文稿编号：20120016 神经胶质瘤Ki67，PTEN和survivin表达的临床研究
贾云峰1，韦玮1，胡国良1，董永军1，马剑1，李健1，赵振伟2
(1. 延安大学附属医院神经外科，陕西延安716000；2. 第四军医大学唐都医院神经外科，陕西西安710038)
摘要目的:研究在神经胶质瘤组织中表达Ki67基因、张力蛋白同源基因(PTEN)和存活素(s urvivin)表达及其临床意义。方法:收集神经胶质瘤组织44例和神经胶质瘤旁正常脑组织11例，采用免疫组织化学方法检测Ki67，PTEN和survivin的表达，并分析它们的表达与神经胶质瘤患者性别、临床分级、肿瘤部位和Kernohan 分类之间关系。结果: 神经胶质瘤44例中，术后临床改善22例，较术前加重4例，无明显变化18例。在正常脑组织中，Ki67和survivin表达均为阴性，PTEN表达均为阳性。在神经胶质瘤中，Ki67，PTEN和survivin的阳性表达率分别为45.5%(20/44)，63.3%(28/44)和56.8%(25/44)，PTEN表达明显降低(P＜0.05)，Ki67(P＜0.01)和survivin (P＜0.01)表达明显增高，与对照组比较差异有统计学意义。神经胶质瘤中，Ki67，PTEN和survivin 阳性表达与性别、临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类均无统计学差异(P>0.05)，但Ki67阳性表达与survivin (r=－0.398，P＜0.05)和PTEN阳性表达(r=－0.388，P＜0.05)呈负相关。结论:在神经胶质瘤组织中PTEN的阳性表达率显著降低，而Ki67和survivin阳性表达率显著高于正常脑组织。提示测定Ki67，PTEN和survivin 表达对研究神经胶质瘤的发生发展有一定参考价值。
关键词：神经胶质瘤；凋亡抑制蛋白类；Ki67基因；张力蛋白同源基因(PTEN)；生存素(survivin)
中国图书分类号：R739.7 文献标识码：A
The clinical analysis of Ki67, PTEN and survivin expressions in glioma tissue
JIA Yun-feng1, WEI Wei1, HU Guo-liang1, DONG Yong-jun1, MA Jian1, LI Jian1, ZHAO Zhen-wei2
(1. Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Yan’an University, Yan'an 716000; 2. Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital of the Fourth Military Medical University, Xi’an 710038, China)
Abstract Objective: To study the expressions of Ki67, PTEN and survivin in glioma tissue and discuss their clinical significance. Methods: The expressions of Ki67, PTEN and survivin were detected by immunohistochemistry in 44 cases of glioma slice and 11 normal brain tissues, and their relation with gender, clinical classification, tumor location, and Kernohan classification in patients with glioma. Results: Of 44 cases of glioma, there was postoperative clinical improvement in 22 cases, compared with the preoperative increase in 4 cases, no significant changes in 18 cases. The expressions of Ki67 and survivin were negative, and that of PTEN was positive in all normal brain tissues. In the glioma tissue, positive expression rates of Ki67, PTEN and Survivin were 45.5% (20/44), 63.3% (28/44) and 56.8% (25/44), respectively. PTEN expression was significantly reduced (P<0.05), Ki67 (P<0.01) and survivin (P<0.01) expressions were significantly increased, the control group with statistically significant difference, and Ki-67 expression and survivin (r =- 0.398, P<0.05), and PTEN expression (r =- 0.388, P<0.05) were negative correlation. In gliomas, Ki67, PTEN and survivin expression and sex, clinical
grade, tumor location and Kernohan classification were not statistically different (P> 0.05). Conclusion: In glioma tussius, positive expression of PTEN was significantly reduced, and the expressions of Ki67 and survivin were significantly higher than that in the normal brain tissue. The expressions of Ki67, PTEN and survivin have important value in the development of glioma.
Keywords: glioma; apoptosis inhibitory proteins; Ki67; PTEN; survivin
神经胶质瘤(glioma)是最常见的脑恶性肿瘤，已证实危险因素除基因外，可能与暴露大剂量电离射线有关，但确切的发病机制仍不清楚[1-3]。由于神经胶质的广泛浸润特性，多影响重要的脑功能区域，故严重影响患者的生活质量和生命安全，预后往往不佳。国内外流行病学调查表明，神经胶质瘤了病率是相当高的，其5年生存率因种类不同差别较大，在15%-80%[2,3]。1995年以来，国内有3307篇研究神经胶质瘤的文章，手术治疗正在发生巨大的变化，胶质瘤手术目的不仅是更广泛的肿瘤切除术，更是最大限度保证安全、延长总生存期和提高生活质量，以及良好的术后神经功能状态[1,3-5]。
Ki67基因是一种与增殖细胞相关的核抗原，它可作为细胞增殖状态和鉴别肿瘤良恶性或判断肿瘤侵蚀力的标志[6,7]。10q丢失的张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten, PTEN)是一种抑癌基因，其中文名为人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因，位于10q23.3，转录产物为515kb mRNA[7-9]。PTEN是迄今为止发现的第1个具有双特异性磷酸酶(dual specificity phosphatase，DPS)活性的抑癌基因，在细胞生长、凋亡、粘附、迁移、浸润等方面具有重要作用，是肿瘤预后的评价指标之一，在细胞凋亡、细胞周期阻滞、细胞迁移过程起关键作用，已证实在多数肿瘤中有该基因的改变[9-11]。生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族成员，大多数正常组织survivin基因表达很低，甚至根本不表达。而在肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌等绝大多数肿瘤细胞中survivin均有表达[12-14]。
为在神经胶质瘤组织中研究Ki67、PTEN和survivin的表达，我们采用免疫组织化学方法，联合检测它们在神经胶质瘤中表达，同时分析它们的表达与神经胶质瘤患者性别、临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类之间关系。。
1 资料与方法
1.1 一般资料回顾性分析延安大学附属医院神经外科2005-01~2010-12年存档的经病理确诊为神经胶质瘤病理标本44例，男性28例，女性16例，年龄36~59(46.3±1
2.9)岁。病历记录中，患者均具有典型的临床症状，如持续头痛、癫痫发作、恶心、呕吐、认知障碍和性格改变。在Gd-enhanced MRI扫描下可见T1低信号，FLAIR、T2和质子密度加权像上呈高信号；CT上显示低密度区、肿瘤周围水肿并有钙化阴影，增强后部分肿瘤有强化表现。神经胶质瘤分布包括额叶17例，顶叶14例，颞叶10例和岛叶3例。所有患者均实施全麻后，在CT及MRI影像的指引下开颅，切开硬脑膜，于显微镜下放大手术野10~15倍后进行显微外科手术，手术切除标本送病理组织学检查。另取我院神经胶质瘤旁正常脑组织标本11例作为对照，男性7例，女性4例，年龄33~56
(42.8±12.4)岁。研究标本组织均经10%甲醛固定，常规石蜡包埋，每个组织连续切片(厚4 μm)5张，1张HE染色用于复查确认，4张用于免疫组织化学染色。兔抗人Ki67、兔抗人PTEN和兔抗人survivin多克隆抗体，SA1022型试剂盒，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2 方法严格按照SA1022型试剂盒说明书进行操作，采用链酶亲和素一生物素一过氧化物酶复合物(SABC)免疫组织化学方法。Ki67阳性反应为细胞核呈深棕蓝色，颗粒状；PTEN阳性染色为肿瘤细胞膜及细胞质内见黄棕蓝色颗粒；Survivin的阳性染色分别定位于胞质、胞核和胞膜/胞质中，染成棕黄色为阳性。研究的标本染色后于400倍显微镜下观察并进行免疫组化半定量分析[5]：表达强度根据阳性物质着色深浅及阳性细胞的百分比分为4级，对每张切片阳性细胞的阳性强度按无着色(0分)、淡黄色(1分)、棕黄色(2分)和棕褐色(3分)；每张切片随机观察5个高倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞(×400)，共计数500个肿瘤细胞，按照阳性细胞所占百分比计分，染色阳性细胞≤5%为0分，6%~24%为1分，25%~49%为2分，50%~74%为3分，≥75%为4分，最后根据上述2项计分之和再确定结果。上述两者之和≥2分者即为阳性，在阳性中又以分值不同分为：2~3分为弱阳性(+)、4~5分为阳性(++)、6~7分为强阳性(+++)。
1.3 统计学分析采用SPSS 15.0统计软件进行分析。Ki67，PTEN和survivin表达应用Pearson检验，率的比较用χ2检验，与性别、临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类等因素的关系分析用Fisher精确概率法检验，相关性分析采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 治疗效果和预后术后临床症状改善22例，较术前加重4例，无明显变化18例。病例随访1~60(18.2±15.5)个月。随访存活1年以上、且影像学明显改善27例，最长生存期59个月，术后1年内死亡4例(其中I~Ⅱ级1例，Ⅲ~Ⅳ级3例)，1年内肿瘤复发的13例均再次进行手术治疗。术前有癫痫症状患者术后半年内均给予预防性口服抗癫痫药物，结果达到满意控制效果。治疗效果和预后与患者性别、床分级、肿瘤部位和Kernohan分类，以及Ki67，PTEN和survivin表达阳性与否无相关性(P>0.05)。
2.2 Ki67、PTEN和survivin在神经胶质瘤中的表达在正常脑组织中，Ki67和Survivin表达均为阴性，PTEN 表达均为阳性(弱阳性2例，阳性4例，强阳性5例)。在神经胶质瘤中，Ki67阳性表达20例(弱阳性6例，阳性8例，强阳性6例，45.5%)，表现为细胞核呈深棕蓝色，颗粒状(图1A)；PTEN表达于神经胶质瘤细胞膜或细胞质中(图1B)，表达阳性28例(弱阳性9例，阳性11例，强阳性8例，6
3.6%)；Survivin表达于神经胶质瘤组织中的胞质、胞核或胞膜胞质中，为沉着性棕黄色颗粒(图1C)，表达阳性25例(弱阳性9例，阳性11例，强阳性5例，56.8%)。与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05) 神经胶质瘤组织中PTEN表达阳性率明显降低于(χ2=5.431，P＜0.05)，而Ki67 (χ2 =8.682，P＜0.01)和survivin(χ2 =7.361，P＜0.01)阳性表达明升高。
2.3 Ki67，PTEN和survivin表达相关性分析神经胶质瘤中Ki67，PTEN和survivin阳性表达与性别、临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类见表1。经Pearson检验显示，不同性别之间Ki67，PTEN和survivin表达差异均无统计学意义(P>0.05)。神经胶质瘤中Ki67，PTEN和survivin阳性表达与临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类均无统计学差异(P>0.05)。在神经胶质瘤中，Ki-67阳性表达与survivin (r=－0.398，P＜0.05)和PTEN阳性
表达(r=－0.388，P＜0.05)呈负相关。
3 讨论
我们研究表明，在神经胶质瘤组织中PTEN的阳性表达率显著降低，而Ki67和survivin阳性表达率显著高于正常脑组织。提示Ki67，PTEN和survivin的共同表达与神经胶质瘤的发生发展有一定关系。
Ki67出现在G1后期，于S期和G2期逐渐增高，高峰在M期，当有丝分裂出现后迅速降解消失，与细胞的合成代谢密切相关，它的表达水平可以反映肿瘤细胞是否处于增殖状态[6-9]。研究表明，Ki67抗原在细胞周期发挥重要作用，特别是的与细胞有丝分裂密切相关，但其确切机制尚不清楚[5,7]。Ki67阳性说明癌细胞增殖活跃，阴性或阳性在10%以内表明肿瘤细胞增殖不太活跃。研究表明，Ki67基因在人乳腺癌和肺癌等中均有表达[5,6]。本研究中有近一半的神经胶质瘤组织中表达Ki67，且与PTEN和survivin表达呈负相关，这一结果与既往报道接近[10-12]。
PTEN也是众多肿瘤预后的评价指标，研究其作用机制对肿瘤的诊断及其基因治疗具有重要意义[1-3,13。抑癌基因PTEN是一种多功能蛋白质，具有蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性，能够促进细胞的生长，抑制细胞的不正常分裂和增殖，抵制细胞凋亡作用。PTEN通过负调节AKT/ PKB信号通路，降低细胞内3,4,5 -三磷酸肌醇水平而达到抑制肿瘤功能，因此在大多数癌症突变中呈高表达。PTEN表达的蛋白产物含有酪蛋白磷酸酶的功能区和约175个氨基酸左右的与骨架蛋白tenasin, auxilin同源的区域。PTEN的磷酸酶功能区包括(I/V)-H-C-X-A-G-X-X-R-(S/T)-G模体，后者也存在于酪氨酸和双重特异性磷酸酶(DPS)中，这可能与酪氨酸激酶竞争共同的底物而影响肿瘤发生发展[11,12]。
A: Ki67 B: PTEN C: survivin
图1 神经胶质瘤组织Ki-67、PTEN和survivin阳性表达(SABC ×400)
Survivin基因是细胞凋亡蛋白(IAP)家族成员之一，它的主要作用是对细胞周期进行调节。Survivin参与外源性和内源性细胞凋亡，可能通过直接抑制凋亡终末效应酶caspase-3和caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，或与周期蛋白激酶CDK4, CDK2相互作用阻断凋亡信号转导通路[11]。Survivin 所具有肿瘤特异性基因只表达于肿瘤和胚胎组织中，与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关，但在肿瘤中的调控机制尚不清楚，但survivin在肿瘤中的过度表达常提示预后不良[10-12]。Survivin也可以肺癌等肿瘤中表达，在神经胶质瘤中的表过已有不少研究，具有控制有丝分裂和对抗细胞凋亡的双重作用，在胚胎发育
时期高度表达，对维持内环境稳定和组织分化中也起着重要作用[11,12]。研究表明，survivin在食管、肺、卵巢、中枢神经系统、乳腺、结肠、直肠等多数肿瘤组织中均有很高的表达[10,14]。本研究结果显示，神经胶质瘤患者survivin表达阳性率为56.8%，且与性别、肿瘤部位和Kernohan分类无统计学差异(P＜0.05)，表明用survivin作为神经胶质瘤预后指标有待进一步研究。
神经胶质瘤是内因和外因综合作用的结果，早期诊断和早期手术治疗是关键[1,13]。Ki67，PTEN和survivin 在神经胶质瘤的发生发展过程中所起的作用，以及临床意义还有待进一步研究[1-3,14-16]。今后研究的方向应是寻找神经胶质瘤早期诊断标志物，以达到早期诊断和早期治疗目的。
表1 神经胶质瘤中Ki67，PTEN和survivin阳性表达与临床分级、肿瘤部位和Kernohan分类[n(%)]
参数n Ki67 PTEN Survivin
性别男28 13(46.4) 18(64.3) 15(53.6)
女16 7(43.6) 10(62.4) 10(62.5)
临床分级I~II 12 5(41.2) 8(66.7) 7(58.3)
II~III 15 7(46.7) 9(60.0) 8(53.3)
III~IV 12 6(50.0) 8(66.7) 7(58.3)
IV~V 5 2(40.0) 3(60.0) 3(60.0)
肿瘤部位额叶17 8(47.1) 11(64.7) 10(58.8)
顶叶14 6(42.9) 9(64.3) 8(57.1)
颞叶10 5(50.0) 6(60.0) 5(50.0)
岛叶 3 1(33.3) 2(66.7) 2(66.7)
Kernohan分类星形细胞瘤20 9(45.0) b13(65.0) 12(60.0)
胶质母细胞瘤15 7(46.7) 9(60.0) 8(53.3)
髓母细胞瘤等9 4(44.4) 6(66.7) 5(55.6)
参考文献
[1]刘华亭,杨天明.神经胶质瘤的治疗策略[J].现代生物医学进展,2011,11(5):958-960.
[2] Crocetti E, Trama A, Stiller C, et al. Epidemiology of glial and non-glial brain tumours in Europe[J]. Eur J
Cancer,2012 Jan 6. [Epub ahead of print]
[3] Filippini G. Epidemiology of primary central nervous system tumors[J]. Handb Clin Neurol,2012,104:3-22.
[4] Wu JS, Zhang J, Zhuang DX, et al. Current status of cerebral glioma surgery in China[J]. Chin Med J (Engl),
2011,124(17):2569-2577. PMID: 22040405.
[5] 王行富,张声,陈余朋.大脑胶质瘤病的临床病理学特征:病例报告及文献综述[J].中国现代神经疾病杂志,
2011,11(2):242-248.
[6] Morimoto K, Kim SJ, Tanei T, et al. Stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1-positive breast cancers are
characterized by negative estrogen receptor, positive human epidermal growth factor receptor type 2, and high Ki67 expression[J]. Cancer Sci, 2009, 100(6): 1062-1068.
[7] Kim JS, Jung J, Lee HJ, et al. Differences in immunoreactivities of Ki-67 and doublecortin in the adult
hippocampus in three strains of mice[J]. Acta Histochem, 2009, 111(2):150-156.
[8] Koohdani F, Sasani F, Mohammad K, et al. Comparison of Ki-67 antigen expression and K-ras mutation in lung
tumours induced by urethane in mice[J].Singapore Med J, 2009, 50(7):729-733.
[9] Wilson PF, Nagasawa H, Fitzek MM, et al. G2-phase chromosomal radiosensitivity of primary fibroblasts from
hereditary retinoblastoma family members and some apparently normal controls [J]. Radiat Res, 2010, 173(1): 62-70.
[10]陈宏刚,唐运涛,刘伦波,等.胶质瘤中S100、survivin和Ki-67的表达及其生物学意义[J].局解手术学杂志,
2011, 20(3):287-289.
[11] Su CC, Wang MJ, Chiu TL. The anti-cancer efficacy of curcumin scrutinized through core signaling pathways
in glioblastoma[J]. Int J Mol Med, 2010,26(2):217-224.
[12] Srirangam A, Milani M, Mitra R, et al. The human immunodeficiency virus protease inhibitor ritonavir inhibits
lung cancer cells, in part, by inhibition of survivin [J]. J Thorac Oncol, 2011,6(4):661-670.
[13]王文波,杜贻庆,莫万彬,等.神经胶质瘤手术治疗58例回顾性分析[J].右江医学,2011,39(3):297-299.
[14]Sanai N, Chang S, Berger MS. Low-grade gliomas in adults[J]. J Neurosurg, 2011,115(5):948-965. PubMed
PMID: 22043865.
[15]McBride WH. Integration of adenovirus thymidine kinase suicide-gene therapy with surgery and radiation
therapy for malignant glioma[J]. Future Oncol, 2012,8(1):17-20.
[16] Zhao Y, Chen X, Wang F, et al. Integration of diffusion tensor-based arcuate fasciculus fibre navigation and
intraoperative MRI into glioma surgery[J]. J Clin Neurosci,2012,19(2):255-261.
作者简介：贾云峰(1974-08)，男，汉族，陕西洛川县人，大学本科，副主任医师，神经外科副主任。主要从事神经外科基础与临床研究。电话：0911-*******,手机：138********，E-mail:xuct2001@https://www.doczj.com/doc/3c19152059.html,
地址：(716000)延安市宝塔区北大街43号延安大学附属医院神经外科
通讯作者：赵振伟(1963-07)，男，汉族，辽宁阜新人，博士，主任医师，硕士导师，神经外科副主任。主要从事脑血管病和脑肿瘤的治疗研究。电话：029-********，E-mail:xuct2001@https://www.doczj.com/doc/3c19152059.html,