hschol z ii)和1种土壤杆菌A grobacte rium sp.明显减少了两种木霉菌在土壤中的生长。黑曲霉和链格孢菌A.alternata对深绿木霉和钩状木霉T.hamatum抑制率超过85%。病原菌在土壤中产生的代谢物是抑制木霉菌种群的主要原因。但研究表明:深绿木霉对罗汉松和草坪土壤的有益微生物区系多样性没有不利影响[30]。
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2.2.4 植物-木霉菌-病原菌互作 木霉菌生防机理本质上就是木霉菌-植物-病原菌的分子互作机制。上海交通大学利用蛋白质组学技术鉴定出玉米抗腐霉菌根腐病(Pythium sp.)的相关蛋白,其中几丁质酶、SOD、异黄酮还原酶和PR蛋白与玉米苗期抗根腐病相关[31]。在接种弯孢霉叶斑病菌Curuularia lunata的情况下,叶片22kD干旱诱导蛋白、Glx1和AB A成熟诱导类蛋白等与玉米抗弯孢霉叶斑病相关[6]。Marra等[32]研究了植物(番茄、烟草、菜豆、马铃薯)-病原菌(灰霉菌、立枯丝核菌和终极腐霉菌)-木霉菌(深绿木霉P1或哈茨木霉T22)互作过程中蛋白质组图谱的变化,其中任何一方均可明显改变另外两方互作中蛋白质图谱和差异蛋白点的变化规律,例如菜豆叶片蛋白质组图谱中鉴定出一种抗性相关蛋白RPP8-like protein,其在深绿木霉菌-菜豆-灰霉菌三方互作下的表达丰度明显高于单一菜豆(无互作)或菜豆-灰霉菌、菜豆-深绿木霉菌双方互作时的情况。有时三方互作可诱导出一方(无互作)或在双方互作中没有的蛋白,例如在深绿木霉-菜豆根-立枯丝核菌三方互作中,深绿木霉菌蛋白质组中特异出现了抗brefeldinA蛋白,而在深绿木霉菌单独培养时或深绿木菌-菜豆根互作中均未发现该蛋白的存在。Brotman等[33]利用转录学和代谢组学的方法研究了拟南芥-木霉菌-丁香假单胞菌番茄变种三方互作,结果表明:利用木霉菌处理水培拟南芥根系48h,可诱导根系300多个基因表达发生变化,但叶片基因的变化与根系不同。木霉菌诱导宿主植物基因差异表达主要表现在量的水平上。代谢组研究发现有27个化合物与拟南芥诱导抗性有关。
3 木霉菌功能拓展的分子改良
在木霉菌功能分子改良方面,哈尔滨工业大学曾在2004年利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法将Cry1A(b)基因转入生防真菌哈茨木霉中,工程菌株表现出一定的杀虫效果。苯并咪唑类杀菌剂抗性基因在哈茨木霉菌中的转化,获得了抗药性明显提高的工程菌[34]。
为了获得兼治病虫的双价木霉工程菌,上海交通大学将绿僵菌的几丁质酶基因、蛋白质酶基因成功转化木霉菌,转化子对玉米螟幼虫的致死率明显高于绿僵菌[35]。国外已成功将来自木霉菌本身和外源生物活性分子编码基因20余种(无毒基因、Bt毒素基因、植物几丁质酶、脱乙酰几丁质酶、内切几丁质酶、葡聚糖酶基因、渗透蛋白基因、寡聚半乳糖醛酸苷裂酶基因、果胶酸裂解酶基因和激发子隐地蛋白基因等)转化木霉菌,明显提高了木霉菌的拮抗能力[36]。
4 木霉菌资源收集、评价与利用
4.1 资源收集与评价
近年来人们越来越重视从极端生境条件下分离木霉菌,如从海洋环境(海绵、珊瑚)分离木霉菌,部分分离菌株表现出对陆地植物病害很好的生防效果。在木霉菌种类鉴定技术方面,除了进行形态学特征观察鉴定外,主要利用ITS、tef1和cal13个基因进行分子鉴定,明显提高了鉴定效率和准确性[37]。对于木霉菌功能的评价,已从过去的离体抑菌活性和活体防效试验,发展到从分子遗传、生物化学、生态竞争力和营养选择性等多水平综合评价;从单一的生防功能评价,发展到环境修复潜力的评价。Seidl-Seiboth等[38]研究了绿木霉和深绿木霉碳水化合物组(CAZome),发现绿木霉和深绿木霉分别有259个和258个糖苷水解酶基因。绿木霉是目前所有种中含几丁质降解酶基因数量最多的木霉菌;里氏木霉含有纤维素酶和木聚糖酶种类较多,但这两种酶在木霉菌种间的多样性普遍较低。Simkovic等[39]研究了木霉菌Trichode rma sp.编码分泌的蛋白酶基因Prb1和ProA,其中Prb1仅在培养3～4d后才表达。Guazzone等[40]认为木霉菌在植物根际的竞争力应该作为生防木霉筛选的指标。Jegathambigai等[41]利用多种营养基质如大麦、水稻、豇豆、玉米、高粱籽粒和PDA、水稻浸出液等制备成不同的固体和半固体培养基培养木霉菌,评价不同木霉菌的产孢、生长和抑菌能力的变化。菌株筛选及其评价技术方面近年来有了较大进展,越来越多的工作采用了高通量筛选技术,如微阵列和芯片技术、代谢谱检测技术等,大大提高了筛选的效率和信息量[2]。Bissett等[42]利用Biolog FF Mi-cr oPlates T M检测236个木霉菌株生长和呼吸相关的代谢谱变化,建立了检测菌株纤维素酶活性的预测模型,该模型已证明可适用于上千种木霉菌的筛选。上海交通大学已初步建立了基于木霉菌株形态特征、遗传进化(遗传谱系、功能蛋白与基因种类)、生防特性(离体与活体下抑菌或抑病水平)、几丁质酶、葡聚糖酶和蛋白酶活性、降解病原菌细胞壁能力、抗生素产生种类与水平等)、吸附环境重金属(Cd2+、Cu2+、Zn2+)和降解农化148
第2期 陈捷等:木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展
物质(敌敌畏、辛硫磷、氰化物、酚类物等)潜力的综合评价指标。
4.2 木霉菌基因资源利用
4.2.1 转基因植物和微生物的构建 将木霉菌功能基因转化植物,使其获得对病害和非生物胁迫(盐、高温、重金属等)的抗性是木霉基因资源利用的重要方面。例如,将木霉菌几丁质酶基因(ec h42、nag70、nag1、gluc78和chit33)成功转化烟草、马铃薯、水稻、花椰菜、苹果、杨树和黑去杉等多种植物,提高了寄主对链格孢菌A.alte rnata、番茄早疫病菌Alte rnaria solani、灰霉菌、立枯丝核菌、苹果黑星病菌V enturia inaequalis、杨树叶锈病菌Melampsora medusae、梗柱孢Cylindrocladium floridanum等多种病原菌的抗性,其中转ech42最为普遍[43,44]。新疆农业大学将木霉菌几丁质酶基因转化棉花,提高了棉花对黄萎病的抗性[45]。浙江大学将哈茨木霉T22菌株的ec h42、nag70和gluc78转化水稻,获得对水稻纹枯病的抗性工程植株,部分表现对稻瘟病的抗性[46]。Landau等[47]将木霉菌的内切几丁质酶基因c hit36和氨基己糖苷酶(hexoaminidase)基因在拟南芥中与LysMRLK1受体结合、过表达,提高了拟南芥中抗逆相关信号转导和抗胁迫能力。有些转基因植株不仅提高了对靶标病害的抗性,同时也提高了对非生物胁迫的抗性。
木霉菌功能基因也可转化其它生防微生物,提高生防效果,例如上海交通大学已将木霉菌几丁质酶基因Chit42和Chit33、激发子基因Sm1和Xyn2成功转化利迪链霉菌Streptomyces lydicus,获得了对番茄灰霉病菌抗生作用和诱导抗性明显提高的工程菌(未发表数据)。
4.2.2 抑虫功能的利用 关于木霉菌防治农业害虫的报道并不多见,但已有研究发现哈茨木霉菌发酵液能够抑制棉铃虫Heliothis armigera和大黄粉虫Tene brio molitor幼虫的生长[48]。关于木霉菌抑虫机理仍不清楚。一些研究认为木霉菌的丝氨酸蛋白酶pr1与杀虫真菌的Pr1蛋白具有类似的生化特性,因此表现一定的抑虫作用[49]。木霉菌产生的抗菌肽本身也具有一定的杀虫作用。Evidente等[50]从桔绿木霉T.citrinoviride分离出dihydrotrichodimerol和bislongiquinolide等次生代谢物,其中bisorbicillinoids可明显改变麦二叉蚜Schizaphis graminum的取食偏好性,从而抑制蚜虫在叶表的为害。有些学者认为木霉菌潜在的杀虫功能可能会影响木霉菌作为病害生物防治因子的应用,担心其会对非靶标的有益昆虫产生影响。
4.2.3 促进作物生长与修复环境 木霉菌具有提高土壤营养有效性和植物营养利用效率的作用。山东科学院和上海交通大学均筛选出一批具有解磷作用(磷酸钙)、解钾的木霉菌株。上海交通大学筛选出多个拮抗木霉菌株,具有不同的功能,所制备的菌剂应用时可分别使化肥利用率提高30%以上,降解敌敌畏90%、降解辛硫磷30%～50%,降解氰化物80%,吸附重金属Cd2+和Cu2+分别为40%和60%,土壤盐渍化水平下降26%～47%;同时可使土壤速效氮、钾、磷明显提高[51～54];番茄增产均在12%以上,西瓜中心糖度增加11%,边缘糖度增加31%(未发表数据)。
为了揭示木霉菌修复农化污染土壤的机理,上海交通大学从木霉菌中克隆了吸附Cd2+相关基因PLA2、高效吸附铜相关基因酰胺水解酶基因、耐受敌敌畏和辛硫磷相关基因hex1,鉴定出敌敌畏和Cd2+胁迫下木霉菌特异应答的蛋白质组,验证了上述基因的减轻农化污染的功能[53～55];并证明生物矿化作用是木霉菌降解敌敌畏的主要机制[56];成功开发出木霉菌-油菜联合吸附土壤超标重金属关键技术。
4.2.4 生物能源的潜在资源 山东科学院研究表明木霉菌在天然培养基上可产生烃类物质及其衍生物,所产生的烃类物质的C链长度一般在C9-C35之间,可成为生物柴油潜在开发资源。木霉菌降解作物秸秆中纤维素和木质纤维系等生产燃料———乙醇已有较多报道。山东大学利用基因工程手段改良木霉菌相关基因的表达水平,提高了纤维素酶产率。上海交通大学构建了高产纤维素酶突变株,酶活达3.76U·mL-1,明显提高了对水稻和玉米秸秆的降解率[51]。
5 木霉菌产品的耐贮性与加工技术
生防木霉菌能否商业化应用,在很大程度上取决于木霉菌剂的抗逆性(如高温、干燥、紫外辐射等)和耐贮性(常温下1年以上)。目前主要有两方面技术,一方面是降低酸度和调节氧气利用率诱导木霉菌产生抗逆性厚垣孢子,另一方面在菌剂中加入一些化学助剂(如添加铜)[49,57]。
上海交通大学和沈阳农业大学经过几年研究形成了诱发木霉菌产生厚垣孢子专利技术[58],已在中试发酵水平上大量诱导厚垣孢子的产生。华东理工大学和中国农业科学院植物保护研究所近年来也开展了木霉
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菌高产厚垣孢子发酵工艺和相关基因研究。目前国内外关于调控厚垣孢子形成的分子机理一直没有取得突破。Kandula等[59]通过向木霉菌加入海藻糖提高木霉对高温(35～40℃)和紫外线的抗性。Srira m等[60]加入甘油做湿润剂延长了木霉菌剂的货架期。专用包装设计、真空干燥、低密聚乙烯包装材料等均可延长货架期至15个月。在木霉菌剂型加工方面,沈阳农业大学和上海交通大学联合开发出木霉菌分生孢子粉尘剂,获得了国家发明专利[61]。
6 展望
6.1 木霉菌-植物特异互作的分子机理
研究表明:木霉菌与玉米和番茄等作物品种存在一定的特异性互作关系,因此在田间应用生防木霉菌产品之前需要进行品种适用性生物测定,确保木霉菌应用的效果和安全性。目前国内外学者正试图鉴定控制木霉菌-玉米品种间特异互作的基因。
6.2 木霉菌诱导植物免疫分子基础
国际上提出的微生物相关分子模式(MAMPs)受到普遍关注,木霉菌产生的各效应因子如何与植物细胞受体互作成为揭示木霉菌诱导植物免疫机理的关键,需要加强研究。
6.3 木霉菌发酵工艺改良
为了提高木霉菌生物农药的质量,除了需要监测发酵过程中的pH、溶氧量和温度等传统指标外,还需要在细胞代谢流、基因组、蛋白质组和代谢组等尺度上监测与拮抗物质产率的相关性。另一方面,需要建立更为科学的活体木霉菌产品质量标准,如增加拮抗物质含量或活性指标。应加强开发新剂型,如细胞微囊剂、油包水乳剂等保护性剂型;还要进一步研究厚垣孢子产生的分子机理。随着转基因木霉菌研究的深入,应开展转基因木霉菌生物和环境安全性的前瞻性研究。
6.4 建立多样化的应用技术模式
美国康奈尔大学Har man等[62]提出了木霉菌的4种应用模式:(1)以生物农药形式注册和市场营销的模式;(2)以接种体、植物生长促进剂和生物肥料形式应用的模式;(3)当地直接生产应用的模式;(4)政府或国营主导应用的模式。上述4个模式中第2种模式和第3种模式比较适合我国的情况。其中木霉菌以生物肥料的形式注册相对容易,可同时应用于多种病害的生物防治,同时还能兼顾对作物生长的促进和土壤环境的修复。
参考文献
[1] Harman G E,Howell C R,Viterbo A,e t al.Nature R evie w Microbiol ogy[J],2004,2:43-56.
[2] Lorit o M,Woo S L,Harman G E,et al.Annual R evie w of Phytopathology[J],2010,48:395-417.
[3] Harman G E.Phytopathology[J],2006,96(2):190-194.
[4] Martinez D A,Chee C,Kunkel J,et al.In:T r ichoder ma:Molecular Mechanis ms and Appl ications of Bioc ontrol in A griculture[C].Haifa,Israel,2010.8.
[5] Hernández-O?ate M,Ibarra E,Vega J,et al.In:Tr ichoder ma:Molecul ar Mec hanis ms and Applicati ons of Biocontrol in Agriculture[C].Hai fa,Israel,
2010.9.
[6] Ihrmark K,As mail N,U bhayasekera W,et al.Evolutionary Bioinformatics[J],2010,6:1-26.
[7] 邱德文.植物免疫与植物疫苗———研究与实践[M].北京:科学出版社,67-79.
[8] Liu Z H,Yang X X,Sun D M,et al.M olecular Biology R eports[J],2010,37(8):3673-3681.
[9] Vinale F,Ghisalberti E L,Sivasithamparam K,et al.Letters in Applied Microbiology[J],2009,48(6):705-711.
[10] Segarra G,Casanova E,Avilés M,et al.Microbial Ec ology[J],2010,59(1):141-149.
[11] Burmeister L,Hau B.Biocontrol[J],2009,54(4):575-585.
[12] Mukgerjee P K,Kenerley C M.In:T richoder ma:Molecular Mechanisms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,2010.15.
[13] Tij erino A,Cadoza R E,Moraga J,et al.In:Tric hode rma:Mol ecul ar Mechanis ms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,
2010.16.
[14] Song X Y,Shen Q T,Xie S T,et al.FEMS Letters Microbiology[J],2006,260(1):119-125.
[15] Schus ter A,Schomll M.Appl ied M icrobiol ogy and Bi otechnology[J],2010,87:787-799.
[16] Harman G E,Petzoldt R,Co mis A,et al.Phytopathology[J],2004,94:147-153.
[17] Mukherjee P K,Latha J,Hadar R,et al.Applied and Environmental Microbiology[J],2004,70(1):542-549.
[18] Zeilinger S,R eithner B,Scal a,et al.Applied and Environmental Microbiology[J],2005,71(3):1591-1597.
150
第2期 陈捷等:木霉菌生物防治作用机理与应用研究进展
[19] R eithner B,Schuhmacher R,Stoppacher N,et al.Fungal Genetics and Biology[J],2007,44(11):1123-1133.
[20] Markus O,Susanne Z.Journal of Signal Trans duction[J],2010,doi:10.1155/2010/123126.
[21] R eithner B,Al fredo H E.In:Tric hode rma:Molec ular Mechanis ms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,2010.10.
[22] Shores h M,HarmanG E,Mas touri F.Annual Review of Phytopathology[J],2010,48:21-43.
[23] Shores h M,Gal-On A,Leibman D,et al.Pl ant Physi ology[J],2006,142:1169-1179.
[24] Dj onovic S,Pozo M J,Dangott L J,et al.Molecul ar Plant-Microbe Interactions[J],2006,19:838-853.
[25] Mukherj ee M,K os ti I,Glaser F,e t al.In:T ric hode rma:Mol ecular Mechanis ms and Applicati ons of Bioc ontrol in A griculture[C].Haifa,Israel,2010.41.
[26] Shores h M,Harman G E.B MC Plant Biology[J],2010,10:136.
[27] R ubi o B,Hermosa R,Monte E.In:T richoder ma:Molecular Mechanisms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,2010.36.
[28] Viterbo A,Landau U,Ki m S,et al.FEMS Letters Microbiology[J],2010,305(1):42-45.
[29] Stewart A,Brownbridge M,Hill R A,et al.Soil Microbiology and Sustainable Crop Production[J],2010:315-371.
[30] M cl ean K,Dodd S,Ste wart A,et al.In:T ric hoder ma:Molecular Mechanis ms and Applic ations of Bioc ontrol in Agric ulture[C].Haifa,Is rael,2010.29.
[31] Chen J,Harman G E,Comis A.Journal of Integrated Plant Biology[J],2005,47(8):988-997.
[32] Marra R,A mbrosino P,Carbone V,et al.Current Genetics[J],2006,50:307-321.
[33] Brotman Y,Lisec J,Willmitzer L,et al.In:Tric hode rma:Molecular Mechanis ms and Applications of Bioc ontrol in Agricul ture[C].Haifa,Israel,
2010.24.
[34] 高兴喜,杨谦.科学通报[J],2004,49(21):2193-2197.
[35] Chen J,Li Y Y.In:Tric hode rma:Molecular Mec hanis ms and Applications of Biocontrol in Agricult ure[C].Hai fa,Israel,2010.27.
[36] Mukherjee P K,Nauti yal C S,Mukhopadhyay A N.In:Nautiyal C S,Dion P,eds.Molecular mechanis ms of plant and microbe coexis tence(Soil Biology
Series)[M]https://www.doczj.com/doc/4a2940053.html,herlands:Springer.243-262.
[37] Marigowda R A,Thokala P D,Ganesan M V,et al.In:Tric hode rma:M olecular M echanis ms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,
Israel,2010.58-59.
[38] Seidl-Seiboth V,Coutinho P M,Henriss at B,et al.In:T richoder ma:Molecular Mechanis ms and Applications of Biocontrol in Agric ulture[C].Haifa,
Israel,2010.13.
[39] Simkovic M,Kurucova A,Zemkova Z,et al.In:Tr ichoder ma:Molecul ar Mec hanis ms and Applicati ons of Biocontrol in Agriculture[C].Hai fa,Israel,
2010.14.
[40] Guazzone N,Hill R,Steyaert J,et al.In:T ric hode rma:Molecular Mechanis ms and Applications of Biocontrol in Agricul ture[C].Haifa,Is rael,2010.33.
[41] Jegathambigai V,Wils on Wijeratnam R S.In:Tric hode rma:Molecular Mechanis ms and Applications of Bioc ontrol in Agricul ture[C].Haifa,Israel,
2010.37.
[42] Biss ett J,Shoukouhi P,D ufres ne P,et al.In:T richoder ma:Mol ecul ar M echanis ms and Applications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,
2010.46.
[43] Shah M R,Mukherj ee P K,Eapen S.Physiology Mol ecul ar Biology of Plants[J],2010,16(1):39-51.
[44] Bolar J P,Norelli J L,Harman G E,et al.Trans genic R es earch[J],2001,10(6):533-544.
[45] 李莉,曲延英,陈全家,等.新疆农业科学[J],2005,42(3):178-180.
[46] Liu M,Sun Z X,Zhu J,et al.Journal of Zhejiang Universit y[J],2004,5(2):133-136.
[47] L andau U,Brot man Y,Pnini S,et al.In:T ric hode rma:Molecular Mechanis ms and Applications of Biocontrol in Agricul ture[C].Haifa,Is rael,2010.34.
[48] Binod B,Sukumaran R K,Shirke S V,et al.Journal of Applied Microbiology[J],2007,103(5):1845-1852.
[49] Shakeri J,Fos ter H A.Enzyme Microbial Technol ogy[J],2007,40(4):961-968.
[50] Evidente A,Andol fi A,Ci mmino A.Journal of Chemical Ecol ogy[J],2009,35(5):533-541.
[51] 胡仕凤,唐俊,高永东,等.上海交通大学学报(农业科学版)[J],2007,25(6):513-518.
[52] Zhou X Y,Xu S F,Chen J,et al.Bioresource Technology[J],2007,98(15):2958-2962.
[53] Tang J,Liu L,Huang X L,e t al.Canadian Journal of Microbiology[J],2010,56:121-127.
[54] Wang B,Liu L X,Chen J,e t al.Chemosphere[J],2009,74:1400-1403.
[55] Fu K H,Liu L X,Fan L L,et al.Biotechnol ogy letters[J],2010,32:1815-1820.
[56] Sun W,Chen Y P,Chen J,et al.Biores ource Technology[J],2010,101:9197-9203.
[57] Kol ombet L V,Zhi gletsova S K,Kosareva N I,e t al.Worl d J ournal of Microbial and Biotechnol ogy[J],2008,24(1):123-131.
[58] 陈捷,庄敬华,高增贵.木霉菌厚垣孢子的生产方法[P].中国发明专利.200410025682.8.2006
[59] Kandul a J,Braithwaite M,Hay A,et al.In:Tric hode rma:Molecular Mechanis ms and Applications of Bioc ontrol in Agricul ture[C].Haifa,Israel,
2010.50.
[60] Sriram S,Savitha M J,Rajeshwari R,et al.In:Tr ichoder ma:Mol ecular Mechanisms and Appl ications of Biocontrol in Agriculture[C].Haifa,Israel,
2010.61.
[61] 庄敬华,陈捷,杨长成,等.木霉菌分生孢子粉尘剂的制备方法及其应用[P].中国发明专利.200710010263.0.2010.
[62] Harman G E,Obregón M A,Samuels G J,et al.Plant Disease[J],2010,94(8):928-939.
151