细胞生物学实验手册
第四版前言
这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制临床专业和研究生班。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附实验报告一册。
本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。
教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。现在第四版在1993年第三版基础上对部分实验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。
目录
前言
实验室规则 (1)
常用实验动物了解和解剖器械的使用 (2)
细胞生物学实验绘图方法与要求 (4)
实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量 (5)
实验二线粒体的活体染色及电镜照片观察 (8)
实验三液泡系的活体染色及电镜照片观察 (10)
实验四细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察 (11)
实验五细胞器的光镜切片和电镜照片观察 (13)
实验六细胞生理活动的观察 (16)
实验七细胞组分的化学反应 (20)
实验八细胞核与线粒体的分级分离 (23)
实验九细胞分裂的形态观察 (26)
实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备 (31)
实验十一细胞融合 (36)
实验十二应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本 (38)
实验十三培养细胞的形态观察和计数 (40)
实验十四细胞的原代和传代培养 (43)
实验十五酸性磷酸酶的显示 (46)
实验十六肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定 (48)
实验十七电镜生物标本的制备及镜下观察 (50)
实验十八整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察 (54)
实验十九免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原 (56)
实验二十姊妹染色单体互换标本制备与分析 (58)
实验二十一银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察 (60)
实验二十二染色体扫描电镜标本制备及观察 (63)
实验二十三细胞显微摄影 (65)
附录一离心机转数与离心力的换算表 (67)
附录二溶液的配制 (68)
主要参考资料 (77)
实验室规则
一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任
课教师请假。
二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。
三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。
四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。
五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设
备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。
损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。
六、注意节约实验材料、药品和水、电等。
七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材
清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。
八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。
九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。
常用实验动物的了解和解剖器械的使用
一、常用实验动物
常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。
在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。
蟾蜍
蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。
1．雌雄鉴别
通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。
2．捉拿及处死方法：
常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。
小白鼠
小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。
1．捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
2．处死方法：
处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。
3．给药方法：
小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm 后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。二、常用手术器械及操作方法：
1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。
2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。
3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。
4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。
5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。
6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。
7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。
常用手术器械
执手术刀的姿势
执手术剪的姿势
执手术镊的姿势
执手术刀、手术剪、手术镊的姿势
(张之曾编)
细胞生物学实验绘图方法与要求
一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例
关系)。
二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，
不得涂暗影或进行其它美术加工。
三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。
四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。
实验一动物细胞的基本形态观察和显微测量
实验目的
制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。
实验用品
一、材料和标本蟾蜍一只，人血液一滴。
二、器材和仪器配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。
三、试剂 1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。
实验内容
一、细胞的基本形态观察
(一)原理
细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。
不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。
(二)观察方法与结果
1．制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。
取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁(参照照片)。
2．蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察
剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。 3．蟾蜍肝脏压片的制备与观察
剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约2～3mm 3)肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。染色用甲基兰。显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形(参照照片)。
4．蟾蜍血涂片的制备与观察
取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图l一1)。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。
图1—1血涂片的制备
5．人血涂片的制备与观察
取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目少，为圆形。
6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察
用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。
二、测微尺的使用
(一)原理
测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米(1000μm)，被分为100格，每格长度是10微米。
(二)方法
1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图1—2)。
2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度
目镜测微尺每格代表的长度(μm)=X10
三、测量人口腔上皮细胞
从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。
作业
一、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度：
低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(μm)= μm
高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(μm)= μm
二、分别绘制所观察的6种细胞并注明基本结构。
三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。
计算细胞、细胞核体积的公式：
圆形 V=4/3πr 3(r为半径)
椭圆形 V=4/3πab2(a、b为长、短半径)
核质比 N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)
实验二线粒体(Mitochondrion)的
活体染色及电镜照片观察
实验目的
掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
实验用品
一、材料和标本兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml 注射器、吸管。
三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。
实验内容
一、兔肝细胞线粒体的活体染色
（一）原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
（二）方法
用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。
染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织
块脱离。
将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。
(三)结果
显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。
二、线粒体的光镜切片观察
用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
三．线粒体的电镜照片观察
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。
这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。
作业
绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。
(时伟红编)
实验三液泡系(Vacuolar system)的活体染色
及电镜照片观察
实验目的
掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结构。
实验用品
一、材料和标本蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。
二、器材和仪器光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、吸水纸。三、试剂 l／3000中性红染液、Ringer氏液(两栖类用)。
实验内容
一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察
(一)原理
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
(二)方法
取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液，染色8～lO分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。
(三)结果
显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。
二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察
动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。
大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液
泡系发达，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。
作业
绘制光镜下软骨细胞液泡系。
(时伟红编)
实验四细胞中的微丝染色及微丝
与细胞形态的实验观察
实验目的
掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。
实验用品
一、材料和标本盖片培养的成纤维细胞三片。
二、器材和仪器光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。
三、试剂 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。
实验内容
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应
(一)原理
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。
（二）细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察
1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。
2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。
3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。
4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
5．染色处理
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。
②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。
③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。
⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。
(三)结果
光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应
(一)原理
丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。
(二)方法
1．剪下一小块丽藻叶片(1～2cm)，置于载片上，盖上盖片。
2．观察（阳光充足时效果较好）。
3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。
4．洗去药物，再观察。
(三)结果
在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。
三、微丝的电镜照片观察
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。
作业
绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。
(时伟红编)
实验五细胞器的光镜切片
和电镜照片观察
实验目的
观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。
实验内容
一、三种细胞器的光镜切片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。
图5一l神经节细胞(示高尔基复合体)
(二)尼氏小体(Nissl’s Body)
甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。
图5—2 脊髓前角神经细胞的尼氏小体
(三)中心体(Centrosome)
铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。
染色体中心体
图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)
二、六种细胞器的电镜照片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。扁平囊约3～8层，它们平行排列，略弯曲成弓形。凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大部分不断脱离扁平囊，形成分泌泡。
(二)内质网(Endoplasmic Reticulum)
人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较发达，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。在粗面内质网的膜外表面附着许多小颗粒，即核糖体。
人胃粘膜盐酸细胞、小鼠睾丸间质细胞滑面内质网电镜照片：盐酸细胞分泌盐酸，细胞中密集的圆泡，无核糖体附着即滑面内质网，参加盐酸的合成。小鼠睾丸间质细胞中含有丰富的分支管状滑面内质网，合成固醇类的雄激素。
(三)中心粒(Centriole)
白血病细胞的中心粒电镜照片：中心粒是相互垂直的两个短筒状小体，从横切面看，每个短简由9组三联体微管组成。
(四)溶酶体(Lysosome)
小鼠肝细胞、人胃癌细胞溶酶体电镜照片：溶酶体为一层单位膜包围的囊状结构。溶酶体呈球形，质地均匀，吞噬性溶酶体依结合物不同而呈不同形态，溶酶体主要含酸性水解酶。
(五)核糖体(Ribosome)
小鼠肾细胞核糖体电镜照片：核糖体是由核糖核酸和蛋白质构成的大小亚基组成的椭圆形颗粒，附着于内质网上的称附着核糖体，此外还有散在于细胞质中的游离核糖体，而多个核糖体由mRNA串连在一起叫多聚核糖体。
(六)细胞核(Cell Nucleus)
豚鼠肝细胞核、人胃癌细胞核电镜照片：可见核膜由双层单位膜构成。内外核膜相距一定的距离结合形成核孔。核膜外层也附着核糖体并与内质网相通。
核中的海绵状球形结构就是核仁，它由纤维和颗粒构成。
在核膜内面和核仁四周，着色较深的为异染色质，其余着色较浅的是常染色质。
三、观察恒河猴脊髓前角运动细胞的电镜照片，总结细胞的超微结构
照片中是一个多角形的脊髓前角运动细胞，细胞表面以非常细的线条与周围分界，就是细胞膜。中央有圆形的细胞核，核膜密布核孔，核膜内侧少量着色深而致密的是异染色质，色浅的是常染色质。核中央海绵状的一团深色结构是核仁。细胞膜与核膜之间为细胞质。其中有许多膜性结构形成扁平囊状或管泡状，密集成排的膜上附有颗粒，这就是粗面内质网。分散于细胞质中内质网间的许多圆形或棒状膜结构是线粒体。在核的四周可见小泡，扁平囊等集合形成的高尔基复合体。在细胞质中还可见一些不规则形的黑色致密结构是脂褐质，细胞质基质中分散存在纤细的微丝和微管是细胞骨架成份。
(时伟红编)
实验六细胞生理活动的实验观察
实验目的
通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。
实验用品
一、材料和标本雄性蟾蜍、小白鼠、l％鸡血悬液、6％淀粉肉汤、草履虫。
二、器材和仪器光镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、移液管、试管、玻璃片、黑纸。
三、试剂 0.3％台盼兰、1％刚果红。
实验内容
一、细胞的吞噬活动
(一)原理
白细胞是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。它们有许多生理功能，如游走性、变形运动、趋化性、吞噬异物等。在白细胞中，以粒细胞、单核细胞的吞噬活动较强，故称此二类细胞为吞噬细胞。单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞。吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物。吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走，然后伸出伪足包围异物，并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞，继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物。
(二)小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察
l．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤O．5～1ml(含O．3％台盼兰，起标记作用)，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞(此步由教师在实验前进行完毕)。
2．实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％鸡血悬液0．5～1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。
3．1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注入O．5ml～1ml 生理盐水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。
4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。
5．镜检，高倍镜下画图记录所见结果。
二、暗视野观察细胞的纤毛和鞭毛运动
(一)原理
暗视野照明法是一种不使照射被检物体的光线直接进入物镜的照明方法。常常用它来观察没有染色的活体细胞或胶体粒子。利用此照明法，在镜检时不能直接看到通过标本的照明光线，只有被检物体反射或衍射的光线进入物镜可以提高分辨率，在暗视野中可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。
(二)自制遮光板变普通显微镜为“简单的暗视野显微镜”。
步骤：
1．将显微镜聚光器调到最高位，用低倍镜调焦至清楚。
2．取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。
3．放一块透明玻璃于载物台透光孔上，用尺子测量光圈孔径。
4．按照图6--1的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。
5．将中央遮光板放置在显微镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。
注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。
图6—1中央遮光板
a．光圈孔径
b．滤光片直径
(三)观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动
步骤：
1．用捣毁脑脊髓的方法处死蟾蜍。
2．腹部向上将蟾蜍固定在蜡盘上。
3．沿蟾蜍二侧口角向后剪开约l厘米，将下颌翻转固定在腹部。
4．在上颌中线距喉头1厘米处放置腊屑，观察腊屑向什么方向移动？记录腊屑开始移动到消失的时间(见图6--2蟾蜍口腔内面图)。
5．然后，用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌粘膜约232cm2小块，用牙签挑取剪下的粘膜，将纵切面贴于载片上。
6．加一滴生理盐水于载玻片标本上，加盖玻片，镜检。
图6—2 蟾蜍口腔内面图
结果：
1．在低倍镜下观察上颌粘膜细胞纤毛运动的现象。
2．换高倍镜仔细观察纤毛有规律的运动。
(四)暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动
步骤：
l．将前面实验所用蟾蜍沿腹中线开腹，暴露出黄色圆柱状精巢。
2．剪取一侧精巢于盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗去血污。
3．移取洗净的精巢于另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，加入数滴自来水混匀。
4．用吸管吸取平皿内液体，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待2～3分钟于镜下观察。
结果：
1．在低倍镜下可见到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构。
2．置高倍镜下观察：可见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使而运动的精子，测量鞭毛长度。
三、草履虫纤毛运动及食物泡的形成
图6—3 草履虫
草履虫是一种单细胞动物。虫体由一个细胞组成，能执行复杂的生理功能。
其体表，均匀密布纤毛，为运动细胞器。身体的前部有口沟，由前端斜向伸至体中部，口沟的底部为胞口，下部一短管斜向后部而入胞质，称胞咽。纤毛有规律的摆动使食物在胞咽聚结形成食物泡(吞噬泡)，最后脱离胞咽入胞质。食物泡随细胞质由体后端到前端不停环流，并与溶酶体(含酸性水解酶)融合，行使细胞内消化。
根据食物泡中刚果红指示剂的颜色变化(酸性时，为红色；近中性时，为黄色；碱性时，为蓝色)。可以观察到消化过程。
实验步骤：
1．取一滴草履虫培养液于载玻片上，放上几根棉花纤维，以减慢草履虫的运动。加盖玻片，制成临时装片。
2．观察草履虫的运动方式(观察时光线可调暗些)：可见镜下有许多样似倒置鞋底的草履虫，体表纤毛不断摆动，虫体以其中轴左旋前进，若遇阻力则试触后即刻回避而转向。 3．观察草履虫的食物泡的形成：
1)在盖玻片一侧加一滴l％的刚果红指示剂，用吸水纸从另一侧吸引使指示剂进入盖片下方，选一运动较迟缓的草履虫，移入高倍镜观察吞噬活动。
2)几分钟后可见草履虫体内出现许多红色食物泡，随着食物泡不停的在胞质中环流，食物不断消化，泡内酸性减弱或近中性，颜色渐渐呈黄色，食物泡渐小，最后食物泡颜色呈蓝色，不能被消化的残渣，环流到身体后部的胞肛排出，不排出时不易见到胞肛。
作业
1．画图记录细胞吞噬实验所见结果，小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的着色？
2．在观察细胞纤毛和鞭毛运动实验中,记录一下腊屑从开始运动到消失的时间。
3．鞭毛和纤毛有何异同？
(朱亚勤编)
实验七细胞组分的化学反应
实验目的
了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性
蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
实验用品
一、材料和标本蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。
二、器材和仪器光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。
三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh 苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)
实验内容
细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。
一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA
(一)原理
细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。
(二)方法
l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。
2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。
3．放入Carnoy固定液中固定l小时。
4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。
5．取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2～3次(2～3秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色2～3秒钟。
6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒钟。
7．放入纯二甲苯中透明5分钟。
8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。
9．镜下观察
（三）结果
细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。
二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示
（一）原理
由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
（二）方法
1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。
2. 将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。
3．放入5％三氯醋酸中60℃30分钟，抽提出核酸。
4．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。
5．滤纸吸干玻片上水分。
6. 一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。
7．清水冲洗，盖上盖片镜检。
（三）结果
经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质
存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。
三、细胞内过氧化物酶的显示
（一）原理
过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。
（二）方法
1．取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。
2．推片，室温晾干。
3．将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒~1分钟。
4．取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。
5．清水冲洗，放入1％番红溶液中复染2分钟。
6．清水冲洗，室温晾干。
7．镜检或封片后镜检。
（三）结果
涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。
四、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原(参照照片和示教片)
(一)原理
组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。
(二)方法
l．取l~2mm厚的肝组织块，用Carnoy氏液4℃固定4～6小时。
2．乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。
3．用70％乙醇展片。
4．脱蜡：二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100％乙醇5分钟→含1％火棉胶的乙醇液1分钟→70％乙醇1分钟。
5．直接浸入过碘酸酒精液反应5～15分钟，经70％乙醇洗片刻。
6．浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。
7．亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。
8．流水冲洗3～5分钟。
9．蒸馏水洗。
10．浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒，使细胞核着色。
11．脱水：95％乙醇3分钟二次→100％乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。 12．加盖片镜检或树胶封固后镜检。
(三)结果
细胞中呈紫红的颗粒即为糖原(参照照片)。
五、苏丹Ⅲ染色——显示细胞内脂肪(示教片)
作业
1．用彩色笔绘出Brachet反应及PAS反应的镜下所见。
2．说明着色的碱性蛋白可能是什么物质?
(纪晓辉编)
实验八细胞核与线粒体的分级分离
实验目的
通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
实验用品
一、材料和标本小白鼠、冰块。
二、器材和仪器玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
实验内容
一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取
(一)操作步骤
1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
(二)结果
分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。
三、高速离心分离提取线粒体
(一)操作步骤
1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。
2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm 离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol ／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。
3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。
(二)结果
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
作业
1．简要说明分级分离细胞的原理及意义。
2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实验结果中纯度如何？
2．描述一下涂片⑤所见结果。
小白鼠
脱颈椎处死，迅速开腹
剪取肝组织
0.9％NaCl洗涤，称1g剪碎加8ml预冷的0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液
匀浆
过滤，滤液移入离心管，滤
液涂片①
2500rpm，15分钟
滴片滴片
詹纳斯绿B染詹纳斯绿B染
色④盖片色⑤盖片
镜检油镜检
图8—1 细胞核和线粒体分离图解
(朱亚勤编)
实验九细胞分裂的形态观察
实验目的
通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。
实验用品
一、材料和标本蛙血涂片、马蛔虫子宫切片和洋葱根尖切片、固定的蝗虫精巢。
二、器材和仪器显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。
三、试剂 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋红染液、45％醋酸、二甲苯。
实验内容
细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。
一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片
(一)原理
无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami—tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。
蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。
(二)观察与结果
在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成熟的红细胞小。
二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖切片
(一)原理
细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。
马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。
(二)观察
1．动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片
取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。
图9—1马蛔虫受精卵的有丝分裂
间期(Interphase)
细胞质内有两个近圆形的细胞核，一为雌原核，另一为雄原核。两个原核形态相似不易分辨，核内染色质分布比较均匀，核膜、核仁清楚，细胞核附近可见中心粒存在。
分裂期(Mitosis)
前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色体相互混合，两个中心粒分别向细胞两极移动，纺锤体开始形成。
中期(Metaphase)染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板，由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观的两种不同现象，侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连；极面观由于染色体平排于赤道面上，六条染色体清晰可数，此时的染色体已纵裂为二，但尚未分离。
图9—2 洋葱根尖细胞有丝分裂
后期(Anaphase)纺锤丝变短，纵裂后的染色体被分离为两组，分别移向细胞两极，细胞膜开始凹陷。
末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态，核膜、核仁重新出现，最后细胞膜横缢，两个子细胞形成。
2．植物细胞有丝分裂的观察——洋葱根尖切片
将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察，寻找生长区，这部分的细胞分裂旺盛，大多处于分裂状态，细胞形状呈方形。换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征．与动物细胞有丝分裂特征比较，找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。
三、蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察
(一)原理
减数分裂(Meiosis)是配子发生过程中的一种特殊有丝分裂，即染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，结果使染色体数日减半的过程。减数分裂过程中体现了遗传三定律，所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着重要作用。
蝗虫精巢取材方便，标本制备方法简单，染色体数日较少，例如，蝗虫初级精母细胞染色体数2n=22+X，经过减数分裂形成四个精细胞，每个精细胞的染色体数为n=ll+X或n=11(注：蝗虫的性别决定与人类不同，雌性有两条X染色体、雄性为XO，即只有一条X染色体，没有Y染色体)，一般多采用它来研究观察减数分裂染色体形态变化。
(二)蝗虫精巢压片标本的制备
l．采集采集到各期分裂相的标本是实验成功的关键，解决这一关键要把握两点(1)时间：沈阳地区采集，一般在8月15至25日为宜；(2)虫体特征：雄虫翘膀长到刚好盖住腹部一半时，正好是雄虫精子发生的峰季，采集最适。在公园、田埂、河边、路旁的草丛中均可采到。
2．取材将采到的雄虫，用大头针固定在木板或纸盒上，沿腹部背中线剪开体壁，见
消化管背侧的浅黄色结构即是精巢，用镊子分离出来。
3．固定把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小时，在期间用大头针小心分离精细管，加速固定，促进脂肪溶解。固定后移入70％乙醇中存放于4℃冰箱备用。
4．染色取固定好的精细管2～3条，置于干净载玻片中央，用45％醋酸处理5分钟，用吸水纸吸干后，加1～2滴醋酸洋红染色15分钟。
5．压片在染色材料上盖上盖玻片，再在盖玻片上放一块吸水纸，用大拇指垂直在盖玻片上适力下压(压片时不要滑动盖片)使精细管破裂细胞平展开，吸去溢出的染液，即可观察。
(三)蝗虫精子发生过程减数分裂的镜下观察(参照照片)
蝗虫精巢是由多条圆柱形的精细管组成，每条精细管由于生殖细胞发育阶段的差别可分成若干区，良好压片可见到从游离的顶端起始依次为精原细胞、精母细胞、精细胞及精子等各发育阶段的区域。
1．精原细胞(Spermatogonia) 位于精细管的游离端，胞体较小，由有丝分裂来增殖，其染色体较粗短、染色较浓。
2．减数分裂I(Meiotic division I) 减数分裂l是从初级精母细胞到次级精母细胞的一次分裂。
(1)前期I(Prophase I)在减数分裂中，以前期I最有特征性、核的变化复杂，依染色体变化，又可分为下列各期：
细线期(Leptotene stage)染色体呈细长的丝，称为染色线。弯曲绕成一团，排列无规则，染色线上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。
偶线期（zygotene stage）同源染色体开始配对，同时出现极化现象，各以一端聚集于细胞核的一侧，另一端则散开，形成花束状。
粗线期（Pachytene stage）每对同源染色体联合完成，缩短成较粗的线状，称为双价染色体，因其由四条染单体组成，又叫四分体。
双线期(Diplotene stage)染色体缩的更短些，同源染色体开始有彼此分开的趋势，但因两者相互绞缠，有多点交叉，所以这时的染色体呈现麻花状。
终变期(Diakinesis) 染色体更为粗短，形成Y、V、O等形状，终变期末核膜、核仁消失。
(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，纺锤体形成，双价染色体排列于赤道面，着丝点与纺锤丝相连。这时的染色体组居细胞中央，侧面观呈板状，极面观呈空心花状。
(3)后期I(Anaphase I)由于纺锤丝的解聚变短，同源的两条染色体彼此分开，分别向两极移动。但每条染色体的着丝粒尚未分裂，故两条姐妹染色单体仍连在一起同去一极。
（4）末期I(Telophase I>移动到两极的染色体，呈聚合状态，并解旋，同时核膜形成，胞质也均分为二，即形成两个次级精母细胞，这时每个新核所含染色体的数目只是原来的一半。到此减数分裂I结束。
3．减数分裂Ⅱ(Meiotic divisison Ⅱ)减数分裂Ⅱ类似一般的有丝分裂，但从细胞形态上看，可见胞体明显变小，染色体数目少。
(1)前期Ⅱ(Prophase Ⅱ)末期I的细胞进入前期Ⅱ状态，每条染色体的两个单体显示分开的趋势，染色体象花瓣状排列，使前期Ⅱ的细胞呈实心花状。
(2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)纺锤体再次出现，染色体排列于赤道面。
(3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)着丝粒纵裂，每条染色体的两条单体彼此分离，各成一子染色体，分别移向两极。
(4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到两极的染色体分别组成新核，新细胞的核具单倍数(n)的染色体组，胞质再次分裂，这样，通过减数分裂每个初级精母细胞就形成了四个精细胞。 4．精子形成在两次精母细胞分裂过程中，各种细胞器，如，线粒体、高尔基体等也大致平均地分到四个精细胞中，精细胞经一系列的分化成熟为精子。镜下精子头部呈梭形，由细胞核及顶体共同组成，尾部细长呈线状。
作业
一、说明动植物细胞有丝分裂的区别。
二、绘制马蛔虫受精卵有丝分裂的各期细胞图像，并注明结构名称?
三、小结有丝分裂与减数分裂过程的异同点。
(谢荣林编)
实验十正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备
实验目的
掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤细胞核型的一般特征。
实验用品
一、材料和标本健康人的外周血、培养的HeLa细胞和HL—60细胞。
二、器材和仪器超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管(10m1)、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、培养皿、注射器(5ml、lml)、注射针头(7号、号)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。
三、试剂 1640培养液、500单位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、0.075mol／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(pH6.8)、生理盐水等。
实验内容
一、微量全血培养
细胞生物学实验指导
细胞生物学实验指导目录 一．显微镜的使用 实验一、几种光学显微镜的使用 实验二、参观电子显微镜及生物超薄切片标本制备 二．细胞形态结构 实验三、细胞大小的形态观察——测微尺的使用 实验四、细胞活体染色技术 实验五、植物细胞骨架光学显微观察 实验六、胞间连丝观察 三．细胞化学 实验七、鉴定RNA的细胞化学方法——Branchet反应 实验八、DNA显色的观察——Feulgen反应 实验九、固绿染色法鉴定细胞内酸性蛋白与碱性蛋白 实验十、多糖及过氧化酶的显示 实验十一、核仁组成区的银染显示与观察 四．细胞生理 实验十二、细胞膜的通透性 实验十三、细胞电泳 五．细胞和组织培养技术 实验十四、植物原生质体的分离和融合 实验十五、植物细胞的培养与观察 实验十六、动物细胞融合 实验十七、动物细胞的培养与观察 六．细胞化学成分的分离 实验十八、细胞器的分离、纯化——细胞分级分离 实验十九、荧光的细胞化学测定 实验二十、细胞活力的鉴别 实验一几种光学显微镜的使用
一、实验目的 了解几种光学显微镜的结构、工作原理、主要用途和使用方法；掌握使用普通显微镜提高分辨力的方法。 二、实验原理 (一)基本原理 一般实验室经常使用的光学显微镜都是由物镜、目镜、聚光器和光阑组成，普通显微镜它们的放大原理及光路图如下： AB物体．A1B l第一次成像，A2B2第二次成像，O l目镜．O2物镜， F1为O l的前焦点，F2为O2的前焦点 各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。 (二)几种光学显微镜 l、普通光学显微镜： 普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。它适于观察一般固定的，有色的透明度较高的标本。其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、机械和电子三大系统。 2、暗视野显微镜： 暗视野显微镜是以丁达尔现象(Tyndall phenomenon)(即光的微粒散射现象)为基础设计的,它使用了特殊的聚光器进行斜射照明,因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0．2—0．004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。而暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切。它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜。使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。 3、相差显微镜： 相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
1. 什么是细胞培养？ 细胞生物学实验 指从动物活体体内取出组织，并将其分散为单个细胞（机械或酶消化），在体外模拟体内的生理环境，使其在人工培养条件下保持生长、分裂繁殖、细胞的接触性抑制以及细胞衰老过程等生命现象。 最常见的细胞一般有两种，一种是原代细胞，另一种是传代细胞。 原代细胞是指动物组织经过胰酶或胶原酶等酶类的消化，使其分散，从而获得单个细胞，再使这些单个细胞生长于培养容器中的过程。大多数组织可以制备原代细胞，但制备的方法略有不同，制备的细胞生长快慢及难易程度也不相同。 不同的原代细胞，其形态也不尽相同。一般将10代以内的细胞称之为原代细胞。 传代细胞一般指无限繁殖的细胞系，理论上这类细胞可以无限次的传代。做实验的时候也会经常使用这类细胞，如Hela、293、Vero 等细胞。 2. 细胞的生长周期 游离期：细胞刚接种到新的培养容器中到贴壁前的一段时期，这个时期的长短由细胞类型决定，从几分钟到几个小时不等。 贴壁期：细胞从游离状态变为贴附到培养器皿表面并展现出一定细胞形态的时期。 潜伏期：细胞在完成贴壁后，并不会马上进行增殖，会进行增殖所必须的物质和能量的储备，这个时候称之为潜伏期。
对数生长期：细胞在完成物质和能量储备后，开始大量的增殖的时期。这个时期的细胞活力旺盛，且状态稳定，我们所做的绝大多数实验都是在这个时期开展的。 停止期：随着细胞的生长，细胞密度越来越大，由于营养物质的消耗、细胞间的接触抑制等因素，细胞生长缓慢，甚至停止生长。这个时候，我们就要给细胞进行传代了，使细胞可以继续进行增殖，保持旺盛的活力。 3. 细胞生长所需要营养条件 细胞的培养所需要的营养成份一般来自于基础培养基（比如DMEM培养基）和血清。 基础培养基：主要是提供细胞生长所需要的氨基酸（组成蛋白质的基本单位）、维生素（细胞代谢中辅酶的组成成分）、无机离子（K+，Na+等）、碳水化合物（碳源和能量来源）和一些激素等营养物质。 血清：主要是提供一些基础培养基不能提供的生长因子和低分子的营养物质，此外它还有促进细胞的贴壁、中和有害重金属离子等作用。如果只提供基础培养基而不提供血清，绝大多数细胞是无法生长的。血清对于我们实验的重要性就不言而喻了，那么什么样的血清才算是合格的血清呢？ 合格的血清需要通过各种检测，包括无细菌，无真菌，无支原体检测，无病毒污染。血清一般呈现为淡黄色，透明状液体，由于含有大量的蛋白质等成分，会略有黏稠。以全式金公司的TransSerum EQ Fetal Bovine Serum (FS201-02)为例，它通过了牛腹泻病毒、牛副
生物学实验原理与技术教学大纲 10.1教学任务： 本课程由植物生物学、生理学、微生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、生物化学和分子生物学等方面相关的实验理论知识、实验技术和实验方法组成，是一门与实验课相衔接的实验理论讲授课程，各部分内容在实验课开课前统一进行集中讲授，学生课后预习，为学生进行的实验操作奠定了理论基础。 10.2教学要求： 本课程是各门基础实验课程的前导课，涉及各个实验项目的原理与基本技术方法。因此，要求学生在实验前认真听教师讲解相关基础知识，积极思考、认真记录。课后认真复习、认真回答思考题，并参加每次实验前的预习测试。 10.3教学目的： 使实验课程与理论课程合理衔接，加强学生对实验的相关理论知识的理解与掌握，促进学生充分预习和对即将进行实验的基本技术和基本方法全面的理解。为学生进行的实验操作奠定理论基础。 11．学生应掌握的实验技术及实验能力 本课程是一门与实验课相衔接的实验理论讲授课，涉及8门生物学基础实验课程的实验原理、技术和方法。具体内容包括显微镜技术、分离类胡萝卜素和叶绿素、提取叶绿体色素、观察叶绿素的荧光现象、观察光对叶绿素的破坏作用、测定种子发芽率、观察呼吸运动的调节、麻醉家兔、气管插管、制备蛙类坐骨神经腓肠肌标本、证实反射弧的完整性与反射活动的关系、验证心肌有效不应期较长的特征、观察蛙期前收缩与代偿间歇、钝性分离气管、无菌操作技术、微生物
简单染色方法、血球计数板的使用、灭菌锅的使用方法、微生物分离纯化技术常规微生物涂片观察技术微生物培养技术、菌种保藏技术、无菌操作技术、微生物简单染色方法、血球计数板的使用、灭菌锅的使用方法、微生物分离纯化技术、常规微生物涂片观察技术、微生物培养技术、菌种保藏技术、显微镜技术、观察胀泡的形成、鉴别纺锤体、鉴别姐妹染色单体、植物染色体制片技术、染色体臂形成、观察细胞内多糖的分布、观察细胞内DNA的分布、原代细胞培养、传代细胞培养、细胞的消化分散、观察细胞融合的现象、詹纳斯绿染色、PEG诱导鸡静脉血的化学融合、植物组织培养技术、制作石蜡切片及HE染色、核酸的乙醇沉淀、测定RNA含量、测定核酸含量、定磷法测定核酸的含量、地衣酚法测定RNA含量、预处理组织、匀浆组织、提取核酸、核酸核蛋白（RNP）苯酚分离、剥离凝胶板、自溶处理、超声破碎、制冰盐浴、目测酶活力、免疫小鼠、颈部皮下注射抗原、腹腔注射抗原、统计处理数据、梯度稀释血清、离心分离血清、摘眼球取血、测抗体效价、体外重组DNA、连接DNA片段、凝胶回收DNA、CaCl2法制备感受态、转化外源DNA、PCR扩增、DNA琼脂糖凝胶电泳、碱裂解法提取质粒、蓝白斑筛选、限制性内切酶使用等。 本课程还加入了安全环保及习惯教育内容。主要内容包括火灾预防与逃生常识，触电防护知识，烧烫伤处理方法，实验室有毒废弃物处理常识，实验动物尸体处理常识，实验习惯教育及实验室环保教育等。 12．开设实验项目 开设实验项目一览表
细胞生物学实验 实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的] 通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。 通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。 [实验原理] 应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。 该实验完成需时6学时。 [实验材料、试剂和仪器] 一、仪器 普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。 二、材料 洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。 三、试剂 生理盐水，10μg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存） [实验步骤] 一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。 2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。 3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。 4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。 5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。 二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞 1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生
细胞生物学实验测试题 1、试述荧光显微镜的原理和用途。（并操作） 原理：荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。 （滤光镜片：获得所需波长的激发光；光源：高压汞灯） 用途：荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光； 另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研 究的工具之一。 2、试述酸性磷酸酶显示法的原理及主要步骤。 原理：酸性磷酸酶（ACP）是溶酶体的标志酶，通常酸性磷酸酶在pH 为5左右时发挥作用能水解磷酸酯而释放出磷酸基，PO43-与底物中硝酸 铅反应生成磷酸铅沉淀物。由于这些沉淀物是无色的，需再与黄色的硫化 铵反应，生成棕黄色到棕黑色的硫化铅沉淀而被显示出来。其反应过程如 下： β-甘油磷酸钠+酸性磷酸酶→甘油+PO43- PO43-+Pb(NO3)2 →Pb3(PO4)2↓ Pb3(PO4)2+(NH4)2S →PbS↓(棕黑色) 主要步骤： 1、前处理：获取小白鼠或大白兔腹腔液（猪肝） 2、制片： （1）、将腹腔液（肝细胞悬液）滴一滴于冰冻的干净载玻片上，用牙签涂开，自然干燥。 （2）、放入10%中性福尔马林固定液中固定30min。 （3）、蒸馏水中漂洗,3-5次。（洗去固定液） （4）、磷酸酶作用液，37°C，30Min。 （5）、蒸馏水中漂洗3次，5min一次。（洗去游离铅离子） （6）、1%硫化铵处理（3-5min）; （7）、吉姆沙染液复染15min;（使细胞核、轮廓显示出来） （8）、制片观察。 结果：阳性细胞内有大小不等的棕色或棕黑色的颗粒即为酸性磷酸酶。 对照实验：标本放入作用液前先用高温（50℃）处理 30min，使酶失去活 性，做好标记，其他步骤相同。 3、试述DNA的Feulgen染色法的原理及主要步骤。 原理：DNA经稀盐酸（1mol/L HCL溶液）处理后，可使嘌呤碱与脱氧
细胞生物学实验指导 细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步,所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。 实验一普通显微镜及其使用（装片观察） 一、目的要求： 1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。 2、参观了解其他各类显微镜。 二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。 三、方法和步骤： 1、介绍普通光学显微镜的构造 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。 光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。 2、油镜的原理及使用方法 原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。 3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。 4、注意事项： （1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。 （2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍已干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜
头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。 5、观察几种细菌标本片。 6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。 四、作业及思考题： 1、油镜的原理是什么？ 2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？ 实验二、细胞膜的渗透性 实验目的 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验原理 将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。 实验用品 一、器材 50ml烧杯, 试管（1～10cm）, 10ml移液管, 试管架。 二、材料 羊血。 三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。 实验方法 一、羊血细胞悬液 取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透 明的红色液体，此即稀释的羊血。
实验室规则和要求 一般规定 1.上课第一天请先熟悉环境，牢记“安全”是进行任何实验最重要的事项。 2.在实验室内请穿著实验衣（最好长及膝盖下），避免穿著凉鞋、拖鞋（脚 趾不要裸露）。留有长发者，需以橡皮圈束于后，以防止引火危险或污染实验。 3.在实验室内禁止吸烟、吃东西、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑，食 物饮料勿存放于实验室的冰箱中，实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服外 套及杂物等。 4.所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有，不得携出实验室外。每 组分配之仪器、耗材请在课程开始前确定清点与保管，课程结束后如数 清点缴回。公用仪器请善加爱惜使用。实验前后，请把工作区域清理擦 拭，并随时保持环境清洁。 5.实验前详阅实验内容，了解实验细节的原理及操作，注意上课所告知的 注意事项。实验进行中有任何状况或疑问，随时发问，切勿私自变更实 验程序。打翻任何药品试剂及器皿时，请随即清理。实验后，适切记下 自己的结果，严禁抄袭，确实关闭不用之电源、水、酒精灯及瓦斯等。 6.身体不适、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中，请立即停止实验。 实验时间若延长，请注意时间的管制及自身的安全，不可自行逗留实验 室。 7.实验完毕，请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及冷气，离开实验 室前记得洗手。 8.任何意外事件应立即报告教师或实验室管理人员，并应熟知相关之应变 措施。
药品 1.使用任何药品，请先看清楚标示说明、注意事项，翻阅物质安全资料， 查明是否对人体造成伤害，使用完毕请放回原位。 2.新配制的试剂请清楚注明内容物、浓度、注意事项及配制日期，为避免 污染，勿将未用完的药剂倒回容器内。 3.挥发性、腐蚀性、有毒溶剂（如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、 -巯基乙醇、甲醛、酚等）要在排烟柜中戴手套量取配制，取用完应随即盖好盖子，若不小心打翻试剂，马上处理。 4.有毒、致癌药剂例如丙稀酰胺（神经毒）、溴化乙啶（突变剂）、SDS（粉 尘）请戴手套及口罩取用，并勿到处污染，脱下手套后，养成洗手的好 习惯。 5.使用后的实验试剂和材料，应放在专用的收集桶内。固体培养基、琼脂 糖或有毒物品不得倒入水槽或下水道中。 6.使用刻度吸管取物时，切勿用嘴吸取，请用自动吸管或吸耳球。 仪器 1.使用仪器前先了解其性能、配备及正确操作方法，零件及附件严禁拆卸， 勿私自调整，并注意插座电压（110V或220V）之类别。 2.使用离心机时，离心管要两两对称、重量平衡，离心机未停下不得打开 盖子。冷冻离心机于开机状态时，务必盖紧盖子，以保持离心槽之低温并避免结霜。 3.电源供应器有高电压，切勿触摸电极或电泳槽内溶液，手湿切勿开启电 源。
细胞生物学发展简史公司内部编号：（GOOD-TMMT-MMUT-UUPTY-UUYY-DTTI-
细胞生物学发展简史 一细胞的发现和细胞学说的建立 1665年，英国学者Robert Hooke用自制的显微镜观察栎树软木塞的薄切片，发现了其中有许多蜂窝状的小室，并将这些小室命名为cell。实际上当时看到的是植物细胞的细胞壁。此后，生物学家用cell一词描述生物体的基本结构单位，中文翻译为细胞。Hooke对有关细胞的首次描述见于1665年他的《显微图谱》中，因此人们认为细胞的发现是在1665年。 真正观察活细胞的是荷兰科学家Antony von Leeuwenhoek，他用设计较好的显微镜观察池塘水中的原生动物、蛙肠道内的原生动物、人类和哺乳动物的精子，并于1674年在观察鱼的红细胞时描述了细胞核的结构。 由以上可见，细胞生物学的基础建立于17世纪，并且Hooke和Leeuwenhoek两位科学家为此做出了重要贡献。 在Hooke发现细胞后的近170年中，人们用光学显微镜相继发现了一些不同类型的细胞，但对细胞的认识基本上没什么新的进展。直到19世纪30年代，显微镜制造技术有了明显的改进，分辨率提高到1μm以内；同时还由于切片机的制造成功，从而对细胞的观察有了许多新的进展，细胞核、核仁、细胞的原生质等被揭示，人们才真正认识到细胞的生物学意义。 1838~1839年，德国植物学家Scheleiden（1838年）和动物学家Schwann （1839年）总结前人的工作，综合了植物和动物组织中细胞的结构，提出了“细胞学说（cell theory）”，指出“一切生物，从单细胞生物到高等动、植物都是由细胞组成的；细胞是生物体结构和功能的基本单位”。后来德国科学家
16考研厦大生科院初试第一，分享备考经验+复试环节 本人是华侨大学的，2016届考厦大生科院，是聚英厦大考研网的学员，今年以初试第一，复试第七名的成绩考进厦门大学生命科学院，广大研友的要求分享一下我的备考经验：包括初试经验分享（已更新），考研时间规划和所用书籍，包括初复试环节和复习注意事项，十分详尽，希望同学们做好笔记~ 环节一、初试 1.考研初试分数分配 初试科目： 英语：100 政治100 832生物化学：150 620细胞生物学150 厦大生科院近几年分数线： 2014年：322分2015年：310分2016年：310分 近几年生命科学院专业课压分比较严重，所以与厦大理科基本保持一致，而厦大理科线每年浮动小，如果没有重大改革，分数线不会有较大变化。总体来说，厦大生科院较之其他学院，虽然分数线比较低，但试卷题目难度大，而且招生特点是宁缺毋滥，近两年都收不满，都需要调剂，调剂的原则上要求考生是985/211的院校出身。 2.620细胞生物学的初试情况 2016年620试卷分数分配 选择题15题，30分；名词解释5题，30分；问答题2题，30分；英译汉3题，30分；实验题3题，30分。 其中选择题、名词解释、问答题最基础，但是以16年情况来看，出的偏题怪题比较多，这类题型主要来自中科院生物学的往年考研题，大家可以关注一下。而英译汉的题型要求熟记基本名词解释的英文，重点掌握关于癌症和癌细胞、生态系统。实验题基本上是厦大生命科学院常用的一些实验技术，重点掌握蛋白质与蛋白质之间的相互作用。另外2015年及之前每年都有考到RNA干扰，但2016年没考，该技术很可能会被基因编辑CRISPR所取代，16年复试有考，要重视这个动向。 关于初试的目标分数，建议至少要考到320分，因为如果初试分数太低，复试很容易被淘汰。由于厦大生科院专业课压分比较严重，主观题给的分数低，政治和英语的平均分最好都要过60,620分子生物细胞学和832生物化学平均要达到100分，这样总分加起来：60+60+100+100=320分，初试基本上没有问题。 在这里推荐一下聚英厦大的英语政治的暑期强化班和最后冲刺班，会邀请北京的大牛老师像陈正康、李海洋来讲课，一方面你可以把握一下考试重点在哪里，另一方面尤其是英语可以学到很多非常实用的应试技巧。专业课的话，推荐聚英官网的《620分子细胞生物学复习全书》和《620分子细胞生物学实验用书》，可以帮你梳理知识点，把握核心考点。 2017厦大生科院考研资料
实验一普通光学显微镜的构造和使用 一、目的要求 1了解显微镜的基本构造和使用方法 2 掌握油镜的原理和使用方法 二、显微镜的基本结构及油镜的工作原理 1．显微镜的基本构造 光学部分：接目镜、接物镜、照明装置（聚光镜、虹彩光圈、反光镜等）。 机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。 2．显微镜的放大倍数和分辨率 放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力3．油镜的使用原理 当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、器材 1．永久切片 2. 溶液或试剂：香柏油、二甲苯。 3. 仪器或其他用具：显微镜、擦镜纸等。 四、操作步骤 1．观察前的准备 （1）显微镜的安置，检查零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光源 2．显微镜观察
（1）低倍镜观察 （2）高倍镜观察 （3）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3．显微镜用毕后的处理 观察完毕，上升镜筒，用擦镜纸和二甲苯清洗镜头，后将镜体全部复原。 五、思考题 1．用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间滴加什么油？起什么作用？ 2．为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？ 实验二胞间连丝的观察 一、实验目的 观察植物细胞的胞间连丝，加深对胞间连丝功能的认识． 二、实验原理 植物细胞的细胞壁上有许多原生质的细丝，称胞间连丝。相邻细胞的胞间连丝相互联接，在细胞间的物质运输与信息传递中起桥粱作用，并使细胞的各种生理活动协调一致，使植物体成为统一的有机体。用合适的植物细胞为材料，经简单处理，即能方便地看到胞间连丝。 三、实验材料 红辣椒表皮细胞临时装片、柿胚乳细胞间胞间连丝切片 四、实验步骤
生物学一级学科（专业）攻读硕士学位研究生培养方案 （专业代码：） 一、培养目标 本学科培养的研究生，要热爱祖国，崇尚科学，诚实守信；应能较好地掌握辨证唯物主义的原理与方法，具有良好的科学素养和合作精神，学风严谨，谦虚、进取、敬业，有较强的事业心和社会责任感；具有健康的身体和心理素质。 本学科研究生应掌握扎实宽广的生物学基础理论和系统的各自相关的专业知识与实验科研技能，掌握一门外语（一般为英语）；具有从事科学研究工作或独立担负专门技术工作的能力。毕业后可从事生命学科及相关学科的科研、教学、环境保护及科技管理等方面的工作。 二、二级学科各专业及研究方向 1. 植物学 2. 动物学 3. 微生物学 4. 遗传学 5. 发育生物学 6. 细胞生物学 7. 生物化学与分子生物学 8. 海洋生物学 9. 生物物理学
三、学制与学习年限 全日制硕士研究生的学制为3年，在校学习期限为2-4年。3年制硕士研究生可申请提前毕业，最长提前时间不能超过一年。成绩优秀，提前完成论文、且在SCI刊物上发表与毕业论文有关的研究论文者，硕士论文经学位委员会指定的3人以上指导小组预答辩，推荐进行硕士论文答辩方可向学校申请。 四、培养方式 1．根据宽口径、厚基础的原则，本学科按生物学一级学科招收硕士研究生，按一级学科开设专业基础课程，在学生进入到实验室后，由导师或导师组对学生进行专业知识和专业技能的培训，完成相应的专业学习。 2．本学科鼓励开展硕士研究生的“三种经历”工作，即海外学习经历、第二校园经历和社会实践经历，在海外学习经历、第二校园经历中实行双导师合作培养。 五、应修总学分数 硕士生的课程学习一般为一年，应修总学分不少于30学分，其中必修课不少于22学分（含前沿讲座与社会实践），选修课不少于8学分；具体课程见课程设置一览表。 六、课程的类别及设置 硕士研究生课程分为必修课与选修课两大类，具体课程见课程设置一览表。 1、必修课22学分
细胞培养基本理论 一细胞培养概述 细胞培养（cell culture）模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 群体培养（mass culture）将大量细胞置于培养瓶中，让其贴壁或悬浮生长，形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。 克隆培养（clone culture）即将少数的细胞加入培养瓶中，贴壁后彼此间隔距离较远，经过繁殖每一个细胞形成一个集落，称为克隆。 组织培养（tissue culture）指把活体的组织取出，分成小块，直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。 特点：1.，组织不失散，细胞保持原有的组织关系。2，形成生长(cut growth)或形成由扁薄细胞构成的单层细胞培养物。3，在体外生长时，细胞间呈相互依存、互相影响的关系。 器官培养（organ culture）将活体中器官或器官一部分取出，在体外生长、生存，并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。 特点：1，培养的器官在合适的条件下能生长和分化，存活数周或1 年。2，观察受限，只能用组织切片的方法观察或用透射电镜、扫描电镜观察。 细胞培养优点：.1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性；2．可控制：各种物理、化学、生物等因素可调控；3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记；4．应用广：不同物种、年龄、组织，正常或异常缺点：人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同；当细胞被置于体外培养后， 生活在缺乏动态平衡的环境中，时间久了，必然发生变化。 三细胞的形态和类型由不同生长方式造成的差异 呈悬浮生长时，因生长在液体环境中，胞内渗透压高于周围液体环境，因此胞体基本呈圆形。呈贴附于支持物上生长的细胞，开始为圆形，很快过渡成扁平形，并逐渐恢复至原先的细胞形态. 细胞来源：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 细胞按生长方式：贴壁型细胞（Monolayer cells）；悬浮型细胞（Suspension cells）绝大多数有机体细胞属贴壁型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 按细胞形态(贴壁细胞）：成纤维型细胞；上皮型细胞；其它，不定型 贴壁型生长细胞或锚着依存性细胞 处于体外培养状态下的贴附生长型细胞在形态上表现单一而失去了在体内原有的某些特征。形态各异反映其胚层起源。如来源于内外胚层的细胞多呈上皮型；来自中胚层的则易呈成纤维细胞型。分为成纤维型细胞；皮型细胞；游走型细胞；多形型细胞 贴壁型细胞形态比较 成纤维型细胞：梭形或不规则三角形；中央有卵圆形核；胞质向外伸出长短不同的突起；中胚层间质起源 上皮型细胞：扁平不规则多角形；细胞中央有圆形核；紧密相连单层膜样生长；内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等 游走型细胞：散在生长，一般不连成片；细胞质经常伸出伪足或突起；活跃的游走或变形运动；羊水细胞培养的早期 多形细胞型：难以确定规律和稳定的形态；如神经组织的细胞等
细胞生物学实验 1 考核方式 平时实验记录，实验报告，实验操作，考试笔试 2 考核内容 仪器设备使用；所开设实验：实验原理、步骤作用、试剂作用、结果分析、注意事项、实验异常原因分析；其它：实验安全，试剂使用注意事项，试剂配制，试剂标签包括的内容，等等。 2.1仪器设备使用 本课程重点掌握：普通双目显微镜，离心机，微量取液器，组织匀浆机 一般通用仪器：电子天平，恒温水浴，恒温培养厢，低温冰箱，烧杯，量筒，容量瓶，离心管，血球计数板。 生物技术专业加：系统显微镜及其自动曝光系统 2.2 开设实验 细胞化学：细胞总体蛋白和碱性蛋白的定位 理解运用固绿染色原理（例：pH5.5固绿染色的是哪些蛋白质？） 蛋白质两性电解质性质 固绿染色特点 细胞内蛋白质酸碱性 10%福尔马林作用？ 5%三氯乙酸作用？ 染色异常的原因分析 实验成功需要注意事项？ 细胞化学：孚尔根（Feulgen）DNA染色法 理解运用实验原理。 固定液有什么作用？ 热盐酸处理的作用？ Schiff试剂的有效成分是什么？ 漂洗液的有效成分是什么，有什么作用？ 显示DNA时，根材料的哪部分最好？ 显微镜下怎样分辨细胞的间、前、中、后、末五个时期？ 一个良好的压片至少具备哪些特征？（列举3个） 实验成功的关键是什么？ 细胞生理：细胞膜的通透性 理解运用实验原理。 能够从实验数据推理，得出结论。（例：从下表中数据和描述，你能得出什么结论？）从EXCEL制图。 三线表制作。 图表格式的规范。（例：指出下表格式的欠规范之处）。 细胞分离技术：叶绿体的分离及荧光观察 掌握细胞分离的一般原理。取样原则？保护方法？细胞裂解方法及选择？ 差速离心。
细胞生物学实验 班级：生科142 姓名：旷江 学号：10143131 组号： 2 小组成员：旷江、韦立尧、莫霞指导老师：范立强、李鹏飞 华东理工大学 应用生物学系
摘要 本次细胞生物学实验通过细胞形态与结构的观察技术，细胞化学，细胞生理，细胞培养与分析，细胞周期分析，细胞成分分离与分析，细胞增殖与染色等技术对动植物细胞进行细胞形态结构的观察、细胞生理过程的研究、细胞培养与细胞分析、细胞冻存与复苏等，以此来研究动植物细胞的结构、功能和各种生命规律。 关键词：细胞增殖、细胞染色、冻存复苏、生理过程、形态结构
Abstract The cell biology experiment was carried out by cell morphology and structure observation technique, cytochemistry, cell physiology, cell culture and analysis, cell cycle analysis, cell fractionation and analysis, cell proliferation and staining. Observation of cell physiological processes, cell culture and cell analysis, cell cryopreservation and resuscitation, in order to study the structure of animals and plants, functions and a variety of laws of life. Key words: cell proliferation, cell staining, cryopreservation, physiological processes, morphological structur
细胞生物学实验教案 【经典学习资料，收藏必备】
实验一、细胞形态结构与几种细胞器的观察 【实验目的】 在普通光学显微镜下识别细胞和细胞器的形态结构，掌握生物绘图的方法。 【实验原理】 细胞在形态上是多种多样的，有球形、椭圆形、扁平形、立方形、梭形、星形等。虽然细胞的形状各异，但是它们却有共同的基本结构特点，都由细胞膜（动物）、细胞壁（植物）、细胞质和细胞核组成。细胞中的各种细胞器，如线粒体、高尔基体、中心体、核仁、染色体等，一般经过一定固定染色处理后，大多数在光学显微镜下是可以看见的（图）。细胞器的形态结构在普通光学显微镜下与电子显微镜下所看到的结构有很大的差别。 （自拍图） （a）（b） （c）（d） 图 1 细胞形态结构 a. 柿胚乳细胞示胞间连丝； b. 马蛔虫受精卵分裂中期示中心粒； c. 兔的神经细胞中高尔基体； d.小鼠肝细胞线粒体 【实验仪器、材料和试剂】 1. 仪器：复式显微镜、擦镜纸 2．材料：洋葱根尖切片、小白鼠肝切片、兔神经节切片、马蛔虫受精卵切片3．香柏油或石蜡油、二甲苯 【方法与步骤】
一、洋葱根尖切片细胞的观察 先用低倍镜观察根尖的纵切面，注意分生区、伸长区、成熟区细胞的异同，然后再仔细观察细胞的形态结构，特别注意细胞的形状、大小，以及细胞壁、细胞核、核仁、细胞质、液泡的形态结构。 二、兔神经节细胞切片高尔基体的观察 先在低倍镜下找到兔神经节细胞，然后转用高倍镜观察，可看到细胞内淡黄色的背景上有黄褐色的细胞核，核的周围分布着许多深褐色的（硝酸银镀染）高尔基体，呈弯曲的线状，颗粒状，少量分散在细胞质。 三、小白鼠肝细胞切片线粒体的观察 先用低倍镜后用高倍镜观察，可见到许多肝小叶，每小叶有许多紧密排列成索状的多角形的肝细胞，细胞中央有大而圆的细胞核。这时，转用油镜观察，可见到细胞质内分布着许多被苏木精染成深紫色的线粒体，呈颗粒状和线状。 四、马蛔虫受精卵切片中心体的观察 1．取马蛔虫受精卵切片，在显微镜下找到充满子宫腔的受精卵，每个马蛔虫受精卵外围有一层较厚的卵膜，膜内有宽大的围卵腔，各围卵腔内有处在不同分裂期的卵细胞。找到分裂中期的细胞，在细胞中央被染成蓝色条状或棒状的结构，这就是染色体。在染色体两侧可见各有一个较小的，亦被染成蓝色的小粒，称中心粒。在中心粒的周围可见呈放射状的星丝。 实验一、细胞的显微测量 【实验目的】 掌握显微测微计的基本原理及使用方法。 【实验原理】 细胞长度、面积、体积的测量是研究正常的或病理组织细胞的基本方法之一。在显微镜下用来测量细胞长度的工具叫显微测量计，由目镜测微尺（ocular micrometer）和镜台测微尺（stage micrometer）组成，两尺要配合使用。目镜测微尺是放在目镜内的一直径为2cm圆形玻片上，里面有100等分格的刻度尺。每一小格表示的实际长度随不同的显微镜、不同放大倍数的物镜而不同。镜台测微尺是一块特制的载玻片，在它的中央由一片圆形盖片封固着一具有精细刻度的标尺，标尺全长为lmm，分为100等份的小格，每小格的长度为0.01 mm（10μm），标尺的外围有一小黑环，便于找到标尺的位置。显微测量时，先用镜台测微尺标定目镜测微尺每小格所表示的实际长度。在测量细胞时，移去镜台测微尺，换上被测标本，用目镜测微尺即可测得观察标本的实际长度。 【实验仪器、材料和试剂】 （一）仪器：显微镜、目镜测微尺、镜台测微尺、解剖剪、解剖镊、注射器、载玻片、盖玻片、试管、无菌采血针 （二）材料：血涂片 （三）试剂：生理盐水、瑞氏（Wright）染色液 【方法与步骤】
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization）
冻存细胞的复苏 1、于液氮罐中取出冻存管。 2、37℃水浴锅中摇动，使之快速融化。 3、超净台内酒精棉球擦拭，打开冻存管，吸出细胞悬液，注入离心管中，再滴加2倍培养液，混匀。 4、离心：1500转/分，3分钟，弃上清。 5、吸取2-3ml培养液加入到离心管中，吹打制悬，接种到培养瓶中，37℃培养。 组织块法培养骨骼肌细胞 1、将新生大鼠处死，再用酒精棉球擦拭其全身消毒，带入超净台内于肩关节和髋关节处剪取四肢（去爪），置培养皿中。 2、PBS液中，清理血污，剥去皮肤。 3、用PBS液洗涤两次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 4、用将肌组织从骨骼上剪切下来，PBS液清洗后转移至干净培养皿中。 5、加少量培养液，将组织剪成1mm3小块，用吸管将其转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃培养箱静置0.5-1小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 贴壁细胞的传代和冻存 1、超净台中打开细胞培养瓶，用吸管将培养液吸出。 2、加入PBS液，使其覆盖培养瓶底部，轻轻摇动后倒掉。 3、加入消化液，以覆盖整个培养瓶底部，盖好瓶盖，于倒置显微镜下观察，待 见到细胞质回缩、细胞间隙增大后于超净台内倒掉消化液。 4、加培养液终止消化。 5、用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁，制备细胞悬液。 6、将细胞悬液吸入离心管中，离心1500转/分，3分钟，倒掉上清。 7、加入3ml培养液于离心管中，吹打制悬。 8、取2ml细胞悬液进行接种后，剩余细胞悬液继续离心1500转/分，3分钟。 9、去上清，加入1ml冻存液，制悬，转移到冻存管，再按照-4℃1小时→-20℃ 2小时→-80℃2小时→液氮的顺序进行冻存。 细胞计数
第二节细胞生物学实验方法与技术 细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体