重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用
国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。
第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。
第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。
第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。
第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA 及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。
对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。
第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。
最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌
理化性质从热稳定性方面说
酵母源乙型肝炎疫苗37℃保存1周不改变其免疫原性
乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备，使用直接注射的方法打入静脉。这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片段）：
,HBscFv等电点理论值为 8.5 1,实验值为 7.3～ 8.1（就是抗体）
综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、乙肝病毒表面抗原的分离纯化、产品多项性质的初步检测、成品化处理（如添加佐剂、抗生素、除菌）、成品检测鉴定、包装几个步骤。对产品多项性质的检测对于保证疫苗的安全性尤其重要。
目前临床上应用的乙肝疫苗主要有以下几种：
(1)血源性乙肝疫苗：此疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成，故称血源性乙肝疫苗。它的制备步骤大致是：采用高滴度HBsAg阳性携带者血液，分离出血浆并除去其中有感染的HBV颗粒后，再将HBsAg予以浓缩与纯化，充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒和消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。为确保疫苗的安全，每一阶段均取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中有无其他病原体及血液中的抗原物质。此种疫苗的免疫原性与安全性均已获得解决。
(2)基因工程疫苗：利用基因工程研制重组DNA乙肝疫苗，曾先后研制过大肠杆菌系统、啤酒酵母细胞系统、哺乳动物细胞系统和牛痘病毒系统的重组乙肝疫苗。目前多用酵母基因的重组疫苗。其具有良好的免疫原性，免疫应答特点与血源性乙肝疫苗基本相似，且多无严重的不良反应。
(3)含前S蛋白的乙肝疫苗：目前临床上应用的血源性疫苗与基因工程疫苗，均只含HBsAg蛋白，当证实S蛋白能增强HBsAg的免疫应答后，又注意到单纯只含HBsAg蛋白的疫苗对血液透析病人与新生儿免疫效果较差时，遂生产出添加前S蛋白的酵母源性重组乙肝疫苗，它确能明显地增强免疫应答。
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图1 乙肝病毒表面蛋白表达载体的构建
基因工程技术生产乙肝疫苗首先要选择表达HBsAg的载体系统。在之前的研究中发现，若选用细菌为基因表达载体，即使使用强启动子，也不能得到大量具有免疫原性的基因表达产物。这可能是由于原核表达系统中不能进行糖基化修饰，或者原核细胞环境不适合专性寄生于真核生物的乙肝病毒包膜蛋白表达，故应选用真核表达系统。选用酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为宿主系统，因其具有丰富的膜结构和细胞器的特点，既可使蛋白以分泌形式表达，又可以使蛋白糖基化变为活性形式。克隆载体构建时，将编码HBsAg的基因（野生型adw）添加到酵母酒精脱氢酶Ⅰ（ADHⅠ）的启动子之后。如图1所示构建载体。[6]将质粒转化至酵母菌中，通过HBsAg抗体与酵母菌积累产物HBsAg之间的特异性反应筛选出成功转化的菌体。对筛选出的菌体进一步发酵培养，摸索合适的基因工程菌培养条件，使产物尽量高效积累。
第十四章基因重组与基因工程 一、选择题 1.细菌的F因子是通过哪种方式进行基因转移的 A.接合作用 B.转化 C.转导 D.转染 E.转座 2. 下列关于限制性内切核酸酶作用特性正确的是 A.在对称序列处切开单链DNA B.DNA两链的切点一定不在同一位点 C.酶切部位一定位于识别序列处 D.酶辨认的碱基一般为8～12个 E.酶切后产生的DNA片段多半具有粘性互补末端 3. 限制性核酸内切酶识别的顺序通常是 A.基因的操纵序列 B.启动子序列 C.S-D序列 D.回文结构 E.长末端重复序列 4. 可识别并切割特异DNA序列的酶称为 A.限制性核酸外切酶 B.限制性核酸内切酶 C.核酶 D.核酸酶 E.反转录酶 5. 下列DNA序列属于回文结构的是 A.ATGCCG B.GGCCGG C.CTAGGG D.GAATTC E.TCTGAC TACGGC CCGGCC GATCCC CTTAAG AGACTG 6. cDNA文库包括该种生物 A.某些蛋白质的结构基因 B.所有蛋白质的结构基因 C.所有结构基因 D.结构基因与不表达的调控区 E.内含子和调控区 7. 下列哪种工具酶的出现在基因工程中具有最重要的意义： A.逆转录酶 B.限制性核酸内切酶 C.末端转移酶 D.DNA聚合酶 E.DNA连接酶 8. 常用质粒载体的特点是 A.为线性双链DNA分子 B.为环形单链DNA分子 C.具有自我复制能力 D.含有同一限制性内切酶的多个切点 E.缺乏表达外源基因的能力 9. 基因工程的操作程序可简单地概括为 A.载体和目的基因的分离 B.分、切、接、转、筛、表达 C.将重组体导入宿主细胞，筛出阳性细胞株 D.将载体和目的基因连接成重组体 E.限制性内切酶的应用
基因重组与基因工程 一、选择题 1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化 B．转导 C．转染 D．转座 E．接合 3．溶原菌是指： A．整合了噬菌体基因组的细菌 B．整合了质粒基因组的细菌 C．含有独立噬菌体基因组的细菌 D．含有独立质粒基因组的细菌 E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌 4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为： A．转化 B．转导
C．转染 D．转座 E．接合 5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组 B．同源重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 6．发生在同源序列间的重组称为： A．位点特异的重组 B．非位点特异的重组 C．基本重组 D．随机重组 E．人工重组 7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生： A．5'磷酸基和3'羟基基团的末端 B．3'磷酸基和5'羟基基团的末端 C．5'磷酸基和3'磷酸基团韵末端 D．5'羟基和3'羟基基团的末端 E．以上都不是 8．可识别并切割特异DNA序列的称： A．限制性核酸外切酶 B．限制性核酸内切酶
C．非限制性核酸外切酶 D．非限制性核酸内切酶 E．DNA酶 9．限制酶的识别顺序通常是： A．聚腺苷酸 B．聚胞苷酸 C．RNA聚合酶附着点 D．回文对称序列 E．甲基化“帽”结构 10．限制酶： A．从噬菌体中提取而得 B．可将单链DNA任意切开 C．可将双链DNA任意切开 D．可将双链DNA特异切开 E．不受DNA甲基化影响． 11．限制酶的作用特性不包括： A．在对称序列处切开DNA B．同时切开双链DNA C．DNA两链的切点常在同一位点 D．酶切后的DNA片段多具有粘性互补末端 E．酶辨认的碱基一般为4—6个 12．限制酶的特点不包括： A．只识别一种核苷酸序列 B．其识别不受DNA来源的限制
重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用 国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。 第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。 第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。 第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。 第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA 及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。 对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。 第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。
第十七章基因重组和基因工程 一、单项选择题 1.限制性核酸内切酶切割DNA后产生 A. 5′磷酸基和3′羟基基团的末端 B. 5′磷酸基和3′磷酸基团的末端 C. 5′羟基和3′羟基基团的末端 D. 3′磷酸基和5′羟基基团的末端 E. 以上都不是 2. 可识别并切割特异DNA序列的酶是 A. 非限制性核酸外切酶 B. 限制性核酸内切酶 C. 限制性核酸外切酶 D. 非限制性核酸内切酶 E. DNA酶 3. 有关限制性核酸内切酶，以下哪个描述是错误的？ A. 识别和切割位点通常是4～8个bp长度 B. 大多数酶的识别序列具有回文结构 C. 在识别位点切割磷酸二酯键 D. 只能识别和切割原核生物DNA分子 E. 只能切割含识别序列的双链DNA分子 4. 在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的酶是 A. 解链酶 B. DNA聚合酶 C. DNA连接酶 D. 内切酶 E. 拓扑酶 5. 对基因工程载体的描述，下列哪个不正确？ A. 可以转入宿主细胞 B. 有限制酶的识别位点 C. 可与目的基因相连 D. 是环状DNA分子 E. 有筛选标志 6. 克隆所依赖的DNA载体的最基本性质是 A. 卡那霉素抗性 B. 青霉素抗性 C. 自我复制能力 D. 自我表达能力 E. 自我转录能力 7. 重组DNA技术中常用的质粒DNA是 A. 病毒基因组DNA的一部分 B. 细菌染色体外的独立遗传单位 C. 细菌染色体DNA的一部分 D. 真核细胞染色体外的独立遗传单位 E. 真核细胞染色体DNA的一部分 8. 下列哪种物质一般不用作基因工程的载体？ A. 质粒 B. 噬菌体
C. 哺乳动物的病毒 D. 逆转录病毒ＤＮＡ E. 大肠杆菌基因组 9. 关于pBR322质粒描述错误的是 Ａ．有一些限制酶的酶切位点Ｂ．含有1个ori. Ｃ．含有来自大肠杆菌的lacZ基因片段Ｄ．含个氨卞青霉素抗性基因Ｅ．含四环素抗性基因。 10. 以ｍＲＮＡ为模板催化ｃＤＮＡ合成需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Klenow片段 D. 逆转录酶 E. ＤＮＡ酶 11. 催化聚合酶链反应需要下列酶 A. RNA聚合酶 B. DNA聚合酶 C. Taq DNA聚合酶 D. 逆转录酶 E.限制性核酸内切酶 12. 关于ＰＣＲ的描述下列哪项不正确？ A. 是一种酶促反应 B. 引物决定了扩增的特异性 C. 扩增产物量大 D.扩增的对象是ＤＮＡ序列 E.扩增的对象是RNA序列 13. 在基因工程中，DNA重组体是指 A. 不同来源的两段DNA单链的复性 B. 目的基因与载体的连接物 C. 不同来源的DNA分子的连接物 D. 原核DNA与真核DNA的连接物 E. 两个不同的结构基因形成的连接物 14. 基因工程操作中转导是指 A. 把重组质粒导入宿主细胞 B. 把DNA重组体导入真核细胞 C. 把DNA重组体导入原核细胞 D. 把外源DNA导入宿主细胞 E. 以噬菌体或病毒为载体构建的重组DNA导入宿主细胞 15. 重组DNA的筛选与鉴定不包括哪一方法 A. 限制酶酶切图谱鉴定 B. PCR扩增鉴定 C. 显微注射 D. 蓝白筛选 E.抗药筛选
基因工程乙肝疫苗的制备 【摘要】基因工程乙肝疫苗是通过构建含有乙肝表面抗原的重组质粒转染酵母细胞，制备乙肝病毒表面的有效蛋白。本文主要介绍基因工程疫苗--重组酵母乙肝疫苗制备的基本原理和工艺流程，以及乙肝疫苗的纯度分析方法。 【关键词】乙肝疫苗重组质粒工艺流程 1.基因工程乙肝疫苗产生背景 疫苗是人类目前可以彻底消灭某一疾病的唯一武器，接种疫苗被认为是最有效、最经济的疾病预防手段。《发展中国家消灭乙型肝炎免疫接种计划实施指南》中指出：“世界上四分之三的人口生活在中或高乙肝流行区，因此，唯一的策略就是有效地减少乙肝的流行，最终消灭乙肝······” 世界卫生组织肝炎专家及计划免疫全球咨询组认为：控制全球乙型肝炎及减少死亡的策略是开展大规模的婴儿及学龄前儿童的乙肝疫苗接种。 我国卫生部制定的目标是从92年开始在全国逐步推行乙型肝炎（HB）计划免疫。92年全国共生产血源疫苗1500万人份，尚不能满足新生儿接种需要，如考虑其他人群，缺口更大。为了实现HB计划目标，进一步为控制全球HB做出贡献，我们必须大规模提高HB 疫苗的产量和进一步提高质量。 血源HB疫苗原料为无症状带毒者的HBsAg阳性血浆。血源价格昂贵，供应量有限，采集困难。因此血源疫苗的产量和成本受到原料的限制。利用基因工程重组微生物细胞表达HBsAg生产HB疫苗的技术，原料易得，价廉，适宜进行大规模生产，有可能大幅度降低成本。 2.使用重组酵母的原因和重组酵母构建 2.1使用重组酵母的原因 使用重组酵母进行乙肝疫苗的大规模生产，有如下几点原因： （1）.酵母对培养基的要求低，价廉易得。 （2）.酵母细胞生长快，故生产率高。 （3）.动物细胞生长慢，容易染菌，对操作要求严。 （4）.酵母系统容易放大，动物细胞系统放大难。 2.2重组酵母构建 HBV只有3200bp，为双链的DNA,是一个相当小的病毒。其基因组共有四个ORF，编码以下一些蛋白：Core蛋白和pre-core蛋白，Pol蛋白，X蛋白，以及S蛋白（L、M、S）。故重组酵母可用以下方法： （1）.根据已经测定的编码乙肝病毒表面抗原决定簇基因序列，用化学合成法直接合成目的基因或者通过鸟枪法克隆目的基因。用识别相同黏性末端的限制性内切酶将外源DNA和质
乙肝疫苗基础知识 乙肝疫苗接种预防已被列入我国计划免疫项目，但是其接种普及率并不高，许多人对于接种乙肝疫苗的接种方法和注意事项并不清楚，非常有必要在这里简要介绍一下。 一、选用怎样的乙肝疫苗? 目前使用的多为基因工程乙肝疫苗，昔日使用的血源性疫苗已基本淘汰(原因是有引起血源性疾病的嫌疑和浪费大量的血浆)。基因工程乙肝疫苗是利用现代基因工程技术，构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，它可以用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感染。现在用的基因工程乙肝疫苗为乙肝重组脱氧核糖核酸酵母疫苗和重组牛痘病毒疫苗，剂量为每支5微克。 二、为何要打乙肝疫苗? 乙肝疫苗可以成功预防乙肝病毒的感染，新生儿一出生就接种乙肝疫苗，基本可以确保将来不得乙肝。 现有的肝硬化、肝癌多从乙肝发展而来，成功地预防乙肝，实际就是防硬化、防肝癌第一针。目前乙肝疫苗较便宜，每支几元钱，民众都能接受。 三、乙肝疫苗的正确使用方法是什么? (1)如果新生儿的父母均没有乙肝，该新生儿在出生后应尽快(8小时内)给予基因工程乙肝疫苗1支肌肉注射，注射部位为上臂三角肌(儿童、成人都一样)，1个月后，再打1支，6个月后再打1支，一共3针，此方案称为0、1、6方案；儿童和成人打疫苗前需先进行
化验，如果乙肝三系统检查均为阴性，转氨酶正常，可以按0、1、6方案进行乙肝疫苗接种。免疫成功率为90%以上，免疫成功的标志是乙肝表面抗体转为阳性，保护时间一般为2年以上，接种者可定期复查乙肝三系统，只要表面抗体依然存在，证明免疫能力依旧。(2)对于母亲一方为单纯表面抗原阳性的新生儿，单用乙肝疫苗就可取得比较满意的效果，乙肝疫苗的使用方法依然是0、1、6方案，有报导认为第一针可打2支(10微克/l毫升)效果更好。(3)对于母亲一方为乙肝病毒表面抗原和e抗原双阳性的新生儿最好是联合应用高效价的乙肝免疫球蛋白和乙肝疫苗。具体方法是新生儿采用注射2次高效价乙肝免疫球蛋白(出生后立即及出生后1个月各注射1支，每支XXXX 年仍保持在这一水平；第3年降到74%左右，抗体滴度也下降。是否需要再次接种疫苗,主要是要在测定乙肝表面抗体的滴度后，决定何时再打乙肝疫苗。乙肝表面抗体滴度小于或者等于10国际单位/毫升者，应在半年内接种。抗体滴度大于10国际单位/毫升可在6年内复种。我国的多数学者建议免疫后3年内加强1次为好。 六、乙肝疫苗能和其他疫苗同时使用吗? 乙肝疫苗可以和流脑疫苗、卡介苗、白百破、脊髓灰质疫苗、乙脑疫苗同时接种，接种程序按照计划免疫所要求的顺序进行。但是乙肝疫苗最好不要和麻疹疫苗同时使用。 七、意外接触乙肝病毒者如何打乙肝疫苗? (1)对未接种过疫苗的接触者，先注射乙肝免疫球蛋白(24小时内)，然后接种乙肝疫苗(打完乙肝免疫球蛋白后1周)。(2)如果接触
第十四章基因重组与基因工程 内容提要： 细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的DNA转移称为接合作用。通过自动获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。由病毒携带将宿主DNA片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接即为重组。 重组DNA技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基因的结构与功能，从构建的基因组DNA文库或cDNA文库分离、扩增某一感兴趣的基因就是基因克隆或分子克隆，又称重组DNA技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1．分，即目的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几种途径：化学合成、PCR技术、基因组文库或cDNA文库中获得。载体是目的基因的携带者，常用的载体有质粒、噬菌体等。2．切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，是实现重组DNA技术的重要的工具酶。3．接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组DNA）。4．转，即将重组体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、转染及感染。5．筛，即重组体的筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和Southern印迹或免疫学方法对抗药菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组DNA获得基因克隆。重组DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA诊断及疾病的预防等方面具有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。 一、选择题 【A型题】 1．下列DNA序列属于回文结构的是（） A．ATGCCG TACGGC B．GAA TTC CTTAAG C．GGCCGG CCGGCC D．TCTGAC AGACTG E．CTAGGG GA TCCC 2．DNA经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾相接，自行成环。这是因为存在着（） A．钝性末端B．平端C．粘性末端D．5’端E．3’端 3．限制性内切核酸酶的通常识别序列是（） A．粘性末端B．聚腺苷酸 C．回文对称序列D．RNA聚合酶附着点E．甲基化“帽”结构 4．pBR322是（）
关于注射乙肝疫苗基础知识 乙肝疫苗接种预防已被列入我国打算免疫项目，但是其接种普及率并别高，许多人关于接种乙肝疫苗的接种办法和注意事项并别清晰，特别有必要在这个地方简要介绍一下。 一、选用怎么样的乙肝疫苗? 目前使用的多为基因工程乙肝疫苗，昔日使用的血源性疫苗已基本淘汰(原因是有引起血源性疾病的嫌疑和白费大量的血浆)。基因工程乙肝疫苗是利用现代基因工程技术，构建含有乙肝表面抗原基因的重组质粒，它能够用于预防所有已知亚型的乙肝病毒感染。如今用的基因工程乙肝疫苗为乙肝重组脱氧核糖核酸酵母疫苗和重组牛痘病毒疫苗，剂量为每支5微克。 二、为何要打乙肝疫苗? 乙肝疫苗能够成功预防乙肝病毒的感染，新生儿一出生就接种乙肝疫苗，基本能够确保今后别得乙肝。现有的肝硬化、肝癌多从乙肝进展而来，成功地预防乙肝，实际算是防硬化、防肝癌第一针。目前乙肝疫苗较廉价，每支几元钞票，民众都能同意。 三、乙肝疫苗的正确使用办法是什么? ；也有采取出生后马上注射1支高效价乙肝免疫球蛋白，及3次乙肝疫苗(每次15微克，生后马上及1月、6月各注射1次)，2个方案爱护的成功率都在90%以上。 四、接种疫苗后别产生抗体该如何办? 五、接种疫苗后，多长时刻需要再次接种? 六、乙肝疫苗能和其他疫苗并且使用吗? 乙肝疫苗能够和流脑疫苗、卡介苗、白百破、脊髓灰质疫苗、乙脑疫苗并且接种，接种程序按照打算免疫所要求的顺序进行。但是乙肝疫苗最好别要和麻疹疫苗并且使用。 七、意外接触乙肝病毒者怎么打乙肝疫苗? 八、接种乙肝疫苗会可不能传染上其他传染病? 接种肝炎疫苗可不能引起其他肝炎发生，也可不能被传染上其他疾病。乙肝疫苗在生产过程中有严格的质量标准，其中许多工 序都能杀死血液中包括爱滋病病毒在内的病原微生物，经过临床观看是安全可靠的。值得提出的是，使用别合格产品如注射破损、变质疫苗，或注射过程别按无菌要求操作，共用注射器或针头，可染上肝炎或其他传染病。还有一部分人原来是隐性传染者，病毒呈低水冷静制状态，两对半检查正常，需要用核糖核酸增殖法检出病毒(hbvdna阳性)，这种人注射疫苗后可不能有表面抗体形成。 九、假如在边远地区，尚无法做到乙肝疫苗的普种如何办？ 至少要对以下处于乙肝病毒高度惊险状态的易感人群进行乙肝疫苗接种：全部新生儿和幼儿园的孩子；惊险职业的工作人员(传染病、口腔科、血液透析室、血站、保育员等等)；使用血液制品者；新入伍的军人；器官移植前的患者；需长期使用免疫抑制剂者；乙肝病毒携带者的家人、性接触者。 十、乙肝患者有没有必要打乙肝疫苗？ 乙肝疫苗对乙肝患者及乙肝病毒携带者都无预防效果，不管打多少支乙肝疫苗，都可不能产生相应的爱护性抗体乙肝病毒表面抗体，不过白费疫苗和经费而已。对由于以往感染乙肝病毒而如今差不多自然获得有效的爱护性抗体者(乙肝二对半检查表面抗体呈阳性)，更没有必要再接种疫苗，只是接种后也可不能产生别良副反应，其乙肝表面抗体水平可能会有所增高。假如是急性乙肝患者，经积极治疗后彻底治愈并康复，检查乙肝病毒二对半表面抗原已阴转，只剩下核心抗体为阳性，而爱护性的乙肝病毒表面抗体又始终别能自己产生，在这
时间： 地点： 主讲：胡永珍 参加人员： 内容：重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用 国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。 对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因中间，在这种情况下，表达产物是融合蛋白质，融合蛋白质可以抵抗内源蛋白酶的降解，又可以在细胞信号肽的引导下分泌到细胞外。最后，利用发酵工程培养重组与乙肝疫苗的工程菌理化性质从热稳定性方面说酵母源乙型肝炎疫苗37℃保存1周不改变其免疫原性乙肝疫苗，主要成分是45个氨基酸的多肽，通过化学合成的方式制备，使用直接注射的方法打入静脉。这45个氨基酸分别编码了三个抗原表位（所谓表位，是一串大于9个氨基酸的多肽，是能够刺激免疫系统发生反应的最小多肽片段）：,HBscFv等电点理论值为8.5 1,实验值为7.3～8.1（就是抗体）综上所述，用基因工程法生产乙肝疫苗要先后将过获取目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工
基因工程方法生产乙肝疫苗 乙肝病毒的感染可导致慢性肝脏疾病甚至肝癌的发生。[1] 我国乙肝感染率为60%，乙肝表面抗原携带率约为10%，有约1.2亿人携带乙肝病毒。[2] 疫苗接种是预防乙肝的主要途径。国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。[3] 但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗。 [4]1982年, Valenzuela等人在国际上首次成功运用基因手段构建重组质粒，在酵母中表达出乙肝病毒表面抗原。[7] 1986年，美国批准了酵母来源基因工程方法生产的乙肝疫苗投放市场。[5] 本文主要内容是简要总结运用基因工程方法，以酵母为载体生产乙肝疫苗的流程。 乙肝病毒中决定乙肝病毒抗原性的蛋白是乙型肝炎病毒(HBV)包膜蛋白，主要包括：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，前S1抗原和前S2抗原。乙肝病毒包膜相关蛋白的编码基因位于HBV基因组的S区。S区基因有三个起始密码子和同一个终止子，从不同的起始密码子开始转录，可得到三种不同的包膜蛋白。小蛋白（SHB,即主表面蛋白,S蛋白）包括表面抗原HBsAg（p24为非糖基化形式，gp27为糖基化形式），由226个氨基酸组成；中蛋白（MHB）除了具有S蛋白的226个氨基酸，N端多出55个氨基酸残基（前S2蛋白）；大蛋白（LHB）除了具有S蛋白和前S2蛋白还具有前S1蛋白。在完整的乙肝病毒Dane毒粒中，小蛋白、中蛋白与大蛋白通过各自S蛋白之间的二硫键共价连接，外包脂膜形成完整颗粒。由于三种蛋白中均包括S蛋白区域，故含有HBsAg的疫苗可以在机体中引发针对乙肝病毒的免疫反应。[2]
精品文档乙肝疫苗宣传资料 一、免疫程序、接种禁忌及注意事项 （一）乙肝疫苗免疫程序？ 乙型肝炎疫苗全程免疫共需接种 3 针，免疫程序为0、1、 6 个月，即出生后24 小时内接种首针乙肝疫苗， 1 个月和6 个月接种第 2 及第 3 针乙肝疫苗。乙肝疫苗首针及时 接种和全程接种是保证乙肝疫苗保护效果的关键。首针乙肝 疫苗要求在出生后 24 小时内接种，且越早越好。 （二）接种乙肝疫苗有什么禁忌？ 乙肝疫苗接种禁忌包括：已知对该疫苗所含任何成 分，包括辅料、甲醛以及抗生素过敏者；患有急性疾病、 严重慢性疾病、慢性疾病的急性发作期和发热者；妊娠期 妇女；患未控制的癫痫和其他进行性神经系统疾病者。 （三）乙肝疫苗能和其他疫苗同时使用吗？ 乙肝疫苗可以和流脑疫苗、卡介苗、百白破、脊髓灰 质疫苗、乙脑疫苗、含麻疹成分疫苗、甲肝疫苗等同时接 种。乙肝疫苗和其它疫苗同时接种时要在不同部位分开接 种。
二、乙肝疫苗的免疫效果 （一）乙肝疫苗的保护时间？ 乙肝疫苗接种后产生的抗体水平随时间的逐渐下降。 抗体滴度越高，持续时间越长。一般接种疫苗，注射 3 针 后的 1-3 个月 97%的人都可测到乙肝表面抗体（抗-HBs）； 1年时仍保持同一水平，以后阳转率逐渐下降，到免后第三 年时可降到 74%左右，抗体滴度也逐渐下降。目前大量资料 显示，接种乙肝疫苗后有抗体应答者的保护效果一般至少可 持续 20 年。 （二）新生儿全程接种 3 针乙肝疫苗后，何时可检测抗 体？ 新生儿全程接种 3 针乙肝疫苗后，一般人群可以不进行抗体 （抗 -HBs）检测。如果母亲为 HBsAg阳性时，新生儿有必 要进行抗体检测。可选择在完成乙肝疫苗全程接种后的 1～ 5 个月时采血，因为这时体内抗体滴度最高,如抗-HBs< 10 mIU/ml ，可进行再次接种。 （三）使用乙肝疫苗进行基础免疫过程中，前后 3 针 疫苗的生产公司或疫苗类型不一样，会有哪些问题，有效 吗？
基因工程乙肝疫苗市场前景广阔 疫苗是医药产业中的朝阳产品，全球疫苗市场过去20年增长了10倍，是处方药市场增幅的2倍,在生物制品行业中扮演着重要角色。2002年全球疫苗市场约为85亿美元，并以平均每年10%～15%的速度增长，发展中国家经济收入的增长已是疫苗市场增长的源泉。葛兰素史克公司是目前世界最大的疫苗生产供应商，占据了世界疫苗市场24%的份额，2000年在全球畅销的500个药品中，葛兰素史克公司的重组酵母乙肝疫苗销售额为7亿美元，排名全球畅销药品的68位，2001年的业绩为6.41亿美元。在全球疫苗市场中Infanrix、Twinrix、Recombivax HB也具有显赫的地位。2002年全球抗肝炎药物市场已达40多亿美元，按5.4%复合年增长率测算,预计到2008年可达到62.75亿美元的市场份额。我国疫苗市场的总体规模约为25亿元,其中乙肝疫苗约占1/3，疫苗制品按照我国《传染病防治法实施办法》的规定，在卫生部宏观调控下，地方卫生防疫部门负责疫苗年度预算计划，实行统一订购，并供给各所属医院应用接种，国内市场需求与生产基本处于平衡状态，市场份额为7.7亿～8.2亿元左右,国产品占80%以上。进口乙肝疫苗主要是葛兰素史克的原液产品，由上海生物技术研究所分装，2002年葛兰素在中国疫苗市场的销售额为1.59亿元，约占该公司疫苗销售业绩的3%，其他国外乙肝疫苗制剂在市场上极少，外来品牌在国内市场竞争压力不大。北京天坛生物研制有多种疫苗,其收入和利润的85%以上来源于疫苗。主要品种有脊髓灰质炎疫苗、乙肝疫苗、乙脑疫苗、流脑疫苗和风疹疫苗，近年来乙肝疫苗占据了主导地位，2002年基因工程乙肝疫苗收入占主营业务的55%,占据全国近40%的市场份额。在生物制药领域，康泰生物为国内基因工程乙肝凤苗市场上的巨头,近几年乙肝疫苗的销售额在亿元以上，占据了40%的市场份额。华北制药集团也是开发乙肝疫苗的主要企业,金坦公司重组(CHO)乙肝疫苗中试生产后，工艺日臻成熟,2003年底报道实际供应市场量为700万人份。云大科技控股的大连高新生物制药的重组酵母乙型肝炎疫苗，投入规模化生产后，对疫苗市场又是一个利好消息。目前，乙肝新疫苗保护的靶对象正逐渐扩展为慢性肝病患者和肝炎病毒携带者，国外在单一抗原HBV疫苗基础上开发了多种抗原疫苗,临床表明预防甲肝、乙肝有效率在98%以上，因此合并有S抗原的Bio-Hep-B和Hepagene有望能替代现在广为使用的重组疫苗；预测到2010年，相继问世的疫苗将占HBV疫苗市场的20%，DNA疫苗、口服植物性疫苗、联合疫苗、治疗性乙肝疫苗有望成为新的热点。尤其是治疗性乙肝疫苗与现有抗HBV药物联合应用,将是肝炎新疗法之一，在这一方面，江苏复旦悦达生物技术拥有我国自主知识产权的乙肝治疗性疫苗已完成临床研究，商品名为乙克。疫苗市场分为计划免疫和有价疫苗市场，计划性免疫可避免大规模疾病暴发，符合我国的医保政策，是国民经济中重要组成部分；在人们对疾病防疫认识提高后，将会自觉使用有价疫苗，疫苗这一潜在的市场将会浮出水面。目前，植物基因工程口服乙肝疫苗尚在研究之中，是21世纪最具前景的疫苗品种，中国疫苗市场目前处在起步阶段，从市场规模到消费观念均有较大的发展空间。
关于乙肝疫苗的产品研发历程与市场现状分析 摘要：疫苗在疾病预防中的地位日益重要,对疫苗质量的要求也日益提高。近年来,在传统和新型疫苗的制备中,应用先进的分离纯化技术是提高疫苗效力降低副反应的有效手段。综述了我国乙肝疫苗制品研发过程、疫苗市场与疫苗生产企业的发展现状,指出了我国疫苗产业的市场前景与发展方向。 关键词：乙肝疫苗；疫苗市场；现状前景 乙型肝炎是由HBV 引起的全球性传染病,其疫苗的研究很早就受到重视。《促进生物产业加快发展的若干政策》中将“发展预防和诊断严重威胁我国人民群众生命健康的重大传染病的新型疫苗和诊断试剂”列为生物医药领域的重点工程,发展疫苗产业已成为我国医疗卫生事业以及生物高新技术领域发展的重点。 1 血源乙肝疫苗生的研发 早在1964 年,Blumberg 等发现乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 后,即报告用氯化铯密度梯度离心法分离HBsAg 的初步研究。1972 年Dressman等应用差速离心、超声处理后,再经2 次氯化铯1次蔗糖密度梯度离心,制出HBsAg 纯品。1978年谢彦博等采用胃酶消化、DEAE 离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等四步综合法获得高纯度的乙肝表面抗原,用来免疫动物,生产抗2HBs 诊断血。随着超速离心技术越来越多的应用于生物大分子的分离,国内学者正式开始了血源乙肝疫苗的研制。血源乙肝疫苗的制备,是以密度梯度离心为主,结合盐析和超滤为辅的综合纯化方法。 首先,在HBsAg 阳性血浆内加入氯化钙(CaCl2 ) ,经保温后离心,除去纤维蛋白。随后在血浆中加入硫酸铵, 使终浓度达到50 %饱和度, 经低速离心(3 000 r/ min) ,收集沉淀即为HBsAg 的粗提物。 第2 步精提纯,主要采用超速离心技术,也是制备血源乙肝疫苗的关键技术。其基本原理是根据所分离物质在介质中的浮密度的差异,将混合物质进行分离。HBsAg 的纯化通常采用2 次等密度区带离心( isopycniczonalcent rifugation) 和1次速率区带离心(rate zonal cent rifugation) 。等密度区带离心是将氯化铯或溴化钾配制成不同浓度的梯度液,将样品置于梯度液的高浓度区,经过30 000 r/ min ,20 h 离心,在重力的作用下, HB2sAg 浮升到与自身相符的密度区间( d = 1. 2) ,收集抗原密集部分,经过2 次离心,可将HBsAg 与球蛋白有效分离,但与HBsAg 密度相同的高密度脂蛋白和Dane 氏颗粒,必须再通过以蔗糖为介质的速率区带离心才能彻底分离。速率离心是根据所分离物质的分子量之间的差异,在密度梯度介质中的沉降速度不同,使混合物达到分离。经速率离心后, HBsAg 密集在蔗糖浓度为45 %( d =1. 14 - 1. 16) 区间内,与高密度脂蛋白和Dane 颗粒达到完全分离。 第3 步是表面抗原的灭活,在此过程中,HB2sAg 经胃酶消化后通过洗涤浓缩,将残存的微量杂蛋白彻底去除。HBsAg 通过盐析粗提,超速离心精提和灭活处理后,电镜下观察均为形态一致的22 nm 表面抗原颗粒。电泳分析, 纯度可达98 %以上。为血源乙肝疫苗的规模化生产奠定了工艺基础。乙肝疫苗的大规模生产中,各纯化工艺之间的衔接和转化过程,都需要对大量样品进行脱盐、脱糖和浓缩。在此,超滤技术发挥了重要的作用。根据乙肝表面抗原的分子量,采用截流分子量为100 ku 的中空纤维超滤柱,在对HBsAg 进行脱糖、洗涤、浓缩的同时,将一部分小于截留分子量的非目的蛋白去除,有利于抗原的进一步纯化。因此,在超滤浓缩过程中,选择不同截流分子量的滤膜也能起到一定的纯化作用。 2 乙肝疫苗产业发展现状 2. 1 我国疫苗流通领域的开放和计划免疫范围的扩大,加强计划疫苗需求,激活有价疫苗市场 2005 年6 月,我国开始实施《疫苗流通和预防接种管理条例》,对疫苗实行分类管。该条
乙肝疫苗 乙肝疫苗是用于预防乙肝的特殊药物。疫苗接种后，可刺激免疫系统产生保护性抗体，这种抗体存在于人的体液之中，乙肝病毒一旦出现，抗体会立即作用，将其清除，阻止感染，并不会伤害肝脏，从而使人体具有了预防乙肝的免疫力，从而达到预防乙肝感染的目的。接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染的最有效方法。药品名称乙肝疫苗 外文名称hepatitis B vaccine 主要适用症预防乙肝感染 用法用量肌肉注射 不良反应注射部位可能有红肿，疼痛，发热等反应 主要用药禁忌乙肝、麻疹疫苗不可同时 乙肝疫苗分为血源乙肝疫苗及基因重组（转基因）乙肝疫苗两种，其中基因重组(转基因)乙肝疫苗又可分为哺乳动物表达的疫苗和转基因酵母疫苗，乙肝血源疫苗系统由无症状HBsAg携带者血浆提取的HBsAg，经纯化，灭活及添加佐剂氧化铝制成。目前我国多采用基因重组（转基因）乙肝疫苗。 基因重组乙肝疫苗是利用转基因技术，构建含有乙肝病毒HBsAg基因的重组质粒，转入酵母（啤酒酵母.毕赤酵母或汉逊酵母）或重组中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达的乙型肝炎表面抗原，在繁殖过程中产生于未糖基化的HBsAg多肽，经破碎酵母菌体，颗粒形未糖基化的HBsAg多肽释放，经纯化，灭活，加氢氧化铝后制成。 治疗性乙肝疫苗
治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品。 乙肝疫苗 治疗性乙肝疫苗可分为蛋白疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗。治疗性乙肝疫苗其不同于预防性乙肝疫苗的地方在于它可克服机体的免疫耐受，提高机体的特异性免疫反应，对乙肝起到治疗作用。 研究已经表明，治疗性乙型肝炎疫苗效地产生特异性体液免疫和细胞免疫效应。因此，治疗性疫苗以打破免疫耐受、重建免疫应答，激发慢性乙肝患者体内产生中和抗体和以CTL应答为主的细胞免疫应答，从而达到清除肝细胞内病毒的目的。 治疗性乙肝疫苗的问世将为治疗慢性乙肝提供了新的手段，带来了希望和憧憬。但治疗性乙肝疫苗尚在研究之中，结构的改变、疫苗的稳定性、佐剂的选择、乙肝病人的个体差异、乙肝病毒的突变、疫苗的剂量、远期疗效、毒副作用等问题的解决尚有待时日，因此治疗性疫苗还不可能马上投入临床使用。治疗性乙肝疫苗的研发还需要进行长期的研究和临床试验观察，即使治疗性乙肝疫苗问世后，疫苗疗法也不能取代药物治疗，最后很有可能形成一种综合疗法。 国家食品药品监督管理局SFDA批准进行临床试验的有且只有以下4种： ①高剂量乙型肝炎疫苗60μg/1.0ml），估计二期B（IIb期）临床试验已完成，现进度未明； ②抗原抗体复合物治疗性乙型肝炎疫苗（乙克60μg/1.0ml），三期临床试验开展中；
基因工程方法生产乙肝 疫苗 The manuscript was revised on the evening of 2021
重组乙肝疫苗的研制生产过程、理化性质、生物学活性、临床应用 国际上先后研制出了第一代血源性乙肝疫苗和第二代基因工程乙肝疫苗。第一代乙肝疫苗主要运用乙肝病毒携带者血清中提取纯化出的的乙肝病毒表面抗原，先后经过减毒处理和添加佐剂后注入人体预防接种。但是由于对血源性疫苗安全性存在顾虑，人们进一步着手开发第二代乙肝疫苗，也就是基因重组疫苗。 第一步是分离目的基因，获得目的DNA片段的方法主要有两种，一是直接从细胞基因组中分离，二是人工合成。 第二步是将DNA片段和载体在体外连接重组，成为重组DNA分子，多采用连接酶的方法连接。 第三步是基因克隆，即将重组体DNA分子，引进合适的宿主细胞(大肠杆菌、酵母)中增殖。根据所用载体的不同，可选用转化(以质粒作载体时，重组体DNA分子以此种方式进入感受态的宿主细胞，以获得转化子菌落)、转染(λ噬菌体作载体时，构成的重组体DNA分子，以此种方式进入宿主细胞，可转染得到噬菌斑)、转导(λ噬菌体DNA与外源DNA组成的重组体DNA分子，与噬菌体蛋白组装成具有感染力的噬菌体颗粒，即人工包装的噬菌体颗粒，引入宿主细胞)的方法，往宿主细胞引入重组体DNA分子。 第四步是目的基因克隆的筛选与鉴定，即从大量携带重组体DNA分子的细胞中分离出带目的基因的细胞。因为不是所有的细胞都能获得重组体
DNA分子，为了获得摄取了重组体DNA分子细胞，需经筛选，才能将其与未摄取重组体DNA分子的细胞区别开来，并作进一步鉴定。筛选含有重组体DNA分子细胞的方法，一般都是以载体DNA及目的基因的遗传标记及分子特征为依据，并结合受体细胞的基因表型而建立起来的。由于许多质粒都具有抗生素等药物的抗性标记，因此，在含有一定浓度抗生素的选择培养基上，可以很容易地把摄取了重组体DNA分子，因同时也获得了抗生素抗性的细胞辨认出来。但药物筛选只是一个方面，依据它只能判断质粒载体是否进入了受体细胞，还不能确定受体细胞是否摄取了含有目的基因的重组体DNA分子。 对于重组体DNA分子的鉴别，通常是在抽提出重组质粒DNA后，用凝胶电泳法或电镜观察其分子大小，用限制酶酶解，观察其酶切图谱进行。还可采用菌落原位杂交法来进行鉴定，即将菌落从最初生长的平板上转移到硝酸纤维素滤膜上，用碱裂解滤膜上的菌落，使DNA分子游离，变性，并固定在滤膜上，随即用同位素标记的与目的基因互补的DNA或RNA探针杂交，最后通过滤膜的放射自显影鉴定菌落，并从最初生长的平皿上挑选出放射自显影呈阳性的菌落。 第五步是基因表达，这是指宿主细胞在大量繁殖过程中外源DNA在宿主细胞中的转录和翻译，表达生成的产物(蛋白质)，最好在细胞内不被分解，而分泌到细胞外面。表达产物若为较小的多肽，或是对细菌蛋白酶极为敏感的蛋白质，形成后，通常即被迅速降解。为了保证外源基因表达产物能分泌到细胞外而不被降解，通常可以把外源基因插入在载体的某些结构基因
基因工程乙肝疫苗 【摘要】基因工程乙型肝炎（乙肝）疫苗是人类同乙肝斗争的产物，是现代生物技术的重大成果。它优质、安全、高效，可避免因乙肝导致的对人类健康的危害和巨大的经济损失。基因工程乙肝疫苗（酵母重组）在我国乃至世界的乙肝计划免疫中日益发挥着重要作用，成为控制乙肝流行的主要疫苗 【关键字】基因工程乙肝疫苗血缘乙肝疫苗 一、乙肝疫苗病理 目前使用的商售乙肝疫苗的一些明显的缺点是抗体应答较迟，一部分接种者不产生应答或应答较低。一般情况下，有10%的成人不产生应答，另有5%～10%的接种者抗HBs水平低于100mIU/ml，HB疫苗低应答与许多因素相关，如年龄较大、吸烟、营养不良、肥胖、肾功能衰竭或免疫抑制者，特别是受主要组织相容性复合物（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）和T细胞受体等因素的影响，如何提高疫苗的应答水平是当今HB疫苗研究的热点。有学者认为无应答和低应答者实际上是迟缓应答而已，通过增加剂量可能会促使抗体的产生，但尚待进一步研究验证。由于现在使用的疫苗中未包含病毒变异株的基因，故有必要进行进一步的研究，在未来疫苗的配方中应尽可能包含这类病毒株，提高应答率。 二、基因工程乙肝疫苗取代血源乙肝疫苗已成定局： 基因工程乙肝疫苗较之于血液乙肝疫苗主要区别之一在于它生产来源不同。它有着许多血源乙肝疫苗不可比拟的优势。 自1985年以来，我国一直采用接种血源乙肝疫苗预防乙肝，血源乙肝疫苗对控制我国乙肝大面积流行曾起了很大作用，但是，由于血源乙肝疫苗需用乙肝病毒表面抗原携带者的血浆为原料，它具有一些自身无法克服的缺点： 其一，乙肝表面抗原携带者由于已感染乙肝病毒，在此情况下，再抽取其血浆作为乙肝疫苗原料，对携带者的身体健康有损害； 其二，疫苗的生产受到乙肝病毒表面抗原携带者血浆来源和质量限制，无法大规模稳定生产； 其三，在表面抗原阳性血浆的采集、运输和加工过程中，存在着引发血源性传染病流行的可能性； 其四，在血源乙肝疫苗的生产过程中，虽采用三步灭活工艺，但三步灭活不足以将血源中所有已知和未知的潜在致病因子全部灭活，难以最大限度地保证血源乙肝疫苗受种者绝对安全； 三、基因工程乙肝疫苗（酵母重组）的产量、生产工艺和质量控制