第十四章试验研究
在进行环境与健康关系研究时，不仅需要宏观的流行病学研究，微观的试验研究手段也是不可或缺的。试验研究从很大程度上弥补了流行病学方法的局限性，如：可根据研究目的和要求，人为控制暴露水平和强度，避免人群调查中存在的众多干扰因素；能利用实验动物的任何组织和器官，从整体动物到分子水平观察各种效应，观察指标不受限制，能更准确地了解体内作用的靶和毒作用机制；可利用特殊基因型的细胞、转基因动物等试验材料，引入相关学科的新技术，更有利于研究的深入。
第一节试验研究的基本内容和任务
在环境因素对健康影响的研究中，环境毒理学是有用的试验研究手段，它的研究内容和任务主要是：
1、对未知毒性效应的环境因素，研究其毒性作用大小、蓄积性、作用的靶器官和组织等基本毒理学特征，以及对其致畸、致癌、致突变性的特殊毒性作用作出评价；
2、对特定的环境因素，研究其剂量-反应关系，为卫生基准的制订及环境危险度评价提供依据；
3、毒作用机制研究，探索环境因素在机体反应中出现的特异的、敏感的指标，即生物标志，为环境流行病学调查提供新的手段；
4、对已造成健康危害，并通过环境流行病学调查出的可以致病因素，建立动物模型予以证实，确定病因；
5、应用于环境生物监测一、急性毒性试验的目的：
概念：研究化学物大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物后所引起的毒作用试验。
主要根据人体可能的暴露途径，选择经口、经皮、经呼吸道的染毒途径进行急性毒性试验，获得LD50或LC50。农药等有可能与皮肤或眼接触的化学物需进行皮肤刺激试验、眼刺激试验和皮肤变态反应试验。对呼吸道有刺激作用的化学物还应进行吸入刺激阈浓度试验。通过急性毒性试验，可对化学物的毒性作出初步的估计并确定其急性毒作用特征，为急性毒性定级、进一步试验的剂量设计和毒性判定指标的选择提供依据。目的：在短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。
1、确定供试化学物急性毒性的剂量—反应关系和中毒特征；
2、求LD50或LE50,为急性毒性评价提供依据。
3、研究毒物的毒动学和毒效学过程。
用来表示急性毒性大小的是LD50:对受试物的个体感受性影响较小，有更高的重现性；从剂量反应曲线上看它处于曲线的中段，是死亡率对剂量敏感的部位，有60％一70％死亡动物集中在LD50附近。
见p505表22-5，22-6
二、试验程序与评价
1．动物选择首先选择受试物在体内代谢情况与人体内相近的或对受试物最敏感的品系。
啮齿类：大鼠、小鼠；
兔、猪、狗。
应对两种性别、成年和幼年动物进行测定。
2．染毒途径与方式：一般应与人的接触途径相同。常用的有以下几种：
(1)经口染毒常用灌胃法，也可将受试物放在饮水中由动物自由摄取。将化学物与饲料混和．具有剂量不准确的缺点，而且常会影响吸收，降低化学物的毒性。
为了便于染毒常需用溶剂来溶解受试物或将其配成混悬液，溶剂本身应无毒，且不
与受试物起反应。溜胃容积一般大鼠不超过3m1，小鼠不超过o．5m1，当染毒剂量过大时，可分几次给药。
(2)经呼吸道染毒将实验动物放在有毒气或粉尘的染毒柜内进行染毒。急性吸入染毒采用静式染毒瓶(20—25L)或染毒拒(25—50L)，加入定量受试物形成所需浓度的空气环境，让动物自由吸入，染毒2—4h。
(3)经皮肤染毒本法主要用于化学物如化妆品农药经皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。常用动物是成年家免或脉鼠，有时也用大鼠和小鼠。在正式给药前24h，给动物背部脱毛，注意勿伤皮肤。将受试物均匀涂布于皮肤表面，用纱布覆盖，共敷24h。3．试验程序：
（1）剂量与分组首先应根据受试物的结构对比文献中类似化学物的致死量作初步估计，然后进行预试以找出粗略的LD50或LD0。正式试验可在LD100与LD0之间设5—7个剂量组。
（2）症状观察
时间：24h或两周内的反应。
观察内容：表现症状和解剖观察p504表22-4
三、LD50的计算与结果评价
计算LD50及其标准误的方法：.
通常采用概率单位法和寇氏法。见p506。
根据所得结果，按前述急性毒性分级标准，评定其毒性大小。LD50值愈小，毒性愈大。各种化学物之间的毒性有明显的差异。
概率单位法
用正态曲线下的面积来表示死亡率的大小，其均数左右边的面积各为50%。将正态曲线横轴上的单位，用标准正态差为单位来计算：d=(x-μ)/δ
为消去负号，将其值一律加5，称为概率单位。
死亡率为50%时，概率单位为5，以此类推。
从表17-1百分率-概率单位换算表，可以任一死亡率换算为相应的概率单位。
经此换算，剂量对数与概率单位(即表示死亡率)，已不是S状曲线(A)而成为直线关系(B)。
LC50计算步骤如下：
a．根据各组死亡率从表17-1百分率-概率单位换算表中查到各组的概率单位，如第一组死亡率为80％，查得概率单位为5.84，余此类推。死亡率为100％或0％者，不列入计算。
b 用方格纸绘相关线，横轴表示浓度对数（x），纵轴表示概率单位（y），各级数值点在图上（图17－7）。
C．顺着各点的分布趋势，用直尺绘出一条最适合于各点的直线，此线应尽量靠近概率单位为5及附近的点子。画线前可用透明尺或用一根黑线进行测试，为直线通过各点中间。
d．求概率单位与处的浓度对数（m），其反对数即为LC50
e.剂量-反应关系的回归方程的计算：可选两个相距较远的概率单位点y□和y2,求回归系数b。
代入回归方程
式中：计值为任一组概率单位的估y ?
5为概率单位y
b 为直线斜率
x 为y 的剂量对数
x 为概率单位5的剂量对数
f.求LC 50的可信限
先求LC 50的标准误差(S m )：
=4
平均致死量法（又名寇氏法）
此法计算LD 50较为简便，但试验时要符合下列要求：①每个试验组动物数要相同；
②
各组剂量要按等比级数分组；③最大剂量的死亡率最好为100％或与之接近，最小剂量
的死
亡率最好为0％或与之接近。计算公式如下：
式中，X m 为最大剂量的对数值；i 为相邻剂量比值的对数； p 为各组死亡率的总和
（以小数表示）。
例小鼠腹腔注射致百虫急性毒性试验结果如表 17－4所示，求 LD 50
式中，p为一个组死亡率；q为一个组存活率；i为相邻剂量比值的对数；h为各组动物数。
第二节亚慢性和慢性毒性试验
了解长期反复接触低剂量化学物质可能引起的毒性效应。
需进行蓄积试验和亚慢性、慢性毒性试验。
一、蓄积试验及其方法：
环境化学物的蓄积作用是慢性中毒的基础。
（一）蓄积作用：某些物质以较小剂量反复作用于机体，可使机体对该物质的反应性增强，即一次染毒不引起明显中毒反应或死亡的剂量，经分次重复染毒后，可引起明显中毒或死亡，此种现象称为蓄积作用(accumulation)。可分两种：
物质蓄积，即毒物在体内的排出量小于进入量，以致毒物在体内的贮留量增多为物质蓄积；
功能蓄积：是毒物进入机体后，并末发现在体内明显贮留，但可引起机体功能改变的逐渐累积，导致对该毒物的反应性增强，此种现象称为功能蓄积。
但两者的划分是相对的，既有差别，又互有联系。功能蓄积可能是由于贮存于体内的化合物或代谢产物的数量极微，目前分析方法尚不能检出的一种物质蓄积，或是由于每次机体接触化合物之后所引起的损害累积所致。
耐受性(tolerance)是机体多次接触化学物质后．对该物质产生反应性减弱的现象，显示不易发生慢性中毒。
（二）蓄积作用的测定方法
有多种，常用蓄积系数法。
蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现某种效应的总剂量(ED50(n))与一次染毒引起
同一效应的剂量，即半数效量(ED 50(1))的比值。
)
1(50)
(50ED ED K n = 若以死亡为毒效应指标，上式为 )1(50)
(50LD LD K n =
蓄积系数的测定：
1．固定剂量法 由Kagan 和s 帕nkevic(I 954)提出，该法固定每天染毒剂量为1／
20—1/5 LD 50，连续染毒，直至实验动物半数死亡。如果染毒剂量累计已达5个LD 50 动
物死亡仍末达半数，实验均可告结束，计算蓄积系数，作出评价。
2．递增剂量法 由Lim 等(1961)提出，先测定LD 50（1），然后对另一组动物每天染毒，
以4天为一期，开始给予0.1LD 50。以后每期按1.5倍递增剂量，直至动物半数死亡，或实
验已达24天，可结束实验，计算系数。
3. 二十天试验法 本法是我国《食品安全性毒理学评价程序》(1984)针对上述两法
的利弊而提出的。选用大鼠或小鼠每个剂量组雌雄各10只，以1／2、l ／5、1／10、1／
20 LD 50。分别对每组进行染毒，每日1次，共20天。如l ／20LD 50组动物有死亡，且有剂
量—反应关系，则有较强蓄积作用；如1／20 LD 50组无死亡，则为弱蓄积。
二、亚慢性毒性作用及其试验方法：
1、目的：确定化学物亚慢性毒性的阈剂量 和NOEL(最大无作用剂量或未观察到作用
剂量)。
2、试验期限：
无完全统一认识，一般认为3-6月；
现有学者主张喂饲：90天，因有报道认为3个月毒性效应与更长时间基本相同。
呼吸道吸收：30或90天，每天6小时，每周5天。
皮肤毒性：30天。
3、试验动物的选择、饲养环境及染毒途径：
选择：急性毒性实验证明对受试化学物敏感的物种或品系；
环境：营养合理，饮水清洁、充足、温、光、湿适宜；
染毒途径：尽量模拟人类在环境中接触受试化学物的途径，与急性毒性试验相似。
4、剂量选择与分组
剂量：1／20—I ／5LD 50，对于在体内不产生蓄积作用而排泄又快的物质可适当加
大剂量，反之则可减少剂量。
设3—4个实验组和1个对照组。
实验组要求：
要求在实验结束时，最低剂量组的动物不会产生可观察到的毒性反应，相当于亚慢
性的最大无作用剂量；
最高剂量组要求能引起动物明显的毒性反应，但又不引起动物死亡；
中间剂量组应产生轻微的毒性反应，相当于亚慢性的阈剂量。
另设一对照组。
剂量选择可参照急性毒性和蓄积毒性的资料。如：以急性非致死性试验的阈剂量作
为亚慢性试验的最高剂量。
5、症状观察
(1)一般性指标：如动物体重增长率、食物消耗率、活动能力等。为整体反应指标。体重明显下降常常是中毒或疾病的信号，也是一项比较敏感的指标。
(2) 化验指标：
特异指标：用以测定化学物作用于机体后所引起的特异性反应。因此，它能更确切地阐明该物质对动物产生有害影响的闻剂量(浓度)及无作用剂量(浓度)。例如：有机磷农药：测定血中胆碱酯酶活性；
芳香族硝基化学物：可测定高铁血红蛋白；
无机F：可检查斑釉发生率及牙齿和骨氟含量。
功能指标：血、肝、肾功能指标：一些酶的测定来实现的，目前常用的有谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(吻)、碱性磷酸酶(AKP)、乳酸脱氢酶(LDH)及其同功酶、r—谷氨酰转耽酶(r—GTP)等活性测定。
有害物质在体内的分布、代谢及排泄指标：生物材料(血、尿、毛发等)中有害物质(汞、镉、铅、砷、氟等)含量测定。
三、慢性毒性作用及其试验方法：
慢性毒性试验是检测在较长时间内，以小剂量反复染毒后所引起损害作用的试验。
1、目的：
评价化学物在长期小剂量作用的条件下对机体产生的损害及其特点．确定其慢性毒作用阈剂量和最大无作用剂量。
2、试验方法：
（1）动物选择、染毒方法、观察指标等与亚慢性毒性试验相似；
（2）染毒期限：1-2年或终身染毒，也有人提出6月。
（3）剂量分组：
3个染毒组和一个对照组。
高剂量组：1/5—1/2亚慢性试验阈值；
中间剂量：1/50—1/10；
低剂量组：1/100。
第四节致突变实验
一般包括①原核细胞基因突变实验，如Ames试验或大肠杆菌试验或枯草杆菌试验；
②真核细胞染色体畸变实验，如微核试验或骨髓细胞染色体畸变分析；如实验结果为阳性，可在DNA修复合成试验、显性致死试验、果蝇伴性隐性致死试验和体外细胞转化等试验中再选两项进行最后的综合评价。通过致突变试验，可对受试物的潜在遗传危害性作出评价并预测其致癌性。
一、目的
确定外源化学物对生物体是否具有致突变作用。
基因点突变试验、染色体畸变试验、DNA损伤试验。
二、供试生物：
微生物、动物细胞、昆虫、动物或植物
三、试验方法
体外基因突变试验、细胞遗传学试验、体内基因突变试验、DNA损伤试验（一）体外基因突变试验
1、Ames试验（鼠伤寒沙门氏菌/动物肝细胞微粒体试验）
（1）方法原理：
利用一种突变微生物菌株与被检测化学物接触，使突变型微生物回复突变，重新成
为野生型微生物。
突变型微生物不具备合成组氨酸的能力，不能在不含（或低浓度）组氨酸培养基上生长。
（2）方法：
将突变型沙氏菌在不含（或低浓度）组氨酸培养基上培养,以其生长状况作为指标。
在培养基中加入哺乳动物的肝细胞微粒体：提高灵敏度。
（3）特点：
优点：
简便、灵敏、快速（48h）、费用低；
检测结果与对动物的致癌性的相符率达约90%。
缺点：
利用微生物作为供试物，不能全面反映哺乳动物的遗传信息，仅1/6；
微生物的DNA修复系统与动物有差异；
微生物无免疫功能。
2、哺乳动物体细胞突变试验
（1）方法原理与微生物突变类似。
常用的细胞株：中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠肺卵巢细胞(CHO)、小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。
V79、CHO细胞株：缺乏利用嘌呤碱的一种酶——次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）。
在培养基中加入某些类似嘌呤碱类物质：6-巯基嘌呤、6-硫代嘌呤、8-N杂鸟嘌呤，这些物质对正常细胞有毒性，不能在该培养基上生长；
而突变细胞株可利用类似嘌呤碱类物质而合成DNA, 在该培养基上生长良好。如待测化合物能引起回复突变，使突变细胞成为正常细胞，则中毒不能生长。
（二）细胞遗传学试验
鼠淋巴瘤L5178Y突变细胞株：缺乏胸苷激酶（TK），可在含有细胞毒物5-溴脱氧尿苷的培养基上生长。在突变物作用下产生回复突变成为正常细胞后，则不能生长。
（1）试验方法：
a. 体外培养：
CHO细胞或人类外周血淋巴细胞与化学物，在细胞培养液（DMEM, RPM, 1640或1999）中，370C下培养24h(CHO)或72h(人类细胞）。观察前2h加入秋水仙碱（中期分裂阻断剂），制片，镜检观察。
b. 体内染色体畸变分析：大鼠、小鼠，染毒饲养，观察骨髓细胞染色体畸变情况。
致畸试验用于确定受试物的胚胎毒作用以及对胎仔的致畸作用。生殖试验一般要求进行两代，以判断受试物对生殖过程的影响。代谢试验是了解化学物在体内的吸收、分布和排泄特点，有无蓄积性以及毒作用的可能靶器官和组织。
第一节体外试验
毒性试验的目的在于获取一定的数据，为社会需要的外源化学物的安全使用做出判断。过去利用整体实验动物模型或称体内试验(in vivo test)模型所提供的资料，判断外源化学物及其制品和混合物等对人类健康是否具有损害作用。体外试验模型(in vitro test)在上述过程中也起着重要的作用，尤其是机理研究方面。但是，在毒理学研究中整体试验研究的观点仍占主导地位。目前，此种观点已发生变化，因为：①全世界每年约有千
种以上的新化合物作为商品进入人类的环境。而且在现有的化合物中，还有相当数量没有进行必要的毒理学评价。在此种情况下，利用经典的整体动物试验取得完整的毒理学资料极为困难。解决此种问题的重要方向是体外试验。②现有的整体动物毒性试验方法需消耗大量的时间和昂贵的经费，而体外试验则可节省时间和经费。③动物保护主义运动的兴起，要求尽量减少动物的使用，而且应当尽量减少痛苦地处理动物。④更重要的是由于生物技术的巨大进步，不仅表现在细胞组织及器官培养领域，而且在生物分子技术方面，也为毒性试验和研究提供了新的方法和工具。所以体外试验在毒理学研究中所占的地位日趋重要，甚至有占主导地位的趋势。但也需指出，体外试验的发展，并不排斥体内试验本身的重要性，两者必须相互补充、相互验证才能为毒理学研究提供坚实的科学基础。
一、概述
(一) 分类
毒性试验的目的是提供一些适当的资料，以便确定有关化学物的毒理学性质。在有些情况下，是要决定一种化学物在所预期的条件下使用是否安全，如新药物开发即需要这一评价。在有些情况下，例如新工业品或日用化学品的开发，必须决定一种新化学物的接触安全限量。了解体外毒性试验在上述毒理学决策过程中有何意义，对于评价体外毒性试验在毒理学中的地位极有帮助。可依据体外试验在决策过程中所起的作用将其分为3类：①筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。②附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。③替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。
(二) 基本原理
体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和／或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。如将敏感细胞或某分子靶部位例如酶，在体外条件下，维持其正常的生理功能，并观察外源化学物对其的影响，即将毒理学中毒物中毒的启动阶段，在体外条件下，观察其对外源化合物的反应和外源化学物对它的作用。基于上述原理，体外试验模型取材范围很宽，可取哺乳动物的离体脏器灌流、脏器切片温育、细胞培养、亚细胞器组份以及提纯的某些酶分子或DNA分子等等。
(三) 体外试验的优缺点
体外毒性试验的优点可归纳在表12—1。
表12-1 体外毒性试验系统的优点
能控制环境因素
可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响
每一剂量水平可利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等
试验间的误差较少
可同时和／或反复多次取样
可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等
较为快速和经济
需要较小量的受试化合物
产生较小量的有毒废物
可以利用人体细胞
减少整体动物的使用
其中特别值得一提的优点是体外试验的简便和易于利用人体细胞。体外毒性试验结果可迅速得出，将减少了解新化学物毒理学资料所需的时间，最终可以缩短从新化学物的合成到产品进人市场的时间过程。此外，对鉴定毒理学资料有问题的新化学物，可及时终止开发，减少由资源到产品的投入。在毒理学整体试验中禁止直接进行人体试验。但毒理学试验的目的是关心人类健康，目前主要是将动物试验结果外推至人类，物种间差异为其不确定因素之一。在体外试验中，利用人体细胞组织进行试验，可较好地解决物种差异的问题。
体外毒性试验系统的利用在目前尚有不足之处：①体外到体内外推的问题。体外试验是依据毒性作用的始发阶段及继续发生的分子与细胞反应，其与整体系统有差异，如何将产生体外毒性的体外浓度与相应体内剂量联系的问题是最终未解决的难题。它需要更好的工具——预测性毒物代谢动力学来解决，其关键在于发展有生理学基础的毒物代谢动力学模型。另一方面，体外毒性试验中缺乏毒理学反应的调控因素，如细胞与组织的修复过程和免疫系统的不同类型细胞间的相互影响等。假如有了更全面的毒理学过程的基础知识，可设计更符合整体动物模型的体外系统。但现阶段毒理学作为一个学科的发展尚缺少许多重要的资料。②体外毒性试验难以预测慢性毒性。因为，慢性毒性病理过程的机理所知甚少，缺乏发展体外试验的理论依据，再者，某些体外系统仍难以达到长期维持生理状态的要求。
二、体外试验系统
(一) 脏器灌流
1. 肝脏灌流是毒理学中研究外源化合物对肝脏损伤及代谢的常见方法。在灌流液中加入外源化学物，此外要维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。一般是以下腔静脉和门静脉为插管灌流通路，为此应结扎肝动脉、上腔静脉，在恒温条件下灌流。有报道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氢取代衍生物三氯甲烷与二氯甲烷对肝脏毒性，结果发现随着灌流时间延长(在4h之内)，灌流液的上清液中K+、谷丙转氨酶(SCPT)、山梨醇脱氢酶(SDH)、谷氨酸脱氢酶(GDH)增加，说明三种化合物对肝细胞均有损伤，而以四氯化碳为最，且依氯原子被氢取代肝毒减低。需指出肝灌流时间不能过久，以4h之内为宜，否则肝细胞的功能与生存不能维持。
2. 肠灌流利用某一部分小肠体外灌流可以研究一些化合物的吸收及动力学过程。如用大鼠，则在麻醉下切腹分离一段小肠，在保持原有血液循环体系下，将肠两端插管，清洗净肠中内容物，在恒温环境中灌入灌流液。例如有人研究锌的吸收及其影响因素，以大鼠回肠段为标本，证实锌吸收呈二室模型(肠腔为Ⅰ室、肠粘膜为Ⅱ室)，苯丙氨酸能增加肠腔与肠粘膜之间锌的交换，且加速向血流的清除过程。
3. 膈肌-膈神经标本取完整的大鼠膈肌-膈神经置于恒温灌流液中，，在几小时之内可维持基本正常的神经肌肉传导。这种标本可用在研究神经毒物对神经传导功能的损伤及强度。
(二) 脏器切片
肝脏、肾脏、脑部及心均可以制备切片。例如，脑片和心肌条等是将组织片置于恒温的孵育液中进行有关试验研究，但需注意切片中的细胞需保持完好的细胞基质和细胞之间的交流。切片厚度一般在250μm。不同研究期间有别，如肝切片研究CytP-450不应超过8h，脑切片一般在6h左右。此系统的优点是保持了细胞之间的结构，其操作也比脏器灌流容易。不足之处是切片内的细胞易于缺氧，且受试物也不易均匀到达细胞内。
(三) 原代细胞培养
1. 肝细胞原代培养肝细胞尚未建成传代的细胞株系，多用原代培养。肝细胞原代培养期间细胞不分裂、不增殖，但发现基因转录是存在的(培养初期24h在1％或以上)。
细胞原代培养维持生存期1～2周，但是CytP-450却在24～28h活性减少50％左右。据报道人肝细胞中CytP-450活性稳定性比大鼠强。
利用原代培养的肝细胞可以进行多种毒理学研究。如研究化学物的肝脏毒性，一般认为，用原代肝细胞培养筛检与鉴定是否化学物具有肝脏毒性较为可靠，与体内试验相符合。有报道以肝细胞损伤后某些酶释放为指征，研究30个化学物，结果除少数化学物在肝细胞培养中表现毒性比体内试验低之外，多数化学物内外毒性符合一致。在体外试验表现毒性较低的化学物有环已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和长春新碱(vincristine)等。
2. 巨噬细胞豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法获取肺巨噬细胞，小鼠可用腹腔灌洗获得腹腔巨噬细胞，甚至人也可通过肺灌洗得到。巨噬细胞可以用于多种体外试验，例如利用巨噬细胞的免疫功能检测外源化学物的免疫毒性，又如利用巨噬细胞检测以肺脏为毒理学终点的外源化学物的中毒毒性和机理。关于后者，有人利用豚鼠肺巨噬细胞原代培养纯化后，研究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的机理。
3. 淋巴细胞多用小动脉脾脏分离淋巴细胞或进一步分离T、B淋巴细胞进行免疫毒理研究。例如研究镉的免疫毒性，证明镉可以抑制淋巴细胞转化和抑制白细胞介素-2的产生，且在一定条件下使淋巴细胞内游离钙浓度增加及钙调素(CaM)活性降低，此为镉的免疫毒性机理研究提供了线索。
4. 脑细胞分离的新鲜脑细胞有助于研究外源化学物对神经系统损伤的评价与探讨其机理如用小鼠大脑皮质分离、温育后，研究二价阳离子钙、镁、锌、镉等对皮层神经细胞的损伤，发现这些离子随着浓度的增加，脑神经细胞的电泳迁移率逐渐减慢。
随着脑细胞技术的发展，还可在温育体系中存在外源化学物情况下，用微电极插入脑细胞，通过电信号的变化，更深入地研究外源化学物对神经细胞的功能损伤。
5. 心肌细胞心肌细胞用于毒理学研究的报道目前还较少。用新生1～2日龄大鼠心室肌分离心肌细胞，原代培养4天后，将微电极(直径<0.5um)插入细胞内，研究镉对心肌的影响。经记录、分析各心肌细胞动作电位参数，结果镉在5～20μmol／L浓度下，可使心肌细胞动作电位及最大除极速率显著降低，表明镉对心肌有直接的毒性效应。
此外，将分离的心肌细胞于培养的24~48h期间，利用膜片钳的连细胞电压钳法，描记心肌细胞上的B型、L型及T型3种Ca2＋通道的单通道活动。当在培养液中加入10μmol ／L氯化镉之后，B型通道开放时间缩短1／3、关闭时间延长45.1％、通道开放概率下降55％，L型通道开放时间缩短40.7％、关闭时间延长23.1％、通道开放概率下降50％，而对T型通道无影响。进一步证实镉对心肌有毒性效应。
(四) 细胞培养
有些脏器细胞建立了传代培养技术，建成有稳定遗传特征的细胞株系。有的利用细胞培养技术建立了特殊的试验方法。
1. 肾细胞由于肾小管，尤其是肾近曲管是肾脏重要的功能单位，目前已经建立了几种肾近曲管细胞株系用于毒理学研究。例如1926年Hull等人选育传代培养的LLC-PK1细胞是来源于Hampshire猪。据报道此株系细胞的各种生物学特征已进行了相当深入的研究(包括激素应答反应、物质转运特征、细胞的代谢功能和标志等)。此后又建立了从鼬(opossum)获得的OK株系、从兔获得的RC-SVI株系。
近年国内利用300次传代培养的LLC—PKl细胞系对铅的肾毒进行了研究，包括铅对细胞的损伤、对细胞膜脂流动性的影响、对细胞膜相变温度的影响、脂质过氧化效应、胞内钙浓度变化及形态学改变等，这对铅的肾脏毒性机理提供了依据。
2. 胚胎细胞利用胚胎细胞体外培养，筛检和研究外源化学物的毒性效应。例如我国用人胚肺纤维母细胞传代培养人胚肺二倍体细胞，已建立了以2BS为代表的株系。此
株系在用于筛检致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍体细胞在10-7～10-8mol／L苯并(a)芘长达28～38代传代培养下，电镜镜检发现细胞核外形不规则、核膜深陷、出现细桥(tiny bridge)伴分叶核形成、核内胞浆包涵体、核仁巨大或多核等细胞癌变特征。
此外，人胚主动脉平滑肌细胞也可作为标本传代培养研究金属的毒理。
近十年来，毒理学相继引入啮齿类动物的着床前全胚胎培养技术(pre-implantatation whole embryo culture)、着床后全胚胎培养技术(post-implantation whole embryo culture)，以及器官培养如腭板培养、胚胎枝芽体外培养等筛检致畸化学物均取得一些成果。
(五) 组织匀浆
取脏器除血污制备组织匀浆，是用物理学方法使细胞壁破坏，细胞组成成分与细胞间质混合形成混悬液。利用匀浆为标本主要是研究外源化学物对细胞酶系统的毒理作用。最常使用的是脑匀浆、肝匀浆，虽然肺、肾、肠等脏器也可制备匀浆，但是因纤维结缔组织或肌细胞不易破碎影响匀浆的质量。
文献中有机磷化合物对神经系统Ache抑制的强度及特征，大量工作是通过以脑匀浆为标本，主要是以哺乳动物、啮齿类和昆虫的脑完成的。不少外源化学物的代谢和以肝脏为靶器官的外源化学物的毒性效应特征与机理是通过肝匀浆进行的。现虽然不少工作已为其它技术所取代，但是应用匀浆作为过筛与初步研究还是有用的，主要因其制备方法简单、制备周期很短，且不需复杂的设备。
(六) 亚细胞组分
将细胞中各亚细胞组分分离和纯化，对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效应的机理均十分重要。它较组织匀浆优越，排除了匀浆中其它因素的影响。现代毒理学中使用最多的亚细胞组分是细胞膜、微粒体及线粒体。
1. 细胞膜人与动物红细胞分离后低渗溶血，高速低温离心可制得红细胞膜(或称血影，ghost)。血影为常用的细胞膜标本。此外肺巨噬细胞、肺细胞、突触小体等均可制备膜标本(先将细胞匀浆破膜，低温差速离心、梯度离心制备)。使用细胞膜可以进行很多的毒理试验，尤其是在探讨化学物中毒机理方面。
以红细胞膜为例，用人工细胞为标本与0.1mmol／L铅作用仅5min，红细胞膜远紫外色谱就出现改变，表明膜蛋白的构象发生了变化。
神经末梢断裂脱落的突触体(synaptosome)具有类似完整细胞的功能，除可利用突触体作为标本外，还可进一步制备突触体膜(synaptosome membrane)。实验表明对硫磷在5×10-9mol／L水平即可抑制突触体的摄钙功能，并引起突触体膜脂流动性下降。
近年来为纯化实验条件，以利于从分子水平研究外源化学物的毒效应机理，已将人工膜引入毒理学研究。所谓人工膜，即是以正常细胞膜的膜脂组分，人工合成后用之在—定介质中形成人工膜。
2. 微粒体(microsome) 尤其是肝细胞制备的微粒体常作为毒理学研究的标本，这是由于肝脏代谢酶系主要存在于肝细胞内质网，即肝细胞的亚细胞组分分离后的微粒体中。
有报道TNT在无氧而加人NADPH环境下与微粒体温育，用ESR波谱仪检测出硝基阴离子自由基(Ar-NO2￣)；而在有氧环境中能迅速与分子氧反应生成硝基化合物与超氧阴离子(O2 )。
3. 线粒体(mitochondria) 它是细胞中进行呼吸作用的主要场所。据报道溴氰菊酯(decamethin)在体外试验中，对线粒体呼吸功能有明显抑制作用。又据报道镉对大鼠肝细胞线粒体Ca2+-ATPase有抑制作用，且使线粒体膜脂流动性下降。
(七) 酶
外源化学物对机体的毒性效应，往往表现某种或某些酶的活性变化上，即可以利用
标志酶活性的变化反映化学物所损伤的靶器官。
在体外毒理学中则主要是定量研究外源化学物对靶酶作用的特征、性质和机理。此类研究的基础工作是纯化酶，如获得纯化酶，可在体外精确地控制各种因素，对纯化酶作用的体征、性质和机理进行研究，如细胞色素P-450重组系统。由于酶的提纯技术复杂，故而在一般毒理学研究中多用脏器匀浆和亚细胞组分作为酶源。虽然这些酶源标本含有多酶成分，但是只要测定酶活性的条件适宜，完全可以得到良好的结果。
有报道金属离子Cd2+、Hg2+、Pb2+对一些钙调素依赖酶就具有双向效应，即在低浓度时可以激活这些酶，而高浓度时又可抑制酶的活性。
文献中早已证明有机磷化合物的主要靶酶是AChE。经酶动力学分析，有机磷化合物与AChE底物ACh呈竞争性；即有机磷化合物对AChE为竞争性的不可逆性抑制物。但是不同结构的有机磷化合物对AChE的亲合力可有很大差别。
第二节哺乳动物细胞制备和培养
一、概述
到目前为止，分离的细胞是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。体外系统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞。在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统日渐广泛，造成这种趋势的原因有三：一是来自公众要求减少实验中使用动物数量的压力；二是非整体动物实验可显著地减少常规整体动物实验所需的高额费用；三是人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺乏。利用细胞，可更严格控制实验条件，有效地研究毒性作用的生化机理。表12-2详细列出细胞在毒理学中应用的优缺点。
表12-2 体外系统——细胞在毒理学中应用的优、缺点
优点改善效率，减少费用
使用实验动物较少
仅需少量的受试物
较大程度控制细胞族的性状
直接控制胞外基质、化学物浓度及接触时间
排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫系统的影响
可从同一实验体系重复取样
缺点缺少整个器官的形态学观察
选择性丧失整体器官特异性功能，如毒性代谢酶的丧失
缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统，
一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物的逐渐累积。
多为短期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大
表12-3 毒理学研究中常用细胞
各种物种的成纤维细胞
淋巴母细胞
腹水瘤细胞
淋巴细胞
角质细胞
肝细胞
肝癌细胞
肾脏髓质和皮质细胞
肺的各种类型细胞
培养的背根胶质细胞
培养的睾丸细胞
膀胱细胞
心脏细胞
脊髓微血管细胞
脂肪细胞
由于哺乳细胞作为体外实验系统的优越性，在毒理学中，已有许多不同类型细胞应用于毒理学实验。表12-3为毒理学实验中常用的细胞类型，其中有些细胞可来源于人体组织。
利用哺乳动物细胞进行毒理学体外实验有两种方法：一是建立正在迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用；二是利用已高度分化的细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊毒作用；
二、基本技术
（一）仪器与设备
1. 培养箱一般来说，在5％CO2，95％空气和99％的相对湿度的条件下，许多细胞可存活。故细胞培养的关键设备是CO2培养箱。其基本要求：①精确地温度控制调节，一般在土0.5℃，箱内温度的均衡可依赖风扇；②CO2浓度调节，利用CO2传感器监测箱内CO2浓度；使箱内大气为5％CO2，95％空气；③箱内湿度，可用水盘来维持。有的细胞培养可以不控制CO2分压。例如，原代肝细胞培养，可用LeibovitzL-5介质，不需CO2，而要求敞开培养瓶，以供给较高的O2分压。
2. 冰箱和冷柜冰箱(4℃)用于存放培养介质，冷柜(—20℃)则存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培养介质如谷氨酸和血清。
3. 显微镜最基本的配置是一台简单的倒置显微镜，用作日常观察培养中的细胞，以便依据细胞生长状况，进行调整或对污染进行补救或处理。进行进一步的研究，则需要更高级的显微镜，例如，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。
4. 超净工作台在没有无菌操作室的条件下；可用超净工作台。它是一无菌操作装置，主要是利用鼓风机，驱动空气通过高效滤膜净化后，缓缓通过工作台面，使工作部位构成无菌环境。它具有占地面积小，操作方便等优点，但它尚难绝对除去病毒类微生物，而且灰尘过多对净化作用不利，故超净工作台最好安置在清洁无尘的房间。
5. 清洗和消毒设置：培养中所用玻璃器皿可用电热干燥箱消毒，要求温度160℃以上，最好使用较大规格的干燥箱，如650×500×500mm。
器皿的清洗可用超声波洗涤器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的冲洗装置。金属器械如解剖刀、虹膜剪、镊子、尖镊、止血钳等可用高压蒸汽消毒。
6. 培养器皿为了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、无毒性、有利于细胞生长的优点。主要的塑料瓶皿有；①多孔培养板，其规格有4孔、6孔、24孔及96孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；
②培养皿，规格有直径30mm、60mm及l00mm，与玻璃培养皿相同，尤其有利于集落形成和细胞转化等试验；③培养瓶，带有螺旋盖塞，规格有30ml、50ml、l00ml及500ml，适于在CO2培养箱中使用；④其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，后者的规格有200~1000μ1和1μl~100μl二种。
玻璃器皿在实验室仍不能完全被塑料制品取代，除培养皿和培养瓶外，主要还有：①吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有l0ml，5ml和lml；②玻璃瓶，用于配
制各种培养液的储贮存液和血清等，可用生理盐水瓶或血浆瓶代替，规格有500ml、250ml 和l00ml；
③离心管，规格有50ml、l0ml和5ml，用于细胞洗涤。
7. 液氮贮存器贮存细胞多用液氮，液氮温度在-196℃，具有经济、省力和能较好保持细胞生物学特性的优点。液氮贮存器有25L和50L两种规格，它与液氮运输瓶，或称杜瓦瓶不同，因液氮贮存器一般每两周需补充一次液氮。如有需要可配置贮存器和运输瓶。
8. 水纯化装置细胞培养对水的要求较高，通常要求使用三次蒸馏水配制各种培养液。对玻璃器皿也应用纯水清洗。但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地去除有机物。
实验室应配备自动加水石英玻璃管加热的蒸馏器，具有蒸馏速度快，使用安全等优点。外购蒸馏水或去离子，应在本实验室重蒸后使用。对水质量应经常检测，如pH和电导系数。同一实验尽量使用同一水源，避免水质量造成结果的差异。
9. 滤过消毒装置培养介质不能经高压蒸汽消毒，而需通过孔径为0.22μl的滤膜过滤消毒。滤过消毒装置由抽气泵(水流玻璃抽气泵或真空泵)、安全瓶、抽滤瓶和滤器组成。
10. 一般设备
离心机，用于对细胞悬液离心处理，以达到细胞洗涤、调节细胞浓度等。
天平，包括普通台秤、扭力天平和分析天平，用于配制各种培养液、酶消化液及生理盐水等。
酸度计，用于准确调整各种介质及生理盐水的pH。
电磁搅拌器，微量加样器等。
(二) 培养用液
指细胞培养中所使用的溶液，如培养液、消化液、pH调整液、染液及细胞洗涤液等。培养液的选择取决于细胞生长的要求，故它是维持细胞生存和生长所需的基本溶液，它的主要成分为平衡盐溶液和适应细胞体外培养的各种溶液。
培养液在制备过程中应严格操作，避免混入杂质。应特别注意下列问题：①容器，应仔细认真清洗，必要时须消毒；②水，三次重蒸蒸馏水；③严格选择品质优良的药品；
④制备好的培养介质要标明名称、配制日期及配制者；⑤贮存与消毒。
1. 平衡盐溶液常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸盐缓冲液(PBS)等。它具有维持渗透压、控制酸碱度平衡的作用及供给细胞生存所需的能量和无机盐的成分。它是配制各种培养介质的基础溶液，也是洗涤细胞的溶液。
2. 小牛血清是细胞培养中最常见的天然培养基，它具有丰富的营养物质，对细胞附着和保护也有明显的作用。但它有成分较为复杂、个体差异较大、来源也有一定的限制等不足。弥补个体差异的办法是对血清进行无菌检测和支持生长能力测定后，混合使用。天然培养基除小牛血清外，还有鸡血浆、鸡胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾胶原等。
3. 合成培养基系依据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的。如最简单的MEM
Eagle培养液，包括12种必需氨基酸、谷氨酸胺和8种维生素。根据需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脱氧核糖及丙酮酸钠等)、核酸的前体物(嘌呤和嘧啶类化合物)及氧化还原剂，抗坏血酸、谷胱甘肽等。
如进行无血清培养，除上述营养成分外，还应加入纤维连结素、多聚赖氨酸和胶原等成分以促进细胞贴壁。有时，还需要加入酶的抑制剂，如大豆胰酶抑制剂。
为了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、链霉素
及庆大霉素等。
4. 消化液进行传代细胞培养时，为了使细胞脱离生长表面和细胞离散成单个细胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25％或0.125％)和乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA)溶液(0.02％)。
5. 其它pH调整液，为了营养成分稳定和延长贮存时间，配制生理盐溶液，和培养液时，均在临用前加入NaHCO3溶液。常用浓度有3.7％、5.6％和7.4%。此外，还有HEPES溶液，是一种氢离子缓冲剂，能较长时间保持恒定的pH值范围。使用终浓度为10～15mmol／L。
染色液：常用的有①苏木精-伊红染色液或称H.E染色；②Giemsa染色液。
固定液：常用的有①中性缓冲福尔马林，相当于10％的福尔马林；②Bouin氏固定液；③醋酸甲醇，临用前配制，结合Giemsa染色效果较好；④FAA固定液，由福尔马林、冰醋酸及80％酒精组成，用于盖片单层培养的固定。
(三) 消毒技术
在细胞培养中，消毒是最基本的一项工作，它直接影响实验的结果。消毒措施应在细胞培养的每个环节严格执行。细胞培养的微生物污染，包括细菌、真菌及病毒，它们主要来源于：操作者的粗心；操作表面或周围的环境；培养液及培养器皿的灭菌不彻底或存放时间过久等。
对不同的细胞培养所用物品，可采用不同的消毒灭菌的方法。一般有两类：一是物理灭菌法，即利用紫外线、干热及微孔过滤等；二是化学灭菌法，即利用化学消毒剂。主要消毒方面法介绍如下：
1. 紫外线适于消毒空气、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培养板等，使用方便，效果较好。应注意其可产生臭氧，影响健康。
2. 高压蒸气消毒它适于金属器械、胶塞、布类及某些培养液。一般要求15磅压力下20min。或者更简单的，煮沸消毒，其不足是湿度大，不易久存。
3. 干热消毒适于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用贮存。加温应到160℃，保持90-120min。
4. 滤过消毒适于大多数培养用液。选择孔径为0.22μm的微孔滤膜，过滤除菌效果较佳。
5. 消毒剂适于操作者的皮肤、操作表面和台面、桌椅及墙壁等，常用的消毒剂有来苏儿、新洁尔灭、过氧乙酸及70％酒精。
三、培养细胞的鉴定
对培养细胞的鉴定有两个目的：一是观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷冻贮存的样品重新建立新的培养细胞；二是培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。因为培养条件的一致性，对于实验结果的可信性有极为重要的影响。对于培养细胞的鉴定包括污染鉴定、生存指标及细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。
(一) 污染鉴定
细胞培养中常见的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。受到污染的细胞培养可明显地改变生长特性，引起pH变化和生长迟缓。污染常常表现为pH变化，培养液表面起泡或起膜，培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可消失。肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。
1. 鉴定方法真菌或细菌的污染可用肉眼或低倍光学显微镜观察，支原体仅能用特别的荧光染料如Hoechst 33258染色后在光学显微镜下，或用扫描电子显微镜观察。由于用肉眼无法发现支原体的污染，在细胞培养过程中应经常定期检查，例如每三个月。
最简便和最可靠的检测支原体的方法是用荧光染料染色在显微镜下观察。
2. 处理基本的良好消毒技术并不一定能防止污染，还应注意下列方面：消毒步骤(如高压锅和干热消毒柜)的效果；多层流防护罩的消毒效果；经常检查培养器皿；每个工作者有自己配制的培养用液，处理受污染的培养用具和环境。对于已污染或怀疑污染的培养用具均可用 2.5％高氯酸处理。用抗生素对预防或去除细菌污染较为有效。对支原体污染，消除方法较多，如抗生素、加温及动物体内接种等，但都较为繁琐，且效果不甚满意，最好的办法是弃去，再重新培养。
(二) 生存指标
1. 台盼蓝排斥试验是判定细胞损伤的快速试验，它还可很方便进行细胞计数。具体方法如下：
①取少量细胞混悬液，加人等量的0.5％台盼蓝溶液。
②放置1-5min后，将混合液滴入血细胞计数池内。
③显微镜下，细胞显蓝色的为死亡细胞，尤其是核深染，而未染的细胞为存活细胞。统计出细胞总数后，可计算出细胞存活率。
2. 酶漏出的检测胞浆酶如乳酸脱氢酶(LDH)的漏出检测也与染料排斥试验有同样的灵敏度，同时，可更精确地进行定量，但操作时间较长。
(1) 仪器：分光光度计，最好配有温育(37℃)的装置。
(2) 试剂：
溶液0.9％NaCl，0.1％TritorX-100和0.1％牛血清白蛋白。
底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和31.0mg丙酮酸钠溶于450ml的蒸馏水。配好后，可贮存于-20℃的冰箱内。
NADH，称42mg，溶于4.5ml的1％NaHCO3，临用前配制。
(3) 操作步骤：离心，以适当速度使所有细胞沉淀而不引起细胞损伤。例如肝细胞用50g×2min。取出上清，放人干净试管，并保持0℃以下备用，加入等量的溶液至细胞沉淀，用漩涡混合器混合。保持在0℃以下，备用。
取一比色杯，加3ml底物，50μl的NADH和25~200μl的样品(取决于培养细胞的种类)，迅速混合后，在340nm处进行比色。整个过程应在37℃条件下完成。计算上清或沉淀(即溶液中细胞)的LDH活性，漏出率表示方法为培养液中LDH活性占总的LDH 活性的百分率。
3. 其它方法铬的释放，利用51Cr3+可被活细胞吸收，并还原成51Cr3+，留在胞内，而死亡细胞则释放51Cr3+。用r-计数器检测无细胞上清液中51Cr3+的量，即可判断培养细胞的存活情况。还有贴壁效率和A TP含量等指标可鉴定培养细胞的存活情况。
(三) 细胞特性鉴定
在连续培养期间，细胞可能发生某些变化，如细胞与原始细胞的差异逐渐加大。但每一细胞株具有一系列细胞特性“正常”的参数，可供鉴定评价。例如，形态学参数、生长特性及染色体分析等皆为细胞特性鉴定的指标，其中形态学与生长特性的测定相对容易进行。
1. 形态学检查评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查；应在每次传代时用倒置显微镜进行观察，最好拍照记录细胞的形态。要详细地描述每一细胞系的形态。若因限于篇幅，不能详述，可掌握两个述语，即“成纤维样”和“上皮样”细胞，即可描述所观察的细胞。成纤维样细胞系指在单层细胞培养时，细胞的长度要大于其宽度的两倍的细胞，而上皮样细胞系指呈多角形的细胞。
2. 生长特性的检查在培养细胞时，其生长特性的检查较易进行，主要通过测定更换培养液的时间和传代的时间来完成。虽然不同的细胞其传代时间和更换培养液的时间
不同，但对于每一细胞系应该较为固定，因为主要取决于细胞生长速率。
每个细胞系均有其自己的生长循环周期，这取决于接种进行培养的细胞数目。一般认为，在培养中的细胞，是处于不同的生长阶段。进行生长分析，应观察单个细胞的生长速率。在实际工作中，是测定克隆效率或者接种效率。克隆效率是测定由单个细胞生长的克隆。接种效率是测定植入小量细胞(2~50个／cm2)后，等生长至可分辨的小克隆时，经用生理盐水洗涤，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml／25cm2)和清水冲洗后，计算克隆数。
克隆数目
接种效率=%
100
植入细胞数目
一般认为，传代效率小于30表示生长不正常。此项指标可用于正常细胞生长的监测，贮存细胞的复苏及鉴定每一批血清等。
在细胞培养试验中，一般监测指标可采用形态学、生长模式及接种效率即可。
3. 其它检查除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目和结构以及DNA、RNA和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。
七、细胞培养在食品毒理学中应用
利用培养的细胞，可进行多方面的毒理学研究，如表12-4中所列。
表12-4 培养细胞用于毒理学体外实验的实例
一般毒性：主要为急性细胞毒性
器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等：
毒作用机理
生物转化、毒性代谢产物的形成
遗传毒性，如程序外DNA合成测定
繁殖毒性
联合毒性
不同物种间的比较毒性
光敏毒性
以下重点讨论毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题。
1. 细胞类型的选择细胞类型的选择取决于实验的目的。一般性筛选系列化合物的一般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞会逐渐丧失许多功能，如细胞色素P-450的活性。
细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。常用的细胞系有CHO、V79、Hela、BHR 及L929等。
2. 代谢活化细胞经8-24h培养后，细胞色素P-450活性将迅速下降。而在CHO 细胞系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。
解决这个问题有两个方法，一是加S9，二是与原代肝细胞复合培养。S9需要NADPH 才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有NADPH生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如V79、中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。
3. 受试物的给予许多受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在1％以下。在试验中可设立适
当的有机溶剂对照和培养液对照。例如，需用S9混合液；有机溶剂的浓度应限制在0.1％，因为许多有机溶剂可抑制酶的活性。不溶性的受试物如，颗粒和油剂在给予培养液时仍存在问题。一般是混悬于培养液或者先溶于溶剂，再加人培养液，但有时会产生不同的毒性结果。例如，黄樟醚和降脂乙醚等油性受试物，假如使用高剂量时将有某些塑料培养皿成分的溶出，则所观察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。
4. 设立阳性对照组实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用经过研究或公认有特定作用的化学物。例如在代谢活化研究中常选择环磷酰胺为阳性对照物，在细胞毒性筛检时可选二甲基环己基烃乙基戊二酰亚胺和二硝基苯酚为阳性对照物。
5. 毒性指标的选择依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列指标在毒理学中经常采用：
(1) IC50：即经3天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速率可用蛋白总浓度来表示，可用于细胞毒性的常规筛检。此外，前述评价细胞特性的指标，如形态学和接种效率等，均可采用。
(2) 细胞膜损伤：可选择台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、Ca2+的释放以及钙泵的变化等指标来评价细胞膜的损伤。
(3) 大分子物质合成与降解的改变：可选用[14C]亮氨酸蛋白试验和[3H]尿嘧啶参入RNA试验等指标，以判断受试物对培养细胞的大分子合成与降解的有无作用。
(4) 代谢能力：除可选择A TP浓度、NADP／NADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指标外，还有毒物代谢酶的活性、细胞膜脂质过氧化作用及[14C]-葡萄糖氧化代谢成14CO2的速率，均可反映出细胞的代谢能力。
(5) 形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，可了解受试物对培养细胞的形态改变情况。
第三节亚细胞组分制备及其检测方法
细胞由许多亚细胞组分组成，如核、线粒体、内质网膜、溶酶体及高尔基氏体等，它们在维持细胞正常生理功能方面起着重要的作用。故许多外源化学物引起机体的损害作用，有可能与亚细胞组分的结构与功能损伤有关。在毒理学中，亚细胞组分作为遗传毒性测定中的代谢活化系统，如S9已普遍运用。此外，亚细胞组分主要用于中毒机理的分子水平研究，因它们是从整体细胞上在自然环境下分离出来的，使毒理学家在体外条件下，有可能更深入了解外源化学物在毒作用部位的作用机理。但它离开子整体细胞，也有其局限性；即它仅提供有关一些特殊作用能力的特定信息。对外源化学物毒作用机理研究，还应结合其它研究如整体试验、细胞试验等，综合作出评价。现就微粒体和线粒体的制备及其检测方法加以介绍。
一、基本技术
(一) 设备
1. 匀浆器(homogenizer) 常用匀浆器为Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管组成。它是利用两者的间隙将细胞破碎，其间隙一般在0.15~0.25nm。杵是由马达传动，其速度在2000rpm以内，且可调节。它较适合肝细胞、肾细胞及脑细胞的破碎，而对肺、甲状腺等结缔组织较多的组织效果不佳。匀浆器可从5ml至50ml大小不等，依实验需要加以选择。使用本法破碎细胞应注意：①在低温下操作避免匀浆磨擦生热和室温影响实验结果；②马达速度不宜过快，慢速可获更大的扭力矩；③匀浆上下次数，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝细胞匀浆上下8~10次即可达到破碎目的。
2. 离心机是亚细胞组分制备的关键设备，一般需要低温高速离心机，最大转速为18 000～24000rpm，和超速离心机，最大转速为50000～75000rpm。离心机应配备各种类型的转头，以供亚细胞组分制备时差速离心选用。离心管最好为聚丙烯的，因其透明性较好。
(二) 匀浆介质和缓冲液
最常用的匀浆介质为等渗的蔗糖(0.25mol／L)和氯化钾(0.154mol／L)。蔗糖为经典亚细胞组分分离研究所选用，而氯化钾更适合外源化学物代谢酶的研究，如它可更有效除去微粒体制备物中的血红蛋白，减少光谱测定的干扰。匀浆介质在使用前应将pH调至7.4左右。匀浆缓冲液可含有5~50mmol／L的Tris或Hepes。
大多数研究中常用的匀浆缓冲液为含0.154mol／L KCl的50mmol／L Tris·HCI缓冲液，pH7.4。此缓冲液在4℃条件下，至少贮存12周不变质。
(三) 生物样品
实验动物如大鼠、小鼠、金黄地鼠应迅速处死，常用的方法是断头处死。应避免使用麻醉剂，如乙醚、巴比妥类药物，它们将影响毒物代谢酶的活力。对于大实验动物，如狗等，应在适当的麻醉条件下，放血处死。尽快取出所需脏器，如肝、肾、肺及脑等，置人冰的匀浆介质中。为了减少实验误差，应参考动物的年龄、性别、品系、健康状况、饮食类型和饲养环境等因素。此外，为避免昼夜节律影响，每次实验应在相同时间处死动物。为避免肝糖原影响，大鼠应禁食过夜。
(四) 微粒体酶的诱导方法
1. 苯巴比妥钠它是常用的诱导剂之一。其方法是以小鼠80mg／(kg·d)，大鼠100mg／(kg·d)，经腹腔注射或与生理盐水混合灌胃，连续3~5天即可诱导细胞色素P-450的活力。还可以将药溶于饮水，1ng／ml，大约7天后，可达到诱导效果。主要诱导细胞色素P-450。
2. p-萘黄酮(β-naphthoflavone) 它是多环芳烃类的诱导物，可诱导细胞色素P448，同类诱导物还有3-甲基胆葸(3-methylcholanthrene)。β-萘黄酮的使用方法是小鼠40mg／(kg·d)，大鼠80mg／(kg·d)，经腹腔注射，连续3～4天，即可达到诱导作用。主要诱导细胞色素P448。
3. 多氯联苯常用多氯联苯诱导物是Arochlorl254，它是混合型的诱导物，即同时诱导细胞色素P-450和细胞色素P-448，剂量依多氯联苯种类不同而异，需做预试验来确定。
二、微粒体的制备
微粒体(microsome)是内质网在细胞匀浆过程中形成的碎片，并非独立的细胞器。由于微粒体含有混合功能氧化酶，其在毒理学研究中有着重要地位，故微粒体是毒理学中较常用的体外系统。
(一) 肝微粒体制备
1. 以断头方法处死动物，迅速取出肝脏，用预冷生理盐水或匀浆介质洗净血污，剪去粘连的组织，用滤纸轻轻吸干表面水分，称重。
2. 将肝转入小烧杯，用剪刀剪碎肝脏，加入适当匀浆介质，一般为3ml／g肝脏。放人Potter匀浆器中，上、下8次，制成肝匀浆。
3. 按示意图操作离心。
肝匀桨
离心，10000g 20 min
上清液沉
淀
离心，10500g 1h
沉淀（微粒体）上清液弃去
在第一次离心去除线粒体、核等物质时，离心管上层漂浮有脂质层，应用吸管将其除去，再收集上清液。在第二次超速离心后，如为了减少血红蛋白的影响，可加匀浆介质将沉淀重新悬浮，将所制备的微粒体再洗涤一次。沉淀即微粒体，悬浮于10mmol／L Hepes·HCl缓冲液，pH7.6，内含0.154mol／L KCl，l mmol／LEDTA和20％甘油，贮存于-20～70℃或是液氮中。应强调的是贮存方式和时间对微粒体酶的活性或特征会有不同程度的影响。
4. 其它方法除超速离心法制备微粒体外，还有凝胶过滤、钙沉淀法和等电点沉淀法也可以制得微粒体。凝胶过滤法不适于做多个样品。钙沉淀法适于没有超速离心机的实验室使用。其方法是在去线粒体的上清液中加入钙离子，使其终浓度为8mmol／L CaCl2，此时，内质网部分产生钙依赖性聚集，在较低的离心条件，2000~25 000g，20min 即可将其沉淀。不足之处是钙离子可影响某些酶的活性以及造成核糖体的丢失。等电点沉淀法是利用pH改变，使微粒体沉淀出来，弃去线粒体的上清液用醋酸缓冲液把pH 调至
5.5时，在较低离心条件下，10000g l0min，即可制得微粒体。其优点也是不需超速离心机，不足之处是酸性条件下，可使某些酶和CytP-450失活。
(二) 肝外组织微粒体的制备
肝微粒体制备过程中的一般性规则对于肝外组织同样适用。对于较软的脏器，如肾脏、睾丸和脑与肝微粒体制备的操作变动不大。对于结缔组织较多的肺、皮肤等脏器和对于小肠微粒体的制备较为麻烦。因为，小肠仅上皮细胞含有外源化学物的代谢酶，在小肠的不同区域其酶活性也不一样，以及肠内的蛋白酶可迅速降解代谢酶。其解决的办法有：①小肠上皮细胞可由打开的小肠内面刮取或用机械振荡来与小肠结缔组织分离；②加入胰蛋白酶的抑制剂使蛋白酶活性降低或加入甘油或二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)保护酶活性；③加肝素防止凝集和蛋白聚集。
肝外组织的细胞色素P-450的含量和有关酶活性远较肝组织低。应注意所有操作应在0~4℃下进行，对于组织应尽量除去血红蛋白，较好的方法是脏器的原位灌流。
三、混合功能氧化酶系的测定方法
MFO催化的反应类型繁多，且底物特异性不强，故有多种方法用于MFO测定，可分为直接法和代谢法。直接法是直接测定MFO的各组成成分，如细胞色素P-450含量等。代谢法是通过测定MFO催化反应中的底物消耗量或产物生成量，间接了解MFO 活力。由于MFO作用的复杂性以及成分的多样性，通常认为使用单一方法进行MFO 的评价不够全面和可靠，因此，在毒理学中是采用多种检测分析方法，从不同角度进行MFO作用的评定。
(一) 直接法
1. 细胞色素P-450含量测定细胞色素P-450是MFO的主要成分，起到终末氧化酶的作用。其最大特点是还原型CytP-450与一氧化碳结合后，在450nm处有最大吸收光谱，因此被称为CytP-450。利用其在450nm的最大吸收光谱，可测得样品中CytP-450的含量。
(1) 仪器：双光束可记录的分光光度计。因为微粒体样品是浊状样品，需双光束分光光度计，在450nm和490nm处进行差示光谱分析。
会计(2016) 第十四章或有事项课后作业 一、单项选择题 1. 下列交易或事项中属于或有事项的有（）。 A.未来可能发生的自然灾害 B.环境污染整治 C.未来可能发生的交通事故 D.未来可能发生的经营亏损 2. 下列关于相关事项发生概率的说法中，不正确的是（）。 A.“基本确定”是指，发生的概率大于95%但小于100% B.“很可能”是指，发生的概率大于或等于50%但小于或等于95% C.“可能”是指，发生的概率大于5%但小于或等于50% D.“极小可能”是指，发生的概率大于0但小于或等于5% 3. 2015年10月20日，甲公司因违反合同而被丁公司起诉。2015年12月31日，人民法院尚未对案件进行审理。甲公司法律顾问认为败诉的可能性80%，将要支出的违约金在80万元至120万元之间，在这个区间内每个金额的可能性都大致相同，则甲公司2015年12月31日因该未决诉讼确认预计负债的金额为（）万元。 A.0 B.80 C.100 D.120 4. 在将未来现金流出折算现值时，下列说法中不正确的是（）。 A.用来计算现值的折现率，应当是反映货币时间价值的当前市场估计和相关负债特有风险的税前利率 B.用来计算现值的折现率，应当是反映货币时间价值的当前市场估计和相关负债特有风险的税后利率 C.风险和不确定性既可以在计量未来现金流出时作为调整因素，也可以在确定折现率时予以考虑，但不能重复反映 D.企业应当在资产负债表日，对预计负债的现值进行重新计量 5. 企业应当在资产负债表日对预计负债的账面价值进行复核，有确凿证据表明该账面价值不能真实反映当前最佳估计数的，应当（）。 A.不做任何处理 B.按照原确认负债时最大可能金额调整 C.按照原确认负债时最小可能金额调整 D.按照当前最佳估计数对该账面价值进行调整 6. 对于资产负债表日的诉讼事项，下列说法中不正确的是（）。
广州市2019版九年级全册物理第十四章了解电路练习题A卷 姓名:________ 班级:________ 成绩:________ 一、单选题 1 . 下列说法正确的是（） A．用塑料尺在头发上摩擦后，能吸引轻小纸屑的过程中，是机械能转化为电能 B．将太阳能电池连在小电扇上，使它对着阳光，小电扇转动起来的过程中，太阳能转化为机械能 C．在能量的转化和转移过程中其总量总保持不变，所以能量的转化和转移不具有方向性 D．来回迅速摩擦双手，手会发热，其原因是摩擦过程中机械能转化为内能，手的内能增加，温度升高 2 . 关于电的认识，错误的是（） A．电源是提供电压的装置，电压是形成电流的原因 B．烧坏保险丝说明电路中肯定发生了短路 C．串联电路的开关控制整个电路的通断 D．用电器能将电源提供的电能转换成我们所需要的能 3 . 电流看不见、摸不到，但我们可以通过电路中小灯泡发光来判断电流的存在.这种研究方法是（）A．控制变量法B．类比法C．比较法D．转换法 4 . 如图，电流表和电压表都接错了，关于电流表和电压表，下列说法中正确的是（） A．电流表接在A、B间要烧坏，接在D、C间不会烧坏 B．电流表接在A、B间不会烧坏，接在D、C间也不会烧坏 C．两种接法电流表都要烧坏 D．两种接法电压表都要烧坏 5 . 如图所示，把一根塑料绳一端扎紧，从另一端撕开成许多细丝，用手从上向下捋几下，发现细丝张开了．细丝张开的原因是
A．异种电荷相吸B．同种电荷相斥 C．分子间相斥D．分子间相吸 6 . 有一种“光控开关”能在天黑时自动闭合，天亮时自动断开；而另一种“声控开关”能在有声音时自动闭合，无声音时自动断开利用“光控开关”和“声控开关”来控制居民楼里楼道灯可以节约电，要求灯白天不会亮，天黑后楼道有人走动发出声音时灯会自动亮，下列如图所示的电路图中合理的是（） A．B．C．D． 7 . 小云家卫生间安装了换气扇和照明灯，换气扇和照明灯的电路连接如图所示，下列说法中正确的是（） A．换气扇和照明灯不能同时工作 B．换气扇和照明灯只能同时工作 C．换气扇和照明灯工作时，通过它们的电流一定相等 D．换气扇和照明灯工作时，通过它们的电流有可能相等 8 . 有一串小彩灯，每盏小彩灯的规格为"4V 0．2A”。下列表述中不正确的是（） A．若要使小彩灯在家庭电路中正常工作，应把55盏小彩灯串联起来使用 B．每盏小彩灯正常工作时的电阻是20Ω C．每盏小彩灯的额定功率是0．8W D．小彩灯不工作时，电阻为零 9 . 如图所示是小明厨房安装的抽油烟机和照明灯的连接电路图.下列说法正确的是（）
沪科版九年级物理第十四章检测卷 一、选择题(每题3分，共36分) 1．关于摩擦起电，以下说法错误的是() A．摩擦起电的原因是不同物质的原子核对核外电子的束缚本领不同 B．丝绸摩擦过的玻璃棒所带的电荷是正电荷 C．丝绸摩擦过的橡胶棒所带的电荷是负电荷 D．如果两个带电体互相吸引，那么它们一定带异种电荷 2．甲、乙、丙三个带电的轻质小球相互作用情况如图所示，已知乙带负电，则下列判断正确的是() A．甲带正电，丙带正电B．甲带正电，丙带负电 C．甲带负电，丙带正电D．甲带负电，丙带负电 3．如图所示，下列各电路图中无误的是() 4．如图所示，在探究并联电路中电流的规律时，小刚同学用电流表测出A、B、C点的电流，分别为I A＝0.3 A，I B＝0.2 A，I C＝0.5 A，在表格中记录数据后，下一步应该做的是() A．整理器材，分析数据，得出结论 B．换用不同规格的小灯泡，再测出几组电流值 C．改变电流表的量程，再测出几组电流值 D．对换L1和L2的位置，再测出一组电流值 5．某学校的前后两个门各装有一个开关，若前门来人闭合开关S1时传达室内红灯亮铃响，后门来人闭合开关S2时传达室内绿灯亮铃响，图中呼叫电路设计最佳的是()
6．如图所示电路中，甲、乙两处分别接入电流表或电压表。当S闭合后，为使两灯均能发光，则() A．甲、乙均接入电流表B．甲接入电流表，乙接入电压表 C．甲、乙均接入电压表D．甲接入电压表，乙接入电流表 (第6题)(第7题)(第8题) 7．如图所示的电路中，闭合开关S时，下列说法正确的是() A．两灯泡串联B．电流表测的是L1的电流 C．电流表测的是总电流D．电流表测的是L2的电流 8．如图所示电路，闭合开关，甲、乙两灯均发光，两电表均有示数，过一会儿，其中一个灯泡突然熄灭，一只电表示数增大，另一只电表示数减小到几乎为零，造成此现象的原因可能是() A．甲灯短路B．乙灯短路C．甲灯断路D．乙灯断路 9．如图所示，几只串联的水果电池提供的电力足够点亮排成V字形的一组发光二极管。下列说法正确的是() A．水果电池将电能转化为化学能 B．水果电池将化学能转化为电能 C．一组发光二极管同时发光说明它们一定是串联 D．如果少串联一个水果电池，二极管将变亮 10．小军同学按照如图所示的电路“探究串联电路中电流、电压的特点”，当开关S闭合时，灯L1、L2都不亮，电流表无示数，电压表有示数约为3 V，则故障原因可能是() A．L1断路 B．L1短路 C．L2断路 D．L2短路
学习必备欢迎下载 第十四章或有事项（一） 本章考情分析 本章主要阐述了或有事项的确认、计量及列报。分数 本章近三年主要考点： 2 分左右，属于不太重要章节。 （1）预计负债的概念； （2）亏损合同预计负债的计算； （3）重组计划对利润总额影响金额的计算等。 本章应关注的主要问题： （1）或有事项的概念； （2）或有事项确认负债的条件及计量； （3）或有事项确认资产的条件及计量； （4）亏损合同的会计处理； （5）重组义务的会计处理； （6）或有事项的列报。 2015 年教材主要变化 本章内容没有变化。 主要内容 第一节第二节第三节第四节或有事项概述 或有事项的确认和计量 或有事项会计的具体应用 或有事项的列报 第一节或有事项概述 一、或有事项的概念和特征 或有事项，是指过去的交易或者事项形成的，其结果须由某些未来事项的发生或不发生才能决定的不确定事项。 或有事项具有以下特征：
（一）由过去的交易或事项形成。即或有事项的现存状况是过去交易或事项引起的客观 存在。 【提示】未来可能发生的自然灾害、交通事故、经营亏损等事项，不属于企业会计准则 规范的或有事项。 （二）结果具有不确定性。即或有事项的结果是否发生具有不确定性，或者或有事项的 结果预计将会发生，但发生的具体时间或金额具有不确定性。 （三）由未来事项决定。即或有事项的结果只能由未来不确定事项的发生或不发生才能 决定。 常见的或有事项有：未决诉讼或未决仲裁、债务担保、产品质量保证（含产品安全保证）、环境污染整治、承诺、亏损合同、重组义务等。 【例题 ?多选题】下列事项中，属于或有事项的有（）。 A.对债务单位提起诉讼 B.对售出商品提供售后担保 C.无形资产摊销 D.为子公司的贷款提供担保 E.亏损合同 【答案】 ABDE 【解析】无形资产摊销，其价值最终会转移到成本或费用中是确定的，该事项的结果是确定的，因此无形资产摊销不是或有事项。 二、或有负债和或有资产 或有负债，是指过去的交易或者事项形成的潜在义务，其存在须通过未来不确定事项的 发生或不发生予以证实；或过去的交易或者事项形成的现时义务，履行该义务不是很可能导 致经济利益流出企业或该义务的金额不能可靠计量。 或有资产，是指过去的交易或者事项形成的潜在资产，其存在须通过未来不确定事项的 发生或不发生予以证实。 或有负债和或有资产不符合负债或资产的确认条件，企业不应当确认或有负债和或有资 产，而应当进行相应的披露。 【例题 ?单选题】根据或有事项准则的规定，下列有关或有事项的表述中，正确的是 （）。 A.由于担保引起的或有事项随着被担保人债务的全部清偿而消失
九年级物理第十四章《了解电路》测试题 时间：90分钟总分：100分姓名成绩 一、选择题：（每题２分，共２８分） 题号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 答案 1、手中拿一根金属棒和毛皮摩擦后，从未发现金属棒有带电现象，这是因为：A．金属棒的原子核把电子紧紧地束缚着 B．经摩擦后，金属棒所带上的电荷很快通过手传到大地上去 C．毛皮只有跟橡胶棒摩擦时才有电 D．金属棒中没有自由电荷 2、用跟毛皮摩擦过的橡胶棒接触带电的验电器的金属球，发现验电器的金属 箔先合拢后又张开，则：（） A．验电器原来带负电，后来带正电 B．验电器原来带正电，后来带负电C．验电器先后都带正电 D．验电器先后都带负电 3、下列现象不属于摩擦起电的是：（） A．在干燥的天气脱毛衣时会听到轻微的噼叭声 B．用干净的塑料梳子梳头发时，头发会随梳子飘起 C．化纤衣服穿在身上特别爱吸附灰尘 D．擦黑板时粉笔灰四处飘落 图1 4、某同学用电流表测量电流时，用了如图１所示的两个接线柱，则下列叙述 正确的是（）
A．电流表的量程为0.6A～3A B．电流表的量程为0～3A C．电流表的量程为0～0.6A D ．不能用来测量电流，谈不上量程 5、如图2所示，甲、乙两表的示数分别是：（） A．0.44A 2.1V B．0.44A 10.5V C．2.2A 2.1V D．2.2A 10.5V 6、某家用电器正常工作时，测得通过用电器的电流为4A，则此时用电器可能是下列中的： A．家用电冰箱 B．日光灯 C．家用空调机 D．电风扇 7、下面关于电流表和电压表的使用规则的各种说法中，错误的是：（）A．使用前都要检查指针是否对准零刻度线 B．测量前要估计测量值的范围，以选定量程 C．接入电路时，都要使电流从表的正接线柱流进，从表的负接线柱流出D．接入电路时，都要严禁将表的两个接线柱直接连到电源两极上 8、对于图3中的电路，图4中与实物连接图完全对应正确的电路是：（） 图2
图 4 第十四章了解电路 测试题 一 选择题 ( )1.关于摩擦起电，以下说法错误．． 的是 A ．摩擦起电的原因是不同物质的原子核对电子的束缚本领不同B ．丝绸摩擦过的玻璃棒所带的电荷是正电荷C ．丝绸摩擦过的橡胶棒所带的电荷是负电荷D ．如果两个带电体互相吸引，它们一定带异种电荷 ( )2.四个悬挂着的通草小球。相互作用情况如图1所示， 那么D 球可能 A ．带与A 球相同的电荷 B ．带与B 球相同的 电荷C ．带与C 球相同的电荷 D ．不带电 ( )3．“0.15A ”最可能是下列哪个用电器工作时的电流 A ．家用电冰箱 B ．家用空调器 C ．普通计算器 D ．普通的白炽灯 ( )4．高铁每节车厢都有两间洗手间，只有当两间洗手间的门都关上时（每扇门的插销都相当于一个开 B C D ( )6. 如图 4 所示，在“探究并联电路中电流的规律”时，小雨同学用电压表测 出A 、B 、C 点的电流，分别为I A =0.3A ，I B =0.2A ，I C =0.5A ，在表格中记录数据后，下 一步应该做的是 A ．整理器材，分析数据，得出结论 B ．换用不同规格的小灯泡， 再测出几组电流值 C ．改变电流表的量程，再测出几组电流值 D ．对换L 1和L 2 的位置，再测出一组电流值 ( )7．如图5所示，为保证司乘人员的安全，轿车上设有安全带未系提示系统．当 乘客坐在座椅上时，座椅下的开关S 1闭合．若未系安全带，则开关S 2断开，仪表盘上 的指示灯亮起；若系上安全带，则开关S 2闭合，指示灯熄灭．下列设计比较合理的电路图是 ( )8、从2013年4月9日起，交管部门将依法严管行人无视交规闯红灯行为。根据你对指挥行人过斑马线红绿交通信号灯的了解，下列控制红绿灯的电路图可行的是 ( )9．如图所示的电蚊拍，具有灭蚊和照明等功能．当开关S 1闭合，S 2断开时， 只有灭蚊网通电起到灭蚊作用；当开关S 1和S 2都闭合时，灭蚊网与灯都通电同时起 到灭蚊和照明的作用．下列电路设计符合这种要求的是 A B C D 图5
第十四章了解电路复习提纲 一、电荷 1、带了电（荷）：摩擦过的物体有了吸引轻小物体的性质，我们就说物体带了电。 轻小物体指碎纸屑、头发、通草球、灰尘、轻质球等。 使物体带电的方法： ①摩擦起电定义：用摩擦的方法使物体带电 原因：不同物质原子核束缚电子的本领不同 实质：电荷从一个物体转移到另一个物体使正负电荷分开 电荷种类：带异种电荷 ②接触带电：物体和带电体接触带了电。带同种电荷。 ③感应带电：由于带电体的作用，使带电体附近的物体带电。 3、两种电荷： 正电荷：规定：用丝绸摩擦过的玻璃棒所带的电。 实质：物质中的原子失去了电子 负电荷：规定：毛皮摩擦过的橡胶棒所带的电。 实质：物质中的原子得到了多余的电子 4、电荷间的相互作用规律：同种电荷相互排斥，异种电荷相互吸引。 5、验电器：构造：金属球、金属杆、金属箔 作用：检验物体是否带电。 原理：同种电荷相互排斥的原理。 6、中和：放在一起的等量异种电荷完全抵消的现象 扩展：①如果物体所带正、负电量不等，也会发生中和现象。这时，带电量多的物体先用部分电荷和带电量少的物体中和，剩余的电荷可使两物体带同种电荷。 ②中和不是意味着正负电荷被消灭，实际上电荷总量保持不变，只是等量的正负电荷使物体整体显不出电性。 二、导体和绝缘体： 1、导体：定义：容易导电的物体。 常见材料：金属、石墨、人体、大地、酸碱盐溶液 导电原因：导体中有大量的可自由移动的电荷 说明：金属导体中电流是自由电子定向移动形成的，酸、碱、盐溶液中的电流是正负离子都参与定向运动 2、绝缘体：定义：不容易导电的物体。 常见材料：橡胶、玻璃、陶瓷、塑料、油等。 不易导电的原因：几乎没有自由移动的电荷。 3、“导电”与“带电”的区别 导电过程是自由电荷定向移动的过程，导电体是导体；带电过程是电子得失的过程，能带电的物体可以是导体，也可以是绝缘体。 4、导体和绝缘体之间并没有绝对的界限，在一定条件下可相互转化。一定条件下，绝缘体也可变为导体。原因是：加热使绝缘体中的一些电子挣脱原子的束缚变为自由电荷。 三、1、电路的组成 ①电源：将其它能量转化为电能的装置 定义：能够提供电流的装置，或把其他形式的能转化为电能的装置。 作用：在电源的内部不断地聚集正电荷负极聚集负电荷。以持续对外供电 2、连接方式： 四、电流 1、形成：电荷的定向移动形成电流 注：该处电荷是自由电荷。对金属来讲是自由电子定向移动形成电流；对酸、碱、盐的水溶液来讲，正负离子定向移动形成电流。 2、方向的规定:把正电荷移动的方向规定为电流的方向。
第二十四章或有事项 1、或有事项三特征： A、过去的交易或事项形成的 B、其结果须由某些事项的发生与否才能决定的 C．不确定事项 2、常见的事有事项： A．未决诉讼或仲裁 B．债务担保 C．产品质量保证（含安全保证） D．承诺 E．亏损合同 F．重组义务 G．环境污染整治 3、区别或有事项意义在于是辨别企业承担了义务还是形成了潜在资产： A．或有资产和或有负债均不确认 B．或有事项符合一定条件时，应当确认为负债 （2）企业承担义务，应分别确认： ①或有负债—不符合确认条件时—应予以披露，不得确认和计量 ②预计负债—符合确定条件时—应予以确认计量和披露 （3）或有事项确认为资产应同时满足以下两个条件： A．相关义务己确认为负债 B．从第三方或第三方得到补偿基本确定 （4）企业因或有资产的处理： ①不能加以确定，一般也不能披露—不是很可能时不作处理 ②很可能导致未来经济利益流入企业时—应披露 4、将或有负债确认为预计负债的条件—应同时满足： （1）该义务是企业承担的现时义务 （2）履行该义务很可能导致经济利益流出企业 （3）该义务的金额能够可靠计量 5、可能性划分的概率区间标准： （1）基本确定事件：发生的可能性95% 精心整理 第十四章了解电路知识点总结 一、电是什么 1、自然界中只有两种电荷。人们把绸子摩擦过的玻璃棒上带的电荷叫做正电荷，毛皮摩擦过的橡胶棒上带的电荷叫做负电荷。 2、电荷间相互作用规律：同种电荷互相排斥,异种电荷互相吸引。带电体能吸引不带电的轻小物体。 若相互吸引，可能带异种电荷，还可能一个带电另一个不带电。 若相互排斥，都带电，且带的是同种电荷。 3、摩擦起电的实质：是电子在物体间发生了转移。（电是不会凭空产生的） 得到电子的物体显示带负电，失去电子的物体显示带等量的正电。 4（1（2（35端。 6问1问2(1)问312（1（2）电流可能只是由负电荷定向移动形成的。 （3）电流可能是由正、负电荷同时向相反方向定向移动形成的。 3、物理学中规定：把正电荷定向移动的方向规定为电流的方向。 （1）正负电荷的定向移动都可以形成电流，那么按照定义，负电荷的定向移动与电流的方向相 反，如金属导体中的电流，是由自由电子的定向移动形成的。那么它的电流就和自由电子的定向移动方向相反。 （2）外电路中的电流方向：电路接通时，电流总是从电源的正极流出，经过导线、开关、用电 器等流入电源负极。 4、三种电路： （1）通路：处处相通的电路。或叫电路是闭合的。 （2）开（断）路：某处断开的电路 （3）短路：不经过用电器而直接将电源两极用导线连通的电路。 电源两端或用电器两端直接用导线连接起来。 ①电源短路：电路中有很大的电流，可能烧坏电源或烧坏导线的绝缘皮，很容易引起火灾。 ②用电器短路（部分电路短路）：用电器（或部分电路）两端直接用导线连接，该用电器（或 部分电路）不能工作，没有电流通过该用电器（或部分电路）。 5、电路图：用规定的符号表示电路连接的图叫做电路图。 画电路图的要求：要用统一规定的符号；简洁、整齐、画成矩形、用直尺。 三、连接串联电路和并联电路 1、串联：两个或两个以上的小灯泡逐个顺次串接在一起，然后在接入电路的连接方式。 2、串联电路的特点： （1 （2 （3 3 4 （1 （2 （3 5 1 2 3 如图电流表选择的量程， 最小分度值， 此时电流表的示数是。 如图电流表选择的量程， 最小分度值， 此时电流表的示数是。 5、串联电路电流特点：串联电路中各处的电流是相等的。 6、并联电路电流特点：并联电路中，干路中的电流等于各支路中的电流的总和。 五、测量电压 1、电压是电路中形成电流的原因，电源是提供电压的装置。用“U”表示。 第十四章终结审计与审计报告 (一)单项选择题 1．无论是建议调整的不符事项、未调整的不符事项，还是重分类误差，在审计工作底稿中都是以( )的形式体现的。 A．会计分录B．审计差异调整表C．明细表D．试算平衡表 2．编制审计差异调整表的关键是( )建议调整的不符事项和未调整不符事项。 A．运用重要性原则划分B．在工作底稿中详细记载 C．与管理当局进行书面沟通D．在会计报表的附注中进行充分披露 3．按审计报告的容与格式要求，审计报告的下列要素中，( )不是必须的。 A．围段B．说明段C．意见段D．引言段 4．当注册会计师出具无保留意见审计报告时，如果认为必要，可以( )，增加对重要事项的说明。 A．在意见段前增加解释性说明B．在围段与意见段间说明所持意见的理由 C．在意见段后增加说明段D．取消意见段，增加说明段 5．在审查合并会计报表时，主审注册会计师往往要利用其他注册会计师的工作。如果其他注册会计师的工作结果对合并会计报表很重要，但无法加以核实，则主审注册会计师对这部分工作应当( )。 A．加以利用，并在审计报告的意见段后增加说明段专门给予说明 B．不予利用，并按审计围受限的处理原则决定所发表的审计意见的类型 C．加以利用，因为由利用这部分工作可能导致的错误由其他注册会计师负责 D．不予利用，并基于负责的态度直到能加以核实时再出具审计报告 6．如果注册会计师发现被审计单位有总金额超过重要性水平、账龄长达3年的应收账款，且被审计单位对此进行了适当的披露，则应当( )。 A．发表保留意见 B．发表无法表示意见 C．在意见段后增设说明段予以说明D．出具否定意见 7．注册会计师发现被审计单位连续出现巨额营业亏损的情况时，下列观点中，你认为不正确的是( )。 第十四章了解电路 （一） 1、四个悬挂着的通草小球,静止时的位置关系如图所示,下列说法正确的是( ) A.A球与C球一定带有异种电荷 B.B球可能带电,也可能不带电 C.B球与D球一定带有同种电荷 D.D球可能带电,也可能不带电 2.丝绸与玻璃棒相互摩擦后,玻璃棒带(选填“正”或“负”)电,将丝绸靠近带负电的轻质小球时会相互(选填“排斥”或“吸引”)。 3.如图所示,将塑料绳一端扎紧,把绳尽可能撕成更多的细丝,用手从上向下捋几下,观 察到细丝蓬散开来,是因为细丝与手摩擦后带上(选填“同”或“异”)种电荷 而相互。 4.有A、B两个带电体,若A与B互相排斥,而A又与带正电的C相互吸引,那么A一定带电,B与C一定能互相。 （二） 1.在如图所示的电路中,正确的电路组成是( ) 2.如图电路中,用导线连接下列两点后,会导致电路短路的是( ) A.a、c B.b、c C.b、d D.d、e 3.小明设计并制作了一个“盲人水杯”,其工作原理如图所示。杯中近 杯口处A点是水位器的两个触点,当杯中的水位到达A位置时,水位器 会自动发出音乐声,表示水已盛满。杯口处两个触点的作用相当于( ) A.导线 B.开关 C.用电器 D.电源 4.(多选)如图所示的电路中,要使小灯泡发光,a、b两处可连接的电路元件 是( ) A.a、b两处都接开关 B.a、b两处都接导线 C.a处接电源,b处接开关 D.b处接电源,a处接开关 5.短路和开路是电路中常见的故障,下列四幅图中有短路现象的是( ) 6.家庭电路中经常出现的故障有:灯泡的灯丝断了、灯头内的电线断了、灯头或开关等处的接线松动。这些现象都属于,而如图所示的情况属于。 7.电风扇中有一个自动断电的安全装置,如图所示,当电风扇倾倒时, 它电路,直立时,它电路。(均选填“断开”或“闭合”) 8.如图所示,当开关S1、S2断开时,电路是;当S1闭合、S2断开时,电路是;当S1、S2都闭合时,电路是。(均选填“通路”“开路”或“短路”) 9.根据如图所示电路图,请将实物图连接起来。 （三） 1.下列给出的用电器中连接方式属于串联的是( ) A.烘托节日气氛的小彩灯 B.道路两旁的路灯 C.家中的电视、电脑等家用电器 D.教室里照明用的日光灯 2图中的电路图和实物图相对应的是( ) 3.(多选)有一个看不见内部情况的盒子,盒上有两个灯泡和一个开关,它们的连线在盒内。闭合开关,两个灯泡都发亮,断开开关,两个灯泡都熄灭。在不打开盒子的情况下,小玲为了判断两个灯泡的连接方式,把其中一个灯泡拆下,闭合开关,观察另一个灯泡。下列说法正确的是( ) A.如另一个灯还亮,则原来两灯是并联 B.如另一个灯还亮,则原来两灯是串联 C.如另一个灯不亮,则原来两灯是并联 D.如另一个灯不亮,则原来两灯是串联 4.火车车厢后有两间厕所,只有当两间厕所的门都关上时(每扇门的插销相当于一个开关),车厢中显示“厕所有人”的指示灯才会发光。下图中符合要求的电路是( ) 5.如图所示的电蚊拍,具有灭蚊和照明等功能。当开关S1闭合、S2断开时,只有灭蚊网通电起到灭蚊作用;当开关S1和S2都闭合时,灭蚊网与灯都通电同时起到灭蚊和照明作用。下列电路设计符合这种要求的是( ) 第十三章或有事项 第一节或有事项概述 一、或有事项的概念和特征 企业在经营活动中有时会面临一些具有较大不确定性的经济事项，这些不确定事项对企业的财务状况和经营成果可能会产生较大的影响，其最终结果须由某些未来事项的发生或不发生加以决定。比如，企业售出一批商品并对商品提供售后担保，承诺在商品发生质量问题时由企业无偿提供修理服务。销售商品并提供售后担保是企业过去发生的交易，由此形成的未来修理服务构成一项不确定事项，修理服务的费用是否会发生以及发生金额是多少将取决于未来是否发生修理请求以及修理工作量、费用等的大小。按照权责发生制原则，企业不能等到客户提出修理请求时，才确认因提供担保而发生的义务，而应当在资产负债表日对这一不确定事项作出判断，以决定是否在当期确认承担的修理义务。这种不确定事项在会计上被称为或有事项。 或有事项，是指过去的交易或者事项形成的，其结果须由某些未来事项的发生或不发生才能决定的不确定事项。常见的或有事项包 证）、亏损合同、重组义务、承诺、环境污染整治等。 或有事项具有以下特征： 第一，或有事项是因过去的交易或者事项形成的。或有事项作为一种不确定事项，是因企业过去的交易或者事项形成的。因过去的交 易或者事项形成，是指或有事项的现存状况是过去交易或者事项引起的客观存在。例如，未决诉讼是企业因过去的经济行为导致起诉其他单位或被其他单位起诉，是现存的一种状况，而不是未来将要发生的事项。又如，产品质量保证是企业对已售出商品或已提供劳务的质量提供的保证，不是为尚未出售商品或尚未提供劳务的质量提供的保证。基于这一特征，未来可能发生的自然灾害、交通事故、经营亏损等事项，都不属于或有事项。 第二，或有事项的结果具有不确定性。首先，或有事项的结果是否发生具有不确定性。例如，企业为其他单位提供债务担保，如果被担保方到期无力还款，担保方将负连带责任，担保所引起的可能发生的连带责任构成或有事项。但是，担保方在债务到期时是否一定承担和履行连带责任，需要根据被担保方能否按时还款决定，其结果在担保协议达成时具有不确定性。又如，有些未决诉讼，被起诉的一方是否会败诉，在案件审理过程中是难以确定的，需要根据法院判决情况加以确定。其次，或有事项的结果预计将会发生，但发生的具体时间或金额具有不确定性。例如，某企业因生产排污治理不力并对周围环境造成污染而被起诉，如无特殊情况，该企业很可能败诉。但是，在诉讼成立时，该企业因败诉将支出多少金额，或者何时将发生这些支出，可能是难以确定的。 第三，或有事项的结果须由未来事项决定。或有事项的结果只能由未来不确定事项的发生或不发生才能决定。或有事项对企业会产生有利影响还是不利影响，或虽已知是有利影响或不利影响，但影响有 图5-1 第十三章了解电路 一、填空题 1．如图1甲所示，丝绸摩擦过的玻璃棒和不带电的验电器金属球接触， 发现验电器金属箔片张开的原因是______ ___。若将另 一带电小球与验电器金属球接触，发现箔片闭合，如图乙所示，则此带 电小球带电。 2．计算器中的电流大约100μA，也就是 A ；雷电是一种常见的自 然现象，发生雷电时的电流高达2×105A，相当于 mA。 3．小明家中装有一台电视机、一台洗衣机、两盏照明灯，正常工作时的电流分别为200mA、1A和250mA。如果电路中的电流不允许超过3A，他家最多还能再装300mA的照明灯____________盏。4我们经常在加油站看到一条醒目的警示：“严禁用塑料桶运汽油”。这是因为在运输过程中汽油会不断与筒壁摩擦，使塑料桶带________，容易造成火灾隐患。 5有A、B两个带电体，若A与B相互排斥，而A又与带正电的C相互吸引，那么A一定带_______电，B与C一定能相互_______。 6某同学参加兴趣小组活动时，连成了如图5-1所示电路，那么，当S1、S2都闭合时，发光的灯泡是；当S1断开、S2闭合时，发光的是。 7在如图5-2所示的电路中，只增加一根导线，使电路变成并联电路，则这根导线应该接在________两点之间。 8如图5-3所示，将导体接到电路A、B之间时，导体与灯泡是 ________联的．如果将不同的导体分别接到A、B之间，闭合开关，可通过观察、比较 ________来判断不同导体导电能力的大小．若两个导体的导电差异不大，则可以用 ________表替换灯泡，作进一步的判断． 9按照我国交通管理的规定，“红灯停、 绿灯行、黄灯预备”，有人在科技活 动中设计了一个实验电路，用以模拟 十字路口的红绿灯，如图5-4所示。 当单刀多掷开关接通位置“1”时， 东西方向的灯发光。当单 刀多掷开关接通位置“3”时，允许 方向的车辆通行。 10如图5-5所示电路中 （1）若使L1、L2串联，则应闭合， 断开；（2）若使L1、L2并联， 则应闭合，断开 ；（3）如果只闭合S1而断开S2、S3，则灯亮；（4）同时闭合开关和是不允许的. 11．如图1示，当开关S闭合后，要使电阻R1、R2并联，甲表是、乙表是。(选填“电流表”或“电压表”) 12．如图4，电源电压为12V，电压表示数为4V，则两灯泡是______联，L1两端的电压是_____V，。13．如图3(a)所示电路中，当闭合开关 后，两个电压表指针偏转均为图 (b)所 示，则电阻Ｒ1两端的电压为， Ｒ2两端的电压为。 14．家庭电路中的电风扇、洗衣机、电 视机等用电器使用的插座与电灯之间 的连接方式是_________联，开关与电灯之间的连接方式是_________联。 15．某导体10秒内通过导体横截面的电荷量为3库，则通过导体的电流为_______安。某电源由3节干电池串联组成的电池组，电源的电压是。 16如图5-6甲所示电路中，电流表A1 与A2指针指示的位置如图所示，则电 流表A1所使用的量程为，读 数是；电流表A2所使用的量 程是，读数是，灯 L1电流是。 17如图所示，L1、L2及A、B两点间 的电压分别为U1、U2和U AB，它们之间的关系为_________。若已知 U AB=6 V，U1=3.8 V，则U2=_________。 18.如图6-2-14所示，当S1闭合、S2断开时，电压表示数为2.5 V； 当S1断开、S2闭合时，电压表示数为 6 V。灯L1两端的电压为 _________V，灯L2两端的电压为_________ V，电源电压为________ V。 二、选择题 17在如图5-7所示的各电路中，开关S闭合后，小灯泡L1、L2都能发光的是 （） S L L A1 A2 1 2 3 0.2 0.4 0.6 图5-6 图5-2 图5-3 L1 L2 S1 S2 S3 图5-5 红 黄 绿 红 黄 绿 红黄绿红 黄 绿 东 西 北 南 1 2 3 电源 图4 图1 图 1 甲乙 图3 5 10 15 1 2 3 (b) (a) 第十四章或有事项 一、单项选择题 1.甲公司下列各项中，不属于或有事项的是（）。 A.甲公司为其子公司的贷款提供担保 B.甲公司以其自己的财产作抵押向银行借款 C.甲公司起诉其他公司 D.甲公司被其他公司起诉 2.2014年10月2日，乙公司涉及一起诉讼案。2014年12月31日，乙公司尚未接到人民法院的判决。在咨询了公司的法律顾问后，乙公司认为：胜诉的可能性为30%，败诉的可能性为70%；如果败诉，需要赔偿200万元的概率为75%，需要赔偿300万元的概率为25%。假定不考虑其他因素，乙公司2014年12月31日因上述事项需确认的预计负债为（）万元。 A.200 B.300 C.500 D.250 3.2015年10月20日，甲公司因违反合同而被丁公司起诉。2015年12月31日，人民法院尚未对案件进行审理。甲公司法律顾问认为败诉的可能性80%，将要支出的违约金在80万元～120万元之间，在这个区间内每个金额的可能性都大致相同，同时需支付诉讼费用6万元，则甲公司2015年12月31日因该未决诉讼确认预计负债的金额为（）万元。 A.80 B.120 C.106 D.100 4.乙公司（甲公司的子公司）从丙银行取得贷款，甲公司为其担保本息和罚息总额的60%，其余部分乙公司以自身房地产作为抵押。截止2014年年末乙公司贷款逾期无力偿还，被丙银行起诉，甲公司成为第二被告，丙银行要求甲公司与被担保单位共同偿还贷款本息500万元，并支付罚息10万元，承担诉讼费用10万元，2014年年末该诉讼正在审理中。甲公司估计承担担保责任的可能性为90%，且乙公司无偿还能力，2014年年末甲公司应确认的预计负债是（）万元。 A.306 B.500 C.510 D.312 5.甲股份有限公司（以下简称甲公司）是生产并销售A产品的企业，2015年第一季度，共销售A产品60 000件，销售收入为360 000 000元。根据甲公司的产品质量保证条款，该产品售出后一年内，如发生正常质量问题，甲公司将负责免费维修。根据以前年度的维修记录，如果发生较小的质量问题，发生的维修费用为销售收入的1%；如果发生较大的质量问题，发生的维修费用为销售收入的2%。根据甲公司技术部门的预测，本季度销售的产品中，80%不会发生质量问题；15%可能发生较小质量问题；5%可能发生较大质量问题。根据上述资料，甲公司2015年第一季度应在资产负债表中确认的负债金额为（）元。 A.0 B.540 000 C.900 000 D.360 000 6.M企业因提供债务担保需赔偿对方50万元并承担诉讼费5万元，同时基本确定可以从第三方获得金额为52万元的补偿。下列关于M企业的会计处理正确的是（）。 A.确认管理费用55万元 B.确认其他应收款50万元 C.确认营业外支出55万元 D.确认预计负债55万元 7.企业发生的未决担保诉讼，如果律师或法律顾问等出具的书面意见上表明企业败诉的可能性大于胜诉的可能性，并且损失金额能够合理估计，就应当将损失金额（）。 A.确认或有负债，计入当期营业外支出，并在资产负债表附注中进行披露 B.确认或有负债，计入当期管理费用，并在资产负债表附注中进行披露 第十三章或有事项 一、单项选择题 1、M公司2010年年初因A产品售后保修确认的预计负债余额为20万元。2010年该公司分别销售A产品4万件，销售单价为50元。公司向购买者承诺A产品售后2年内免费提供保修服务，预计保修期内将发生的保修费在销售额的1%～5%之间。2010年实际发生保修费8万元。假定无其他或有事项。企业适用的所得税税率是25%。M公司2010年应确认的递延所得税资产为（）。 A、0.5万元 B、－0.5万元 C、4.5万元 D、－4.5万元 2、甲公司2013年12月份发生的下列或有事项，对当期损益的影响金额及记入的会计科目，处理正确的是（）。 A、对一项未决诉讼很可能赔偿的损失200万元计入营业外支出，同时将基本确定从第三方获得的补偿30万元确认营业外收入 B、对一项重组义务中发生的员工遣散费支出230万元计入管理费用，同时将因撤销厂房租赁合同支付违约金20万元计入营业外支出 C、对一项销售收入为2 000万元的业务计提产品质量保证支出，按照以往经验，发生的保修费一般为销售额的2%～3%，因此计提了50万元的销售费用 D、对一项亏损合同，已发生成本为38万元，已知执行合同损失38万元，产品如果按照市价销售将会获利5万元，由于如果不执行合同甲公司将支付40万元的违约金，因此选择执行合同并确认38万元资产减值损失 3、至2013年末，甲公司账上与或有事项相关的资料如下： （1）正在诉讼过程中的经济案件估计很可能胜诉并可获得100万元的赔偿； （2）由于甲公司生产过程中产生的废料污染了河水，有关环保部门正在进行调查，估计很可能支付赔偿金额60万元，同时甲公司检查发现废料污染时由于购买的环保设备不达标造成的，预计很可能从第三方得到补偿金额20万元。 假定不考虑其他因素，计算甲公司应确认的资产和预计负债的金额分别为（）。 A、100万元；40万元 B、100万元；60万元 C、0；60万元 D、0；40万元 4、甲公司是一家化工厂，其产生的化工废料严重影响了当地环境。由于其治污不力，被当地居民起诉，要求其赔偿损失共计500万元。甲公司经咨询，预计很可能赔偿金额为300万元。至2×13年年末，该未决诉讼尚未判决。2×14年2月1日，法院开庭审理，判决甲公司应向当地居民支付赔偿款400万元，甲公司与当地居民均服从判决，并于2月底结算赔偿款。税法规定，该赔偿金额在实际发生时允许税前扣除。甲公司2×13年的财务报告于2×14年4月30日批准对外报出。甲公司适用的所得税税率为25%，不考虑其他因素，下列处理中正确的是（）。 A、2×13年，甲公司确认预计负债500万元 B、2×14年2月1日，甲公司确认其他应付款400万元 C、2×14年2月1日，甲公司确认递延所得税资产75万元 D、甲公司不应进行账务处理，应对上述事项在财务报表附注中进行披露 第十四章了解电路 一、复习目标 （1）知道什么叫物体带电和摩擦起电。 （2）知道自然界有两种电荷间的相互作用。 （3）了解电路的组成，形成电路的概念。 （4）能了解通路、开路及短路，认识短路的危害。 （5）通过实物认识电路元件及其符号，会识别简单电路图。 二、课时安排 2课时 三、复习重难点 （1）了解电路的组成，形成电路的概念。 （2）能了解通路、开路及短路，认识短路的危害。 四、教学过程 （一）知识梳理 1.电是什么 ①摩檫起电现象②探究电荷的种类和相互作用规律③电荷间相互作用的规律 2.让电灯发光 ①电路的组成②电流的方向③电路的三种状态④电路元件符号与电路图⑤根据实物图画电路图 3.连接串联电路和并联电路 ①电路的基本连接②串联电路图及特点并联电路及特点③电路的设计 4.科学探究：串联和并联电路的电流 ①电流强度②电流的测量③电流表④读取数据的正确顺序⑤如何把电流表正确的接入电路 5.测量电压 ①电压单位②电压表及使用规则③电压规律④串联、并联电路电压关系 （二）题型、方法归纳 选取经典选择题以及问答题形式，给学生讲解，以促进学生对所学知识的充分理解与掌握。采用启发、诱思、讲解和讨论相结合的方法使学生充分掌握这一章节的知识。 （三）典例精讲 例1：如图所示，小杜同学用与丝绸摩擦过的玻璃棒接触验电器的金属球，看到验电器的金属 箔张开，在这个过程中（） A．玻璃棒和验电器都带负电荷 B．玻璃棒带正电荷，验电器带负电荷 C．用丝绸摩擦过的玻璃棒产生了电荷 D．金属箔张开是因为同种电荷相排斥 解：用丝绸摩擦过的玻璃棒带正电．AB、玻璃棒带正电，当其与验电器接触时，验电器也带正电，故AB错误；C、摩擦起电是电荷的转移，不是创造了电荷，故用丝绸摩擦过的玻璃棒显正电性，是由于一部分电子转移到丝绸上的缘故，故C错误；D、据验电器的原理可知，金属箔张开是因为同种电荷相排斥，故D正确；故选D． 例2：从显像管尾部的热灯丝发射出来的电子，高速撞击到电视机荧光屏上，使荧光屏发光，则在显像管内（） A．电流方向从灯丝到荧屏 B．显像管内是真空，无法通过电流 C．电流方向从荧屏到灯丝 D．电视机使用的是交流电，显像管中的电流方向不断改变 解：由题意可知电子的移动方向为从灯丝到荧屏，因为电流的方向与负电荷定向移动的方向相反，所以电流方向为从荧屏到灯丝．故选C． 例3：汽车转向前，司机会拨动转向横杆，同侧的前后两个转向灯就会同时闪亮、同时熄灭，但其中一个损坏时，另一个仍能正常工作，下列说法正确的是（）. A．两灯一定是串联 B．两灯一定是并联 C．两灯的电阻一定相等 D．通过两灯的电流一定相等 解：AB、汽车同侧的前后两个转向灯就会同时闪亮、同时熄灭，但转向灯可以单独工作，所以它们是并联的，故A错误、B正确．C、由于两个灯泡的规格不一定相同，所以电阻不一定相等，故C错误；D、由于两个灯泡的规格不一定相同，所以电流不一定相等，故D错误；故选B．（四）归纳小结 1 电是什么 （1）带了电（荷）：摩擦过的物体有了吸引物体的轻小物体的性质，我们就说物体带了电。 第十四章或有事项 第一节或有事项概述 一、或有事项的概念和特征 1 概念：或有事项，是指过去的交易或者事项形成的，其结果须由某些未来事项的发生或不发生才能决定的不确定事项。 2 常见的或有事项（7个）包括：未决诉讼和未决仲裁、债务担保、产品质量保证（含产品安全保证）、亏损合同、重组义务、承诺、环境污染整治...（结合中财） 3 特征：过去形成、现在不定、未来证实 二、或有负债和或有资产 1 或有负债概念：是指过去的交易事项形成的潜在义务，其存在须通过未来不确定事项的发生或不发生予以证实； 是过去的交易或事项形成的现时义务，旅行该义务不是很可能导致经济利益流出企业或该义务的金额不能可靠计量。 2 或有负债涉及两类义务： 潜在义务：是指结果取决于不确定未来事项的可能义务。 现时义务：是指企业在现行条件下已承担的义务，该现时义务的履行不是很可能导致经济利益流出企业，或者该现时义务的金额不能可靠地计量。 3 履行或有事项相关义务导致经济利益流出的可能性，通常按照一定的概率区间加以判断。一般情况下，发生的概率分为以下4个层次： 基本确定：发生的概率在95%到100%； 很可能：发生的概率在50%到95%； 可能：发生的概率在5%到50%； 极小可能：发生的概率在0到5%之间。 4 或有资产概念：是指过去的交易或者事项形成的潜在资产，其存在须通过未来不确定事项的发生或不发生予以证实。 5 或有负债和或有资产不符合负债或资产的定义和确认条件，企业不应当确认或有负债和或有资产，而应当进行相应的披露。 第二节或有事项的确认和计量 一、或有事项的确认 1 或有事项形成的或有资产只有在企业基本确定能够收到的情况下，才转变为真正的资产，从而予以确认。 2 与或有事项有关的义务应当在同时符合以下三个条件时确认为负债，作为预计负债进行确认和计量： （1）该义务是企业承担的现时义务；（这里所指的义务包括：法定义务和推定义务） （2）履行该义务很可能导致经济利益流出企业；（流出可能性超过50%） （3）该义务的金额能够可靠地计量。 3 预计负债应当与其他负债进行严格区分，单独进行列报。 原因：因为与预计负债相关的未来支出的时间或金额具有一定的不确定性。第十四章了解电路知识点
自考审计学第十四章
沪科版九年级物理第十四章了解电路
第13章 或有事项
第十四章_了解电路_测试卷(68中)
会计(2015)第14章 或有事项 课后作业(下载版)
【推荐】注册会计师考试章节练习第十三章 或有事项(附答案解析)
【公开课教案】：第14章了解电路复习
高财-十四章或有事项
相关主题
文本预览