第四章基因克隆的载体
载体（vector vector））是指能携带外源基因进入宿主细胞的运载工具载工具。。
早期早期：：质粒质粒、、病毒病毒、、噬菌体新增新增：：人工微小染色体人工微小染色体、、
YAC YAC载体载体
作为基因工程的载体作为基因工程的载体，，必须具备以下几个性能必须具备以下几个性能：：
1、具备自主复制的能力；即能独立于染色体而进行自主复制主复制；；
2、具有合适的选择标记，便于重组便于重组DNA DNA DNA分子的检分子的检测；
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因插入插入；；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域，插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增复制和扩增；；
5、具有较好的安全性，不能任意转移不能任意转移，，避免基因非控制性扩增制性扩增。。
第一节质粒质粒（（plasmid ）载体
一、质粒定义与其基本特征二、
质粒的类型三、
质粒的构型质粒的构型（（存在形式存在形式））四、
质粒的命名规则五、
质粒的不亲合性六、
质粒质粒DNA DNA DNA的分离与纯化的分离与纯化七、重要的大肠杆菌质粒载体
一、质粒定义与其基本特征
质粒（plasmid plasmid））是一种独立于染色体外的能自主复制的共价色体外的能自主复制的共价、、闭合环状双链状双链DNA DNA DNA分子分子分子。。
主要存在于细菌中主要存在于细菌中，，在霉菌在霉菌、、酵母及动母及动、、植物细胞中也发现有植物细胞中也发现有。。
大小大小1~200kb 1~200kb ，约103~105kD kD；；
目前用作载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的然质粒经人工适当改造而成的。。
质粒
plasmid））
质粒（（plasmid
筛选。。常有1 ~ 3
1 ~ 3个个抗药性基因，以利于筛选
三、质粒的构型
（存在形式）
L 构型构型：：线性线性DNA DNA （线状双螺旋线状双螺旋））
OC OC构型构型构型：：开环开环DNA DNA （开环双螺旋开环双螺旋））
SC SC构型构型构型：：共价闭合环形共价闭合环形DNA DNA
（cccDNA cccDNA））
L
OC SC 不同构型质粒DNA电泳移动速度比较
四、质粒的命名规则
例：p BR322质粒载体
“p”表示是一种质粒（plasmid）；“BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”，或者是实验室名称缩写；
“322”表示实验编号。
五、质粒的不亲合性
是指在没有选择压力的情况下，，
是指在没有选择压力的情况下两种亲源关系密切的不同质粒，，不两种亲源关系密切的不同质粒
能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象，，也称作不相容性。
共存的现象
彼此不相容的质粒属于同一个不亲合群。
主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。。
间的相互干扰造成的
六、
质粒质粒DNA DNA DNA的分离与纯化的分离与纯化
1、氯化铯密度梯度离心法氯化铯密度梯度离心法；；
2、碱变性法碱变性法；；
3、微量碱变性法微量碱变性法。。
1.氯化铯密度梯度离心法
1、质粒DNA占总DNA的1%～2%；
2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态；
3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA 链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB-DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。
第六讲基因克隆的质粒载体 中国科学院遗传与发育生物学研究所 2017年8月
基因克隆的质粒载体 一、导言 1．质粒是一类引人注目的亚细胞有机体 其结构比病毒还要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。2．质粒的类型多种多样 F质粒：F因子或性质粒(Sex plasmid)，它能够使寄主染色体上的基因与F因子(F factor)一道转移到原先不存在该质粒的 寄主受体细胞中去。 R质粒：通称抗药性因子(Resistant factor, R factor)，编码一种或数种抗菌素抗性基因，并能将此抗性转移到缺乏该质粒 的适宜的受体细胞中去。 Col质粒：所谓Col质粒，即是一种产生大肠杆菌素的因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素可使不带Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死。 3．质粒载体 70年代在实验室构建的一类最普遍使用的基因克隆载体。
二、质粒的一般特性 1．质粒DNA(细菌质粒定义) *1.大肠杆菌的质粒是独立于寄主染色体以外的自主复制的共价、闭合、环形的双链DNA分子(covalently closed circular DNA, cccDNA)。除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所有的质粒都是质粒DNA。但是质粒DNA的复制又必须依赖 于寄主提供核酸酶及蛋白质。 *2.质粒DNA分子大小 文献中有3种说法：小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD *3.质粒DNA与寄主染色体DNA间的关系 一般情况下，质粒DNA可持续地处于寄主染色体外的游离状
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
基因工程课程论文： 基因工程载体的探索 学号：A09120248 姓名：金文杰 班级：生技1203 任课教师：任桂萍
基因工程载体的探索 摘要基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。基因工程载体是基因工程所必需的工具，是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有质粒DNA、病毒DNA、λ噬菌体的衍生物三种主要类型。植物、动物、微生物所用的质粒可能不同，在不同条件下所需的质粒也不同，所选用的质粒按需要选用。在基因操作过程中使用载体有两个用途：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。较常见的几种载体有：质粒pUC19、M13、科斯载体等。 关键词：载体、质粒、λ噬菌体、病毒DNA 一、理想载体要求： 对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求；能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好；容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制，这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点，且每种酶的切位点最好只有一个；容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作；有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才介于克隆操作。 二、常见质粒 1、质粒pUC19最常用的大肠杆菌克隆用质粒pUC19，此质粒的复制起点处序列经过改造，能高频率起动质粒复制，使一个细菌pUC19的拷贝数可达500-700个；质粒携带一个抗氨芐青霉素基因，编码能水解β-内酰胺环，从而被坏氨芐青霉素的酶，当用pUC19转化细菌后放入含氨芐青霉素的培养基中，凡不含pUC19者都不能生长，结果长出的细菌就是都含有pUC19的；pUC19还携带细菌lac操纵元中的lacI和lacZ基因编码，β-半乳糖苷酶N端状146个氨基酸的段落，当培养基中含有诱导物IPTG(isopropyl-thiogalactoside异丙基-硫代半乳糖苷)和Xgal(5-bromo-4- chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)时，lacZ ' 基因被诱导表达产生的β-半乳糖苷酶N端肽与宿主菌表达的C端肽互补而具有β-半乳糖苷酶活性（质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两都融为一体而具酶活性，称为α-互补，α-complementation），半乳糖苷酶水解Xgal而使菌落呈现蓝色；在lacZ '中间又插入了一段人工设计合成的DNA序列，其中密集多个常用的限制性核酸内切酶的位点，使外来的基因和序列能很方便地被插入此位置，当外来序列插入后则破坏了lacZ '编码的半乳糖苷酶活性，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。 根据用途可以对质粒进行改造，例如：根据鼠李糖乳杆菌D- ldhD-乳酸脱氢酶基因序列, 设计扩增同源臂 D1和 D2的引物,扩增同源臂D1的引物为 Lr-d1-H和 Lr-d1-X,扩增同源臂 D2的引物为Lr-d2-E和Lr-d2-A。分析载体pU C19-CM和D-ldh基因的序列,分别在引物Lr-d1-H和Lr-d1-X的5’端添加H ind 和Xho酶切位点;在引物 Lr-d2-E和Lr-d2-A 的5端添加 EcoR和Apa酶切位点。利用这2对引物扩增得到的同源臂分别插入到载体pUC19-CMHind和Xho酶切位点、EcoR和Apa酶切位点中,得到自杀质粒 pUC19-CM-D测序确定序列插入的正确性利用引物 Pkd3-cm-1和 Pkd3-cm-2从质粒pKD3上扩增到氯霉素抗性基因CM, 大小为1200bp。质粒 pUC19和基因CM分别经Pst和Sac内切酶处理后连接, 转入大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴定及测序结果表明基因 CM 正确插入到质粒 pU C19中, 载体 pU C19-CM 构建成功。由同源臂 D1引物 Lr-d1-H和Lr- d1-X扩增长约为180bp左右的基因片段,由同源臂 D2的引物Lr-d2-E和L r-d2-A 扩增出了约237 bp的基因片段。将2个同源臂片段和 pUC19-CM 载体经酶切处理连接后, 转化至大肠杆菌 JM 109中,PCR酶切鉴
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。 克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。 是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。 表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。 表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。 （RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。 由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。 真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan） 克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。 克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2. 载体的分类 按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。 按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）. 克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
基因克隆的质粒载体 在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。 ①F质粒又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。 ②R质粒通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 ③Col质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 第一节质粒的一般生物学特性一．质粒DNA 细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。 质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型； 3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型（见图4-2）。 在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，仍具有不同的电泳迁移就绪。其中走在最前沿的是SC DNA，其后依次是L DNA和OC DNA（图4-3）。 凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator）、选择性记和克隆位点。 二．质粒DNA编码的表型 质粒DNA仅占细胞染色体组的1%～3%左右，但却编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。其中对抗菌素的抗性最质粒的最重要的编码特性之一。
第三章基因工程载体 体外获得的任一DNA片段,必须插入到可以自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。基因工程载体(Vectors)就是携带外源基因进入受体细胞进行繁殖和表达的一种工具。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 基因工程中3种主要类型的载体： 1.质粒载体 2.噬菌体载体 3.柯斯质粒（cosmid）载体 基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。 外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。 第一节质粒(plasmid)载体 质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。 (一)质粒的构形 环形双链的质粒DNA在提取过程中通常出现三种不同的构型： ①共价闭合环形DNA（cccDNA） ②开环DNA（open circular,ocDNA） ③线形DNA（linear,lDNA） （二）质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。 接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒或F因子）甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。 非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗性质粒）、Col质粒（细菌素质粒）。 符合基因工程的安全要求。 R质粒： 带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。 Col质粒： 细菌素通过与敏感细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。 某些非接合型质粒（Col E1）在接合型质粒的存在和协助下也能DNA转移，这个过程由bom和mob基因决定。 （三）质粒的复制类型 1.严紧型质粒（stringent plasmid）低拷贝数，有1~3份的拷贝；（接合型质粒分子量大，一般属严紧型） 2.松弛型质粒（relaxed plasmid）高拷贝数，10~200份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型） 松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的控制，因此，当用蛋白质合成抑制剂氯霉素（Cml）处理寄主细胞，使大肠杆菌染色体DNA复制受阻时，松弛型质粒DNA仍可继续扩增（氯霉素抗性质粒例外）。而严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格限制，其拷贝数不能通过用氯霉素来增加，对于有剂量限制的基因克隆需要使用低拷贝数的质粒载体。
第一章基因工程概述 1?什么是基因工程，基因工程的基本流程？ 基因工程（Genetic engineering ）原称遗传工程。从狭义上讲，基因工程是指将一种或多 种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大 要素。 1. 分离目的基因 2?限制酶切目的基因与载体 3. 目的基因和载体DNA在体外连接 4?将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养 5. 选择、筛选含目的基因的克隆 6. 培养、观察目的基因的表达 第二章基因工程的载体和工具酶 1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？ 具有对受体细胞的可转移性或亲和性。 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。 具有合适的筛选标记。 分子量小，拷贝数多。具有安全性。 2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？ 1、自主复制性 2、可扩增性 3、可转移性 4、不相容性 主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒 3. 质粒的构建 （1）删除不必要的DNA区域，尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。一般来说，大于20Kb的质粒很难导入受体细胞，而且极不稳定。 （2）灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的mob基因，杜绝重组质粒扩 散污染环境，保证DNA重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数 （3 ）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的DNA序列，即多 克隆接头（Polylinker ），便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点，使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。 （5 ）根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。 4. 什么是人工染色体载体？ 将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体 5. 什么是穿梭载体？ 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和 复制的载体。 6. 入-噬菌体载体及构建 hDNA为线状双链DNA分子，长度为48.5kb，在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。 1缩短长度提高外源DNA片段的有效装载量删除重复的酶切位点 引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性 灭活某些与裂解周期有关基因。 使入-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的污染现 象的发生。加装选择标记，便于重组体的检测 7. M13单链噬菌体DNA载体
连接反应总体积为10μL，体系组成如下： 回收纯化的PCR扩增目的基因片段 7.0μL 10×Ligation buffer 1.0μL T载体（10ng/μL） 1.0μL T4 DNA ligase 1.0μL 共10.0ul 混均后，4℃连接18-24小时，连接所得克隆载体命名为TA-VP4-STI。 转化操作方法 1）取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化； 一次转化感受态细胞的建议用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超过感受态细胞悬液体积的十分之一。以100ul为例： 2）加入连接物（50ul的感受态细胞能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min；
3）将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分钟，该过程不要摇动离心管； 4）向每个离心管中加入500ul液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。 5）将离心管内容物混匀，吸取100ul已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上（含50 ug/ml氨苄青霉素），用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。 涂布用量可根据具体试验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；反之，如转化的DNA总量较少，可取200-300ul 转化产物涂布平板。如果预计的克隆较少，可通过离心 （4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）
1基因工程的基本步骤，其特点是什么? 狭义基因工程的基本五步：切、接、转、增、检。 a.从供体中分离出基因组DNA ，用限制性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开。 b.接，用DNA连接酶含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成DNA重组分子。 c.转，借助细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。 d.增，短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中。 e.检，筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。 2基因工程的基本原理 a．利用载体DNA在受体细胞中独立于染色体DNA而自主复制的特性，将外源基因育载体重组，通过载体分子的扩增提高外源基因在受体细胞中拷贝数，以提高其宏观表达水平。涉及到DNA分子高拷贝复制以及稳定遗传的分子遗传的遗传学原理。 b．筛选、修饰、重组启动子、增强子、操作子和终止子等基因转录调控原件，并将这些原件与外源基因精确剪切，通过强化外源基因的转录水平而提高其表达水平。 c．选择、修饰、重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控后原件，强化受体细胞中目标蛋白的生物合成过程。（以上两步涉及基因表达调控的分子生物学原理。） d．在强化并维持基因工程菌（细胞）最佳生产效能的基础上，从工程菌大规模培养的工程和工艺角度切入，合理控制微生物反应器的增值熟读和最终数量，也是提高外源基因表达产物产量的重要环节。 3基因工程中载体的功能是什么？一个理想的载体具有哪些特征？ (1).载体有三大功能：a.为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。b.为外源基因提供在受体细胞中复制或整合能力。c.为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。 (2).理想载体所具有的4个特点：a.具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体入细胞的效率。b.具有与特定受体细胞相适应的复制位点和整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定的遗传。c.具有多种单一的核算内切酶识别切割位点，以便于外源基因的剪接插入。d.具有合适的选择性标记，以便于重组DNA分子的检测。 4在构建质粒载体时，质粒的基本特征中哪些被利用？哪些通常被除去？为什么？ （1）质粒的基本特征：a。自主复制性，质粒能够利用宿主细胞的DNA复制系统独立的复制并保持恒定遗传，由必要区和非必要区组成。必要区含复制相关的基因，决定质粒的存活与复制功能。非必要区主要含抗性、毒素分泌、复杂物质降解等性状的基因，影响细胞表型。 b.可扩增性，有有严谨型和松弛型两种复制形式。 c.不相容性，不同的质粒能稳定的存在同一受体细胞内称为质粒的不相容。 d.可传递性，质粒在一系列特定转移基因控制下，可以通过结合作用在宿主细胞间进行自然传递。 e.自带有遗传标记性状。 （2）理想的质粒载体所具有的特点：a.能高效的导入受体细胞。b.具有完整的复制子功能和整合位点，能在受体细胞中稳定的遗传。C.具有易被检测的合适的选择性标记。d.具有多种限制性内切酶的单一识别位点。e.具有尽可能小的分子质量。f.属于松弛型复制。g.属于非传递型质粒。 5.质粒载体构建的基本思路？ a.删除DNA非必要区域，尽量缩小质粒的相对分子质量，提高外源DNA片段的装载量。 b.灭活不需要的基因（如为提高拷贝数而灭活的质粒表达的负调控基因，为防重组质粒扩散污染而灭活mob基因。
基因工程载体的分类及其特性 田文晓 1343001125 按照来源和性质分类 1、质粒载体 ①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。 在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。 ②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个； 松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。 ③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质 粒导入后，在不涉及 DNA 限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。 ④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。它需 要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。 2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体） 1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出 现无插入片段的空载体。 2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模 板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。 ①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。 ②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。此时，原噬菌 体从宿主基因组上切离下来进行增殖。 3、粘粒载体（柯斯质粒） ①具有λ噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌 体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。但该载体不包含λ噬菌体的全部必要基因，因此不能够通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒。
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎ 实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 ※ 基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化— 涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。（5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
基因工程原理复习题思考题 1、基因工程的定义与特征。 2、试述基因工程的主要研究内容。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 3、引起核酸变性的因素主要有哪些？核酸变性后性质有何变化？ 4、DNA复性及其影响因素。 1，DNA凝胶电泳中核酸分子分离的机理。 2，DNA凝胶电泳中影响电泳迁移率的因素主要有哪些？ 3，PCR的原理和主要反应过程，并分析影响PCR扩增的影响因素。 4，PCR引物设计的原则，若给一指定DNA序列并需要通过PCR扩增此序列，如何设计扩增引物？ 5，定量PCR的原理？Ct值的含义。 6，分子杂交的类型主要有哪些？探针的标记方法与标记类型？常用的双链DNA的标记方法是哪两种？ 7，Southern杂交一般过程及影响杂交因素。 8，基因组文库的构建过程？如何确定文库的大小？ 9，基因文库的类型包括哪两种？各有什么特点？ 10，一般质粒DNA的构型有哪几种？在琼脂糖凝胶电泳中的有何特点？ 11，碱裂解法提取质粒DNA的原理，分析影响试验结果的各种可能因素。 12，电泳缓冲液使用一定时间后出现DNA在凝胶中跑不动现象的原因，有何解决办法？ 13，电泳的指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？ 1限制性核酸内切酶的类型，基因工程常用的是哪种限制性核酸内切酶？ 2什么是星活性，产生星活性的因素可能有哪些？ 3结合已做的实验，分析影响酶切的因素。 4限制性核酸内切酶命名规则及各字母代表的含义。 5简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。 6连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 7试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。 8基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？ 2、质粒的不相容性及其分子机理。 3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？ 4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？ 5重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理 1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的， 自选哈，建议必选DD RT-PCR和SSH，原因请看下题） 2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？ 3抑制性差减杂交的原理与应用。
载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。 一、一个合格质粒的组成要素 a复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。 b 抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+ c 多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段 d P/E 启动子/增强子 e Terms 终止信号 f 加poly（A）信号可以起到稳定mRNA作用 二、如何阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒） 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 （1）Ampr 水解β－内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr 可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸转移酶使G418（长那霉素衍生物）失活 （5）hygr 使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体，还是要以实验目的为准绳。 启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号 a 启动子－促进DNA转录的DNA顺序，这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游，是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位，但启动子本身不被转录。b增强子/沉默子－为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发
名词解释一 RNase:RNA水解酶 Restriction endonucleasr：限制性核酸内切酶 RBS:核糖体结合位点 SD sequence：SD序列。可结合原核生物的核糖体。 Ori：复制起始原点 Promptor：启动子 Klenow fragment：大肠杆菌pol1的大片段 Reverse tranecriptase：反转录酶 Transferred DNA：转移DNA MCS（multiple cloning site）：多克隆位点 IPTG: 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 X-gal：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 GUS：β-葡萄糖苷酸酶 X-gluc：5-溴4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯 Ampr（ampicillin resistance gene）：氨苄青霉素抗性基因 Cmr：氯霉素抗性基因 Tetr：四环素抗性基因 Kanr：卡那霉素抗性基因 Ermr:红霉素抗性基因 Neor:新霉素抗性基因 supF:琥珀突变抑制基因 phagemid：噬菌粒 plasmid：质粒 YAC ( yeast artificial chromosome)：酵母人工染色体 BAC(Bacterial Artificial Chromosome）：细菌人工染色体 PAC（P1 artificialchromosome）：P1人工染色体 TEL: 端粒重复序列 CEN:着丝粒 ARS: 自主复制序列 Cosmid：黏粒 PCR（Polymerase Chain Reaction）:聚合酶链式反应 dNTP:脱氧三磷酸核苷 RT-PCR:反转录(reverse transcriptase)PCR或实时定量(real-time)PCR DD(RT)-PCR:差异(反转录)显示PCR TAIL PCR：热不对称相错PCR RACE: cDNA末端的快速扩增 RAPD：随机扩增多态性DNA AFLP:扩增片段长度多态性 SSH：抑制性扣除杂交 FISH:荧光原位杂交 Vector:载体 Blunt end：平末端 Match end/cohesive end:匹配黏端/黏性末端