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_骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究与应用

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间充质干细胞在医学中的应用文献综述

间充质干细胞在医学中的应用文献综述 学院:生命科学学院 年级:2011 姓名:张胜男

前言:干细胞是具有增殖分化潜能的一种细胞,人体200多种细胞均起源于一个全能干细 胞---受精卵,出生后的机体生存也依赖于不同组织中的干细胞,进行自我更新和损伤修复.追溯到1895年人类第一次临床应用骨髓移植治疗肿瘤疾病,干细胞在临床上的应用已有100多年的历史,间充质干细胞是干细胞家族的重要成员.随着人类技术的发展,人类具备了从成体组织中提取间充质干细胞的能力,并可以在体外进行大量的细胞扩增培养,但是间充质干细胞临床试验研究所面临的基础理论、实验技术、行业法规,法律伦理等问题,使其在真正走向临床应用的道路还很艰难,这条路上还有多少障碍?还有多远?需要的不仅仅是生命科学领域研究人员的努力,也需要相关管理部门同行! 正文: 1间充质干细胞 间充质干细胞英文缩写MSC,存在于多种组织中。 1.1间充质干细胞的发现过程 间充质干细胞最早在骨髓中发现,随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。目前, 我们能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞,使用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。 2006年,我国在胎盘和脐带组织中分离出间充质干细胞,这种胎盘和脐带来源的间充质干细胞有可能成为骨髓间充质干细胞的理想替代物,并具有更大的应用潜能。 鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点,正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟,临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞, 临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病;作为免疫调节细胞,治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。 最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的,他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC,在体外扩增培养4~7周,然后再静脉注射入患者体内,患者被分为3组,分别给予不同剂量的MSC,注射后没有观察到毒副作用,提示MSC 用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多,病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等,在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。 然而自体间充质干细胞的应用过程中逐渐暴露了不便之处:例如扩增能力个体差异很大;潜在的肿瘤细胞污染风险;培养需要一定的时间,不能及时适应病情的需要等。这些制约了自体间充质干细胞的使用。间充质干细胞给未来的再生医学带来了新希望, 对间充质干细胞更深入的研究和临床应用必将在不远的将来造福人类。其中,胎盘和脐带来源的间充质干细胞具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征,有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。 1.2 间充质干细胞的生物学特性 间充质干细胞具有其独特的生物学特性

脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略

脐带间充质干细胞治疗技术的临床研究策略 脐带间充质干细胞(UCMSC )具备药品的“工厂化、规模化、标准化”生产特点,是目前“成药”性最高的成体干细胞(ASC )之一。UCMSC 还有广泛的生物效应,对各种损伤、退变和炎症性疾病的疗效明确,且具有免疫原性低、异体治疗无免疫排斥反应、临床应用的安全性高、无伦理限制等临床应用优势。UCMSC 的研究与应用受到了国内外研究者的广泛关注,已对其高效制备技术、体内生物学行为、临床疗效与机制及安全性进行了深入研究,解决了临床前关键技术和理论问题,进入了迈向临床验证的最后一公里,即将成为临床疾病治疗的新型“药物”和技术。但如何科学、合理、规范、循序渐进地推进UCMSC 向临床转化,是管理部门和研究者共同面临的问题。笔者在对UCMSC 进行系统性临床前研究的基础上,对UCMSC 治疗系统性损伤和自身免疫性疾病的临床技术及规范进行了探讨。 1 . UCMSC 治疗的临床适应证 UCMSC 制剂可在临床上用于涉及组织细胞损害(变性、坏死、缺失)、自身免疫和炎症反应引起的疾病的治疗,但在同种疾病的不同阶段、不同个体之间,疗效可能不尽相同,其原因在于UCMSC 来源、质量及临床实施方法的差异。根据UCMSC 的生物学特性及疾病治疗机制研究进展,UCMSC 的临床适应证主要有: (1)机械性创伤:包括武器、交通与意外伤害、自然灾害等导致的各种类型的组织器官损伤; (2)退变性疾病:如衰老、器官纤维化、骨质疏松、器官萎缩、动脉硬化等; (3)缺血性疾病:心脑血管意外、血管栓塞等; (4)中毒性疾病:如酒精、食物、药物、毒剂、环境等导致的肝、肾、神经中毒等; (5)自身免疫性疾病:系统性红斑狼疮,再生障碍性贫血、类风湿性关节炎、多发性硬化、自身免疫性肝病等; (6)炎症性疾病:慢性炎症、急性系统性炎症综合征等; (7)代谢性疾病:糖尿病、甲状腺功能异常、高血酯症、高血压等; (8)组织残缺性疾病:主要用于组织缺损的局部再生及人工组织构建与移植治疗。 总之,UCMSC 的适应范围很广,可通过多种机制发挥治疗作用,对并发多种疾病的患者有“一药治多病”的效应。

骨髓间充质干细胞研究进展(一)

骨髓间充质干细胞研究进展(一) 【摘要】骨髓间充质干细胞是干细胞领域的研究热点之一。虽然近几年来有关间充质干细胞的研究已取得了很大进展,但仍有很多问题有待进一步解决。本文主要对间充质干细胞的生物学特性、以及免疫耐受性、分化和促修复、间充质干细胞的标记等问题进行综述。 【关键词】骨髓间充质干细胞分化标记 骨髓间充质干细胞,BMSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoieticstemcells,HSC)之外的另一类干细胞,是骨髓造血微环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆,因此也称成纤维细胞集落形成单位(Colonyformingunitfibroblast,。又由于它们来自骨髓的支持结构,并作为滋养层支持造血干细胞的生长,因此也有人称其为骨髓基质细胞(Bonemarrowstromalcells,BMSCs)。 1骨髓MSCs的生物学特性 不同物种的BMSCs体外培养的形态学特征大致相同,主要表现为梭形、纺锤形,少数为多角形。目前,BMSCs的分离方法主要有以下几种:(1)全骨髓培养,是将无菌抽取的骨髓加入培养液制成细胞悬液并培养,原代培养培养物以造血细胞成分居多,为利于BMSCs的贴壁生长,可采用DMEM和胎牛血清培养。BMSCs对营养要求高,胎牛血清终浓度为10%~20%,有人认为红细胞会随着换液而逐渐被自然去除,对BMSCs影响不大。细胞融合后以1:2比例传代,3~4天换液一次〔1〕;(2)离心培养法,是根据骨髓中细胞成分比重的不同,采用离心分离法提取单核细胞进行培养。在新鲜无菌的骨髓抽取物中加入抗凝培养液稀释1500~2000r/min离心20~30min,采集交界处的单核细胞层,PBS洗涤2~3次后,加入培养液接种培养;(3)细胞表面分子标记分选法,主要是根据BMSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。但由于目前仍未找到BMSCs 特异性的细胞表面标记物〔2〕该法较少采用。影响BMSCs扩增的主要因素:(1)血清:血清对大量扩增BMSCs起着重要的作用,不同浓度的血清对培养BMScs纯度的影响亦较大,常用10%~20%的胎牛血清培养BMSCs;(2)接种密度:BMSCs的体外扩增速度与其接种密度也有关,一般认为较低密度种植有益于增殖。高密度接种后细胞生长较慢其原因可能是由于细胞间的接触抑制,或细胞释放到培养基中的因子影响了BMSCs的生长;(3)细胞因子:一些细胞因子对于维持BMSCs增殖和未分化状态亦十分重要;(4)动物种属:一般认为BMSCs的生长特性相似,但也有资料显示BMSCs生长特点有种属差异〔3〕。 2间充质干细胞移植后的免疫耐受性 在移植治疗中,一般情况下,移植物会引起宿主的免疫排斥反应。但对于间充质干细胞来说却不是这样。实验表明间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖从而导致免疫耐受〔4~7〕。T 细胞与其它细胞的相互作用可以通过混和淋巴细胞反应来观察。被标记的T细胞与其它细胞混合后,如果可以引起T细胞的免疫反应,则可以观察到T细胞的增殖现象。但当把间充质干细胞与T细胞混合后却观察不到T细胞的增殖反应,而且这种现象并不是由于T细胞凋亡或其它的有害作用引起的。因为在去除间充质干细胞后,这些T细胞仍然可以对其它物质进行反应。此外,使用趋化膜将两种细胞分隔开培养后,间充质干细胞对T细胞的抑制作用依然存在,表明这种抑制作用可能通过某种可溶性的小分子起作用。另外,除了未分化的间充质干细胞可以抑制T细胞的增殖外,实验也表明,随着干细胞的分化,其抗原性并没有随之增加〔8〕。总之,间充质干细胞可以通过某种机制抑制T细胞的成熟来逃避免疫系统的清除。也暗示间充质干细胞可能在机体免疫系统的调节及骨髓中各种干细胞未分化状态的维持方面起作用。 3促组织修复和细胞分化 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓组织中的一类成体干细胞(adultstemcells,AS),在一

人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养

万方数据

ISSN1673—8225CN21.1539/R赵凌云,等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养wwM.zglckf,comkf23385083@sina.com 0引言 骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群,取材方便,易于体外扩增,可进行自体移植,而不存在组织配型和免疫排斥的问题,被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。 1材料和方法 设计:开放性实验。 单位:解放军济南军区总医院脊髓修复科。 材料:实验于2006—02/12在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者,对本实验均知情同意。基础培养液由含体积分数为0.15胎牛血清和低糖仪一MEM配置。低糖d-MEM培养基(Hyclone);淋巴细胞分离液(密度1.077g/mL,上海试剂二厂生产);胰蛋白酶,胎牛血清(Gibico);C02培养箱(上海力申科学仪器有限公司,HF90);生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司,HFsafe一1200/c);倒置显微镜(Leica);离心机(JOUANB4i多功能台式机)。 设计、实施、评估者:设计、实施为第一作者,评估为第二、三作者,均经过系统培训,未使用盲法评估。 方法: 骨髓间充质干细胞的分离及传代培养:在无菌条件下,以含5mL肝素钠生理盐水的20mL注射器,于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织6mL,移入含5mL肝素钠生理盐水的试管内,混匀,而后沿管壁缓慢加入含10mL淋巴细胞分离液的离心管中,2000r,min离心20min,小心吸取界面层细胞,用D—Hanks平衡盐溶液洗2次,2000r/min离心8min,加入基础培养液,血细胞计数板计数,调整细胞的浓度,将细胞悬液按109—1010L-1接种于培养瓶,放置37℃、体积分数为0.05的C02饱和湿度孵箱中培养。于培养后的两三天更换培养液,并用D-Hanks平衡盐溶液冲洗2次,以去除未贴壁的造血细胞,以后每3d换液一次,进一步去除未贴壁的细胞。观察细胞生长情况,待细胞融合成片、长满培养瓶底部后,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶流过所有细胞表面,盖好瓶盖,将培养瓶放在倒置显微镜下观察,发现细胞变圆,部分脱壁,控制消化时间不超过3min,立即加入2mL有血清培养液终止消化,用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域,吹打过程中不要用力,结束后再用少量培养液漂洗一遍,然后加入适 5650量培养液计数,分别接种在新的培养瓶内。 骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制:取第3代生长状态良好的细胞,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种至24孔培养板,3孔/组,细胞1×104/孔,每孔加入培养液1mL,放置37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中培养。以细胞数为纵坐标,时间为横坐标,绘制细胞生长曲线。 骨髓间充质干细胞贴壁率的测定:取第3代生长状态良好的细胞,用质量浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化制成细胞悬液,接种至24孔培养板,3孔/组,细胞1×104/孔,每孔加入培养液1mL,放置37℃、体积分数为0.05的C02孵箱中培养,每隔2h进行细胞贴壁率检测。 主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的生长曲线。③骨髓间充质干细胞的贴壁率。 统计学分析:由第一作者采用ESA4.0软件进行统计处理,数据以娃s表示。 2结果 2.1骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种1d即贴壁,2d时贴壁细胞较多。经冲洗和换液去除悬浮细胞后,贴壁细胞继续培养3d开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等(图1)。至14d细胞密集在集落中心,基本铺满瓶底,第3~5代细胞呈均匀一致的长梭型,排列成旋涡状或放射状(图2)。 图1原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后3d开始增殖,伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等(倒置显微镜,x20) 2.2骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后3d内处于潜伏期,3d后进入生长期,7d后进入平台期。第3代骨髓间充质干细胞生长曲线见图3。 P.O.Box1200。Shenyang110004kf23385083@sina.com www.zglckf.com  万方数据

间充质干细胞治疗小脑萎缩

间充质干细胞治疗小脑萎缩(山东干细胞网) 遗传性小脑共济失调,即遗传性小脑萎缩,是一组以共济运动障碍为突出表现的慢性进行性小脑变性疾病,发病年龄多在33—34岁,病情进行性加重。发病机理目前并不清楚,病变主要累及小脑,但脊髓、颅神经、基底节、脑干、大脑皮质等也可受累。遗传方式为常染色体显性遗传,因此,如果有本病家族史的人尽量不要生育。 患者:宋某,男性,40岁,患有遗传性小脑共济失调,即遗传性小脑萎缩。其具有明显的家族遗传性,其外公、姨、母亲、两个哥哥均患有该病。 入院时,患者口齿不清,行走经常跌倒 ,双手动作笨拙,症状逐渐加重,并出现双下肢无力,下蹲后不能自行站起。后经间充质干细胞移植成功治疗,基本恢复正常的生活。 目前采用的治疗方法是给予体外培养扩增的间充质干细注射,每周1次,共4次为一个疗程,同时给予系统功能锻炼。 干细胞治疗后在这位患者出院的时候,已经能行走稳健,未再出现跌倒情况,口齿清楚。后来,这位患者的两位哥哥也来做间充质干细胞治疗,恢复的效果也不错。 干细胞治疗重度颅脑外伤后遗症期 患者,男性,35岁。诊断:重度颅脑外伤后遗症期 重度颅脑外伤术后言语及肢体活动障碍8个月,拟行神经外科行颅骨修补和干细胞移植治疗。 干细胞移植治疗前: 四肢肌张力均高,以左侧为著,右上肢、右下肢活动较灵活,左侧肢体处于肌紧张状态,疼痛刺激后有屈曲。 影像学检查:双侧大脑见多发片状低密度区,CT值10-15Hu,边尚清。左侧侧脑室后部与左脑内低密度区贯通,脑内见引流管影。脑室系统略扩张,右侧脑室后角增大明显。右侧颅骨见巨大缺损区,左侧颅骨呈术后状态。[印象]双侧大脑多发软化灶、脑积水分流术后。 干细胞移植治疗后效果: 颅骨修补并干细胞脑内移植治疗后4天,患者左侧上肢肌张力明显降低,第二次干细胞移植后,次日患者左上肢肌张力进一步降低,左下肢肌力增强,达三级,屈伸自如(之前在强刺激下能才在水平面屈曲)。该患者再经过一阶段锻炼,有望下地行走。

_骨髓间充质干细胞在骨科中的应用

第9卷第18期·总第122期 2011年09月·下半月刊 87骨髓间充质干细胞在骨科中的应用※ 陈亮1陈跃平1,2* 摘要:骨髓间充质干细胞(BMSC)是一种来自中胚层发育的早期干细胞,具有多向分化潜能的特性,可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。临床上还运用BMSC治疗骨科疾病大量的体外实验已获成功。 关键词:骨髓间充质干细胞;骨科学;文献综述 doi:10.3969/j.issn.1672-2779.2011.18.055 文章编号:1672-2779(2011)-18-0087-03 骨髓中含有2类干细胞,①造血干细胞,它为循环血液提供前体细胞;②非造血性干细胞,它是骨髓中造血结构性和功能性支持细胞,在调节造血干细胞的长期存活,生长分化中起重要作用。早期分离培养时,发现其形状呈成纤维细胞样而称其为“成纤维细胞集落形成单位”或“骨髓基质成纤维细胞”。随着研究的深入,人们发现其对骨髓造血干细胞起支持诱导作用,又因其来自于骨髓基质,因而称其为“骨髓基质细胞”。因其在不同的诱导条件下,有向中胚层组织细胞分化的能力,又称其为“骨髓间充质干细胞”。 1 骨髓间充质干细胞多向分化特性 多向分化潜能被认为是BMSC最重要的生物学特征。大量体外实验证明,在不同诱导条件下,BMSC可以向多种中胚层来源的组织细胞分化,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。 1.1 BMSC向成骨细胞的定向诱导分化BMSC在体外培养中,通过地塞米松、β磷酸甘油和抗坏血酸等的诱导,能够分化为成骨细胞。Ouyang等[1]在培养基内加入抗坏血酸后BMSC排列紧密呈片状生长,将BMSC片与去除矿物质的移植骨片结合植入受损部位,3周后形态学、组织学、免疫组织化学观察显示,植入物的结构与正常骨膜相似,并向成骨、软骨分化。 1.2 BMSC向软骨细胞的定向诱导分化BMSC向软骨细胞的定向诱导分化将此分离的BMSC加入无血清培养体系中培养,培养体系中加入转化生长因子β、软骨来源形态形成蛋白及整合素可促使BMSC向软骨细胞分化。舒朝锋等[2]实验证明,在单层诱导培养条件下,人骨髓BMSC能分泌软骨细胞特征性细胞外基质如Ⅱ型胶原、糖胺多糖等,具有作为软骨组织工程种子细胞来源的可能。 1.3 BMSC向脂肪细胞的定向诱导分化 1999年,Pittenger等[3]人的BMSC培养体系中加入甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和茚甲新等,结果成功地诱导出脂肪细胞,细胞内聚集脂滴,并表达过氧化物酶体增殖物激活受体,脂蛋白脂酶和脂肪酸结合蛋白aP2。在这种培养条件下,约95%的细胞向此系分化,细胞内的脂质小泡持续增加直至充满细胞,这些物质可被油红染成红色。 ※基金项目:广西壮族自治区科技厅自然基金[No:2010GXNSFA013223] 作者单位:1 广西中医学院附属瑞康医院骨科(南宁530011) 2 南方医科大学在读博士(南宁530011) *通讯作者 2 骨髓间充质干细胞的分离方法 骨髓中BMSC含量很少,仅占骨髓内单个核细胞总数的0. 001%~0.01%,并随年龄的增加而减少,因此,必须实现其体外分离培养、扩增。目前BMSC的分离方法主要以下几种:①密度梯度离心法:主要根据骨髓中细胞成分的比重不同,清除红细胞,分离提取骨髓单个核细胞进行贴壁培养。目前较常用Percoll 液(1.073 g/ml)和Ficoll 液(1.077 g/ml)进行密度梯度离心。值得注意的是,不同密度的分离液对BMSC的纯度影响极大。这种方法分离培养的BMSC大小均匀,纯度较高,Pittenger等[4]在过密度梯度离心法分离培养的BMSC在第1代纯度可达95%,第2代达98%。因此该法被广泛采用。②贴壁筛选法:即全骨髓法,是根据BMSC贴壁生长而造血系细胞悬浮生长的特性,通过定期换液除去不贴壁细胞,收集贴壁生长BMSC,其纯度可达95%。目前多用这两种方法,细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSC的最基本原则,物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养仍是分离BMSC的最基本方法,更好的分离方法还有待于进一步的探索。 3 BMSC的表面标志及鉴定 3.1 表面标志到目前为止,BMSC的表面抗原具有非专一性,它表达了间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志。主要包括:①粘附分子,如CD166、CD54、CD102、CD44、CD106等。②生长因子和细胞因子受体,如IL-1受体、IL-3受体、IL-4受体、IL-6受体、IL-7受体、干扰素γ受体、肿瘤坏死因子α等。③整合素家族成员,包括CD49a、CD49b、CD49c、CD29、CD104等。④其它,如CD90、CD105等。不表达造血细胞的表面标志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8等,也不表达与人白细胞抗原识别有关的共刺激分子B721、B722及主要组织兼容性复合物Ⅱ类分子如人白细胞DR 抗原等[5,6]。此外,BMSC自身还能产生一些造血及非造血的生长因子、白细胞介素和化学激动因子,但除细胞因子是持续性产生外,其它的仅仅在受到刺激后表达,BMSC还能产生一系列的基质分子,包括纤维连接素、胶原、蛋白聚糖,还能表达基质2细胞,细胞2细胞等相互作用的反受体,其中特别有关的是对CD44强表达,CD44是多种配体的受体,其分别在骨、骨髓中对细胞外基质构建起着重要的作用[7,8 ]。 3.2 鉴定对BMSC进行鉴定可联合细胞化学和流式细胞分析方法[9]。细胞化学方法,BMSC具有独特的代谢特点,几乎所有细胞酸性萘酚酸酯酶及糖原阳性,酸

间充质干细胞在免疫治疗中的应用

文章编号(Article ID):1009-2137(2005)01-0158-06?综述?间充质干细胞在免疫治疗中的应用 廖联明,韩钦,赵春华 中国医学科学院基础医学研究所,北京,100730 摘要 近年来对间充质干细胞的研究越来越多,对于间充质干细胞的自我更新和体外扩增的能力及其多向分化的潜能已经被广泛认识。同时,间充质干细胞还具备低免疫原性以及免疫调节活性,使其非常适合用于细胞治疗。目前对间充质干细胞发挥免疫调节的作用机制还不完全了解。本文综述了间充质干细胞免疫调节机制的研究现状及其在免疫治疗中的应用前景。 关键词 间充质干细胞;免疫调节;免疫耐受 中图分类号 R39214;R730.51文献标识码 A Application of Mesenchymal Stem Cell in Immunotherapy———Review L IA O L ian2M i ng,HA N Qi n,ZHA O Chun2Hua Instit nte of Basic Medical Sciences,Chi nese Academy of Medical Sciences,Beiji ng100730,Chi na Abstract There has been an increasing interest in recent years on mesenchymal stem cell(MSC).It is well known that MSCs are capable of self2renewal and differentiating into many cell lineages.MSC can be expended to a large quantity that is required for clinical trans plantation.Recent studies show that MSC have potential application in immune diseases due to their unique immunologic characteristics,such as low immunogenicity and immunoregulatory function.But their immunoregulatory mechanism is not yet clear.This review discusses the advances in researches on the mechanism of MSCs′immunoregulatory function and potential clinical application in immune disease and organ transplantation. K ey w ords Mesenchymal stem cell;immune regulation;immune tolerance J Ex p Hem atol2005;13(1):158-163 免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是,免疫抑制剂的副作用,包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等,也一直困扰着临床医生。在器官移植中,诱导受者对异基因移植物的特异性免疫耐受,减少、甚至完全不用免疫抑制剂,一直是免疫学家和临床医生的一个梦想。这是理论上解决异基因移植排斥,骨髓移植中移植物抗宿主病等临床问题的最佳方案。 在器官或组织移植中,稳定嵌合与特异性耐受诱导密切相关1。已有报道,骨髓干细胞移植后在受者体内可检测到稳定的造血系嵌合,并能诱导对供者的特异性耐受2-4。但骨髓移植前预处理的毒性、移植失败的风险和移植后出现的急、慢性移植物抗宿主病等问题,使骨髓移植仍然局限于恶性肿瘤或严重免疫系统疾病的患者,不适合用于特异性免疫耐受的诱导。最近报道,在未作任何预处理的大鼠中,胚胎样干细胞移植后在其体内可建立造血嵌合,并能诱导对随后相同供者来源的心脏移植物的特异耐受5。这一发现对寻找理想的免疫耐受诱导方法的研究者是一个很大的鼓舞。但是,胚胎干细胞存在众所周知的伦理问题和导致胚胎瘤的潜在危险。因此,在器官移植特异性耐受诱导方面,除了骨髓干细胞和胚胎干细胞以外,寻找一个新的细胞群体是非常必需的。最近,我们以及其他实验室都观察到骨髓源的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)具有免疫调节活性。在小鼠6和灵长类动物7中,输注MSC可以延长异基因皮肤移植物的存活。在造血系统恶性肿瘤患者接受骨髓干细胞移植的同时输注供者来源的MSC,观察到MSC移植组的移植物抗宿主病(GV HD)发生率明显低于未移植MSC组8。另一研究小组也报道了相近的实验结果9。虽然结果还只是初步的,但为MSC的免疫调节特性提供了直接的证据。目前,MSC对免疫系统影响还并不十分清楚,它们潜在的临床应用价值,包括诱导异基因移植物耐受和免疫调节作用,还有待于进一步的研究。 通讯作者:赵春华,教授,博士,组织工程中心主任.电话:(086)22-27210060.传真:(086)22-27210060.E2mail:chunhuaz@public. https://www.doczj.com/doc/3918014623.html, 2003-11-26收稿;2004-09-01接受 ? 8 5 1 ?中国实验血液学杂志 Journal of Ex perimental Hem atology2005;13(1):158-163

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

[基金项目]广东省科技计划项目资助(2002A3020206)。?论著? 人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析 陈建锋1,高 毅2,潘明新2 (1中国人民解放军第401医院,山东青岛266071;2南方医科大学珠江医院) [摘要] 目的 对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法 抽取4例健康人髋骨内骨髓5~20m l,密度梯度离心法分离HM SCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HM-SCs表面标记物;M M T法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果 HM SCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HL A-A BC、U EA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S 形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HM SCs的染色体数目未发生改变。结论 密度梯度离心法可得到纯度较高的HM SCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HM SCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。 [关键词] 人;骨髓;间充质干细胞;细胞培养 [中图分类号] R329.2+7 [文献标识码] A [文章编号] 1002-266X(2006)29-0001-03 Isolati o n an d cu ltivati o n of hu man bone marrow mesen chym al stem cells in vitro an d analysis of th ei r biological characterization s CH EN J ian-f eng,GA O Y i,PA N M ing-x in (401H osp ital of PL A,Qingdao266071,P.R.China) Abstract:[Objective]T o establish a sim ple and feasible method t o culture and pr olifer ate human bone marro w der ived mesenchy mal stem cells(HM SCs)in v itro and analyze t heir biological characterizations.[M ethods]HM SCs w er e isolated by combining gradient density centrifug ation w ith plastic adherence.T he g row th curves o f HM SCs w er e dr aw n by M T T assay,cell phenoty pes wer e detected by flow cyt ometry,cell doubling time was caculated,and cell kar yoty pes wer e measur ed by Giemsa staining.[Results]T he posit ive ex pr essio n of cell pheno type of HM SCs includes CD29,CD44,CD71,CD105,CD166,HL A-A BC,U EA-1,w hile the neg ative expression of cell phenoty pe in-cludes CD34,CD45,HL A-DR.T he g row th curve of HM SCs w as“S”shaped.T he cell doubling time pro longed w ith the passag es increased.T he chr omosome number of HM SCs of passage3and6were both46,same as human be-ings.[Conclusion]HM SCs of higher purity can be isolated by combining gr adient density centrifug ation with plastic adher ence,and maintain cell pheno types as human beings.T he pr olifer ation ability of HM SCs is strong before pas-sag e7,but decreases r apidly later.T he chr omosome number of HM SCs remains orig inal befo re passage6. Key words:human;bone mar row;m esenchymal stem cell;cell culture 骨髓组织可分为造血和基质两大系统。骨髓基质细胞是来源于骨髓基质的一种间充质细胞,在空间上起支持作用,在造血方面起精细的调节作用。体外获得足够的基质细胞是进行各项研究的基础。2004~2005年,我们对人骨髓间充质干细胞(HM SCs)进行了体外培养扩增,并对其表型、生长曲线、核型等生物学特性进行了初步分析。现报告如下。 1 材料与方法1.1 HM SCs的获取及培养 采集4例无血液疾病志愿者髂骨内骨髓5~20ml。5m l骨髓标本中加入5 ml的PBS,900g离心10min2次,以PBS制成4×107细胞数的悬液,取5m l加到5ml Percoll分离液(1.073g/ml)上,900g离心30min,吸取富含有核细胞的中间细胞层。将获取的单个核细胞加2倍量的PBS,900g离心5min,弃上清,以1×106/ml的密度接种于50ml培养瓶中,加入HM SCs完全培养基10 ml。待贴壁细胞达到80%~90%融合后,以1÷3的比例传代培养。 1.2 HM SCs表型鉴定 取传至第3~6代HM SCs, 1 山东医药2006年第46卷第29期

大鼠的骨髓间充质干细胞提取

大鼠的骨髓间充质干细胞提取 第一步,SD大鼠麻醉处死,75%乙醇皮肤消毒,无菌条件下迅速剪开两侧后肢皮肤及肌肉,取股骨及胫骨,浸泡在PBS中。 心得体会:①鼠龄4周,重量在160-200g之间的雄性SD大鼠。老鼠太老了,骨髓都分化的太厉害,没有年幼老鼠的骨髓这么有活力。雌的也行,但是雌的比较厉害,咬人。Wistar 大鼠行不行,也行,但是就品种而言,SD的生存力更强大。 ②我个人认为引颈处死不人道。麻醉药品为氯胺酮、安定、阿托品各一支混到一起,腹腔麻醉,保证30秒老鼠躺倒,安乐死。如果你水平够高,可以直接用注射器抽取心脏内的血液,可以减少手术中老鼠出血较多而影响术野不清的问题。 ③老鼠的两支前肢取下来也行,但老鼠太小,前肢更小,如果你的确需要大量的细胞取下来也无妨。浸泡的15ml的一次性离心管中(也可以用培养皿),管中提前加好含有青链霉素的PBS 10ml就行了,青链霉素的浓度为500U/ml,这样是区别于生长液中青链霉素浓度,组织抑菌是200-500U/ml,生长液抑菌是20-100U/ml。就当初步的消毒吧! ④整个手术过程要快,一般控制在20分钟之内,时间长了,骨髓会凝,不利于后期的冲洗。老鼠浑身都是宝,可以叫上研究脂肪的,嗅鞘的,心肌的其他人员一起来,把剩下不要的老鼠尸体给别人,做实验要巧花钱。一般老鼠一条腿的一根股骨就够种在一个60mm的皿里了,具体根据个人经验而言。 第二步,⑴将装有骨头的离心管置于紫外线下消毒30分钟后移至超净台,倒掉PBS后,再用含青链霉素的PBS清洗骨头三遍。 ⑵去掉骨头两侧的骨骺端,暴露出骨髓腔,用5ml的一次性注射器吸取5.2ml的细胞生长液,用针头插到骨头的一端冲洗,然后换另一端接着冲。将骨髓冲出的细胞生长液至60mm 培养皿中(皿最好倾斜45度),冲洗数次直至将绝大部分骨髓冲出。 ⑶换1ml注射器的针头,反复在培养皿中吹吸细胞悬液2-3次后再全部吸到无菌容器中,大约此时的细胞悬液为5ml。 心得体会: ①离心管中得骨头要用无菌的镊子夹取,放到一次性培养皿的皿盖上,皿是用来承装细胞悬液的,这样可以节省一个皿。 ②5.2ml的细胞生长液经过冲骨髓后或多或少都会有一些残留在骨髓中,所以到最后可能就剩下5ml细胞悬液了,甚至更少,如果不够5ml,可以加至5ml,这样是方便你计数用的。冲洗的过程中以骨腔颜色变白为标准,基本3-4次就差不多。培养皿倾斜45度是为了在冲洗和吹打过程让较大的杂质停留,方便去除的,相对保持细胞悬液的清晰度。 ③换用1ml的针头是为了能更好的打散细胞,当然这个过程要轻柔,避免用力破坏细胞。无菌容器最好是光滑的,因为在转移细胞悬液的时候会存在细胞的丢失,临床上经常使用的抗生素瓶子就非常好用,但是要经过严格的清洗和消毒。 ④以上的细胞生长液5ml具体配制为 DMEM(90%)+胎牛血清(10%)+L-VC(忽略不计)+青链霉素(忽略不计) 低糖DMEM液(含有glutamine的,Gibco公司的,500ml一瓶,大约60元)浓度90%,5ml细胞生长液中大约需要4.5ml

间充质干细胞药物开发策略

间充质干细胞药物开发策略 干细胞药物开发的目的是,从“一对一”的个体化干细胞临床应用转向“一对多”的临床治疗方案,为临床提供标准化的干细胞制品。药物的开发需要遵循常规药物开发的流程,包括:药学研究、非临床研究、临床试验申请、早期临床试验、确证性临床试验、新药申请和批准上市等过程。 1干细胞制剂开发要点概述 干细胞制剂药学研究,主要包括工艺开发与质量评价: ①干细胞库与工作细胞库建立: 供者筛查、组织采集,细胞分离、纯化、培养、保藏、鉴别、效力检测,以及生物学特性、遗传学稳定性研究,干细胞库技术标准及工作标准建立; ②干细胞制剂工艺开发与药学研究: 大规模细胞扩增、细胞制备工艺、剂型选择、包装选择、处方筛选、制剂冻存/复苏工艺,体外操作对干细胞生物学特性的影响,过程质量控制,干细胞药物放行标准建立; ③干细胞制剂冷链运输和稳定性研究: 产品冻存与复苏、冷链运输技术、临床快速检验、稳定性研究等,稳定性研究包括冻存条件下制剂影响因素试验、长期试验,模拟临床应用条件的试验等,通过这些实验获得的药品稳定性信息来确定药物的储存运输条件、包装以及有效期。 干细胞制剂开发原则 干细胞制剂开发过程服从GMP原则,但应充分考虑活的药物与传统药物区别: ①供者细胞的合理性及筛查; ②生产材料应考虑,供者细胞、生产过程细胞分类分级管理,生产用原材料的风险评估, 外源因子去除,限制动物及人来源材料,基因修饰/改造按高风险管控,辅料使用考虑必要性、安全性和合理性; ③制备工艺与过程控制应证明可行性与稳健性,生产工艺的设计(QbD)应避免细胞发生 非预期的或异常的变化,全过程监控、持续改进,用连续自动化、全封闭手段减少污染; ④强调过程控制与制品放行互补,高风险操作评估,细胞制剂与回输制剂转换验证; ⑤质量研究取代表批次及生产阶段细胞的特性、功能性、纯度和安全性等分析; ⑥质量控制基于过程理解,兼顾认知,逐步完善,确证性与商业化保持一致; ⑦临床质量核准,方法验证与药典适用性验证,快速微量方法相互验证; ⑧稳定性研究应采取连续工艺,适用包装密封性研究、冷冻储存适应性研究等,运输条件,

间充质干细胞临床前安全性研究概况

544 中国医药生物技术2018年12月第13卷第6期Chin Med Biotechnol, December 2018, V ol. 13, No. 6 DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2018.06.011· 综述·间充质干细胞临床前安全性研究概况 张澄,霍艳,黄瑛,高阳,侯田田,肖亚妮,汪巨峰 间充质干细胞(MSC)于1974 年被第一次定义,而后在20 世纪90 年代得到推广[1]。2006 年,细胞疗法国际协会针对细胞表面阳性标志物为MSC 建立了一个最低标准,即CD90+、CD105+、CD73+、CD45–、CD34–、CD14–、CD79–、HLA–、DR–[2]。最初的临床试验中,MSC 主要是用于成骨不全[3]或黏多糖症的研究。近年来研究表明,MSC 也具备促血管生成、免疫调节、抗炎、营养支持等生物活性,这为其用于缺血性、炎性疾病等方面的治疗提供了可能性[4]。另外MSC 在实验中易于获得、可在体外大量扩增及有多系分化潜能的性质也表明其可成为组织工程的一个强有力工具[5]。 1 治疗机制及研究进展 临床前研究表明,MSC 一般通过自身分化、营养支持、免疫调节等机制发挥治疗作用[6]。间充质干细胞可由一系列组织分离得到,同时在一定条件下可分化成不同的祖细胞,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及造血支持基质细胞,这些细胞进一步可分化为心肌细胞、神经细胞等。同时,MSC 可通过自分泌或旁分泌途径释放细胞因子,这些活性物质可定向聚集于特定部位起到抑制细胞凋亡、纤维化,促进血管生成或缓解炎性反应等作用[7]。另外,MSC 在体内可通过免疫调节来调节机体的免疫系统,借此治疗一些炎性疾病。最新研究表明,干细胞可能并没有免疫豁免的机制,其可能是通过免疫逃逸机制来实现相关治疗作用的[8]。 MSC 虽然在很多领域展现出极大潜力,但现今的研究仍面临很多挑战。临床试验虽然正在大力进行,但数据仍较为缺乏。临床前研究中,动物模型、干细胞来源、体外培养条件的优化选择目前都没有一个明确的规定。不同来源的人源干细胞分泌的细胞因子、分化方向也有很大差异。 2 安全风险因素 由于细胞自身生物学或实验操作等各种因素,干细胞在应用于临床或基础实验的过程中存在一定安全风险,主要可分为内源性风险、外源性风险及其他生物风险。 内源性风险主要包括:①干细胞肿瘤形成相关风险。干细胞具有不断增殖、对凋亡诱导不敏感等与肿瘤细胞相似的生长调控机制。有研究表明,胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)可引发良性或恶性的畸胎瘤,同时有研究表明高代次的鼠源MSC 可自发恶性转化。干细胞也可能影响体内已存在的肿瘤细胞的生长和扩增,即干细胞的“促瘤性”[9]。②干细胞免疫学相关风险。实验中需要考虑细胞的免疫原性和免疫调节性质带来的生物学风险。ESC 未分化前的免疫原性很低,但在分化后由于MHC 分子的表达可表现出较高的免疫原性。同时体外实验表明,ESC 和MSC 可通过调控T 细胞、单核细胞及NK 细胞等的增殖分化来调节生物免疫能力。③干细胞由于自身携带的传染性疾病、未知或罕见的病原体、遗传性疾病等而产生的风险。外源性风险主要包括:细菌、真菌、支原体及病毒污染[10],一般来自于实验操作、细胞库污染和动物基质细胞污染等方面[11]。与内源性风险相比,外源性风险污染途径多,防控更为复杂。 另外由于干细胞的体内归巢和分化机制仍不明确[12],干细胞进入机体内可能存在非靶向部位转移、目标以外的分化或去分化等风险。同时当大剂量的细胞被注射进入体内,可能阻塞在注射区域,严重的可导致注射区域组织坏死等情况。 3 临床前安全性研究概况 MSC 临床前安全评价一般分为两部分:一般毒性评价和干细胞特定安全评价。一般毒性评价包括行为观察、临床症状、血液生化测定、死亡率、组织病理检查等。干细胞特定安全评价包括致瘤性、生物分布等。其中一般毒性评价和一般生物制品的评价方式相似。另外目前针对干细胞特定的安全评价也已有一定的研究,但仍缺乏专门针对干细胞评价的相关文件规范进行指导。 干细胞安全评价实验设计中需考虑动物模型、给药途径、实验周期等相关因素。①动物模型:考虑到异种排斥,建议选择免疫缺陷或免疫抑制类动物,如NOD/SCID 小鼠、nu/nu 小鼠等,但也需考虑到该类动物寿命较短(12 ~ 18 个月),且可能产生自发肿瘤影响实验结果[13]。同时也有研究选择食蟹猴、狒狒等非人灵长类动物,这类动物模型存在数据采集困难、需进行免疫抑制操作等缺点。②给药途径:尽量和临床保持一致,实验中采用的给药途径主要有静脉注射、皮下注射和肌肉注射等方式。③实验周期:依据实验目的和动物种类的不同,需制定不同的实验周期。免疫缺陷的啮齿类动物的实验周期自8 d ~ 8 个月不等,但需考虑到超过 6 个月时动物可能产生自发性肿瘤,影响实 基金项目:国家重点研发计划课题(2016YFA0101503);中国食品药品检定研究院学科带头人培养基金(2015X1);“重大新药创制”国家科技重大专项(2015ZX09501007-004) 作者单位:100176 北京,中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心/药物非临床安全评价研究北京市重点实验室 通信作者:霍艳,Email:yanhuo@https://www.doczj.com/doc/3918014623.html, 收稿日期:2018-05-24

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