绒山羊FGF5基因毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞
康健1，2胡广东1，2权富生1，2*张涌1，2*
1西北农林科技大学动物医学院，杨凌712100；2西北农林科技大学/农业部动物生物技术重点实验室，杨凌712100
*通讯作者，quanfusheng@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html,；yongzhang19562012@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html,
摘要本研究旨在构建绒山羊(Capra hircus)成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor5,FGF5)基因的毛囊特异性表达载体，并证明其表达的有效性。分别以绒山羊基因组和cDNA为模板，利用PCR方法克隆角蛋白关联蛋白6-1(keratin associated protein6-1,KAP6-1)基因的启动子和FGF5基因的编码区序列(coding sequence,CDS)，并将这两个元件连接到去除CMV启动子的真核表达载体pEGFP-N1上，FGF5与增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框之间以猪捷申病毒(Porcine teschovirus,PTV)2A(P2A)相连，构建毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-KF。表达载体转染绒山羊胎儿成纤维细胞后，对细胞表达产物进行qRT-PCR和Western blot检测。酶切鉴定结果表明，载体pEGFP-N1-KF 构建成功；qRT-PCR结果表明，FGF5正常表达；Western blot结果显示，P2A能够有效剪切FGF5和EGFP 融合蛋白。表明成功得到了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体并在绒山羊胎儿成纤维细胞中能正常表达。
关键词FGF5，载体构建，胎儿成纤维细胞，绒山羊
Construction of FGF5Gene Hair Follicle Specific Expression Vector and Transfected into Cashmere Goat Fetal Fibroblast Cells
KANG Jian1,2HU Guang-Dong1,2QUAN Fu-Sheng1,2*ZHANG Yong1,2*
1College of Veterinary Medicine,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling712100,China;2Key Laboratory of Animal Biotechnology,Ministry of Agriculture,Northwest Agriculture and Forestry University,Yangling712100,China
*Corresponding author,quanfusheng@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html,;yongzhang19562012@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html,
Abstract This study aimed to construct an eukaryotic expression vector and prove whether it could specifically express fibroblast growth factor5(FGF5)gene in the hair follicles of cashmere goat.The keratin associated protein6-1(KAP6-1)promoter and FGF5gene coding sequence were obtained by PCR.The vector pEGFP-N1-KF,a hair follicles specific expression vector of FGF5,was constructed by inserting the KAP6-1 promoter into the CMV promoter-less pEGFP-N1,and then connecting FGF5to the downstream of KAP6-1 promoter,using Porcine teschovirus2A peptide(P2A)to link FGF5and enhanced green fluorescent protein (EGFP)gene.The vector we constructed was transfected into cashmere goat fetal fibroblast cells and two methods were used to verify its functionality including qRT-PCR and Western blot.The enzyme digestion results showed the vector was correctly constructed.The qRT-PCR results indicated that the FGF5gene could express in fetal fibroblast cells.The Western blotting results confirmed that the fusion protein could be availably spelited into FGF5and GFP protein by the functionality of P2A.The conclusion is that the vector pEGFP-N1-KF which can specifically express FGF5gene was successfully constructed and can be normally
基金项目：国家高科技研究发展计划(863)计划(No.2011AA100303)
收稿日期：2014-04-25接受日期：2014-06-11
0引言
绒山羊(Capra hircus )是经过长期自然选择和人工选育而形成的一种独特的山羊品种，主要分布于中国、蒙古、阿富汗和伊朗。所产绒毛的类型分为两种：一种是有髓的粗毛，由初级毛囊产生；另一种是无髓的细绒毛，由次级毛囊产生(姜怀志,
2012)。绒山羊所产的山羊绒，由于其纤维细而长，性能柔软，色润细腻，具有很高的纺织价值。绒山羊的绒毛品质、产量与皮肤毛囊的生长发育密切相关。毛囊作为哺乳动物皮肤的重要附属器官，其生长具有一定的周期性，依次经历兴盛期(anagen)、退行期(catagen)和休止期(telogen)，这种周期性的变化是由“毛囊周期生物钟”控制的(Sch-neider et al.,2009)。关于毛囊周期性调控的研究主要集中在人(Homo sapiens )和小鼠(Mus musculus )等动物上(Muller-Rover et al.,2001;Botchkarev,Paus,2003;Kraus,Foitzik,2006)，在绒山羊上的研究还比较少。自1962年在Jackson 实验室中发现了自然突变的安哥拉鼠(Mus callewaerti )后，科学家就对这种被毛变长的小鼠进行了一系列深入的研究(Nest-erova et al.,2012)。Herbert 等(1994)通过构建基因打靶载体，成功获得了成纤维细胞生长因子5(fi-broblast growth factor 5,FGF5)基因敲除的小鼠，发现相比正常小鼠，其被毛长度增加50%。有研究发现，FGF5基因在小鼠皮肤中存在两种蛋白产物，即FGF-5蛋白和FGF-5S 蛋白(Suzuki et al.,1998)，并通过体外注射两种蛋白研究它们对皮肤毛囊周期的影响，发现这两种蛋白通过竞争相同受体产生拮抗作用(Suzuki et al.,2000)。Housley 和V enta (2006)在对狗(Canis lupus familiaris )的FGF5基因研究时，发现存在两处碱基突变，其中一处错义突变导致狗的被毛变长。高爱琴等(2006)研究发现，FGF5基因能够调节毛囊的周期。
本研究通过构建绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体，并转染绒山羊胎儿成纤维细胞，以验证其基本功能，为进一步阐明FGF5基因在绒山羊皮肤毛囊中的调控机制提供初步技术支持。
1材料与方法
本研究于2012年10月至2013年12月在西北农林科技大学农业部动物生物技术重点开放实验室进行。1.1
材料
质粒pEGFP-N1购自Clotech 公司(美国)，大肠杆菌(Escherichia coli )Trans5α化学感受态细胞购自
北京全式金生物技术有限公司，绒山羊(Capra hircus )胎儿成纤维细胞由本实验室冷冻保存。
1.2
主要工具酶和试剂
限制性内切酶购自美国NEB 公司，T4DNA 连
接酶、PrimeScriptTM RT-PCR Kit 、SYBR Premix Ex TaqTM II(Tli RNaseH Plus)购自宝生物工程(大连)有限公司，TransStart FastPfu DNA Polymerase 、Trans Taq HiFi DNA Polymerase 、Blue Plus ⅡProtein Marker 、抗绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP )标签鼠单克隆抗体、抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP ?DH )鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP )标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体、DNaseI(RNase-free)购自北京全式金生物技术有限公司，质粒提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，PureYield TM Plasmid Maxiprep System 购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司，凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，DMEM 、胎牛血清FBS 购自Gibco 公司，Trizol 购自Invitrogen 公司。
1.2绒山羊FGF5基因毛囊特异性表达载体pEG ?FP -N1-KF 的构建
1.2.1绒山羊KAP6-1启动子的克隆与毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-K 的构建
用绒山羊角蛋白关联蛋白6-1(keratin associat-
ed protein 6-1,KAP6-1)基因的启动子替换真核表达载体pEGFP-N1的CMV 启动子。根据绵羊KAP6-1基因(GeneBank 登录号:M95719)，参照Primer Pre-mier 5.0软件设计特异性引物，并由上海生工生物工程有限公司合成(表1)。提取绒山羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA ，以其为模板，用TransStart
expressed in cashmere goat fetal fibroblast cells.
Keywords FGF5,Vector construction,Fetal fibroblast cells,Cashmere goat
绒山羊FGF5基因毛囊特异性表达载体的构建及转染胎儿成纤维细胞
Construction of FGF5Gene Hair Follicle Specific Expression Vector and Transfected into Cashmere Goat Fetal Fibroblast Cells
FastPfu DNA Polymerase扩增KAP6-1基因启动子区，1%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。PCR反应体系：10μL5×TransStart FastPfu Buffer、5μL dNTPs(2.5mmol/L)、1μL KAPF(10mmol/L)、1μL KAPR(10mmol/L)、1μL绒山羊基因组DNA、1μL TransStart FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)、31.5μL H2O。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃复性10min，16℃30min。
用Aat II和Nhe I分别对pEGFP-N1质粒和PCR产物进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，4℃水浴过夜连接。连接产物转化Trans5α化学感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养板上过夜培养。获得重组质粒pEGFP-N1-K，双酶切鉴定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.2.2绒山羊FGF5基因CDS区的克隆与pEGFP-N1-KF表达载体的构建
收集绒山羊胎儿成纤维细胞，用Trizol试剂提取总RNA，并使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit反转录成cDNA。以cDNA为模板，用特异性引物FGF5F和FGF5R(表1)扩增绒山羊FGF5基因(GeneBank登录号:XM_005681814)CDS区，1%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。将绒山羊成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor5,FGF5)基因CDS区插入到毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-K 的KAP6-1启动子下游，FGF5-CDS与下游GFP之间用具有自我剪切功能的猪捷申病毒2A(P2A)序列连接。
用Nhe I和Hin d III分别对pEGFP-N1-K质粒和PCR产物进行双酶切，经过电泳、连接、转化，最终获得重组质粒pEGFP-N1-KF。双酶切鉴定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。
1.3载体功能验证
1.3.1绒山羊胎儿成纤维细胞的电转染
用含10%FBS的DMEM培养基培养绒山羊胎儿成纤维细胞。电转染前24h，将胎儿成纤维细胞以合适密度接种于60mm细胞培养皿中，待细胞单层融合度达到70%~80%，即可进行电转染。电转染方法：PBS清洗细胞，胰酶消化2min，用完全培养基终止消化后收集细胞；Optin-MEM洗涤离心2次后，用800μL电转液重悬细胞，并加入20μg质粒pEGFP-N1-KF，混匀后静置15min；然后将细胞悬液加入电转杯中，电击参数设置为510V，2ms，1次，电击完静置10min；最后将电转杯中的细胞悬液均匀地接种于两个100mm细胞培养皿中培养(两皿细胞分别用于后续的qRT-PCR和Western blot)。24h后，在荧光相差倒置显微镜(Nikon TE2000-U,日本)下观察细胞。实验中设置阳性对照组pEGFP-N1和空白对照组。
1.3.2qRT-PCR检测FGF5的表达量
电转染24h后，收集转染细胞样品。用Trizol 裂解细胞并提取总RNA，用DNaseI处理所提取的RNA，避免qRT-PCR过程中DNA对结果的影响。
引物名称Primer name KAP6-1promoter
FGF5-CDS
FGF5-qRT
GAPDH-qRT 引物序列/5'~3'
Primer sequence
F:TATAGACGTCCAGTTCATGGGGTCACTAAGAGT
R:GCTAGCTAGCTGTTGAGGTTGTTCTCGGGTAGA
F:TATGCTAGCGCCACCATGAGCTTGTCCTTCCTCCTCCT
R:CATAAGCTT AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGC AGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCC ACCAAAGCGAAACTTGAGTCTGTAT
F:AAGACTGGGCGGGAGTGGTA
R:TGGCTTGACGGGATTAGGTG
F:GTTTGTGATGGGCGTGAACC
R:CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT
产物长度/bp
Size
1050
900
189
173
表1引物序列
Table1Primers used in experiments
下划线：酶切位点；粗体：P2A肽
Underline marked,restriction sites;Bold,the P2A peptide
使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit将样品RNA反转录成cDNA，备用于qRT-PCR分析。借助Primer Premier5.0软件和NCBI网站，设计山羊FGF5基因和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase,GAPDH)(GeneBank登录号：XM_005680968)基因的定量引物(表1)。qRT-PCR 反应体系：10μL SYBR Premix Ex Taq TM II(2×)，0.8μL PCR Forward Primer(10μmol/L)，0.8μL PCR Reverse Primer(10μmol/L)，0.4μL ROX Refer-ence Dye(50×)，2μL cDNA(50ng/μL)，6μL RNase-Free ddH2O。qRT-PCR反应条件：95℃50s；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃15s，60℃1min，95℃15s。以GAPDH基因为内参基因，采用2-ΔΔCt 法计算FGF5基因的相对表达量。各组试验至少重复3次，利用SPSS软件对实验数据进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。
1.3.3Western blot检测P2A的剪切效率
电转染36h后，收集转染细胞样品。用PBS洗涤离心2次后，加入150μL细胞裂解液(由RIPA裂解缓冲液和PMSF蛋白酶抑制剂组成)重悬细胞，冰浴裂解30min。然后加入等量2×SDS-蛋白上样缓冲液，置于100℃水浴锅中煮沸10min。将提取的细胞蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，各组蛋白上样量均为20μL，选用Blue PlusⅡProtein Marker。经过转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育，在暗室中使用WesternBright ECL化学发光底物进行显色反应并用胶片曝光。
2结果与分析
2.1绒山羊KAP6-1基因启动子的克隆与毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-K的构建
从绒山羊胎儿成纤维细胞提取基因组DNA，用特异性引物扩增得到约为1050bp的条带(图1)，与预期相符。
用Aat II和Nhe I双酶切质粒pEGFP-N1，得到一条大小约为4269bp的目的条带(图2)，Aat II在质粒pEGFP-N1中存在4处酶切位点(分别位于126、179、262、448位)，双酶切后，CMV启动子会被切成大小约为50~200bp的多条片段，与预期相符。
凝胶回收PCR产物后，将其连接插入到去除CMV启动子的pEGFP-N1骨架载体中。用Aat II 和Nhe I双酶切重组质粒pEGFP-N1-K，得到大小约为1030和4269bp的条带(图3)，与预期结果一致。
将酶切正确的重组质粒pEGFP-N1-K送南京金斯瑞公司测序，利用NCBI BLAST软件对测序结果进行比对。其与绵羊KAP6-1基因(GeneBank登录号:M95719)启动子序列的匹配比例为97.48%，并且具有完整的CAAT box(位于序列的906位)、增强子核心序列等转录元件，只有TATA box由原序5000
3000
bp M1bp
4269
图2质粒pEGFP-N1酶切检测
Figure2Double digested pEGFP-N1
M：Trans15K DNA marker；1：Aat II和Nhe I双酶切质粒pEG-FP-N1
M:Trans15K DNA marker;1:pEGFP-N1digested with Aat II and Nhe I
2000
1000
bp M1bp
1050
图1KAP6-1基因特异性启动子的PCR产物
Figure1PCR products of KAP6-1specific promotor
M：Trans2K Plus DNA marker；1：KAP6-1特异性启动子
M:Trans2K Plus DNA marker;1:KAP6-1specific promotor
列TACAAAA 变成了TATAAAA(位于序列的951位)。说明成功获得了毛囊特异性表达载体pEG-FP-N1-K 的阳性克隆质粒，可以用于后续的质粒改造。2.2
绒山羊FGF5基因CDS 区的克隆与pEGFP -N1-KF 表达载体的构建
从绒山羊胎儿成纤维细胞提取总RNA ，逆转录成cDNA 后，采用降落PCR 方法扩增得到约为900bp 的条带(图4)，与预期相符。
凝胶回收目的条带，将其连接插入到质粒pEGFP-N1-K 中。用Nhe I 和Hin d III 双酶切重组质粒pEGFP-N1-KF ，得到大小约为5274和882bp 的条带(图5)，与预期结果一致。
对酶切正确的重组质粒pEGFP-N1-KF 进行测序，测序结果与山羊FGF5基因(GeneBank 登录号:XM_005681814)的匹配比例为99.75%，存在两处同义突变，分别位于273、450位。说明成功构建了绒山羊FGF5基因的毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-KF ，质粒图谱如图6所示。2.3
pEGFP -N1-KF 载体在绒山羊胎儿成纤维细胞中的功能验证结果
2.3.1绒山羊胎儿成纤维细胞的电转染
采用电转染的方法将质粒pEGFP-N1-KF 导入
到绒山羊胎儿成纤维细胞中，转染24h 后的荧光观察结果如图7所示，绒山羊KAP6-1基因启动子能够启动GFP 在绒山羊胎儿成纤维细胞中的表达。
2.3.2qRT-PCR 检测FGF5的表达量
电转染24h 后，收集细胞样品并提取总RNA ，
反转录成cDNA 后进行qRT-PCR 分析，结果显示，pEGFP-N1-KF 转染组细胞中FGF5基因的表达水平显著高于pEGFP-N1转染组和空白对照组(P <0.01)(图8)。
50003000bp
M
1
bp
4269
20001000
1030
图3质粒pEGFP -N1-K 的酶切鉴定
Figure 3Identification of vector pEGFP -N1-K by double digestion
M ：Trans2K Plus DNA marker ；1：Aat II 和Nhe I 双酶切重组质粒pEGFP-N1-K
M:Trans2K Plus DNA marker;1:pEGFP-N1-K digested with Aat II and Nhe I
图5质粒pEGFP -N1-KF 的酶切鉴定
Figure 5Identification of vector pEGFP -N1-KF by double digestion
M ：Trans2K Plus II DNA marker ；1：Nhe I 和Hin d III 双酶切质粒pEGFP-N1-KF
M:Trans2K Plus II DNA marker;1:pEGFP-N1-KF digested with Nhe I and Hin d
III
1000750
900
M 1bp bp
图4FGF5基因CDS 区的PCR 产物Figure 4PCR products of FGF5-CDS M ：Trans2K Plus DNA marker ；1：FGF5-CDS M:Trans2K Plus DNA marker;1:
FGF5-CDS M
1
bp
bp
5274
882
800050001000750
2.3.3Western blot 检测P2A 的剪切效率
电转染36h 后，收集细胞样品，提取总蛋白进行Western blot 分析，以GAPDH 为内参蛋白，结果如图9所示，pEGFP-N1-KF 转染组中出现了EGFP 蛋白条带(大小约为29kD)，表明所构建的特异性表达载体中的P2A 能够介导FGF5-EGFP 融合蛋白(大小约为61kD)剪切，使FGF5和EGFP 在细胞中同时表达。
3讨论
绒山羊绒毛纤维主要是由角蛋白和角蛋白关
联蛋白构成，它们共同决定了绒毛的基本性状(Ian,Ian,2005)。根据所含氨基酸成分划分，KAP6-1属于高甘氨酸—酪氨酸角蛋白关联蛋白(Rogers et al.,2005)。Fratini 等(1993)通过cDNA 原位杂交实验，发现，绵羊KAP6-1基因的表达具有组织特异性，主要在毛囊皮质细胞中表达。王春生等(2008)克隆了绵羊KAP6-1基因的启动子，将其插入到切除CMV 启动子的pAcGFP1-N1载体中，并在绵羊成纤维细胞中证明了KAP6-1启动子活性。本研究中克隆得到的绒山羊KAP6-1基因启动子序列大小为1040bp ，具有完整的CAAT box ，而TATA box 序列发生了突变，这与郭旭东等(2007)克隆得到的绵羊KAP6-1基因启动子区的序列分析结果一致。由此推断出，绒山羊KAP6-1基因的表达也同样具有组织特异性，其启动子具有毛囊特异性表达的特性，因而可以作为构建绒山羊皮肤毛囊特异性表达载体的启动子。
绒山羊绒毛的品质和产量与皮肤毛囊的生长发育以及毛囊周期性生理调控密切相关。近年来，关于毛囊的生长与调控研究主要集中在FGF5(He et al.,2014)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)(Botchkarev et al.,2002)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(Yano et al.,2001)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)(Weger,Schlake,2005)等基因上。在小鼠上，发现许多基因突变能够影响被毛形态，但只有一种基因突变使小鼠被毛变长，这种现象后被证实是由成纤维细胞生长因子5(FGF5)突变引起的。越来越多的研究表明，
FGF5
图6质粒pEGFP -N1-KF 图谱Figure 6Map of pEGFP -N1-
KF
A
B
C
D
E
F
图7绒山羊胎儿成纤维细胞电转染24h 后的荧光观察(×100)Figure 7The fluorescence of cashmere goat fetal fibroblast cells after electrotransfection for 24h
A 和
B ：pEGFP-N1-KF 转染组，绒山羊KAP6-1基因启动子能够启动GFP 在绒山羊胎儿成纤维细胞中的表达；
C 和
D ：pEGFP-N1转染组(阳性对照组)；
E 和
F ：未转染组(空白对照组)A and B:pEGFP-N1-KF transfected group,the KAP6-1pro-moter could start the expression of GFP in chasmere goat fetal fibroblast cells;C and D:pEGFP-N1transfected group(posi-tive control group);E and F:No-plasmid transfected group (blank control group)
基因能够诱导毛囊从兴盛期向退行期的转变，导致毛囊生长期缩短，从而抑制绒毛的生长(Nakamura et al.,2013)。本研究克隆获得的绒山羊FGF5基因CDS 区，经过序列比对，在273位存在C →T 突变，在450位存在G →A 突变，但是这两处碱基突变都未引起氨基酸序列的改变。其中，第一处碱基突变与刘海英等(2009)在内蒙古绒山羊群体中发现的结果一致。
为了使目的基因和报告基因能够同时在细胞中表达，需要构建一种多顺反子载体。目前，构建多顺反子载体的策略有：多启动子表达载体，这种方法虽然简便，但是启动子之间会相互干扰，从而影响表达水平；表达融合基因，这种方法常用于细胞蛋白的定位，但是融合蛋白可能会因为空间构象使两种蛋白丧失活性；基因之间以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)序列连接，虽然克服了上述两种方法的不足，但是置于IRES 序列下游外源基因的表达量只有上游基因的20?
50%；基因之间以2A 序列连接，2A 序列来源于病毒，是一种具有自我剪切能力的短肽，由于其结构短小、剪切效率高，成为构建多顺反子载体的首选策略(张俨,李振海,2012)。有报道表明，猪捷申病毒2A(P2A)的剪切效率可达到100%(Kim et al.,2011)。因此，在构建绒山羊毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-KF 时，使用P2A 序列介导FGF5和EGFP 融合蛋白的剪切。Western blot 结果表明，P2A 能够高效地对融合蛋白FGF5-EGFP 进行剪切，且融合蛋白几乎不可见，证实P2A 完全介导该融合蛋白的剪切，这与张俨(2012)的结论一致，该设计在保证FGF5和EGFP 两种蛋白发挥各自功能的同时，为其他多基因共表达真核载体的设计提供了一种技术支持。
本研究构建的载体转染了绒山羊胎儿成纤维细胞，进一步功能验证还需要转染绒山羊毛囊细胞以及生产转基因绒山羊。通过上调FGF5基因的表达量，在目标靶细胞相关基因表达以及动物整体水平基因表达、产绒量的影响等多方面进行系统分析。本实验室在该载体的基础上，构建了绒山羊毛囊特异性表达的干扰载体，关于基因功能的研究将另文报道。
4结论
本研究构建了绒山羊FGF5基因毛囊特异性表达载体pEGFP-N1-KF ，通过转染绒山羊胎儿成纤维细胞，验证了KAP6-1基因启动子活性以及P2A 的剪切活性，为进一步研究FGF5基因在毛囊发育和周期调控中的作用提供了技术支持。
参考文献
高爱琴,李宁,李金泉,等.2006.山羊FGF5基因单核苷酸多
态性群体遗传学分析[J].华北农学报,2l(3):71-76.(Gao A Q,Li N,Li J Q,et al.2006.Analysis on Single Nucleotide Polymorphisms of FGF5Gene in Different Goat Breeds[J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2l(3):71-76.)
郭旭东,毛舒燕,宝明涛,等.2007.绵羊角蛋白关联蛋白
KAP6-1基因5'端调控区的分子克隆及测序结果比较[J].内蒙古大学学报(自然科学版),38(1):58-63.(Guo X D,Mao S Y ,Bao M T,et al.2007.Molecular Cloning of 5'Flanking Region of Ovine Keratin Associated Pro-tein 6-1Gene and Comparison of the Sequences[J].Ac-
2468101214**
F G F 5基因相对表达量R e l a t i v e e x p r e s s i o n o f F G F 5
pEGFP-N1-KF pEGFP-N1Control
图8FGF5的相对表达量
Figure 8Relative expression of FGF5
pEGFP-N1-KF 转染组细胞中FGF5基因的表达水平显著高于pEGFP-N1转染组和空白对照组(P <0.01)
The expression level of FGF5in pEGFP-N1-KF transfected group was significantly higher than pEGFP-N1transfected group and blank control group(P
<0.01)
1
2
3
EGFP GAPDH
61
2936
kD 图9Western blot 检测P2A 剪切功能
Figure 9Validation of P2A by Western blot analysis 内参蛋白：GAPDH ；1：pEGFP-N1；2：pEGFP-N1-KF ；3：Control Reference protein:GAPDH
ta Scientiarum Naturalium Universitatis Neimongol,38
(1):58-63.)
姜怀志.2012.中国绒山羊的毛囊结构特性与发育机制[J].
吉林农业大学学报,34(5):473-482.(Jiang H Z.2012.
Hair Follicle Structure Traits and Developmental Mech-anisms of Chinese Cashmere Goat[J].Journal of Jilin Agricultural Universit,34(5):473-482.)
刘海英,杨桂芹,张微,等.2009.FGF5基因对内蒙古绒山羊绒毛性状的影响[J].遗传,31(2):175-179.(Liu H Y, Yang G Q,Zhang W,et al.2009.Effects of FGF5gene on fibre traits on Inner Mongolian cashmere goats[J].
Hereditas,31(2):175-179.)
王春生,安铁洙,白秀娟,等.2008.绵羊毛发角蛋白结合蛋白启动子的克隆与活性分析[J].中国兽医学报,28(2): 137-145.(Wang C S,An T Z,Bai X J,et al.2008.Mo-lecular cloning and activity analysis in sheep fibroblast of the keratin Associated protein promoter of the sheep [J].Chinese Journal of Veterinary Science,28(2):137-145.)
张俨,李振海.2012.多顺反子载体构建的策略及进展[J].医学分子生物学杂志,9(5-6):429-433.(Zhang Y,Li Z H.
2012.Strategies and Advancements in Construction of Multicistronic Vectors[J].Journal of Medical Molecular Biology,9(5-6):429-433.)
Botchkarev V A,Botchkareva N V,Sharov A A,et al.2002.
Modulation of BMP signaling by noggin is required for induction of the secondary(nontylotrich)hair follicles [J].Journal of Investigative Dermatology,118(1):3-10. Botchkarev V A,Paus R.2003.Molecular biology of hair morphogenesis:Development and cycling[J].Journal of Experimental Zoology Part B:Molecular and Develop-mental Evolution,298(1):164-180.
Fratini A,Powell B C,Rogers G.1993.Sequence,expression, and evolutionary conservation of a gene encoding a gly-cine/tyrosine-rich keratin-associated protein of hair[J].
Journal of Biological Chemistry,268(6):4511-4518.
He X L,Yuan C,Chen Y L.2014.Isolation,characterization, and expression analysis of FGF5isoforms in cashmere goat[J].Small Ruminant Research,116(2):111-117. Hebert J M,Rosenquist T,G?tz J,et al.1994.FGF5as a regu-lator of the hair growth cycle:Evidence from targeted and spontaneous mutations[J].Cell,78(6):1017-1025. Housley D,Venta P.2006.The long and the short of it:Evi-dence that FGF5is a major determinant of canine‘hair ’-itability[J].Animal Genetics,37(4):309-315.
Ian W P,Ian R F.2005.Major genes and QTL influencing wool production and quality:A review[J].Genetics Se-
lection Evolution,37(1):S97-S107.
Kim J H,Lee S R,Li L H,et al.2011.High cleavage efficien-cy of a2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines,zebrafish and mice[J].PloS one,6
(4):e18556.
Krause K,Foitzik K.2006.Biology of the hair follicle:the ba-sics[C].Seminars in cutaneous medicine and surgery, WB Saunders,pp.2-10.
Muller-Rover S,Handjiski B,van der Veen C,et al.2001.A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages[J].Jour-nal of Investigative Dermatology,117(1):3-15. Nakamura M,Schneider M R,Schmidt-Ullrich R,et al.2013.
Mutant laboratory mice with abnormalities in hair folli-cle morphogenesis,cycling,and/or structure:an update [J].Journal of dermatological science,69(1):6-29. Nesterova A P,Nizamutdinov I I,Konyukhov B V.2012.Inter-action of mutant genes Fgf5go-Y,we,and wal changes the duration of hair growth cycles in mice[J].Russian Journal of Developmental Biology,43(1):54-59. Rogers M A,Langbein L,Praetzel-Wunder S,et al.2005.Hu-man hair keratin-associated proteins(KAPs)[J].Interna-tional Review of Cytology,251:209-263.
Schneider M R,Schmidt-Ullrich R,Paus R.2009.The hair follicle as a dynamic miniorgan[J].Current biology,19
(3):132-142.
Suzuki S,Kato T,Takimoto H,et al.1998.Localization of rat FGF-5protein in skin macrophage-like cells and FGF-5S protein in hair follicle:possible involvement of two Fgf-5gene products in hair growth cycle regulation[J].
Journal of Investigative Dermatology,111(6):963-972. Suzuki S,Ota Y,Ozawa K et al.2000.Dual-mode regulation of hair growth cycle by two Fgf-5gene products[J].
Journal of Investigative Dermatology,114(3):456-463. Weger N,Schlake T.2005.Igf-I signalling controls the hair growth cycle and the differentiation of hair shafts[J].
Journal of Investigative Dermatology,125(5):873-882. Yano K,Brown L F,Detmar M.2001.Control of hair growth and follicle size by VEGF-mediated angiogenesis[J].
Journal of Clinical Investigation,107(4):409-417.
·基础研究· 以人皮肤成纤维细胞作为饲养层细胞培养人胚胎干细胞* 杨俊林 刘雄昊喻姣玲冯劢谭杨李卓吴 奔 高 庭 潘 盛 邬玲仟梁德生夏家辉 （中南大学医学遗传学国家重点实验室湖南长沙410078） 摘要目的：比较人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts,HDFs ）与小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)的增殖能力及研究人皮肤成纤维细胞作为饲养层支持人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs ）未分化生长的能力。方法：利用组织贴壁法从人皮肤中分离出HDFs ，通过细胞形态的观察和生长曲线的绘制比较HDFs 与MEFs 的体外增殖能力。将HDFs 作为饲养层细胞与hESCs 共培养，传代12代后，检测hESCs 碱性磷酸酶(AKP)、表面特异性标志及胚胎干细胞特异性转录因子。结果：HDFs 可连续传代培养15代以上，10代以下的HDFs 增殖迅速，而MEFs 自第4代起，增殖能力就明显下降；hESCs 在HDFs 饲养层上可传代培养12代以上，克隆边界清晰，细胞排列紧密，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性，表达了hESCs 特异性转录因子。结论： HDFs 比MEFs 具有更强的增殖能力；HDFs 可作为培养hESCs 的饲养层细胞。关键词：人胚胎干细胞；人皮肤成纤维细胞；饲养层细胞中图分类号： R329.2文献标识码：A 文章编号：1673-6273（2009） 16-3001-05Culture of human embryonic cells by using human dermal fibroblasts as feeder cells* YANG Jun-lin,LIU Xiong-hao,YU Jiao-ling,FENG Mai,TAN Yang,LI Zhuo,WU Ben,GAO Ting, PAN Sheng,WU Ling-qian,LIANG De-sheng,XIA Jia-hui （State Key Laboratory of Medical Genetics,Central South University,Changsha,410078，China ） ABSTRACT Objective:To compare the proliferative potential of human dermal fibroblasts(HDFs)and mouse embryonic fibroblasts (MEFs),and to explore the feasibility for HDFs as feeder cells to support the growth of human embryonic cells (hESCs).Methods:HDFs were obtained from human skin by using the method of tissue-adherence.The proliferative capacities of HDFs and MEFs were compared by cell morphology and growth curve.HDFs were used as feeder cells to culture hESCs.After growing on HDFs for 12passages,the hESCs were tested for the expressions of alkaline phosphatase (AKP),the cell surface markers and cell-specific transcription factor of hESCs.Results:HDFs could be subcultured for more than 15passages,and retained strong proliferative potential before 10passages,while it decreased obviously in MEFs after subcultured for 4passages.The hESCs can passaged on HDFs feeder cells for 12passages with tightly packed cells and clear boundaries of clone,showing the positive results of alkaline phosphatase (AKP)and the cell surface markers and the expression of hESCs-specific transcription factor.Conclusion:HDFs showed a stronger proliferation ability than MEFs;HDFs can support the growth of hESCs. Key words:Human embryonic stem cells;Human dermal fibroblasts;Feeder cells Chinese Library Classification:R329.2Document code:A Article ID:1673-6273（2009） 16-3001-05*基金项目：国家重点基础研究发展计划（2004CB518800），国家高技术研究发展计划（2007AA021002和2007AA021206）和国家自然科学基金（30700458和30971298） 作者简介：杨俊林（1977-），男，博士研究生，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：yangjunlin@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html, 刘雄昊（1975-），男，博士，助理研究员，主要研究方向：基因治疗与干细胞生物学，E-mail ：liuxionghao@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html, 杨俊林、刘雄昊为并列第一作者 △通讯作者：梁德生，E-mail ：liangdesheng@https://www.doczj.com/doc/3110781187.html, （收稿日期：2009-07-06接受日期：2009-07-30） 前言 自1998年Thomson [1]等人建立第一株人胚胎干细胞（hu-man embryonic stem cells,hESCs ）细胞系以来，hESCs 迅速成为人干细胞领域的研究热点。 hESCs 是具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以定向分化成不同的细胞、组织，这使得hESCs 在细胞治疗以及再生医学方面具有巨大的潜力。目前大 多数的人胚胎干细胞系是以小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse em-bryonic fibroblasts,MEFs)作为饲养层细胞维持其生长和未分化状态的， MEF 细胞通过与hESC 直接接触及分泌多种因子维持人胚胎干细胞未分化状态。而鼠源性的饲养层细胞很可能给hESCs 带来动物源性的病原体或生物活性分子的污染，严重阻碍hESCs 的临床应用。早期就在鼠的细胞发现Hantaan 病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV ）、呼肠病毒-3[2]，这些病
人胚胎干细胞研究的临床意义 [关键词] 人胚胎干 健康讯: 吕广秀 20XX14上海市解放军第85医院儿科1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别发表论文阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。 1 胚胎干细胞的一般定义特征考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。 2 胚胎干细胞的最新研究James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能
一，酶消化法制备猪胎儿成纤维细胞 猪胎儿成纤维细胞制作方法的改进及应用2002 1. 3. 1剪切猪妊娠35 d，剖腹手术取出子宫，用75% 的酒精浸泡消毒，无菌取出胎儿，用含双抗的PBS ( 137mmol /L NaCl 2. 7 mmol /L KCl 10 mmol /L Na2HPO4 2 mmol /L KH2 PO4 1 mmol /L CaCl20. 5mmol /L MgCl2 ) 漂洗2 遍，放入含双抗的PBS 中，分离2 个胎儿,放于塑料平皿中, 用无Ca 2+、Mg2+，含有双抗的PBS 缓冲液洗涤3 次, 洗至无色, 备用。将洗涤好的胎儿转移到另一平皿中,用无菌剪子剪掉头,四肢, 尾,去掉内脏, 继续用无Ca2+、Mg2+- PBS 缓冲液洗涤数次, 洗至无色, 将剩余的部分放入到100mm 的平皿中，然后用剪子将胚胎剪切成2～3 mm 小块, 将碎块转移到50ml离心管中。 1. 3. 2消化向放有组织块的离心管中加入二分之一离心管体积的0.25% Trypsin-0.04%EDTA 消化液（胰蛋白酶常用浓度为0.25%，PH为8.0。也有用胶原酶的，因为此酶消化温和，但是价格高，如果用胶原酶则为胶原酶+DMEM+Antibiotic-antimycotic，小鼠多用10ml离心管，因此加入胰酶消化液5ml即可）然后在室温下轻轻吹打组织块(或者，在37℃水浴摇床内消化)。室温消化15～20 min 左右（如果在37摄氏度最好在5min 内消化完）。可以边消化边吹打组织块, 也可以每隔5 min 吹打一次。消化结束后, 加入等体积的终止液10% 胎牛血清的DMEM 培养液(即吸出来细胞上层液如果多则放于到5ml 离心管中，如果少则放于1.5ml离心管中）,并轻轻吹打。 1. 3. 3离心、接种和培养800 r·min 离心5 min, 弃上清液, 然后加入5ml（或1ml) 的含20%胎牛血清的低糖DMEM 培养液培养基, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 按常规方法进行细胞计数（1ml离心沉淀的细胞数=5个中方格中细胞个数X 5 X10 X1000 X稀释倍数，此时的计算值为体细胞的密度即个/ml. 大约徘徊在1-3 x 106个/ml）。以2×105个细胞/ mL(此值因为离心后又加入5ml,即稀释倍数为5.）的浓度接种于25 mL 预先2小时涂有0.1%明胶（来源：猪胎儿成纤维细胞建系影响因素与脂质体介导转染法的研究）的培养瓶中(根据具体情况加入4-5ml培养基，但是加入的培养基要求细胞的最终浓度为2 ×105个/ml)(或者转入到10mm平皿中，在38.5℃，5%CO2和饱和湿度培养）于39℃、5%CO2、95%空气、饱和湿度的培养箱中培养。12小时候观察细胞贴壁生长状况，（原代培养24 h 后，可见细胞贴壁生长，来源：借助慢病毒将EGFP 基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞）一般在第二天换液，随后隔天换液，逐天观察，待细胞将80%-90%培养瓶铺满后即形成细胞单层，开始进行传代。一般消化1 个猪胎儿获得的细胞可接种 2 个50 ml的培养瓶。 如下图为传代培养第一代的西藏小型猪胎儿成纤维细胞图：
人胚胎干细胞的研究发展 摘要：叙述了人胚胎干细胞（hES细胞）的研究现状，并对hES 细胞的研究进展及其应用前景等全面综述。 关键词：人，胚胎干细胞，原始生殖细胞，全能性，多功能性干细胞(Stemcell)是一类具有自我更新能力的多潜能细胞，即干细胞保持未定向分化状态和具有增殖能力，在合适的条件下或给予合适的信号，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，又称其为“万用细胞”。干细胞来源于胚胎、胎儿组织和成年组织。根据发育阶段，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞。1998 年Thomson等第一次从胚胎中分离培养了人体胚胎干细胞(hES C)，并随后发现它能分化为体内几乎所有的细胞后，由此掀起全球范围内的hESC研究热潮。 人胚胎干细胞的生理意义：人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。 1 人胚胎干细胞的来源 胚胎干细胞来源于着床前的囊胚内细胞团或早期胚胎的原始生殖细胞是一大类未分化的二倍体全能干细胞，具有无限增殖、自我更新
和多向分化的潜能。 2 人胚胎干细胞的生物学特性 (1)具有分化的多潜能性，在体外可诱导分化出属于三个胚层的分化细胞; (2)具有种系传递功能; (3)具有长期的未分化增殖能力，细胞不仅能分化成各种器官组织，而且能增殖生成新的保持同种性状的ES 细胞; (4)易于进行基因改造操作; (5)保留了正常的二倍体的性质且核型正常; (6)胚胎干细胞端粒酶活性呈阳性,具有维持端粒长度,保持干细胞增殖能力的重要作用。 3 人胚胎干细胞的培养 (1) 常规培养液常用的基础培养基有改良伊格尔培养基(MEM)α、达氏修正依氏培养基(DMEM)、组织培养基(TCM)199、F12 等合成培养基，以DMEM应用最为普遍。它的主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和一些其他辅助物质。 (2) 无血清培养基血清中含有许多未知的成分和一些分化诱导因子，不利与ESC未分化状态的维持。为此人们尝试使用无血清培养液、化学合成培养液’进行ESC的培养，加入刺激细胞生长的激素、细胞因子等，实验表明ESC增殖旺盛，且能保持未分化状态，并认为无血清培养基优于血清培养基。但也有学者认为含血清培养液更利于胚胎干细胞向中胚层细胞分化,是因为血清中富含中胚层诱导因子,
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
Discussion 讨论 In the current study, we report the birth of live cloned piglets from cultures of fetal fibroblast cells. These cells were harvested from Day 25 fetuses before being frozen in liquid nitrogen for 2 yr. They were then passaged up to 12 times (approximately 40 population doublings) before nuclear transfer. Taken together, this result illustrates the utility of cloning for storing and multiplying genotypes and for transgenesis by enabling enough population doublings for selection of gene-targeted cells before nuclear transfer. We believe our success was due to the development of a porcine nuclear transfer system in which donor nuclei were exposed to unactivated cytoplasm for approximately 3 h before activation by chemical means. 在目前的研究中，我们报告了通过胚胎成纤维细胞培养出生的克隆活仔猪。这些收集的细胞来自在液氮中冷冻了两年的Day 25 胎儿。然后，在核移植前他们传代12次（约40倍群体倍增）。两者合计，为储存和繁殖基因型的克隆，并且在核移植前选择基因靶标细胞来确保足够的群体倍增和进行转基因组的克隆，结果表明这两者都是可利用的。我们相信，我们的成功是由于猪核移植系统的发展，它是用化学方法激活之前移植核供体暴露在未活化的细胞质中大约三个小时。 Exposure to unactivated oocyte cytoplasm is believed to facilitate remodeling and reprogramming of donor nuclei, [12, 22]. Unactivated cytoplasm contains high levels of active maturation promoting factor (MPF), which induces nuclear membrane breakdown (NEBD) and premature chromatin condensation (PCC) of transferred nuclei. Tani et al. [9] recently observed NEBD and PCC when bovine cumulus cells were fused with enucleated ova, regardless of the phase of the cell cycle in which donor cells existed. In the current study, we demonstrate the importance of fusing donor cells under calcium-free conditions to avoid concurrent activation in the majority of recipient cytoplasts. This was evident in the first experiment when 69% of cybrids that were fused in calcium-containing medium and not receiving chemical activation stimulus cleaved after 2 days of culture compared with only 10% of their counterparts fused under calcium-free conditions. Our finding contrasts with results in cattle in which reconstructed cybrids were found not to prematurely activate during fusion, despite the presence of calcium in the fusion medium [23, 24]. It is likely that there are differences between species with the ease at which recipient cytoplasts activate upon fusion. Other factors such as the age of recipient cytoplasts, source of oocytes (in vivo-matured or in vitro-matured), and fusion parameters utilized are also likely to influence the activation status of fused cybrids. 暴露在未激活的卵母细胞的细胞质中被认为是促进供体核的重塑和重新编程，[12，22]。未激活细胞质中含有活跃的成熟促进因子（MPF），它能诱导核膜破裂（NEBD）和移植核的染色体提早浓缩。当不考虑供体细胞中细胞周期的存在时，牛卵丘细胞与去核的卵子融合期间，，谷等人[9]，最近观察到核膜破裂和染色体提早浓缩。在目前的研究中，为避免在大多数受体细胞质中发生并发激活，我们证明了在缺钙条件下培养对于融合供体细胞的重要性。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至 少放置15 min以上。 2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。一般地，一 个T25培养瓶中加入5 ml MEF完全培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS 使用ICR-r P3 MEF，复苏MEF细胞若干支。将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1?106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全 培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使 之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培 养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 1.一般在复苏后第2-3天传代，视克隆大小和密度而定。 2.吸除废液。 3.用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
小鼠胚胎成纤维细胞MEF培养相关知识总结 2009-08-19 18:39:07 来源:未知【大中小】评论: 条 摘要：小鼠胚胎成纤维细胞的富集1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml 胰蛋白酶/EDTA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。 11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。
13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。 4、为了使细胞分散开，轻轻吹打细胞。 5、每加入1ml的胰蛋白酶/EDTA，加入至少1ml的MEF培养基以终止胰蛋白酶的消化。 6、将细胞悬液加入到15ml的锥形管中，吹打几次，使细胞分散为单个的。 7、在新的T75培养瓶中加入10mlMEF培养基。 8、将细胞悬液分装到新的T75培养瓶中，放在37℃培养箱中进行培养。 注释： MEF培养基成分：
人胚胎干细胞的研究进展 周进学号10170807 【摘要】干细胞( Stem Cell)是一类具有分化潜能和自我复制的早期未分化细胞。胚胎干细胞( Embryonic stem cells, ES细胞)是一种早期胚胎内细胞（inner cell mass, ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell, PGC）经体外分化抑制培养，分离和克隆得到的具有发育全能性的高度未分化细胞。人类胚胎干细胞系的建立是人类发育生物学研究的重大突破,揭示了人体发生发展奥秘的进程,可能为现代临床医疗模式带来革命性的变化。现对人类胚胎干细胞的来源,建系、生物学特性、应用前景及所涉及的伦理学问题作一综述。 【关键词】胚胎干细胞；克隆；伦理学,医学;综述 1、胚胎干细胞的概念 胚胎干细胞是从哺乳动物早期胚胎内细胞团(ICM)或桑椹胚分离出来的、能在体外长期培养的、高度未分化的全能细胞系,可在适合的条件下分化为胎儿或成体的各种类型的组织细胞。 胚胎干细胞属全能干细胞。ESCs 这一名词因其来源于胚胎而得名, 但从研究角度来说, 其概念一直没有一个特殊的标准, 2001 年美国国立卫生院根据Austin Smith 对小鼠ESCs 的研究, 概括了ESCs 的一些基本特征, 对其概念提出了一系列标准[1]: ①、来源于内细胞团或囊胚上胚层; ②、能够无限地进行对称分裂并保持未分化状态( 长期自我更新) ; ③、显示并维持正常、完整( 二倍体) 和稳定的染色体核型; ④、全能的ESCs 能够分化成三个胚层( 内胚层、中胚层、外胚层) 来源的所有细胞类型;⑤、在发育过程中能整合到所有胚胎组织中( 体外经长期培养的小鼠ESCs, 被植入另一胚胎形成嵌合体动物后, 仍能产生所有组织) ; ⑥、具有能克隆形成胚胎细胞系的能力, 并能产生卵子或精子细胞; ⑦、基因克隆, 即一个单一的ESCs 能产生一群具有相同遗传特性的细胞( 克隆) , 这些细胞有着与亲代细胞
小鼠胚胎干细胞分化为精子细胞的研究进展 郑晨光生科091 学号090304109 (河北科技大学生物科学与工程学院石家庄050018) 摘要:胚胎干细胞(ESCs) 是一种具有分化发育为三个胚层组织细胞潜能的全能性细胞, 哺乳动物的精子起源于原始生殖细胞(PGCs), ESCs 可分化为PGCs, 并进一步分化为精子细胞。通过在培养基中添加诱导分化因子(如维甲酸等) 或与希望诱导分化的目的细胞(如Sertoli细胞等) 共培养, 并通过鉴别ESCs分化为生殖细胞的各阶段特异性基因标志物 c-kit、VASA、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 获取不同阶段的生殖细胞。鼠的ESCs 已诱导出了不成熟的精子细胞, 但到目前为止尚无成熟精子培养成功, 且诱导分化的效率很低。 关键字：小鼠；胚胎干细胞；精子 胚胎干细胞是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞, 能在体外增殖, 并能保持未分化状态。在一定条件下可以分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型。目前, 已从ESCs 诱导出神经细胞、心肌细胞、肝细胞、骨细胞、胰岛素分泌细胞等。小鼠胚胎干细胞体外已成功诱导分化为精子细胞和卵母细胞, 人胚胎干细胞理论上也具备分化为生殖细胞的潜能。2003 年5 月Hubner 等成功将鼠胚胎干细胞体外分化为生殖系统的卵母细胞,并在Science 上报道了该成果。近来有实验室从小鼠ESCs体外分化产生雄性原始生殖细胞, 孵育分化后注入到卵母细胞可发育成囊胚, 且检验为正常的二倍体核型。本文从小鼠胚胎干细胞定向分化为精子细胞的基因标记和方法学2 个方面, 对ESCs 向精子细胞分化的最新研究进展作一综述。 1 原始生殖细胞的发育 雌、雄鼠合笼至母鼠见阴栓后(days post-coitum,dpc) 7 d ,鼠胚胎中出现原始生殖细胞(primordiralgerm cells, PGCs), 经过增殖, 移行到生殖嵴, 并继续分化为生殖干细胞(germ stem cells, GSCs), 这些细胞是精子和卵子发生的基础。大部分研究者都认为, PGCs 是生殖细胞最初的形式,小鼠胚胎在三个胚层形成时, PGCs同时出现。PGCs 从性腺原条移行到尿囊再移行到近端内胚层中, dpc 7 d 后在中胚层远端可观察到PGCs, dpc 8 d移行到尿囊再到原肠, 这被称为移行期PGCs, 在dpc 9.5-11.0 d , 移行至生殖嵴, 这一阶段被称为移行后期PGCs, 当PGCs 分化为生殖母细胞时, 睾丸或卵巢的结构就已经确立。对于雄性小鼠, 生殖母细胞一直停留在有丝分裂期直到出生后2 d , 然后到达输精管基底膜或者停留在管腔中退化, 那些存活下来的细胞则继续分化为GSCs, 经过多细胞分化阶段, 分化为精母细胞, 精母细胞减数分裂为精子细胞, 后者最终分化为精子。也就是说, 在雄性胚胎中生殖细胞要经历移行前期P G C s 、移行期PGCs、移行后PGCs 、生殖母细胞、A 型精原细胞、GSCs 和减数分裂前生殖细胞, 才形成成熟的精子。在这段复杂漫长的变化中, 有多种不同的特异基因的表达。 2 生殖细胞分化的基因标记 PGCs的很多标志物在未分化的ESCs 上也有表达, 摆在研究者面前的挑战就是如何区分这2种细胞。且ESCs 在分化为PGCs 的过程中, 各个阶段 的基因标记也不同。ESCs的分化依赖于特异基因表达, 在生殖细胞分化中起关键作用的基因有c - k i t 、V A S A 、DAZL、fragilis、miwi、mil1和mil2等, 这些基因的表达有阶段特异性, 即在生殖细胞的不同发育阶段, 它们分别稳定地表达, 从而成为原始生殖细
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
MEF小鼠胚胎成纤维细胞知识总结 2008-06-19 00:00 来源：丁香园点击次数：1517 关键词：MEF小鼠胚胎成纤维细胞 知识总结 分享到：收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 小鼠胚胎成纤维细胞的富集 1、给13-14天的孕鼠注射大约0.5ml阿佛丁。当鼠麻醉后，实施断颈法处死小鼠。 2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮肤向后拉，暴露出腹膜。用消毒过的工具，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 3、用剪刀剪开每一测的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。 4、用两副钟表镊子将胎盘和膜与胚胎分离开，分离后切除内脏（所有深色的东西）。将胚胎转移到(有盖)培养皿中，用10ml不含钙镁离子的PBS洗三遍。 5、用带有弯钩的眼科剪将组织剪碎，当你剪的很累以致于不能再剪的时候，加入2ml胰蛋白酶/ED TA继续剪。再加入另外5ml胰蛋白酶/EDTA，并在37℃孵育大约20分钟。此时，返回至第一步，对下一只鼠进行操作。 6、执行1－4步，到将胚胎置于胰蛋白酶/EDTA中这一步。 7、吹打胰蛋白酶/EDTA中的胚胎，直到有很少的组织物残留。将皿放回培养箱再孵育10分钟。 8、用20ml培养基以终止胰蛋白酶/EDTA的消化，将皿中的物质转移至50ml锥形管中。 9、混匀管内的物质，加入到含有20ml培养基的T75培养瓶中。每个培养瓶中装大约3个胚胎。 10、将这些培养瓶放在培养箱中37℃培养过夜。
11、将胚胎置于PBS中，并重复第5步。 12、第二天更换培养基，以去除碎片和中毒的细胞及其分泌的物质。 13、当培养瓶中的细胞长到80-90%汇合时并仍处于指数生长期时，是冻存细胞的最佳时期。一般说来，这发生在准备胚胎的第二天。这可能或早或晚发生，所以请注意观察你的培养瓶。 注释： 我们已用CF－1品系的鼠制备了成纤维细胞。 培养基成分： 88％DMEM 10％FBS 1％NEAA 1% 双抗 对于新建立的细胞系，要对样本进行支原体检测。 小鼠胚胎成纤维细胞的消化/传代 1、移去MEF培养基 2、用5ml不含钙镁离子的PBS洗涤细胞（以去除胰蛋白酶的抑制物）。 3、每个培养瓶里加入1.5ml的胰蛋白酶/EDTA（0.05%的胰蛋白酶），消化5min。
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞