生物化学实验报告
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生物化学与分子生物学实验教学中心
【实验报告第一部分（预习报告内容）：①实验原理、②实验材料（包括实验样品、主要试剂、主要仪器与器材）、③实验步骤（包括实验流程、操作步骤和注意事项）；评分（满分30分）：XX】
实验目的：1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法
2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法
3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法
4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法
5、了解柱层析技术
实验原理：1、蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。
2、不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别，
可分离纯化各种蛋白质。
3、盐析法：盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可
使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。蛋白质溶液中加入中性盐后，由
于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃
至消失。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷
大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。
4、离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆
的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。
5、醋酸纤维素薄膜电泳原理：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。
它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中
各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电
泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α
2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。
实验材料：人混合血清葡聚糖凝胶（G-25)层析柱
DEAE纤维离子交换层析柱饱和硫酸铵溶液
醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸
1%BaCl
溶液氨基黑染色液
2
漂洗液 pH8.6巴比妥缓冲溶液
电泳仪、电泳槽
实验流程：盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）
实验步骤：
（一）盐析+凝胶柱层析除盐：
（二）离子交换层析（纯化）：
（三）醋酸纤维素薄膜电泳：
1、点样（如下图）：
-
点样线尽量点得细窄而均匀,宁少勿多
2、电泳：
①薄膜粗面向下
②点样端臵阴极端
③两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平
电压：110V
时间：50min
3、染色和漂洗：
电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。
取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。
取出膜，用滤纸吸干即可。
注意事项：
1、所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。
2、使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。
3、上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦
应如此。
4、洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并注意层析柱不要流干，进入
空气。
5、切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO
42-的BaCl
2
混淆，因二者与相应物质生成的沉
淀均为白色。
6、葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!
1.5cm
【实验报告第二部分（实验记录）：①主要实验条件（如材料的来源、质量；试剂的规格、用量、浓度；实验时间、操作要点中的技巧、失误等，以便总结实验时进行核对和作为查找成败原因的参考依据）；②实验中观察到的现象（如加入试剂后溶液颜色的变化）；③原始实验数据。评分（满分20分）：XX】
主要实验条件：
1、0.3mol/LpH6.5醋酸铵（NH
4AC）缓冲液：称取NH
4
AC 23.12g，加蒸馏水800ml溶解，滴入稀
氨水或稀醋酸液（注意混合均匀），调节pH至6.5后，补加蒸馏水至1000ml。
2、0.06mol/LpH6.5 NH
4
AC缓冲液：取上液用蒸馏水做5倍稀释。
3、0.02mol/LpH6.5 NH
4
AC缓冲液：取上液用蒸馏水做3倍稀释。
4、1.5mol/L NaCl-0.3mol/L NH
4AC溶液：称取NaCl87.7g溶于0.3mol/LpH6.5 NH
4
AC溶液中至
1000ml。
5、饱和硫酸铵溶液：称取固体(NH
4)
2
SO
4
850g加入1000ml蒸馏水中，在70-80℃下搅拌促溶，
室温中放臵过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸溶液。
实验现象：
饱和硫酸铵加入到血清后有沉淀生成，沉淀呈米黄色，上清液呈淡黄色。
原始实验数据：
将3条经染色的醋酸纤维素薄膜并列，使点样线位于同一水平，以正常血清蛋白图谱为对照，观察提纯的物质属哪种蛋白。所得的照片如下图：
血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱
【实验报告第三部分（结果与讨论）：①结果（定量实验包括计算）：应把所得的实验结果（如观察现象）和数据进行整理、归纳、分析、对比，尽量用图表的形式概括实验的结果；②讨论：不应是实验结果的重述，而是以结果为基础的逻辑推论。③结论：简单扼要，说明本次实验所获得的结果。（包括思考题）。评分（满分45分）：
XX】
结果：从电泳图谱中可以看出，清蛋白第一管和清蛋白第二管的蛋白质与血清的清蛋白电泳图谱几乎一致，可以确定管内的蛋白质为清蛋白，同理球蛋白管内的蛋白质为γ-球蛋白。讨论：清蛋白第1、2管均含有少量杂质，γ-球蛋白管中的γ-球蛋白纯度较低，导致最终的电泳图谱与血清的电泳图谱有略微偏差。
结论：本次试验所获得的结果基本与预期试验结果相一致。
思考题：
1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?
答：因为清蛋白和球蛋白的盐析浓度不一样，使用半饱和硫酸铵溶液可以使球蛋白沉淀而清蛋白不沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。
2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?
答：因为缓冲液都一样并且分离球蛋白后DEAE纤维素柱的成分没有发生改变，可以继续用于纯化清蛋白。
3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?
答：根据各自的电泳图谱与正常血清蛋白图谱作对照来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白。判定它们纯度的依据是染色后颜色的深浅，深的说明纯度高，浅的说明纯度低。
血清Western Blot去除白蛋白(Albumin) 应用Western Blotting的方法检测血清中某种蛋白的含量是,最关键的问题是要将血清做怎样的电泳前处理. 一般的处理方式: 1.常规分离血清,即取血后常温放置,使其凝固,然后3000 rpm 15 min离心,取上清即可。 2.测血清蛋白浓度。 3.用Laemmli buffer（蛋白裂解液）稀释至所需浓度，我一般为5ug/ul. 4.加入适量loading buffer，100℃煮5分钟。注意：有时会出现水煮后，蛋白液变得 非常粘稠，这时可以在65℃煮10-20 minutes以替代沸水煮。 PS：对于目标蛋白在血清中含量很低，或者目标蛋白分子量与白蛋白或球蛋白分子量相近的情况下，必烦要去除血清中的白蛋白和/或球蛋白，以下是知名厂商 G-Biosciences提供的试剂盒，使用较为简便，同时价格也不贵哦。 美国G-Biosciences-AlbuminOUT?白蛋白去除试剂盒 血浆和脑脊髓液等样本中，包含大量的白蛋白，从而封闭掉在二维凝胶电泳中发现和鉴定其他低丰度蛋白的可能。AlbuminOUT?白蛋白去除试剂盒被设计用来在这种样本中大量去除白蛋白。 这种白蛋白去除方法是基于白蛋白和Cibachron蓝色染料的结合。AlbuminOUT?被优化从样本中去除人的白蛋白。AlbuminOUT?使用快速离心柱方法，每个柱子含有0.2ml的染料结合树脂，从而可以结合大于2mg的人白蛋白。AlbuminOUT?可以从5-50微升人血浆中去除大于98%的白蛋白。 离心柱形式可以在10分钟内去除白蛋白。高结合力的蓝色染料结合树脂可以从人，猪，羊，狗，兔，大鼠和牛样本中达到瞬间的结合和去除白蛋白。AlbuminOUT?或许也可以从其他物种中去除白蛋白。适用于处理25或50个样本。 Figure 1: 2D analysis of whole human serum before (left) and after (right) treatment with AlbminOUT?. 产品特点： ●从样本中不到10分钟的时间内去除白蛋白 ●基于白蛋白和Cibachron蓝色染料的结合 ●每个柱子的结合力大于2mg的人白蛋白 ●从5-50微升人血浆中去除大于98%的白蛋白
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： （一）材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法 这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法 生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法 使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法 如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 （二）蛋白质的抽提 通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 （四）样品的进一步分离纯化
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定 一、实验目的 1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法； 2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法； 3.了解柱层析技术。 二、实验原理 血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。 本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。 1．盐析 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重 金属盐法以及生物碱试剂法等。盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH ４) ２ SO4)等对蛋 白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。 2．脱盐
盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。 3.纯化（离子交换层析） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。 本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。 4.纯度鉴定（电泳） 血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法：以流程图示意 1.实验材料 人血清、葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴 定实验报告 生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称实验日期合作者评分 XX 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验地点指导老师教师签名李某某批改日期 20XX-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出 现多行、多页空白现象。一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定
因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动。 所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。 3、纯化 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯于鉴定 一、实验目的： 1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2、掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3、掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5、了解柱层析技术 二、实验原理： 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。对于不同的蛋白质，其分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用不同蛋白质在这些性质上的差别，利用相应的物理方法可分离纯化不同蛋白质。 A.盐析法：在蛋白质溶液中加入大量中性无机盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。同时，加盐后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，从而破坏了蛋白质的胶体性质，导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间易于聚集沉淀，进而使蛋白质从水溶液中沉淀析出。 B.凝胶层析：利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadeG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒网孔，而分子量小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔中，因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而达到去盐的目的。 C.离子交换层析:离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 D.纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳）：血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低
于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此电泳时可将它们分离为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。 三、材料与方法 A材料 样品：人混合血清 试剂：葡聚糖凝胶（G-25)层析柱、DEAE纤维离子交换层析柱、饱和硫酸铵溶液、醋酸铵缓冲溶液、20%磺基水杨酸、1%BaCl 溶液、氨基黑染色液、漂洗液、pH8.6巴比妥缓 2 冲溶液、电泳仪、电泳槽 B实验步骤 盐析（粗分离）→葡聚糖凝胶层析（脱盐）→DEAE纤维素离子交换层析（纯化）→醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定） 具体操作流程示意：
BSA牛血清白蛋白 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLA TED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLA TED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率
蛋白质的表达、分离、纯化和鉴定 来源：易生物实验浏览次数：2704网友评论0 条第一部分蛋白质的表达、分离、纯化克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作 结构与功能的研究。 第二部分蛋白质的鉴定电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷，大小，性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。 关键词：蛋白质蛋白质表达克隆基因聚丙烯酰胺凝胶电泳氯霉素酰基转移酶十二烷基硫酸钠SDS聚丙烯酰 胺凝胶 第一部分蛋白质的表达、分离、纯化 目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MC AC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材
一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH 8.0 [6] IPTG 易生物仪器库：.ebioe./yp/product-list-42.html 易生物试剂库：.ebioe./yp/product-list-43.html 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h.
实验十蛋白质的表达、分离纯化和鉴定 第一部分蛋白质的表达、分离纯化 目的要求 （1）了解重组蛋白表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离纯化对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，在37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni2+）亲和层析介质加以分离纯化，称为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL。 [2] 氨苄青霉素：100mg/mL。 [3] 上样缓冲液(GLB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 1 mM β-巯基乙醇, pH8.0。 [4] 清洗缓冲液(UWB)：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3。 [5] 洗脱液缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8M Urea, 500 mM 咪唑, pH8.0。 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1 10 cm），蠕动泵 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL
血清清蛋白及γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 目的要求 1．1．熟悉蛋白质分离纯化的总体思路。 2．2．掌握盐析、离心、层析、浓缩、电泳等技术在蛋白质分离纯化中的综合作用。 3．3．学会设计和制定分离纯化蛋白质的方法。 实验原理 血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。 首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度硫酸铵溶液溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。 用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。常用的方法有透析法、凝胶层析法等。本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。清蛋白、α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。其反应式如下：用上述
蛋白质的提取与纯化 一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等
中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
血清白蛋白ALB测定 1 检验目的 指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。 2 实验原理 在pH值4.2时，白蛋白和溴甲酚绿染料结合产生蓝绿色复合物，在630nm处比色，颜色的深度与白蛋白浓度成正比。 pH4.2 白蛋白+溴甲酚绿--------------绿色化合物 3 标本采集 3.1 病人准备:应禁食抽血. 3.2 类型：血清 3.3 标本存放：留取标本后请尽快分离血清。在室温条件下（15～25℃）可以稳定一周，在冰箱保存的条件下（2～8℃）稳定一个月，-20℃保存至少可以稳定3个月。 3.4 标本运输：室温条件下运输
3.5 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。 4 实验材料 4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALB试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成 溴甲酚绿 0.35mmol/L 丁二酸缓冲液 50 mmol/L 4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。 4.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂避光保存于2～25℃，若无污染，可稳定至失效期。试剂有效期为18个月。 4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。 4.1.5 注意事项：避免试剂与皮肤及粘膜接触。 4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的ALB校准品对自动分析仪进行校准。 4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。 5 仪器
AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪 6 操作步骤 6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。 6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。 6.3 项目基本参数：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪项目测定参数。 6.4仪器操作步骤：参见生化检验AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪操作规程。 7 质量控制 在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出现多行、多页空白现象。 一、实验目的 1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。 二、实验原理 1、粗提（盐析法）： 蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐（凝胶层析法） 凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，
所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。 3、纯化（离子交换层析法） 离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。 脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳） 采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。 三、材料与方法：以流程图示意 材料： 1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生） 2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L 的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。 3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。
蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法 一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量
血清蛋白的分类与特征（以区带电泳为主要技术分类） 一、白蛋白（albumin,Alb）由肝实质细胞合成，分子量6.64万，等电4～5.8，半寿期（15～19天，占血浆总蛋白的40%～60。血浆白蛋白浓度可以受饮食中蛋白质摄入的影响，在一定程度上可以作为个体营养状态的评价指标，有较广泛的载体功能。正常参考值：35～50g/L。血浆白蛋白增高较少见，在严重失水时，对监测血浓缩有诊断意义。低白蛋白血症，可见于以下几种原因：（1）白蛋白合成减低：常见于急性或慢性肝病。（2）由于营养不良或吸收不良。（3）遗传性缺陷：无白蛋白血症。（4）组织损伤（外科手术或创伤）或炎症（感染性疾病）引起的白蛋白分解增加。（5）白蛋白异常丢失：如肾病综合征、慢性肾小球肾炎、糖尿病、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、肿瘤、烧伤所致渗出性皮炎。（6）白蛋白分布异常：如门脉高压时，大量蛋白质从血管内渗入腹腔。 目前已发现20种以上白蛋白的遗传性变异，这些个体可以不表现病症，在电泳分析时其白蛋白区带可以出现1条或2条宽带，有人称之为双白蛋白血症。当某些药物大量应用（如青霉素大量注射使血浓度增高时）而与白蛋白结合时，也可使白蛋白出现异常区带。 二、α1区带球蛋白 1、α1-抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin,α1AT或AAT）是具有蛋白酶抑制作用的一种急性时相反应蛋白，分子量为5.5万，等电点4.8，半寿期4天，电泳中位与α1区带，是这一区带的主要组分。正常参考值：成人780～2000mg/L、新生儿1450～2700mg/L。低血浆AAT可以发现于胎儿呼吸窘迫综合症，AAT先天缺陷易导致肺气肿和肝硬化。 2、α1-酸性糖蛋白（α1-acid glycoprotein,AAG）早期称之为乳清类粘蛋白，分子量4万，等电点2.7～3.5，半寿期5天，电泳位于α1区带，成人正常参考值：500～1500mg/L。AAG是主要的急性时相反应蛋白，在急性炎症时增高，在风湿病、恶性肿瘤及心肌梗死患者亦常增高，在营养不良、严重肝损害等情况下降低。 3、α1-脂蛋白分子量20万，成人参考值1700～3250mg/L。在严重肝病如肝硬化时明显降低，妊娠及高雌激素血症时可轻度增加。 4、甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP或AFP）主要在胎儿肝脏中合成，分子量6.9万，电泳位于α1区带，成人参考值：0.03mg/L(<30)。在成人AFP可以在大约80%的肝癌患者血清中升高，在生殖细胞肿瘤出现AFP阳性率为50%，在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出现不同程度的升高。 三、α2区带球蛋白 1、结合珠蛋白（haptoglobin,HP）在血浆中与游离的血红蛋白结合，，是一种急性时相反应蛋白，分子量8.5～40万，等电点4.1，半寿期2天，电泳位于α2区带。正常参考值范围较宽为300～2150mg/L。急性时相反应中血浆HP增加，当烧伤和肾病综合症引起大量白蛋白丢失的情况下亦可见增加。血管内溶血和溶血性贫血、输血反应、谑疾时HP含量明显下降。此外，严重肝病患者HP的合成降低。 2、 2-巨球蛋白（α2-macroglobulin,α2MG或AMG）是血浆中分子量最大的 蛋白质，是由肝细胞与单核吞噬细胞系统中合成，分子量为62.5～80万，等电点5.4，半寿期5天，但当与蛋白水解酶结合为复合物后其清除率加速。成人参考值：1250～4100mg/L。在低蛋白血症时α2MG含量可增高，可能系一种代偿机制以保持血浆胶体渗透压。妊娠气及口服避孕药时血浓度增高，机制不明。 3、铜蓝蛋白（ceruloplasmin,CER）是一种含铜的α2糖蛋白，分子量12～16万，等电点4.4，半寿期4.5天，成人参考值：200～500mg/L。CER也属于一种急性时相反应蛋白。在感染、创伤和肿瘤时血浆CER增加，在营养不良、严重肝病及肾病综合症时（CER往往下降。妊娠期、口服避孕药时其含量有明显增加。该蛋白最特殊作用在于协助Wilson病的诊断，既患者血浆CER 含量明显下降，而拌有血浆可透析的铜含量增加。
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 北京蛋白质组研究中心 地址 102206 北京市海淀区中关村生命科 学园生命园路38号 (72)发明人 钱小红 张养军 余谦 张普民 高方圆 焦丰龙 夏朝双 张汉卿 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分 离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转 基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利 用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先 用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用 反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结 果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出 高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清 白蛋白用于临床用药和生化研究中。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28 C N 109810185 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109810185 A 1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括： 1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液； 2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液； 3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得； 具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L； 所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液； 具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃； 所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃； 所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至 5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L； 所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同； 所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％； 所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h； 所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水； 所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl； 所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检 2
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验 一、实验内容 将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二纳/磷酸二氢纳缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度； 将粗提液通过Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离，分部收集流出物，得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度； 将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS—PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。 二、实验过程： 1.蛋白质粗提液制备 溶液配制：0.1mol/L pH7.4 磷酸缓冲液 （1）1000ml 0.1mol/L磷酸氢二纳；磷酸氢二纳溶于800mL蒸馏水中，定容至1L； （2）250mL 2.蛋白质浓度测定 （1）溶液配制 1mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）标准溶液：5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL，滤纸过滤，避光保存。 （2）0~100ug/mL标准曲线测定： 取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2mL 蛋白质浓度 0 20 40 60 80 100 μg/ml 1mg/mL BSA溶 0 40 80 120 160 200 液（μl） 蒸馏水（μl）2000 1960 1920 1880 1840 1800 总体积（μl）2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500uL蛋白质溶液与2.5mL 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。以OD595值（3次重复的平均值）为X，蛋白浓度为Y做直线，得出标准曲线Y=aX+b，R=？。 （3）测定粗提液蛋白浓度，将粗提液用蒸馏水稀释100倍（2mL），取稀释液500uL与2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，以500uL 蒸馏水+2.5mL考马斯亮蓝G250溶液混匀作为空白对照，3次重复测定，用平均值计算其浓度。 3、Sephadex G-25凝胶层析柱进行分离 （1）凝胶溶胀：将固体凝胶在一定量的沸水浴中溶胀5h，溶胀后倾去上清液，加入一定量的蒸馏水搅拌，静置使凝胶下沉，倾去上清液，直至无细小颗粒为止。 （2）装柱：蒸馏水冲洗柱子，留少量蒸馏水，打开活塞，将悬浮于水中的凝胶连续灌入柱中，直至凝胶沉淀至柱的4/5体积处。
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫