研究报告DOI :10.11895/j.issn.0253?3820.140672液相色谱?串联质谱法测定人工模拟猪消化液中3种霉菌毒素王瑞国 苏晓鸥* 樊霞 王培龙 高忠武 张瑜
(中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,农业部农产品质量安全研究重点实验室,北京 100081)摘 要 建立了液相色谱?串联质谱法(LC?MS /MS)同时测定人工模拟猪胃和小肠消化液中黄曲霉毒素B 1(AFB 1)二脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米赤霉烯酮(ZEA)的快速二灵敏方法,并将此方法应用于霉菌毒素吸附剂吸附率体外法评价三通过模拟猪的消化道对饲料基质进行体外消化获得猪胃和小肠消化液,分别向其中按一定比例添加霉菌毒素吸附剂和3种霉菌毒素,孵育二离心后,经进样液10倍稀释后测定三采用反相C 18色谱柱分离,以0.2mmol /L 乙酸铵溶液和0.1%甲酸?甲醇溶液作为流动相,梯度洗脱,多反应监测离子模式(MRM)检测,同位素内标法定量三在优化条件下,对AFB 1,DON 和ZEA 在人工猪胃和小肠消化液中的定量限分别是1,50,40μg /L 和0.3,50,20μg /L,相对偏差(RSD)<5.0%三并且,在39℃±0.5℃,10h 内测定结果稳定,能够满足霉菌毒素吸附剂吸附率的测定三采用本方法对市售8种蒙脱石类吸附剂和5种酵母细胞壁类吸附剂进行吸附率评价三关键词 液相色谱?串联质谱;模拟猪消化液;霉菌毒素;霉菌毒素吸附剂 2014?08?07收稿;2014?10?04接本文系 十二五”农村领域国家科技计划(No.2011BAD26B0405)资助*E?mail:suxiaoou@https://www.doczj.com/doc/3815038014.html, 1 引 言
霉菌毒素(Mycotoxins)是由霉菌产生的次级代谢产物,一旦被动物采食会产生一系列毒性效应[1]三饲料特别易于被各种霉菌毒素污染[2,3],而霉菌毒素吸附剂是消除饲料中二低剂量霉菌毒素对动物影响的有效手段[4]三对特定毒素的吸附率是霉菌毒素吸附剂评价的最重要指标,但是吸附率的评价尚没有一致的方法三目前,霉菌毒素吸附剂吸附率的评价存在以下问题:(1)评价方法 吸附率的测定通常分为体外和体内两种三体外方法一般以缓冲液为介质,测定吸附剂对某种霉菌毒素的吸附能力,这种方法在吸附剂初步评价和吸附潜力筛选方面得到广泛应用三但是,由于经常与体内方法的评价结果不一致,从而降低了可信度[5]三体内法采用动物生产性能或生物标记物等间接指标来评价吸附剂效果,因为很多因素和实验条件都可影响最终结果,导致了评价结果不稳定[6]三(2)毒素检测方法 绝大部分霉菌毒素吸附剂吸附率评价采用的是高效液相色谱(HPLC)法[7,8],灵敏度相对液质联用而言较低,测定步骤多,过程繁琐,同步测定多种毒素的能力较差三也有采用酶联免疫试剂盒(ELISA)法进行评价[9~11],结果可靠性差三(3)吸附对象 大部分霉菌毒素吸附剂吸附率测定对象采用AFB 1[12],其原因主要是AFB 1较其他毒素更易于被吸附[13]三事实上,75%的饲料同时被多种毒素污染,且以DON二ZEA 等为主[14,15]三但是,多数种类的霉菌毒素吸附剂对DON 和ZEA 等吸附效果一般,甚至无效[16]三体内实验也表明,对AFB 1吸附效果良好的一种吸附剂在同时受到多种霉菌毒素污染的饲料中使用效果不佳[17]三而且,吸附剂对霉菌毒素是非特异性吸附,饲料中的其他成分很可能会干扰吸附效果[18]三霉菌毒素吸附剂吸附率评价的关键在于评价体系和霉菌毒素检测三目前,液相色谱串联质谱法(LC?MS /MS)在食品和饲料中多种霉菌毒素同步检测上得到了广泛应用[19],但尚未见LC?MS /MS 法用于霉菌毒素吸附剂体外吸附率测定的文献报道三本研究针对上述3个问题,通过模拟猪消化道环境和饲料基质特点制备了人工猪胃和小肠消化液,将饲料中霉菌毒素以外的其它成分引入吸附率评价体系中,并应用LC?MS /MS 同时对3种主要毒素进行测定,能够更加全面二准确地测定霉菌毒素吸附剂的吸附率三第43卷
2015年1月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第1期1~6
2 分析化学第43卷
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
TQD超高效液相色谱?串联质谱仪(美国Waters公司);RVC2?18台式离心浓缩仪(德国Christ公司);3K15高速冷冻离心机(美国Sigma公司);ZWY?200D恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司);D37520高速离心机(美国Kendro公司)三
AFB1,DON和ZEA标准品(纯度≥99%,以色列Fermentek公司);同位素内标13C17?AFB1二13C15?DON二13C18?ZEA(ROMER公司);MilliQ超纯水;乙腈二甲醇二乙酸铵和甲酸(色谱纯,美国Fisher公司);胃蛋白酶二胰蛋白酶二猪胆盐二氯化钠等常规试剂(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)三霉菌毒素吸附剂从市场购买,其中主成分为蒙脱石类的8种产品,分别标识为浙江三鼎科技有限公司二攀枝花兴加环保技术有限公司二赤峰和正美化工有限公司二赤峰市物华天宝矿物材料有限公司二浙江丰虹新材料股份有限公司二寿光中联精细蒙脱石有限公司二内蒙古天源蒙脱石开发有限公司和内蒙古润隆化工有限责任公司;主成分为酵母细胞壁类的5种产品,分别标识为广东江门生物技术开发中心有限公司二北京优利保生物科技与技术有限责任公司二巴西ICC公司二上海沪鼎生物科技有限公司二安琪酵母股份有限公司三生长猪配合饲料样品由国家饲料质量监督检验中心(北京)惠赠三
2.2 溶液配制
2.2.1 霉菌毒素混合标准溶液的配制 分别准确移取浓度为1000mg/L的AFB1,DON,ZEA50,500和200μL,用乙腈定容至10mL,配制成为浓度分别为5,50和20mg/L的霉菌毒素混合标准储备液, -20℃保存三
2.2.2 混合同位素内标进样液的配制 分别准确移取400,400和200μL的13C17?AFB1(500μg/L)二13C15?DON(25mg/L)二13C18?ZEA(25mg/L)置于2mL离心管中,40℃条件下用离心浓缩仪1500r/min 旋干,进样液(0.2mmol/L乙酸铵溶液?乙腈?甲酸,95∶4.9∶0.1,V/V)复溶,超声溶解2min,移取并用进样液定容至100mL,4℃保存三
2.2.3 人工猪胃消化液的制备 称取NaCl2g,胃蛋白酶
3.2g,量取36.5%浓HCl7mL,加水至1000mL,混匀,制得人工胃液三称取适量生长猪配合饲料于三角瓶中,按照质量体积比1∶3向其中加入人工胃液,用HCl调至pH=2.0±0.5,置于39℃±0.5℃恒温振荡器中220r/min孵育1h,静置1min,转移上清液,并10000r/min离心10min,收集上清液于1000mL试剂瓶,4℃保存待用三2.2.4 人工猪小肠消化液的制备 称取KH2PO46.8g,加水500mL使溶解,用0.1mol/L NaOH溶液调至pH6.8,称取胰酶10g,加水使溶解,将两溶液混合后,另加3g猪胆盐,加水稀释至1000mL,制得人工小肠液三将3倍体积的人工小肠液加入到人工胃液消化液制备时剩余的饲料沉淀中,置于39℃±0.5℃恒温振荡器中220r/min孵育1h,静置1min,转移上清液,并10000r/min离心10min,收集上清液于1000mL试剂瓶,4℃保存待用三
2.3 样品处理
移取霉菌毒素混合标准储备液40μL于50mL旋盖塑料离心管中,40℃氮气吹干,加入5mL人工猪胃消化液复溶,再向其中准确加入霉菌毒素吸附剂4mg±0.1mg,涡旋混匀1min,迅速水浴加热至39℃±0.5℃,然后置于恒温振荡器中39℃±0.5℃,220r/min振荡孵育1h,立即取出冷却静置三取1mL 上清液,13000r/min离心5min,取50μL上清液与450μL混合同位素内标进样液涡旋混匀,上机测定平衡后体系中游离毒素的浓度三每种吸附剂吸附率的测定设3个平行,并设不添加霉菌毒素吸附剂的基质校正组,人工小肠液消化液中游离毒素浓度测定步骤同上三吸附率(%)的计算公式为Y=(1-C eq/C0)×100%,式中Y为吸附率,C0为毒素初始(即基质校正组)浓度,C eq为平衡后体系中游离毒素的浓度三2.4 色谱和质谱条件
Acquity UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm,美国Waters公司);柱温40℃,流速0.40mL/min,进样量5μL三流动相A为0.2mmol/L乙酸铵溶液,流动相B为0.1%甲酸?甲醇三梯度洗脱:0~0.5min,90%A;0.5~1.5min,70%A;1.5~2.5min,40%A;2.5~3.5min,30%A;3.5~
4.0min,20%A;4.0~4.2min,90%A;4.2~
5.0min,90%A三
电喷雾离子源(ESI),离子源温度为150℃,脱溶剂温度为450℃,脱溶剂气和锥孔气均为N 2,脱溶剂气流速为900L /h,锥孔气流速为20L /h三AFB 1和DON 采用正离子监测,ZEA 采用负离子监测方式,毛细管电压为0.75kV三采用多反应监测方式(MRM)检测,监测离子二碰撞能量二锥孔电压等参数见表1三3 结果与讨论
3.1 质谱条件的优化
以甲醇?水(50∶50,V /V )为流动相,采用结合进样方式,对3种霉菌毒素及其同位素内标的质谱条件进行优化,在正负离子模式下进行全扫描,选择合适的准分子离子峰和电离方式三其中,AFB 1和DON 的准分子离子为正电离模式下获得的[M+H]+,ZEA 因含有酚羟基结构,其准分子离子为负电离模式下获得的[M -H]-三有文献报道,DON 采用加乙酸根离子[20]或减氢[21]的电离模式,但研究显示DON 加氢模式同样能获得很好的响应三结合基质空白和基质标准液的离子扫描图,进一步优化确定了各种毒素的特征离子对等参数(表1)三
表1 MRM 监测模式下3种霉菌毒素及其同位素内标的质谱优化条件Table 1 Optimized MS /MS parameters of 3mycotoxins and isotope internal standards
扫描模式Scan mode 分析物Analyte
保留时间Retention time (min)母离子Parent ion (m /z )子离子Daughter ion (m /z )锥孔电压Cone voltage (V)碰撞能量Collision energy (eV)驻留时间Dwell time (s)正离子Positive ion 负离子Negaive ion Atlatoxin B1,AFB 1
2.6731
3.1013C 17?AFB 1 2.67330.09Deoxynivaleneol,DON 2.02297.2213C 15?DON 2.02
312.43Zearalenone,ZEA 3.28317.2213
C 18?ZEA 3.28335.07241.04*46360.106284.8646220.106255.1046360.106249.06*20120.106231.0720100.106262.8025120.106175.06*38260.106187.1238220.106140.0440300.106*:定量离子(Quantification ions)三
3.2 色谱条件优化
流动相的组成和配比不但影响目标化合物的色谱行为,还影响着目标化合物离子化效率和灵敏度三实验考察了0.2mmol /L 乙酸铵溶液/0.1%甲酸?甲醇(A)二0.2mmol /L 乙酸铵溶液/乙腈(B)二0.1%甲酸/0.1%甲酸?甲醇(C)二0.1%甲酸/乙腈(D)4种流动相体系对3种霉菌毒素的分离效果和峰信号强度三结果表明,3种毒素在A 流动相体系下色谱峰分离效果好,信号峰响应值最高(表2)三进一步优化流动相条件,采用梯度洗脱,优化色谱条件下5min 内完成样品检测三3种霉菌毒素及其同位素内标的分离效果(以人工胃液为例)见图1三
表2 流动相对峰响应值的影响(以A 体系为100%)Table 2 Effect of mobile phase system on signal response (Mobile phase system A as 100%)目标物Analyte
流动相体系Mobile phase system
0.2mmol /L 乙酸铵溶液/0.1%甲酸?甲醇0.2mmol /L Ammonium acetate /0.1%?formic acid?methanol solution (%)0.2mmol /L 乙酸铵溶液/乙腈0.2mmol /L Ammoium acetate /acetonitrile solution (%)0.1%甲酸/0.1%甲酸?甲醇0.1%Formic acid /0.1%formic acid methanol solution (%)0.1%甲酸/乙腈0.1%Formic acid /acetonitrile solution (%)AFB 110078.522.547.3DON 10024.736.430.7ZEA 10057.318.215.3
3.3 基质效应
由于对样品采取稀释10倍的方法上机测定,没有进行净化处理,所以LC?MS /MS 检测时有较强的
3第1期王瑞国等:液相色谱?串联质谱法测定人工模拟猪消化液中3种霉菌毒素
图1 人工胃液中3种霉菌毒素及其同位素内标的定量离子色谱图(AFB 140μg /L,DON 400μg /L,ZEA 160μg /L)Fig.1 Chromatograms of quantification transitions of 3mycotoxins and theirisotope internal standards in artificial gastric juices (40μg /L for AFB 1,400μg /L for DON,160μg /L for ZEA)基质效应三分别配制高中低3个浓度毒素添
加的人工猪胃和小肠消化液,与进样浓度相同
的标准溶液峰面积比较,计算外标法和内标法
的基质效应(表3)三结果表明,采用外标法定
量3种毒素的基质效应较强,精密度较差;而
采用内标法定量可较好地消除基质效应,提高
精密度三虽然在吸附率评价中可采用基质加
标校正曲线对目标物进行定量计算,但是考虑
到基质效应会降低方法的线性二准确度和精密
度[22],以及不同吸附剂可能带来的基质效应差异,所以本研究采用内标法定量以消除基质
效应的干扰三3.4 线性方程二相关系数二定量限和精密度
准确移取100,40,20,10,5和2.5μL 霉
菌毒素标准储备液,室温下氮气吹干,分别用5mL 人工胃液和小肠液消化液溶解制成系列表3 外标法和内标法的基质效应Table 3 Matrix effect of external calibration and isotope dilution method (n =5)
分析物Analyte
添加浓度Addition conc.(μg /L)进样浓度Injection conc.(μg /L)人工胃液消化液Artificial gastric digested juice 外标法EC a ME c (%)/RSD d (%)内标法ID b ME(%)/RSD(%)人工小肠液消化液Artificia lintestinal digested juice 外标法EC ME(%)/RSD(%)内标法ID ME(%)/RSD(%)AFB 1DON ZEA
1001045.0/7.2106.9/1.655.0/9.7102.2/1.650549.2/5.1116.4/1.358.711.2114.7/1.820248.4/12.7110.3/1.960.2/13.1114.0/2.5100010058.4/5.4107.0/1.748.1/5.5102.1/0.85005059.5/10.1105.3/1.942.0/9.6104.8/1.62002064.3/13.0111.2/2.837.8/10.1108.0/1.24004013.6/7.3110.2/2.220.2/6.3103.5/1.02002010.4/9.1107.6/0.923.9/14.8115.4/2.48088.7/16.593.9/2.525.1/21.3110.5/2.6a:External calibration (EC);b:Isotope dilution (ID);c:Matrix effect (ME);d:Relative standard deviation (RSD).
基质校正标准溶液,用混合同位素内标进样液稀释10倍后再进行测定三以目标化合物峰面积与内标峰面积的比值和浓度进行曲线拟合,3倍信噪比为检出限(LOD)三3种毒素的线性方程及LOD 见表4三选定40μL 霉菌毒素标准储备液添加组,在相同条件下重复进样6次,AFB 1,DON,ZEA 在人工胃和小肠消化液中的RSD 分别为0.11%和0.23%,0.24%和0.24%,0.16%和0.07%,均满足仪器精密度要求三表4 线性方程与检出限Table 4 Calibration curves and LOD of 3mycotoxins
溶液体系Solution system
目标物Analyte 线性范围Concentration range (μg /L)线性方程Calibration equation 相关系数R 2检出限LOD (μg /L)人工胃液消化液Artificial gastric juice
人工小肠液消化液Artificial intestinal juice AFB 1 2.5~100y =0.072x +0.0390.9991 1.0DON 50~1000y =0.003x +0.2530.999650ZEA 40~400
y =0.007x -0.1130.999440AFB 1 2.5~100y =0.067x +0.0850.99890.3
DON 50~1000y =0.007x -0.3680.998350ZEA 20~400y =0.006x -0.0140.9992204 分析化学第43卷
3.5 稳定性
霉菌毒素在体系中的稳定性是吸附率评价的重要影响因素三考察了3种霉菌毒素在人工猪胃和小肠消化液中39℃±0.5℃孵育10h 内的稳定性三按照2.3节处理样品,不添加霉菌毒素吸附剂,振荡孵育时间分别设为1,2,5和10h,以孵育1h 时毒素峰面积和内标峰面积的比值为100%,其它时间点的测定结果介于95.9%~111.3%三结果表明,在试验温度条件下10h 内3种毒素在评价体系中不产
生降解,能够稳定存在三
3.6 实际样品测定以猪胃肠液与饲料比为3计,按照2.3节处理样品,相当于在AFB 1,DON 和ZEA 污染浓度120,1200和480μg /kg 的配合饲料中添加了0.24%的霉菌毒素吸附剂,这与生产实际状况比较接近三采用本方法对市售8种蒙脱石类吸附剂和5种酵母细胞壁类吸附剂进行评价,两类吸附剂产品在人工模拟猪胃消化液中对3种霉菌毒素的吸附率分别为85.1%~96.5%(AFB1),8.1%~1
4.7%(DON),13.7%~30.0%(ZEA)和7.4%~16.6%(AFB1),6.9%~16.2%(DON),18.6%~39.0%(ZEA),在人工模拟猪小肠消化液中对3种霉菌毒素的吸附率分别为76.2%~93.0%(AFB1),12.3%~31.3%(DON),0%~23.2%(ZEA)和8.6%~13.4%(AFB1),3.8%~23.5%(DON),24.9%~34.8%(ZEA)三测定结果符合两类吸附剂对不同毒素的吸附性质,与文献[4~6]报道的结论基本一致,表明本方法能够用于霉菌毒素吸附剂吸附率的测定三
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WANG Rui?Guo,SU Xiao?Ou,FAN Xia,WANG Pei?Long,GAO Zhong?Wu,ZHANG Yu (Institute of quality standards and testing technology for agricultural products,Chinese Academy of Agricultural Science, Key laboratory of agrifood safety and quality,Ministry of AgricuLture,P.R.China,Beijing10081,China) Abstract A rapid liquid chromatography?tandem mass spectrometric(LC?MS/MS)method was developed for the determination of aflatoxin B1(AFB1),Deoxynivalenol(DON),Zearalenone(ZEA)in artificial porcine gastrointestinal digested juices,as pigs reacted most sensitively to these mycotoxins.The formula feed was digested by artificial gastric and intestinal juices respectively,then the mycotoxins and adsorbent were added in ratio.After incubation and centrifugation,the supernatant was diluted10?folds by injection solution and analyzed by LC?MS/MS.The3analytes were separated on a reversed phase C18column using a gradient elution program of aqueous solution containing0.2mmol/L ammonium acetate and0.1%formic acid methanol.Qualitative analysis was performed using multiple?reaction monitoring(MRM),and quantitative analysis was by internal standard method.Under optimum conditions,the limit of quantitation(LOQ)of AFB1,DON,ZEA was1,50,40and0.3,50,20μg/L in artificial gastric and intestinal digested juices respectively,and the relative standard deviations(RSDs)were below5.0%.Then,the thermal stability was studied by incubating the analytes at39℃±0.5℃for1,2,5and10h,and the results showed3analytes were stable under the conditions.Furthermore,the method was applied to evaluate the binding efficacy of8 mineral benders and5organic adsorbents.The adsorbents demonstrated binding efficacy of85.1%-96.5%, 8.1%-14.7%,13.7%-30.0%and7.4%-16.6%,6.7%-16.2%,18.6%-39.0%in gastric digested juice,and76.2%-93.0%,12.3%-31.3%,0%-23.2%and8.6%-13.4%,3.8%-23.5%,24.9%-34.8%in intestinal digested juice for these3mycotoxins,respectively,with2kinds of adsorbents. Keywords Liquid chromatography?tandem mass spectrometry;Artificial porcine gastrointestinal digested juice;Mycotoxin;Adsorbent
(Received7August2014;accepted4October2014)
消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定?液相色谱-串联质谱法 Determination of clobetasol propionate and levofloxacin hydrochloride in disinfection product - LC-MS-MS method 1 范围 本方法规定了膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量的测定。 取样量为0.1g时，本方法对丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限见表1。 表1 丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限、保留时间和特征离子 中文名称英文名称 检出限 （μg/g） 保留时 间（min） 特征离子(m/z) 丙酸氯倍他索Clobetasol propionate 0.009 7.83 467.0/355.2/373.4 盐酸左氧氟沙星Levofloxacin hydrochloride 0.06 1.11 362.0/260.9/318.2 2 规范性引用文件 3 原理 试样中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。 4.1甲醇：农药残留级。 4.2乙腈：农药残留级。 4.3甲酸：分析纯。
4.4标准品：丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星均购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99.8%。 4.5标准溶液：准确称取丙酸氯倍他索适量，用乙腈－水（1：1）配制成100μg/mL 的标准贮备液。准确称取盐酸左氧氟沙星适量，用纯水配制成100μg/mL的标准贮备液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用乙腈稀释配制成浓度为10.0μg/mL 的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4 C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。 4.6甲酸溶液(0.2%，v/v)：量取2mL甲酸，用纯水定容至1000mL。 4.7 0.45μm滤膜。 5 仪器 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ，电喷雾离子化源(ESIMS，NI/PI模式)。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。 5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。 5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡旋振荡器。 5.5 具塞试管：10mL。 6 试样的制备与保存 6.1 试样的制备 取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。 6.2 试样保存 制备好的试样置于室温保存。 7 测定步骤 7.1样品前处理 称取0.1g~0.2g样品(精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.7）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 高效液相色谱质谱联用HPLC .液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索一、实验目的1、了解 LC-MS 的主要构造和基本原理； 2、学习 LC-MS 的基本操作方法； 3、掌握 LC-MS 的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍液相色谱 - 质谱法（ Liquid Chromatography/Mass Spectrometry ， LCMS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC 是液相分离技术，而 MS 是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。 LC-MS 经过了约 30 年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。 现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是 1/ 13
2015 年版药典高效液相色谱法、质谱法
2015 版药典 --- 高效液相色谱法、质谱法 0512 高效液相色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。 注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处 理色谱信号。 1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为 3.9 ～ 4.6mm，填充剂粒径为 3～lOμm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约 2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 （1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物 等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰 基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残 留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当 提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH 值一般应在 2～8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚 合物色谱柱可耐受更广泛 pH值的流动相，适合于 pH 值小于 2 或大于 8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外 - 可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、 蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外- 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与 其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射 检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈 线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外 - 可见分光检测器所用流动相应符合紫外 - 可见分光光度法（通则 0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测 器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇 - 水系统和乙腈 - 水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动 相中有机溶剂一般不低于 5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa; （5）检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口； （6）开启动力电源，电压稳定，正常；
液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03
实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
液相色谱-质谱联用(LC-MS) LCMS分别的含义是：L液相C色谱M质谱S分离（友情赠送：G是气相^_^） LC-MS/MS就是液相色谱质谱/质谱联用 MS/MS是质谱-质谱联用（通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等） LC-MS/MS与LC-MS比较，M（质谱）分离的步骤是串联的，不是单一的。 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为色谱分析法。 色谱法的最早应用是用于分离植物色素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物色素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜色的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜色的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜色的色素，并可分别进行鉴定。色谱法也由此而得名。 现在的色谱法早已不局限于色素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它色谱分析。 一、色谱分离基本原理： 由以上方法可知，在色谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。 色谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。 使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。 由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。 二、色谱分类方法： 色谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 从两相的状态分类：
附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，
用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以
高效液相色谱质谱联用技术的应用 高效液相色谱(HPLC或LC)是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等)，分析范围广，而且不需衍生化步骤。质谱是强有力的结构解析工具，能为结构定性提供较多的信息，是理想的色谱检测器，不仅特异，而且具有极高的检测灵敏度。串联质谱（MS/MS）是将一个质量选择的操作接到另一个质量选择的后面，在单极质谱给出化合物相对分子量的信息后，对准分子离子进行多极裂解，进而获得丰富的化合物碎片信息，确认目标化合物，对目标化合物定量等。［1］ 高效液相色谱一质谱(HPLC—MS)联用技术是近几年来发展起来的一项新的分离分析技术，将HPLC 对复杂样品的高分离能力，与MS具有高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量与结构信息的优点结合起来，在药物分析、环境分析等许多领域得到了广泛的应用。［2］ 本文着重讲述液相色谱质谱联用仪在药物分析、环境分析上的应用。 1液相色谱质谱联用在药学分析上的应用 1.1LC/MS在药物代谢中的应用 Lee等［3］总结了利用LC／MS鉴定药物代谢产物的方法，主要包括以下几个步骤：测定原形药物的质谱；选择准分子离子、加合离子和主要的碎片离子进行多级质谱分析；选择原形药物的主要中性丢失，测定生物样品的中性丢失谱，图谱中的离子即为原形药物和可能的代谢物的分子离子；选择主要的子离子测定生物样品的母离子谱，所得母离子即为各个代谢物；测定生物样品中所有可能代谢物的子离子谱，解谱得到代谢物的结构。 王宁生等［4］以LC／MS联用技术及标准品对照法，分离检测健康志愿者口服复方丹参滴丸后，血清中水溶性成分及代谢产物，从一级质谱的分子离子峰推测，丹参素及原儿茶醛在体内分别与硫酸及葡萄糖醛酸结合，产生丹参素硫酸结合物及原儿茶醛的葡糖醛酸结合物。 Hsiu SL等［5］研究芍药苷在小鼠体内药代动力学，用LC／MS方法检测体内药物浓度，未检测到芍药苷原形药物；但在血浆及各种排泄物中，均可检测其代谢物，经液相色谱一质谱分析，结合核磁共振(NMR)，确定其为芍药苷的脱糖基代谢物，提示芍药苷给药后，在肠道经细菌转化为PG后，被吸收进入血液循环中发挥作用。 Chen SJ等［6］用LC／DAD／MS／MS联用技术，对山豆根碱在小鼠体内的代谢进行了研究，用ESI ／MSn技术检测山豆根碱的代谢物，并鉴定其主要代谢物为N一去甲基山豆根碱。 1.2LC/MS在药学浓度上的应用 M．Brolis等［7］采用I-IPLC—DAD—MS法从贯叶金丝桃Hyoericum performm中分离鉴定出槲皮素、异槲皮素、金丝桃苷等成分。 Gerthard Brillgma等［8］采用HPLC—NMR和HPLC—ESI—MS—MS法对Habropetalum dawei进行分析，分离鉴定出dioneopeltine、N-methyldioncophylline、N-methyl-7-epi-dioncophylline、tetralone、(1R，3R)和(1S，3R)-N-formyl-8-hydroxy-6-methoxy-l,3-dimthyltetra-hydroisoquinoline等7个已知化合物，以及5’-O-methydioncopeltine、isoquinoline phylline 2个新化合物。 徐智秀等［9］以反相高效液相色谱法分离了9种人参皂苷（I）, 利用三级四级杆质谱研究了9种I的一级质谱（主要给出相对分子质量信息）和二级质谱（提供碎片结构信息），通过它们的质谱图差异对其进行了鉴别, 并将方法用于实际样品中的9种I的定性。 郭继芬等［10］选用Discovery C18柱，以甲醇-水-甲酸(40:60:0.025)为流动相，经紫外检测后，在ESI- 扫描方式下，对HPLC—UV图谱中各色谱峰进行一级和二级质谱分析，与对照品比较鉴定了提取物中4个已知的黄酮类化合物，推断出3个未知黄酮苷类化合物可能的结构。 2液相色谱质谱联用在环境分析上的应用 1
液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的各种模式探索 一、实验目的 1、了解LC-MS的主要构造和基本原理； 2、学习LC-MS的基本操作方法； 3、掌握LC-MS的六种操作模式的特点及应用。 二、实验原理 1、液质基本原理及模式介绍 液相色谱-质谱法（Liquid Chromatography/Mass Spectrometry，LC-MS）将应用范围极广的分离方法——液相色谱法与灵敏、专属、能提供分子量和结构信息的质谱法结合起来，必然成为一种重要的现代分离分析技术。 但是，LC是液相分离技术，而MS是在真空条件下工作的方法，因而难以相互匹配。LC-MS经过了约30年的发展，直至采用了大气压离子化技术（Atmospheric pressure ionization，API）之后，才发展成为可常规应用的重要分离分析方法。现在，在生物、医药、化工、农业和环境等各个领域中均得到了广泛的应用，在组合化学、蛋白质组学和代谢组学的研究工作中，LC-MS 已经成为最重要研究方法之一。 质谱仪作为整套仪器中最重要的部分，其常规分析模式有全扫描模式（Scan）、选择离子监测模式（SIM）。 （一）全扫描模式方式（Scan）：最常用的扫描方式之一，扫描的质量范围覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量，得到的是化合物的全谱，可以用来进行谱库检索，一般用于未知化合物的定性分析。实例：（Q1 = 100-259m/z） （二）选择离子监测模式（Selective Ion Monitoring，SIM）：不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。实例：（Q1 = 259m/z） 本实验采用三重四极杆质谱仪（Q1：质量分析器；Q2：碰撞活化室；Q3：
液相色谱串联质谱的 小知识
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。 4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa;
液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定癫痫患者血清中 卡马西平的浓度 谢 华ì，王 荣，贾正平?， 徐丽婷 （兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050） 摘要目的：本文建立了液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定患者血清中的卡马西平浓度的方法。方法：色谱柱：Zorbax Extend-C18柱（150×4.6 mm I.D，5μm）；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸 胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1。结果：卡马西平浓度在2～40 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为101.1%，日内精密度、日间精密度的RSD分别为3.39%和4.11%。并测定了10名患者血清中卡马西平的浓度。结论：本方法具有良好的灵敏度、准确度、精确度及专属性，结果准确，重现性好，易于操作，可用于患者血清中卡马西平浓度的测定。 关键词卡马西平；LC/MS/MS；血清 Content Determination of Carbamazepine in epileptic patient serum by Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry XIE Hua, JIA Zheng-ping*, WANG Rong, XU Li-ting (Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China) ABSTRACT OBJECTIVE:An analytical method based on Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detection was developed for the content determination of carbamazepine in epileptic patient serum. METHODS: The method included that the column was Zorbax Extend-C18(150×4.6 mm I.D.，5μm ); mobile phase was methanol-0.01mmol·L-1amine acetic acid (80:20，v/v) at a flow rate of 0.3 mL·min-1. RESULTS: The method was proved to be linear in the range of 2~40ng·mL-1 with a regression confficient of 0.9976. The average recovery rate was 101.1%(n=5). The RSD of average contents of intra-day and inter-day was 3.39% and 4.11% respectively. The carbamazepine concentrations of ten epileptic patient’s serums were detected. CONCLUSION: This method is accurate, precise, sensitive and specific to be used in the content determination of carbamazepine serum. KEY WORDS Carbamazepine; LC/MS/MS; Serum ?基金项目：国家科技部重大项目（2008ZXJ09014-010） ì主管药师。研究方向：临床治疗药物监测。电话：(0931)8994675; E-mial: xiehua-72@https://www.doczj.com/doc/3815038014.html, ?通讯作者：教授，主任药师，博士。研究方向：临床药学。电话：(0931)8994652。
液相色谱—质谱联用来进行物质分离的实验 一、实验目的 1.了解液相色谱—质谱联用的基本原理； 2.掌握液相色谱—质谱联用时的操作步骤及实验方法； 3.学习分析色谱图和质谱图。 二、实验原理 利用不同的物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，当两相作相对位移时，使这些物质在两相间进行反复多次分配， 使得原来微小的分配差异产生明显的分离效果，从而依先后次 序流出色谱柱，以此来达到分离多种物质的目的。然后依次流 出的物质进入质谱中被打碎成为各种离子而被检测到。以此达 到分离的目的。 三、实验仪器和材料 高效液相色谱仪及质谱仪（见下图）、甲醇、水、TADB（相对分子量516）、TAIW（相对分子量336）、色谱柱
四、实验步骤 1.将待分离的两种物质的混合物配成溶液加入到2号样瓶中去； 2.启动联机软件，在四元泵模块的空白处右键单击，在弹出的 “方法”选项中编辑好流动相和流速，点击确定，以使体系过 渡到目标状态，直到压力稳定为止； 3.进入“方法”菜单，“编辑完整方法菜单”，按照“方法参考”进行编 辑（“方法参考”中的参数编辑完成后继续进行编辑，编辑质 谱的相关参数：选择正负极及电压等），编辑完成后再次进 入“方法菜单”，选择“方法另存为”命名后点击“确定”进入“序列” 菜单，“序列表菜单”，然后编辑样品瓶位置为1号、样品名称、 使用方法、进样次数、数据文件、进样量，确定后再次进入 “序列菜单”的“序列参数”菜单，再选择文件夹，确定； 4.方法编辑完成且压力稳定后，点击进样器左上方的“序列/开 始序列”按钮，进行测试，等待测试完毕，点击停止按钮。 然后进入“脱机”软件，查看积分测试报告。 五、实验结果及分析 实验时的液相色谱条件统一为：70%的甲醇，流速0.4ml/min，进样量1ul，波长230nm，测试时间15min。在正极性条件下：
固相萃取-高效液相色谱串联质谱法 测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究 李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076） 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。 关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China） Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate. *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/3815038014.html,。 作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。 基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。
浅谈液相色谱质谱联用技术 刘谦 保定出入境检验检疫局，保定 071000 摘要：液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在药物分析，食品检测等领域有广泛的应用。 关键词：液相色谱质谱食品检测 高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。 在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。 我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 下面说一说ESI和API源的异同点。 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性
第39卷2011年4月 分析化学(FEN XI H U A XU E) 研究报告Chinese Journal o f Analytical Chemistr y 第4期534~539 DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00534 高效液相色谱 串联质谱法分析大肠杆菌代谢组中样品提取方法的比较 梅辉 1,2 戴军 *1 刘文卫3 凌霞3 朱鹏飞3 赵志军 1 1 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122) 2 (江南大学食品学院,无锡214122) 3 (无锡市疾病预防控制中心,无锡214002) 摘 要 比较了基于液相色谱和串联质谱联用技术(L C M S/M S)的E.co li 代谢组分析的5种不同样品提取方法。在对样品进行淬灭和洗涤后,分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法对样品平行提取3次,每个样品重复进样3次。结果显示,冷甲醇法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD <5%)。从相对提取率、重复性等方面综合考察5种提取方法,从优到劣依次为:冷甲醇法>甲醇/氯仿法>高氯酸法>热乙醇法>热甲醇法。此外,以冷甲醇法的提取溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明,本方法的代谢物检测线性较好,线性范围较宽,提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。本方法的检出限为0.05~0.36m mol/L 。 关键词 代谢组分析;液 质联用;提取方法;大肠杆菌 2010 07 20收稿;2010 10 29接受 本文系江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题基金(No.SKLF T S 200803)资助项目*E mail:d j998lc@https://www.doczj.com/doc/3815038014.html, 1 引 言 饲料工业的发展及在医药工业上应用的不断扩大使色氨酸的需求量越来越大,目前我国色氨酸主要依赖进口。采用微生物直接发酵法生产色氨酸,其合成代谢途径较长,代谢流弱,调控机制复杂,很难实现工业化。代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程等方面,但有关色氨酸生产的代谢组学及其分析策略的研究尚未见报道。 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析[1]。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤,一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤[2]。本实验所研究的E scherichia coli (E.coli )全部代谢物仅占细胞干重的3%~5%,但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系[3]。应用现代分析技术对大部分中心代谢途径的磷酸化代谢产物以及三羧酸循环中间代谢物的提取方法已有报道[4~6],多采用气 质联用(GC MS)[7]检测目标代谢物。但气 质联用法往往需要衍生化,且高温条件下易导致热敏性化合物的变性分解。本研究对生产色氨酸的E.coli 发酵液进行淬灭、洗涤处理后,分别运用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取胞内代谢物,在LC M S/M S 的多反应检测模式(M RM )对目标代谢物进行检测,由于胞内代谢物数量巨大,而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用。因此分别选择以上3类物质中有代表性的8种代谢物(共计24种)作为考察对象,比较5种提取方法的提取率及重复性。结果表明,冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(Agilent 公司);3200Q TRA P 质谱仪(Applied Biosystems 公司),配有电喷雾离子源;3L 发酵罐(NBS);高速冷冻离心机(T erm o 公司),超低温冰箱(NBS 公司);真空冷冻干燥机(Labconco 公司);JY 2006电子分析天平(Mettler T pledo 公司);YDS 6液氮罐(乐山东亚公司)。 苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、草酰乙酸、2 酮戊二酸、邻氨基苯甲酸的标准品均购自BBI 公司,其它