2.6.12非无菌产品的微生物限度检查（总的需氧菌菌落计数）
本章包括两种检验方法。第一种方法给出的是测定适用性的参考方法。因些在一个专论中依照本法就意味着依从第一种方法，除非特别指出要使用第二种方法。第二种方法也是欧洲药典的官方组成部分，并且值得注意的是第二种方法特别适用于销售认可。一旦该相关专论被修订就意味着将用第二种方法替代第一种方法。第二种方法包含日本药典和美国药典的共同部分使其能够协调。A．欧洲药典方法
该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是以审疑的态度为了测定一种物质按照欧洲药典的检测方法是否符合微生物的特定限定要求。如果是以这种目的来测定的话，根据下述方法，包括所需的样品数和按照下面方法来解释结果。该法也用来测定药典所描述的抗菌保留的有效性（5.1.3）。此外，该法也可以用来监测原料质量同时也可以用来作为微生物质量检测的指导方针（5.1.4）。如果是用来指导以下目的，如生产厂家的原料检测和/或终产品的检测或终点判定，则包括所需样品数和结果解释的试验方法就必须在生产厂家和主管当局之间达成一致。执行该方法所设计的实验条件就必须避免所测产品受到意外污染。避免污染所采取的措施不侧够影响任何所测的微生物。如果所测产品有抗菌活性，则该产品活性必须补充分中和掉。如果因为该种目的使用灭活剂则必须证明该灭活剂对微生物的有效性和无毒性。
测定总的需氧微生物数通过微孔滤膜法或专论中所描述的平板菌落计数法。
当没有其它方法可以釆用来测定细菌数时保留最大可能数（Most Probable Number, MPN）.选择哪种应该根据产品的特性和可预计的微生物数等因素来选择。任何选择的方法必须通过合理的验证。
当根据5.1.3或5.1.4使用时，可以使用平板浇注法和表面扩散法，和微孔滤膜法。
样品制备：
抽样检验方法：所选样品必须遵循抽样样品规则。抽样检验的结果依赖于下列因素：如样品批号，不可接受的高污染产品的健康危害，产品特性，可预料的污染程度等。除了特别说明外，取10g或10ml物质或制剂检测，釆取上面提到的预防措施。从大批样品中随机选择样品或从制剂容器中随机抽取。如有必要，为了获得所需的样品，将容器中大量的内容物混匀以保证每一份样品都能包含在内，是否要这样做依赖于所检测物质或制剂的性质。现举例说明适用于产品的抽样检验方法，而在该法中关于微生物分布状态的同质性方面可能存在问题，该例包括三类抽样检验方法。在该例中有从每批中分别抽取五份样品。以下是三种方法：（i）可接受的样本：例如：样品包括不少于m CFU(菌落数)/g or ml, m 代表在相关专论中特定指出的限度。
（ii）边缘样本：例如：大于m CFU 而小于10m CFU/g or ml.
（iii）有缺陷的样本：例如：包含大于10m CFU/g or ml.
水溶性产品：溶解或稀释10g 或10ml待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液。但是，根据产品特性或所需的敏感性可以考虑其它比例的溶液。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH 到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
不溶于水的非脂溶性产品：将10g 或10ml待测产品悬浮于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或另一种合适的液体中。一般来说要准备好1/10的稀释液，但根据一些产品特性或所需的敏感性需要更大体积的液体。可以添加合适的表面活性剂如1g 聚山梨醇酯80来帮助不易润湿的底物悬浮液稳定。如果产品有抗菌活性，必须添加灭活剂到稀释液中。如有必要，调节pH到大约7，并准备一系列10倍的稀释液用于样品稀释。
脂溶性产品：取10g 或10ml待测产品与不多于一半质量的灭菌聚山梨醇酯80或另一种灭菌表面活性剂混匀，如有必要可加热，但不超过40℃，如有例外情况下也不应高于45℃。仔细混匀，如有必要可以维持温度在水浴中或恒温器中。加充足的预热过的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液制成一倍或10倍原产品的稀释液。仔细混匀同时维持温度使其能在最短时间内形成乳液状，但无论如何不要超过30分钟。此外必须准备一系列10倍氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液包含有合适浓度的灭菌聚山梨醇酯80或其它灭菌表面活性剂。
贴剂：用无菌镊子除去10批贴剂的表面保护膜（“线性释放”），将它们平放，粘性表面向上放于无菌玻璃或塑料皿中。如有必要，粘性表面用无菌纱布（或纤维聚合物过滤膜）覆盖，然后转移这10批到最少500ML的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液中，该溶液添加有适当的灭活性如聚山梨醇酯80和/或卵磷酯。剧烈振荡至少30分钟（得制备液A）。用同样的方法准备另10批样品，将它们放在最少500ML肉汤稀释液D中，剧烈振荡至少30分钟（得制备液B）。
样品检测
滤膜法：所用滤膜膜孔直径不大于0.45微米，并且滤膜高效截留细菌的能力已知。选择该种滤膜是因为用这种方法使细菌仍然侧够保持高效性同时不影响所测样品的成分。例如硝酸纤维素滤膜可以使用于水溶液，油溶液和弱醇溶液。醋酸纤维素滤膜可以用于弱醇溶液。设计过滤器的目的就是转移培养基中的过滤物。按照样品制备方法立即转移适量的制备样品（最好取有代表性的1g样品，如果所预期的菌落数多可以少点）分别到两层滤膜和滤器上。每个过滤器洗三次，每次用大约100ml合适的液体如氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液。在该溶液中可以加入适当的表面活性剂如聚山梨醇80或抗菌试剂的灭活性。如果用于验证，则不少于三次洗涤。如果主要是为了测定列举的细菌，则转移一个滤膜到合适的琼脂糖表面如介质B或其它介质上，如果主要是为了测定列举的真菌类，则转移滤膜到适当的琼脂糖表面如介质C。培养琼脂糖介质B的平板在30-35℃，介质C 的平板在20-25℃，培养5天，除非在短期内可得到可靠的菌落数。平板计数法要选择最多菌落数不多于100个菌落的平板，计算每克或每ml产品中的菌落数。当检测贴剂时，通过两层的无菌滤膜分别过滤50ml的制备液A。将一个滤膜放置到琼脂糖B介质中用来计算总的需氧微生物菌落数，另一个滤膜到琼脂糖C 用来计算真菌的菌落数。
平板菌落计数法
a.平板灌注法利用直径9cm的有盖培养皿，向每个培养皿中加1ml上述按样品
制备方法制备的样品，然后再加15-20ml适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），在不高于45℃的条件下培养。如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。除非在短期内可以得到较好的菌落，一般情况下将平板在30-35℃下培养5天（真菌在20-25℃下培养5天）。对每一种稀释液选择一种相应的平板，最
多菌落数不少于300（对于真菌不少于100）。计算菌落平均值和计算每克或每ML中菌落形成数。
b.表面延伸法利用直径9cm的有盖培养皿，在每个平皿中，45℃下，加15-20ml
适合培养细菌的液态的琼脂糖培养基（如介质B），或15-20ml适合培养真菌的液态的琼脂糖培养基（如介质C），然后使其固化。如果使用更大的有盖培养皿，琼脂糖的量要相应增加。干燥平板，例如在层流柜中或恒温培养箱中。涂定量但不超过0.1ML的按照上述制备方法制取的样品于上述平板的表面上。对每一种介质，每种浓度的稀释液要准备至少2个有盖培养皿。同平板灌注法一样培养和计算菌落数。
最大可能数（MPN）计算法
表2.6.12.1－细菌的最大可能数
菌通常会得到不可信的结果。因为上述原因，MPN法通常只有在没有其它合适的
方法可用时才用来测定细菌。如果该法可行，则方法如下：
按照样品制备法准备至少3个梯度的10倍稀释液。对每一个稀释液，在3个试管中分别接种1G/ML的样品液在9-10 ML合适的液体介质中（如肉汤介质A）。如有必要，表面活性剂如聚山梨醇酯80或抗生素试剂灭活剂可以加到该介质中。因此如果准备了3个梯度的稀释液则需要接种9个试管。所有试管在30-35℃下培养5天。记录每种稀释液的试官微生物的生长情况。如果根据所测产品特性结果不好读或不确定，可以在同样的肉汤中再次培养，或在合适的琼脂糖介质中培养（如琼脂糖介质B），在同样的温度下培养18-24h,然后使用该结果。从表2.6.12-1表格中确定每克或每ML产品中细菌的最大可能数。
高效的培养介质和有效的计数方法
将合适的细菌试验株分别在含有合适的液态介质（如肉汤介质A）的容器中在30-35℃下培养18-24h。真菌试验株在合适的琼脂粮介质（如无抗生素的介质C）中在20-25℃下培养48小时如白色念珠菌，对曲霉菌在20-25℃下培养7天。金黄色葡萄球菌例如ATCC6538（NCIMB9518,CIP4.83）
大肠杆菌例如ATCC8739（NCIM8545,CIP53.126）
枯草芽孢杆菌例如ATCC6633（NCIM8054,CIP52.62）
白色念珠菌例如ATCC10231（NCPF3179，IP48.72）
黑曲霉菌例如ATCC10231（IMI149007，IP1431.83）
用每ML氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液中大约含有100个形成菌落的悬浮液作为对照品。用分别含有各种微生物的悬浮液作为计数法的控制，悬浮液分别加有被测产品和不加被测产品。当用微孔滤膜法或平板计数法时，对于任何测定的微生物接种所得计算值不相差5倍。对于从MPN法接种所得的计算值要在95％可信限度内。为了检验介质和稀释液的无菌状态，用无菌的氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液作为测试液。在其上必须没有微生物生长。
结果解释
细菌数与琼脂糖介质B中的菌落平均数相等。真菌数与琼脂糖介质C中的菌落平均数相等。总的需氧菌数是上述两种菌之和。如果有证据表明同种类型的微生物在这两种介质中生长则结果就是正确的。MPN法所计算的值是细菌数。
专论中所规定的限度解释如下：
102微生物：最大可接受限度：5*102
103微生物：最大可接受限度：5*103
等。
如果使用抽样方式，如三步抽样法过程如下：
对每五个样品分别计算总的需氧菌数。如果按照下面条件操作，则物或制备液通过了测试：
(i)没有单个的总需氧菌数超过了所预计限度的10倍或更多（如没有不可接
受的样品）
(ii)不超过2个的总需氧数在预计限度和10倍限度之内（如没有两个边缘样品）
所推荐使用的溶液和培养介质将2.6.13中讲到。
B．协调法：非无菌产品的微生物限度试验：微生物列举试验
1.简介：
该试验方法所讲的是在需氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌类微生物的定量检测。
设计该试验的最初目的是为了确定一种物质或制备液是否符合微生物质量已制定的规定。如果是这种目的，则需要遵从下面的说明，包括所需样品数，从而根据下面所提到的方法来解释结果。
该法不适用于包含微生物作为活性成分的产品。
可以使用自动收集法作为替代法，与药典所用方法具有同样效力。
2.一般操作过程
设计方法时所用条件要避免外在微生物对产品的污染。必须釆取措施避免污染以便它们不影响任何所测微生物。
如果所测产品有抗菌活性，必须将这种活性去除或中和掉。如果因此使用了灭活剂，必须证明它们对微生物的高效性和无毒性。
如果在样品制备中加了表面活性剂，必须证明它们对微生物的无毒性和与灭活剂的兼容性。
3.举例方法
按规定用微孔滤膜法或平板菌落计数法。MPN法对微生物测定来说是最不精确的方法，但是，如果某些产品所含极少的微生物量，该法是最合适的方法。
方法选择基于下列因素：如产品的特性和所要求的微生物量。所选方法必须能够测定充足的样品从而来判断该法的适应性。所选方法的合适性必须确定。
4.促生长实验和计数法
4-1 总则
在不加产品的条件下该试验能够检测微生物的能力必须已确定。
如果测试条件改变或产品改变，必须证实方法的适应性，因为这些改变可能影响试验的最终结果。
4-2 试验菌株的准备
使用测试菌株标准稳定的悬浮液或按下面方法制备。
批种子培养技术（seed lot culture maintenance techniques, seed-lot systems）的使用以至于用于接种的微生物从最初的主批种子转移走不多于5通道。细菌和真菌试验株的生产分别见表格2.6.12-2。
使用氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液或pH 7.2的磷酸缓冲液制作试验用悬浮液。对于曲霉菌需要加入0.05％聚山梨醇酯80到缓冲液中。如果在2-8℃下保存则该悬浮液要在2-24小时内使用。作为一种可替代的制备方法，稀释含有曲霉菌或枯草芽孢杆菌的新鲜悬浮液，该悬浮液中加有植物细胞，从而可以制得一种稳定的孢子悬浮液，对于接种试验来说需要将该孢子悬浮液调整到一个合适的体积下。该孢子悬浮液可以在2-8℃保存到适合验证的时间。
4-3 阴性对照
为了验证试验条件必须使用可选用的稀释液作为阴性对照来替代测试液。在该阴性对照品中必须没有微生物生长。
4-4 生长促进介质
测试每一批准备好的介质和每一批介质，要么准备脱水介质要么准备含有所描述的成分。
用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到含有大豆豆蛋白胨消化肉汤的液体/平板和大豆豆蛋白胨消化琼脂上，对每一种使用各自的含有介质的液体/平板。用表2.6.12-2中所描述的少量微生物（不多于100CFU）接种到萨布罗－葡萄糖琼脂糖平板，对每一种使用各自含用介质的平板。接种条件见表2.6.12-2。
对固体介质而言，对标准接种物来讲，所得的生长值不超过计算值的两倍。与用先前的测试方法和验证的批介质所得的测试结果相比，新制备的接种物将会出现微生物的生长值。与用先前的测试方法和验证的批介质所得的测试结果相比，如果清淅可见的微生物生长可见，则液体介质是合适的。
4-5对于所测产品合适的计数方法
4-5-1 样品制备样品制备方法选择依赖于所测产品的物理特性。如果下面所描述的方法均不合适的话，可选用替代方法。
水溶性产品溶解或稀释（通常1-10倍的稀释液需要准备）待测产品于氯化钠蛋白胨（pH 7.0）缓冲液, pH7.2的磷酸缓冲液或干酪豆素消化液肉汤。如有必要，调节pH 6-8。如果必要，可以准备更多倍的同样稀释剂的稀释液。
不溶于水的非脂类产品。让受检产品（通常以1：10稀释制备）悬浮在pH7.0 的缓冲氯化钠蛋白胨溶液，pH7.2 的磷酸缓冲液或酪蛋白大豆消化肉汤中。加入例如1g/l的聚山梨醇酯80的表面活性因子来辅助几乎不可湿的物质的悬浮。如果需要的话，把pH调节为6-8。如果需要的话，用同样的稀释液进一步稀释。
脂类产品。把受检产品溶解在豆蔻酸异丙脂中，通过过滤灭菌或把产品与最小需要量的无菌聚山梨醇酯80或其他的非抑制表面活性剂混合，如果需要的话加热到不超过40℃，或者在特殊情况下不超过45℃。仔细混合且如果必要的话在水浴里保温。假如足够量的预热的所选稀释液来制备原产品的1：10的稀释溶液。仔细混合同时在所需的最短时间内保温来形成乳化液。可以使用含有合适浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它的非抑制物均表面活性剂来制备进一步的一系列的十倍的稀释液。
气溶的液体或固体。把产品无菌转移到一个膜过滤装置或者一个物均区容器中来进一步取样。使用总含量或每个检查容器中的计量的确定的量。
透皮贴剂。去掉透皮贴剂的保护覆盖垫(‘隔离衬垫‘)并把它们向上贴在无菌玻璃或塑料盘上。
用无菌多孔物质例如无菌纱布来覆盖粘贴面，来避免贴剂粘在一起并把贴剂转移到含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂的灭活剂的所选的适当体积的稀释液中。至少用力摇晃制备溶液30分钟。
4-5-2 接种和稀释。假如如上述制备的样品（4-5-1）到一个控制的（不包括被检物质）足够量的微生物混悬溶液中来获得一个不超过100CFU的接种体。接种体的混悬液的体积不能超过稀释产品的体积的1%。
为说明产品的可接受微生物回收率，实验中应该使用制备样品的最低可能稀释因子。如果因为抗微生物活性或者很差的溶解性而不可能，需要进一步探索合适的方案。如果样品的生长的抑制时不可避免的，在中和，稀释或过滤后应假如微生物混悬液的代表性试样。
4-5-3 中和/抗微生物活性的去除。
把如4-5-2所述的稀释制备的样品按照4-5-4中描述的规程进行接种回收的微生物的数量和与对照制备中回收的微生物的数量作比较。
如果生长被抑制（抑制因子大于2），修改列举的检查的过程来保证结果的有效性。过程的修改可能包裹，例如，（1）稀释液体积或培养基的增加，（2）特殊的或一般的中和因子与稀释液的结合，（3）膜过滤，或（4）上述措施的组合。
中和因子。中和因子可能被用来中和抗菌因子的活性（表2.6.12.-3）。它们可能在灭菌前被加入到所选稀释液或更好的培养基中。如果使用的话，它们的功效和对微生物无毒性必须通过使用中和因子不使用产品的空白实验进行说明。
性。这一信息说明产品不可能被上述微生物微生物污染。然而，产品可能只存在于在此提到的微生物中，但不存在于其他在此提到的微生物中。然后，以与微生物生长和标准所允许的最高浓度系数进行试验。
4-5-4. 在产品存在的情况下微生物的回收。
对以上列出的微生物进行分离试验。仅计算加入测试菌的微生物。
4-5-4-1. 膜过滤。使用孔径不大于0.45μm的滤膜过滤。选择滤膜材料类型时，要求滤膜对微生物的滞留能力不受到所观察样品成份的影响。每种上述微生物使用一张滤膜。
将适量按4-5-1至4-5-3制备的样品（含1g产品，若预期CFU较大，则小于1g）用膜过滤，立即过滤并用适量稀释液冲洗滤膜。
将膜转移到豆酪素消化琼脂表面上，以确定厌氧菌总数(TAMC)。将滤膜转移到沙氏葡糖琼脂上，以确定总酵母菌/霉菌（TYMC）按表2.6.12-2接种，进行计数。
4-5-4-2. 平皿计数法。至少在对各培养基复制菌使用平皿计数法，对结果取平均值。
4-5-4-2-1. 浇碟法
在直径9cm的Petri碟中加入1ml按4-5-1至4-5-3法制备的样品以及15-20ml豆酪素消化琼脂或沙氏葡糖琼脂。培养基温度均不超过45℃。若使用更大的Petri碟，则琼脂的量也要相应增加。对于每个表2.6.12.-2中列出的微生物，至少要使用2个Petri培养基。根据表2.6.12.-2进行接种。取各培养基的菌落数的数学平均值计算在原接种CFU的量。
4-5-4-2-2. 表面涂布法
在各直径9cm的Petri碟中加入15-20ml豆酪素消化琼脂或沙氏葡糖琼脂，放置使其凝固。培养基温度均不超过45℃。若使用更大的Petri碟，则琼脂的量也要相应增加。在层流通风柜或培养箱中干燥。对于每个表2.6.12.-2中列出的微生物，至少要使用2个Petri培养基。量取不少于0.1ml按4-5-1至4-5-3制备的样品涂布于培养基表面。培养并按4-5-4-2-1描述的方法计数。
4-5-4-3．最大概率数法（MPN）
MPN法的精确性不及膜过滤法和平皿计数法。在对霉菌计数时结果尤为不可
靠。因此，在无法使用其他方法时，才可以考虑使用MPN法对TAMC计数。如果认定可以使用该法，则按以下方法进行。
按4-5-1至4-5-3制备一系列浓度的产品，至少3个10倍稀释液。对于每个浓度梯度的溶液，将3等分试样接种于含9-10ml豆酪素消化培养基的试管内。若有必要，应向培养基中加入表面活性试剂，例如吐温-80，或微生物抑制剂。这样，若使用3个梯度的稀释度，则共接种9个试管。
在30-35℃培养不超过3天。若因产品本身的性质难以读出结果或不能确定，则在同一培养基或豆酪素消化琼脂上在同一温度下传代培养1-2天，取得到的结果。根据表2.6.12.-4确定每克或每毫升产品的微生物最大概率数。
4-6. 结果和解释
在确定膜过滤法和平皿计数法的适用性时，需要得到与4-5-2中无产品存在的对照值相差系数不大于2的任意试验菌平均数。在确定MPN法适用性时，接种值的计算值与对照值必须在95％置信区间内。
若不符合上述标准或试验菌大于以上方法所述，则使用最接近标准的方法和试验条件。
5. 产品试验
5-1.试验使用量
除另有规定外，参照上述方法取10g或10ml待测品。液体或固体的气溶胶，取10个容器的样品。若为透皮贴片，取10片。
在活性物质按以下方式制备的情况下，试验用量可以减少：单位剂量（如片剂，胶囊和注射剂）少于或等于1mg，或每克或每毫升（对于不以单位剂量为形式的制剂）中活性物质少于1mg的。在这些情况下，试验用量不少于10个单位剂量或10g或10ml产品中的物质含量。
对于作为活性物质的原料，若样品的量受限制，或批量很小（如：少于1000ml 或1000g），则实验两应为批量的1％，除非另有规定允许使用更小的量。
对于批量总数小于200（如临床试验使用的样品），则样品可减少为2个单位，若批量小于100，可为1个单位。
从原料药或制剂、容器中随机取样。混合一定量容器中的产品，以便得到足够量的样品。
5-2. 产品试验
5-2-1. 膜过滤
使用规定的过滤装置使滤渣转移到培养基上。根据第4节的所述，使用适用的方法制备样品，并将适量样品各转移到2张膜上，并立即过滤。选取以下合适的方法冲洗各膜。
将膜转移到豆酪素消化琼脂表面上，以确定厌氧菌总数(TAMC)。将滤膜转移到沙氏葡糖琼脂上，以确定总酵母菌/霉菌（TYMC）。接种于豆酪素消化琼脂上，在30-35℃下培养3-5天，接种于沙氏葡糖琼脂上，在20-25℃下培养5-7天。计算每克或每毫升产品的CFU。
对于透皮贴片，根据4-5-1所述，各通过2张无菌膜分别过滤制剂体积的10％。将一张膜转移至豆酪素消化琼脂上确定TAMC，另一张转移到沙氏葡糖琼脂上确定TYMC。
5-2-2.平皿计数法
5-2-2-1. 浇碟法
根据第4部分所述制备样品。每一培养基的每一稀释度至少制备2个Petri碟。接种于豆酪素消化琼脂上的，在30-35℃下培养3-5天；接种于沙氏葡糖琼脂上的，在20-25℃下培养5-7天。根据上述稀释度选取相应培养皿， TAMC的最大菌落数不少于250个，TYMC最大菌落数不少于50个。取各培养基的菌落数的数学平均值，计算每克或每毫升产品的CFU。
5-2-2-2.表面扩散法
准备样品所用方法如第4部分所述选择合适的方法。每一种介质和每一种浓度和稀释液至少准备2个有盖培养皿。对培养和计算的CFU数与灌注平板法一致。5-2-3最大可能数法（MPN法）
准备和稀释样品所用方法如第4部分所述选择合适的方法。所有试管在30-35℃培养3-5天。如有必要，可以再次培养，选择合适的方法。对每种浓度的稀释液所在试管数的记录表明了微生物生长。从表2.6.12-4中计算每g或每ML样品中的微生物的MPN值。
5-3结果解释
在总的需氧微生物数（TMAC）与用大豆豆蛋白胨消化琼脂所测的CFU值一致。如果测真菌所用的是这种介质则它们只是TMAC的一部分。总的酵母菌/霉菌数（TYMC）与萨布罗－葡萄糖琼脂所得的CFU值一致。如果测真菌所用的是这种介质则它们只是TYMC的一部分。如果所预期的TYMC值根据细菌增长速度超出了可接受限度，可以使用含有抗生素的萨布罗－葡萄糖琼脂。如果用MPN法所计算的结果则所得的菌落数是TAMC。
按规定可接受的微生物质量限度如下：
101CFU：最大可接受值＝20
102CFU：最大可接受值＝200
103CFU：最大可接受值＝2000，等。
推荐使用的溶液和介质见2.6.13中所讲（B部分，协调法）
文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告
目录1 样品相关信息 1.1 基本信息 2 主要仪器设备和试验耗材信息 2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种 3 试验环境 3.1 无菌室 3.2 洁净工作台 3.3 生物安全柜 4 试验方案 4.1 验证试验目的 4.2 微生物限度检查方法草案 5 方法验证试验 5.1 菌液制备 5.2 计数培养基适用性检查 5.3 控制菌检查用培养基使用性检查 5.4 供试液制备 5.5 方法验证 5.5.1 菌落计数方法验证试验 5.5.2 控制菌检查方法的验证 5.6 方法验证结论 6 供试品微生物限度检查结果
1 样品相关信息 1.1 基本信息（三批） 2 主要仪器设备和试验耗材信息2.1 主要使用的仪器设备 2.2 试验用培养基 2.2.1 对照培养基
2.2.2 试验用培养基 2.3 试验用试剂 2.4 试验用菌种
3 试验环境 《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域进行。 本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。 3.1 无菌室 无菌室按《医药工业洁净厂房设计规》GB 50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。 3.2 超净工作台 超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 超净工作台沉降菌检测记录 2015.11.15 3.3生物安全柜 生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。 生物安全柜沉降菌监测记录 2015.11.15 4 试验方案 按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
无菌检验室微生物限度检验室 阳性对照检验室黑曲霉对照检验室 验证方案 上善医疗器械 2011年月 目录 １.验证的目的 ２.验证小组成员 ３.验证小组分工 ４.验证依据 ５.标准容 ６.检验室的自净器和超净台安装确认 7.自净器和超净台的运行确认 8.洁净度的测定 9.验证结果及评价： 10.责任 1．验证的目的 1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。 1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。 1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。
3验证小组分工： 3.1组长：负责审核验证方案是否可行。 3.2副组长：负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准。 3.3组员：负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程；提供监测结果。 3.4组员：负责无菌室正常管理。 4.验证依据： GB—T16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法 YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规 6．检验室的自净器和超净台安装确认 6.1部件安装确认
6.2高效过滤器的检漏测试 采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及边框来回扫描。 检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。 7．自净器和超净台的运行确认 7.1风速测定 采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。 超净台测定8个点，求平均风速。 7.2压差测定 采用微压表测定 7.3温度、相对湿度测定 采用温湿度记录仪测定 7.4结果记录如下：
表：微生物限度检查记录（通用） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）
微生物限度检查记录 （30～35℃，3～5天） 20℃～25℃，5～7天） 沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：） 三、控制菌检查（30-35℃）
表： 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）
表： （含药材原粉的片剂） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、麦康凯液体培养基（配制批号： ）麦康凯琼脂培养基（配制批号： ） （30℃～35℃） 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号： ），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号： ）、三糖铁琼脂（配制批号： ） 五、耐胆盐革兰阴性菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号： ）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号： ），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号： ）
表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液） 三、大肠埃希菌检查 胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
微生物限度检查室沉降菌检查标准操作程序 一、目的：为规定微生物限度检查室沉降菌测试方法和要求，特制定本操作规程。 二、适用范围：适用于公司微生物限度检查室沉降菌测试。 三、责任者：质量监督员、质量检验人员。 四、正文： 2 仪器和设备： a、高压消毒锅 b、恒温培养箱 c、培养皿（φ90mm×15mm） d、培养基（营养琼脂培养基） 3 测试方法： 3.1 将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露 0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。 3.2 全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中 30~35℃培养 48h。 3.3 每批培养基可选定 3 只培养皿作对照试验，检验培养基本身是否污 染。 3.4 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用 5~10 放大镜 检查，有否遗漏，若培养皿上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠，可分 辨时，仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。 3.5 注意事项： 3.5.1 测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。 3.5.2 采取一切措施防止人为对样品的污染。 3.5.3 对培养基培养条件及其他参数作详细的记录。 3.5.4 采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的 应剔除。 4测试规则： 4.1 测试状态： 4.1.1 沉降菌测试前，微生物限度检查室的温湿度须达到规定的要求；换
气次数，空气流速必须控制在规定值内。 4.1.2 测试前，微生物限度检查室应已经消毒过。 4.1.3 测试状态为静态测试，并在报告中注明测试状态。 4.2 测试人员： 4.2.1 测试人员必须穿戴符合洁净室级别的工作服。 4.2.2 静态测试时，室内测试人员不得多于二人。 4.3 测试时间：对单向流，如 100 级净化工作台，测试应在净化空调系 统正常运行不少于10min 后开始。 采样点布置见“质检微生物限度检查室悬浮粒子测试操作规程”。 4.4.1 采样点的布置： 采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。 4.4.1.1 工作区采样点的位置离地 0.8m~1.5m 左右（略高于工作面）。 4.4.1.2 可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。 4.5 记录： 测试报告中应记录房间温度、相对湿度及测试状态。 4.6 结果计算： 4.6.1 用计算方法得出各个培养皿的菌落数。 4.6.2 平均菌落数的计算 平均菌落数M= M1+M2+ +Mn N 式中：M：平均菌落数； M1：1 号培养皿菌落数； M2：2 号培养皿菌落数； Mn：n 号培养皿菌落数； N：培养皿总数 5 结果评定： 用平均菌落数判断微生物限度检查空气中的微生物。 5.1 微生物限度检查室内的菌落数必须低于所选定的评定标准。 5.2 若某区域的平均菌落数超过评定标准，则必须对此区域进行消毒，然后采样两次，测试结果均须合格。
控制菌检查培养基适用性检查记录 一、菌液制备（需要的菌种在□内划“√”）： □（1）大肠埃希菌新鲜肉汤培养物1ml ，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（2）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（3）乙型副伤寒沙门菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（4）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； □（5）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐流体培养物1ml，9ml0.9%无菌NaCl溶液，10倍递增稀释； 二、每ml菌液含菌量的计数测定。 测定方法：取稀释后的菌液1ml（剩余的菌液冷藏保存）,置直径90mm的无菌平皿中，注入15-20ml已经过适用性检查确正的温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基（细菌类别计数选用该培养基）或玫瑰红钠琼脂培养基（霉菌、酵母菌类别计数选用该培养基），混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。细菌类别培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌类别培养温度为23℃～28℃。细菌类别培养3天，霉菌、酵母菌类别培养5天。 三、检查结果：需做的检查在□内划“√”。 □ 1. 增菌培养基促生长能力检查
分别接种不大于100cfu的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌。 检验标准：与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。 结论： □ 2. 固体培养基促生长能力检查 检验标准：被检培养基的菌落数与对照培养基菌落数相比大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 结论： □ 3. 培养基抑制能力检查 分别接种试验菌于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，试验菌。 检验标准：试验菌应不得生长。 结论： □ 4. 培养基指示能力检查 分别接种少量试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度和时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等。 检验标准：被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。 结论： 结论： 检验人：复核人：
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
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1. 明确无菌检查室、微生物限度检查室的要求和规定，确保检验结果的准确性。 2.范围： 适用于本厂质监科无菌检查室、微生物限度检查室的操作。 3.责任： 质监科化验室有关人员。 4.内容：
4.1本厂无菌检查室为1万级、局部（净化操作台）100级的洁净室；微生物限度检查室为1 万级的洁净室。 4.2室内严禁放置杂物，无关人员严禁入内。 4.3室内应保持整洁，定期用甲醛熏蒸消毒（每月一次）；使用前用0.1%新洁尔灭溶液擦拭消 毒净化工作台。 4.4在操作前，对菌检室、缓冲间及净化工作台进行紫外线消毒30分钟，并打 开净化工作台的层流净化装置。操作完毕及时清理，擦净台面,再开紫外灯 照射30分钟。 4.5化验员进入无菌室，必须按规定程序进行更衣、戴帽、换鞋等；操作前用0.1%新洁尔灭或 75%酒精进行手消毒。 4.6吸取菌液时，切勿直接用口接触吸管。吸完菌液的吸管放入5%石炭酸消毒液中。 4.7接种针在每次使用前后，必须通过火焰烧红灭菌，冷却后方可接种培养物。 4.8所有带菌的实验用品，须经有效的消毒灭菌方法处理后，再洗刷，严禁污染下水道。 第2页/共2页 4.9如有菌液污染桌面或地面，应立即用消毒水彻底消毒后，再作处理。
4.10无菌室每月检查杂菌数（在室内打开营养琼脂培养皿30分钟，经37℃培养48小时），10000 级平均菌数不得过3个/皿，100级平均菌落数不得过 1个/皿，如超过应进行清洁消毒。 4.11无菌检查室和微生物限度检查室的清洁卫生均按“1万级洁净区的清洁卫生操作规程”进 行。 欢迎下载阅读！
无菌检查和微生物限度检查操作规范 （中国药品生物制品检定所） 一、无菌室的要求： 无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。 无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。 无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。 无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。 用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。 二、培养基的准备 1、培养基的制备： 配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。 2、培养基灵敏度试验： 培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。 培养基灵敏度试验操作如下：取藤黄微球菌、生孢梭菌、白色念珠菌的新鲜培养液，分别10倍递增稀释，制成每ml 含10-100个菌，并作菌落记数。将制备好的菌液分别加至需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基各3管。至规定温度培养5天，每株菌接种的培养基不少于2管生长，则改培养基的灵敏度试验合格。 3、培养基用前的检查： （1）无菌检查：各种培养基在规定温度培养3天，应无菌生长。 （2）新鲜程度检查：需气菌、厌气菌培养基氧化层的颜色用前不能超过1/5，否则，不能使用。应煮沸去氧，只限加热一次。 4、培养基的保存时限： 配制好的无菌试验用培养基在2周内用完。 三、菌种复苏和保藏 1、菌种复苏： 先将冻干菌种的封口端用砂轮刻痕，在刻痕处过火焰数次，用无菌湿棉球炸裂后打开，然后，加入0.3-0.4ml稀释液于菌种管底部，将菌种稀释、混匀，并吸出菌液，接种于适宜的培养基。培养时间和温度根据不同的菌种而定。仔细检查菌种的有关特性，如无发现异常，即可传代、使用。 2、药品微生物用的菌种传代方法： 取复苏好的菌种一支，接种于规定的培养基数管，培养后，置冰箱中保藏。取出使用的菌种，经一段时间后即可废弃。 为防止微生物突变，菌种应尽量避免不必要的接种和传代。
目的:规范微生物实验室管理,确保微生物检验结果的准确性。 范围:适用于微生物实验室。 职责:微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责。 内容: 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室。１、1 微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮,地面应光滑,并应有缓冲间,设双层传递窗传递物件。 1、2 室内温度1８～26℃,相对湿度为45～65%,室内必须保持整洁。 2、微生物实验室洁净度要求: 2、1微生物实验室洁净度应符合相应的医药洁净室设计规范与验收要求。 2、1、1 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 2、1、2 操作台洁净度应符合洁净度A级要求。 3.微生物实验室的使用: 3.１微生物实验室由微生物检验员管理及使用,其她人员须经主管人员批准后方可进入与使用。 3、2 微生物实验室的人员需经过相关的岗位培训,必要时定期进行再培训。 ３、３微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定。 3.3、1 保持个人卫生,不得佩带饰物,不得涂抹化妆品。 3、3、2 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子。 3、3、3 手部应进行２次消毒,宜带无菌手套。 3、3.4 在操作中,操作台面应垫上消毒布巾,以防操作中有滴落液污染台面。３、3、5 人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前,在一更脱外衣、换鞋后,进入一更缓冲间洗手,并消毒后,进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后,进入二更缓冲间,手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室,实验操作前须带上无菌手套。 ３、４微生物实验室使用前应确保操作室的洁净程度。 3、4.１微生物实验室的清洁分为一般清洁及彻底清洁,其具体的清洁部位、方式方法、频率见下表所示:
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
微生物限度检查工作流程 实验前： 1.对实验器皿的准备：对玻璃器皿进行清洗，将洗净干燥的平皿、乳钵、刻度吸管等用牛皮纸包裹，放入鼓风干燥箱中于160℃干热灭菌2小时或放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 2.对实验用培养基及稀释液的准备：按规定比例配制实验所需的各种培养基及稀释液，包好，放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 3.洁净服的准备：将当天实验所用洁净服放入高压蒸汽灭菌柜于121℃湿热灭菌30分钟，备用。 实验中： 1.将实验所需器皿、培养基、洁净服、样品、稀释液放入相应的传递窗中，打开紫外灯，照射30分钟。 2.打开洁净室的通风设备1小时以上，观察洁净室各个规定区域的压差是否符合相应规定范围，若不符合，则因通知设备部门及时进行调整。 3.进入洁净室，换上工作鞋，用洗手液洗手，烘干，换上洁净服，戴上口罩、手套，并与喷手器下用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对双手进行消毒。 4.进入万级洁净走廊，观察各个规定房间的温度、湿度、压差是否符合规定，并与传递窗中将经紫外灯照射后的样品、器皿稀释液及培养基，放入相应的实验室（如微生物限度检查室或无菌检查室）。并将培养基的温度控制在45℃以下（若培养基出现凝固现象时，因微波炉加热融化；若温度太高时，则因用纯化水降温至不烫手背宜。 5.打开超净工作台的紫外灯，照射30分钟，然后再打开超净工作台的通风设备。用75%乙醇或0.1%新洁尔灭对实验所用工作台面进行擦拭消毒（消毒时应遵循由里到外，由上到下，由洁净要求高到洁净要求低的原则）。 6.按照适宜的次序于超净工作台内摆放好稀释液、天平、消毒液、集菌仪、剪刀、镊子等物品，用75%酒精棉球进行消毒，将样品内包装表面用碘酒棉球以及75%酒精棉球依次进行消毒。将营养琼脂平板与超净工作台的做、中、右各置一个（平板需经下预培养48小时且无菌生长），开盖暴露30min，测定的沉降菌每平板不得超过1cfu，则符合百级超净工作台的沉降菌标准（注：在洁净工作台进行操作时，为防止污染，应用酒精棉球对双手反复消毒）。 7.样品处理（以采用离心薄膜过滤法为例）：用天平称取规定量的样品，置于乳钵中，碾碎，少量几次加入规定量（用灭好菌的两头高量取）的稀释液，研磨均匀，以制备供试液。8.细菌的检查：用灭菌吸管吸取规定量的供试液于离心管中，500转/秒，离心3分钟。离心后用注射器吸取规定量的上清液于集菌仪中（集菌仪中的滤膜应事先用少量的蛋白胨溶液进行润洗），再用规定量的蛋白胨溶液进行反复冲洗（每次冲洗量不得超过100ml，每张滤膜的总的冲洗量不得超过1000ml，且冲洗过程中应该保持滤膜的完整性）。并用等量的蛋白胨溶液制备阴性对照的滤膜。 8.打开集菌仪，用镊子夹取滤膜于在30~35℃预培养48小时且无菌生长的营养琼脂平板上，切忌滤膜与琼脂间有气泡。并且制备2个只加入15~20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂的平板作空白对照。 9.霉菌及酵母菌的检查:取相应稀释级的供试液1ml，加入五个无菌平板中，每个0.2ml，注入15~20ml温度不超过45℃的溶化的玫瑰红钠琼脂培养基，摇匀。
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
1/11
验 证 文 件
目 录
1 2 3 4 5 6 7 8 9
适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
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验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
目的：规范微生物实验室管理，确保微生物检验结果的准确性。 范围：适用于微生物实验室。 职责：微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责。 内容： 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室。 微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮，地面应光滑，并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件。 室内温度18～26℃，相对湿度为45～65%，室内必须保持整洁。 2.微生物实验室洁净度要求： 微生物实验室洁净度应符合相应的医药洁净室设计规范和验收要求。 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 操作台洁净度应符合洁净度A级要求。 3.微生物实验室的使用： 微生物实验室由微生物检验员管理及使用,其他人员须经主管人员批准后方可进入和使用。 微生物实验室的人员需经过相关的岗位培训，必要时定期进行再培训。 微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定。 保持个人卫生，不得佩带饰物，不得涂抹化妆品。 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子。 手部应进行2次消毒，宜带无菌手套。 在操作中，操作台面应垫上消毒布巾，以防操作中有滴落液污染台面。 人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前，在一更脱外衣、换鞋后，进入一更缓冲间洗手，并消毒后，进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后，进入二更缓冲间，手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室，实验操作前须带上无菌手套。 微生物实验室使用前应确保操作室的洁净程度。 微生物实验室的清洁分为一般清洁及彻底清洁，其具体的清洁部位、方式方法、
频率见下表所示： 微生物实验室常用消毒剂及其配制 使用前30分钟应先开启操作台及操作室的净化和消毒系统，关闭消毒系统后10～15分钟再进入操作室；操作结束后，开启消毒系统30分钟后再关闭消毒系统和净化系统。 试验开始前应做好相关试验的准备工作，确保在试验过程中不离开操作室。 进入操作室的任何东西外包装均需消毒处理。 物料进入微生物实验室以前，脱去外包装或者用酒精棉球擦拭后，放置于传递窗中。
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
目得：规范微生物实验室管理,确保微生物检验结果得准确性。 范围:适用于微生物实验室. 职责：微生物检测人员及检验室负责人对此规程执行负责. 内容: 1.微生物实验室包括微生物限度检查室、阳性菌接种室及抗生素微生物检定室. 1、１微生物实验室结构应坚固、严密、防尘、光线明亮,地面应光滑,并应有缓冲间，设双层传递窗传递物件。 1、２室内温度1８~2６℃,相对湿度为４5~6５%,室内必须保持整洁。 2、微生物实验室洁净度要求: 2、１微生物实验室洁净度应符合相应得医药洁净室设计规范与验收要求。 2、1、1 操作室洁净度应符合洁净度C级要求。 2、１、2 操作台洁净度应符合洁净度A级要求. 3.微生物实验室得使用: ３、1 微生物实验室由微生物检验员管理及使用，其她人员须经主管人员批准后方可进入与使用。 ３、2 微生物实验室得人员需经过相关得岗位培训,必要时定期进行再培训. 3、３微生物实验室操作人员应严格遵守洁净工作区域净化控制规定. 3、3、1 保持个人卫生，不得佩带饰物,不得涂抹化妆品。 3、３、2 室内应穿戴专用衣帽、口罩及鞋子. 3、3、3 手部应进行2次消毒,宜带无菌手套。 3、3、４在操作中，操作台面应垫上消毒布巾，以防操作中有滴落液污染台面. 3、3、５人员进入微生物限度检查室、阳性对照室或抗生素微生物检定室前,在一更脱外衣、换鞋后，进入一更缓冲间洗手，并消毒后，进入二更自上而下依次换上洁净帽、口罩、洁净服、洁净鞋后，进入二更缓冲间,手经再次用消毒液消毒后方可进入微生物限度检查室或阳性对照室,实验操作前须带上无菌手套。 ３、4 微生物实验室使用前应确保操作室得洁净程度。 3、4、1 微生物实验室得清洁分为一般清洁及彻底清洁，其具体得清洁部位、方式方法、频率见下表所示：
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表